专利名称：八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法
技术领域：
本发明涉及植物有效成份提取纯化领域，特别是提供一种八角属植物莽草酸生物转化技术及提取纯化工艺。
背景技术：
莽草酸的价值，主要体现在(1)作为抗禽流感特效药“达菲”的原料；(2)作为抗癌药物的中间体，对血小板的凝聚和凝血的抑制作用；(3)其它药理作用。
查新发现，除了八角果实中含有莽草酸外，其它八角属植物、马尾松等也有莽草酸的存在，但目前研究表明八角中含量最高。有关莽草酸研究多集中在其药理、致死等方面，目前没有提取纯化，以及生物转化方面的有关报道。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种优化工艺、成本低、产品优质的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其比传统工艺效率提高一倍以上，成本降低三分之一以上。
为达到上述目的，本发明的实施方案为一种八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤包括(1)、超临界CO2萃取a、先将八角属植物粉碎，过80目筛，装入超临界CO2萃取釜，萃取条件为萃取釜压力35～25Mpa、温度60℃～40℃，分离釜压力8～5Mpa、温度60～40℃；b、萃取1.5h后，调节分离釜压力为5.7Mpa，分离温度45℃，收集萃取物八角茴香油；(2)、莽草酸微生物转化将超临界CO2萃取后的八角渣中加入莽草酸诱导剂，该诱导剂为产莽草酸的八角内生细菌，在28-32℃范围内培养10～48h，提高八角渣中莽草酸含量；(3)、莽草酸提取分离纯化将微生物转化转化后的八角渣以1∶20的比例加入蒸馏水或去离子水，微波频率为3000～2000MHz，萃取时间30min，萃取温度40℃～50℃；或八角渣以1∶10的比例加入蒸馏水或去离子水，加热萃取，时间90min，萃取温度40℃～50℃，然后进行浓缩，结晶，重结晶，最后得纯度大于98％的莽草酸。
步骤(1)中，超临界CO2萃取最佳条件为萃取釜压力25Mpa、萃取温度50℃，分离釜压力6.0Mpa、分离温度46℃；步骤(2)中，所述产莽草酸的八角内生菌由下述方法分离培养所得A、产莾草酸的八角内生菌的分离a、对八角进行表面升汞杀菌，接种八角组织块于固体培养剂(MS)上，培养10-15天，并接种数次；b、对八角产生的愈伤组织进行观察，发现其中愈伤组织仍有微生物生长，对其中微生物进行分离；c、对分离出的微生物进行逐个分离，纯化；d、经过分离，筛选和检测，找到产生莾草酸微生物，为革兰氏阴性细菌。
B、产莾草酸的八角内生细菌的培养a、取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，混合，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培养液；b、产莽草酸的八角内生细菌在牛肉膏蛋白胨培养液中进行培养，最佳培养条件为21g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培养液、1.9g硝酸铵/L牛肉膏蛋白胨培养液、培养温度为30℃，pH值6.5和培养基装量100mL/250mL，接种量为培养基装量的1/10，0.5g氯化钙/L牛肉膏蛋白胨培养液和0.5g氯化镁/L牛肉膏蛋白胨培养液，80r/min-100r/min振荡速度。
步骤(2)中，最佳生物转化温度为30℃。
步骤(3)中，浓缩最佳温度为55℃～65℃。
本发明采用超临界CO2萃取八角茴香油，萃油后的八角渣进行高效生物转化，提高八角渣中莽草酸含量；同时，采用微波萃取法，或常规溶剂提取法，提取效率高；同时采用柱层析、结晶等分离、精制技术，获得98％以上的莽草酸和一定纯度副产物八角茴香油二种产品。
具体实施例方式
八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，具体步骤为(1)、莽草酸含量检测HPLC检测不同来源八角茴香莽草酸含量。HPLC检测条件，检测波长220um，进样2ul，流速为0.5ml/min，流动相乙腈∶2％磷酸＝95∶5。
(2)、超临界CO2萃取(八角茴香油的提取)a、选取莽草酸高含量八角属植物原料，粉碎，装入超临界CO2萃取釜，中，进行超临界CO2萃取，萃取的条件萃取釜压力25Mpa、萃取温度50℃，分离釜压力6.0Mpa、分离温度46℃，收集萃取物八角茴香油，一次性萃取后，原料中含油量很低b、、萃取1.5h后，调节分离釜压力为5.7Mpa，分离温度45℃。收集萃取物八角茴香油，一次性萃取后，原料中含油量很低；(3)、产莽草酸的八角内生菌的分离和培养A、产莾草酸的八角内生菌的分离a、对八角进行表面升汞杀菌，接种八角组织块于固体培养剂(MS)上，培养10-15天，并接种数次；b、对八角产生的愈伤组织进行观察，发现其中愈伤组织仍有微生物生长，对其中微生物进行分离；c、对分离出的微生物进行逐个分离，纯化；d、经过分离，筛选和检测，找到产生莽草酸微生物，为革兰氏阴性细菌。
