专利名称：Adamalysin的解离素结构域在抗血管生成、抗侵入和抗转移组合物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制在许多病理学情况如癌、炎症、动脉硬化症、和视网膜病理性血管生成中所涉及的血管生成(angiogenesis)、侵入(invasion)和转移过程中的事件。
本发明基于发现了人的内皮细胞上存在的一种分子的一种片段具有抗血管生成、抗侵入和抗转移的功能。本发明涉及由全部或部分解离素(disintegrin)结构域构成的Adamalysin片段的应用。更具体地，本发明涉及Metargidin的解离素结构域的应用(Krtzschmar等，1996)，下面将该结构域的“抗血管生成的Metargidin肽”表示为“AMEP”。
与文献中曾描述过的其它抗血管生成物质相比，这个片段具有独创性-同时抑制血管生成的所用阶段内皮细胞的迁移与增殖、其在不同的基质底物上的粘附、毛细血管结构的形成，和-诱导内皮细胞的凋亡(apoptosis)。
此外，出乎意外地，这种片段一方面具有抑制癌细胞侵入的能力，另一方面具有阻止转移形成、特别是在其表面表达整联蛋白αvβ3的细胞的转移形成的能力。
血管生成表示一种形态形成的过程，通过这种过程，通过对刺激发生的反应，已经存在的血管萌生形成了新的毛细血管。在体内血管生成时，这些新生毛细血管由毛细血管或后毛细血管小静脉产生，但不会由动脉、小动脉或静脉产生。因此，血管生成因子是一种有可能引发和/或保持血管生成的分子，例如像FGF2。抗血管生成因子因而是一种通过作用于血管生成的一个或多个关键阶段而抑制血管生成的分子。
粘附包括细胞与细胞外基质结合的能力。这种现象涉及存在于细胞表面的多种粘附分子。
细胞迁移的过程涉及能够让细胞降解基质化合物的酶，以及保证细胞与基质结合的粘附分子。此外，细胞骨架的动态结构使得细胞能够改变运动所必需的粘附和脱离时间。
增殖是一种涉及随着时间推移细胞发生分裂的现象。
凋亡(apoptosis)包括正常细胞按照复杂的程序启动其固有自杀(称之细胞死亡)的内在能力。而Anoikis是由正常细胞发生凋亡后失去与基质粘附所造成的一种形式。
侵入是一类解剖成分的过分增殖，由此导致邻近的成分被该成分取代。
转移是一种癌细胞病灶，它与先前存在的癌——所谓原发的癌——有关，但在远离后者的部位进展，而不与后者相连。通过淋巴或血液途径扩散这些继发的癌细胞病灶。
肿瘤的进展与在不同器官中的扩散取决于血管内和血管周围的血管化，也称之血管生成(Folkman，1984)。针对血管生成过程进行定向是一种新的治疗方法，也是一场癌治疗的革命。许多抗血管生成的分子正处于临床实验阶段。
Vitaxin是人源化的抗整联蛋白αvβ3抗体，其诱导对内皮细胞增殖的抑制以及促凋亡作用(Brooks等，1994；Hammes等，1996)，但其不改变它们的迁移。整联蛋白αvβ3是一种优选地表达于新血管内皮细胞和某些癌细胞的粘附分子。其与细胞外基质中的某些化合物相互作用，具体地是玻连蛋白(vitronectin)、纤连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)、IV型胶原和纤维蛋白，因此诱导内皮细胞粘附和迁移。大量地描述过整联蛋白αvβ3在血管生成中的主要作用(综述，Eliceori和Cheresh，2000)。
Marimastat可阻断金属蛋白酶的蛋白水解活性，因此抑制内皮细胞迁移，而对其细胞增殖没有任何影响。这些金属蛋白酶(MMP)事实上属于一个大的酶家族，它们都能够降解细胞外基质化合物，对内皮细胞迁移是必需的。其它属于丝氨酸蛋白酶的酶也参与细胞迁移，如尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)——当它与膜表面锚定的受体(u-PAR)和纤溶酶发生结合。
所有这些药物的目的是阻断血管生成，但它们的作用限于这个过程的一个或两个阶段，AMEP则相反，它是多能性的。因此，AMEP不仅阻断其最初所针对的整联蛋白αvβ3的全部血管生成功能，即内皮细胞的增殖与粘附，而且它还令人惊奇地诱导完全抑制这些细胞的迁移，以及抑制毛细血管结构的形成。它对这些细胞的促凋亡作用与它们的细胞周期改变不相关，这种促凋亡作用也成为其独到之处。
此外，出乎意料地，AMEP同时具有很强的抗侵入和抗转移能力。