B、产莾草酸的八角内生细菌的培养a、取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，混合，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培养液；b、产莽草酸的八角内生细菌在牛肉膏蛋白胨培养液中进行培养，最佳培养条件为21g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培养液、1.9g硝酸铵/L牛肉膏蛋白胨培养液、培养温度为30℃，pH值6.5和培养基装量100mL/250mL，接种量为培养基装量的1/10，0.5g氯化钙/L牛肉膏蛋白胨培养液和0.5g氯化镁/L牛肉膏蛋白胨培养液，80r/min-100r/min振荡速度。
(4)、莽草酸微生物转化将步骤2超临界CO2萃取后的八角渣中加入步骤3分离培养所得产莽草酸的八角内生细菌，在30℃范围内培养10～48h，使莽草酸类似物转化为莽草酸；(5)、莽草酸提取分离纯化a、将莽草酸微生物转化后的八角渣以1∶20的比例加入蒸馏水或去离子水，进行微波萃取，微波频率为3000～2000MHz，萃取时间30min，萃取温度40℃～50℃；或八角渣以1∶10的比例加入蒸馏水或去离子水，加热萃取，时间90min，萃取温度40℃～50℃。
b、然后离心过滤，然后在真空下进行浓缩，浓缩温度为55℃～60℃，再经吸附脱色、结晶、重结晶，得到≥98％莽草酸产品。
权利要求
1.一种八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤包括(1)、超临界CO2萃取a、先将八角属植物粉碎，过80目筛，装入超临界CO2萃取釜，萃取条件为萃取釜压力35～25Mpa、温度60℃～40℃，分离釜压力8～5Mpa、温度60～40℃；b、萃取1.5h后，调节分离釜压力为5.7Mpa，分离温度45℃，收集萃取物八角茴香油；(2)、莽草酸微生物转化将超临界CO2萃取后的八角渣中加入莽草酸诱导剂，该诱导剂为产莽草酸的八角内生细菌，在28-32℃范围内培养10～48h，使莽草酸类似物转化为莽草酸；(3)、莽草酸提取分离纯化将微生物转化转化后的八角渣以1∶20的比例加入蒸馏水或去离子水，微波频率为3000～2000MHz，萃取时间30min，萃取温度40℃～50℃；或八角渣以1∶10的比例加入蒸馏水或去离子水，加热萃取，时间90min，萃取温度40℃～50℃，然后进行浓缩，结晶，重结晶，最后得纯度大于98％的莽草酸。
2.根据权利要求1所述的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤(1)中，超临界CO2萃取最佳条件为萃取釜压力25Mpa、萃取温度50℃，分离釜压力6.0Mpa、分离温度46℃。
3.根据权利要求1所述的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤(2)中，所述产莾草酸的八角内生菌由下述方法分离培养所得A、产莽草酸的八角内生菌的分离a、对八角进行表面升汞杀菌，接种八角组织块于固体培养剂(MS)上，培养10-15天，并接种数次；b、对八角产生的愈伤组织进行观察，发现其中愈伤组织仍有微生物生长，对其中微生物进行分离；c、对分离出的微生物进行逐个分离，纯化；d、经过分离，筛选和检测，找到产生莽草酸微生物，为革兰氏阴性细菌。B、产莾草酸的八角内生细菌的培养a、取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，混合，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培养液；b、产莾草酸的八角内生细菌在牛肉膏蛋白胨培养液中进行培养，最佳培养条件为21g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培养液、1.9g硝酸铵/L牛肉膏蛋白胨培养液、培养温度为30℃，pH值6.5和培养基装量100mL/250mL，接种量为培养基装量的1/10，0.5g氯化钙/L牛肉膏蛋白胨培养液和0.5g氯化镁/L牛肉膏蛋白胨培养液，80r/min-100r/min振荡速度，时间8-24h。
4.根据权利要求1所述的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤(2)中，莽草酸微生物转化最佳温度为30℃。
5.根据权利要求1所述的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤(3)中，浓缩最佳温度为55℃～65℃。
全文摘要
八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其首先利用超临界CO
文档编号C12R1/01GK101078020SQ20061003169
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月23日 优先权日2006年5月23日
发明者曹庸, 于华忠, 姚茂君 申请人:曹庸, 于华忠, 姚茂君