Adamalysin，也称ADAM(即“解离素和金属蛋白(A Disintegrin AndMetalloprotein)”)，或MDC(即“富金属蛋白、富解离素和富半胱氨酸蛋白(Metalloprotein-rich，Disintegrin-rich and Cysteine-rich protein)”)，是一类在细胞质膜中锚定的蛋白质。全部29个已经描述的Adamalysin的共同结构组成如下-金属蛋白结构域，其蛋白酶的催化活性依赖于锌，-解离素结构域，以及-富半胱氨酸结构域和富EGF型重复结构域(Wolfsberg等，1995)。
但应该提起，在全部Adamalysin中，仅十个含有一种具有催化活性的金属蛋白酶结构域。不同Adamalysin的生理学作用是极不相同的调节细胞粘附、释放配体、激活受体、细胞融合(综述，Primakoff和Myles，2000)。这些分子的作用方式还不得而知。
应该将AMEP与蛇的解离素进行区别，这在文献中分两个方面作过描述
-蛇的解离素对血管生成的不同步骤施加有限作用。例如，Accutin(Yeh等，1998)抑制内皮细胞粘附在不同的基质化合物上，并诱导其凋亡，而Salmosin(Kang等，1999)诱导抑制内皮细胞粘附及其由FGF2诱导的增殖。
-AMEP还有一个优点是源于人，因此它不具有蛇的解离素抗原特性，后者具有免疫原性，因此阻止把它们用作在抗癌治疗需要长期治疗中的药物。
因此，本发明的目的是一种活性剂在制备用于抑制血管生成或侵入和/或形成转移的药物中的应用，所述活性剂选自一种蛋白物质或核酸分子，所述蛋白物质包含Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物或由Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物组成；所述核酸分子包含编码Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物的多核苷酸序列或由编码Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物的多核苷酸序列组成。
优选地，所述的Adamalysin是Metargidin。因此，本发明特别涉及一种蛋白物质的应用，所述的蛋白物质包含Metargidin的全部或部分解离素结构域或其衍生物或由Metargidin的全部或部分解离素结构域或其衍生物组成，该结构域的氨基酸序列列在序列表中，其序号为SEQ IDNO2。
AMEP片段值得注意之处在于它能够抑制肿瘤侵入、形成转移和血管生成的所有阶段，即内皮细胞的迁移和增殖——这与某些作者(Zhang等，1998)的观点相反，他们认为，通过与整联蛋白αvβ3结合，解离素结构域可能只是涉及在血管生成期间的内皮细胞的同型聚集(homotypic aggregation)。另外，在没有加任何血管生成因子时观察到AMEP对血管生成的抑制作用。
相反，在试图证明抗αvβ3抗体的抗血管生成作用时，则需要使用外源血管生成因子。仅在用FGF2(一种在保持血管生成时必不可少的血管生成因子)诱导后，它们才抑制血管所生成(Klein等，1993)。与其它具有RGD序列的肽——它们仅作为内皮细胞粘附的抑制剂被描述过(Kostetsky和Artemjev，2000)——相比，AMEP的治疗意义仍然是基于其作用谱内。
本发明涉及Adamalysin、更具体地为Metargidin的解离素结构域及其衍生物。这些衍生物构成具有抗血管生成、抗侵入和抗转移性质的功能等价物，本技术领域的技术人员可使用本发明说明书，更具体地在下面实验部分中涉及的方式和实验直接对其进行确定。此类衍生物可以是截短形式的片段、或通过缺失、添加、抑制或取代一个或多个氨基酸而修饰的序列。此类衍生物还可能涉及相应于由化学修饰的氨基酸所构成的所述衍生物的片段，这些修饰的目的是使这些衍生物变得更稳定。同样地，本发明也涉及编码所述衍生物的多核苷酸序列。
本发明因此还特别涉及包含编码Metargidin的全部或部分解离素结构域或其衍生物的多核苷酸序列的核酸分子，编码该结构域的序列列在序列表中，其序号为SEQ ID NO1。这个结构域的编码序列由276个核苷酸构成(Met-420至Glu-511)。
所述的序列有利地置于其表达调控序列控制之下。这样一种核酸分子例如是一种载体，如-编码抗血管生成片段AMEP或其衍生物的表达质粒，无论其转移技术怎样，-编码由所述片段或衍生物与利于纯化(pGEX型质粒)或利于组织定向的蛋白质结构域之间形成的融合蛋白质的表达质粒。
-编码所述AMEP片段或其衍生物的质粒或其它类型的表达载体，特别是除细菌外的宿主生物体，例如昆虫细胞中的杆状病毒或真核细胞中的质粒。
这样的核酸分子可以用于基因治疗或细胞治疗方案中，其方案在于给个体施用所述分子或用所述分子转化的细胞，以便在待治疗部位表达全部或部分的解离素结构域。
这样的核酸分子也可用于制备本发明的蛋白物质。因此，用编码AMEP的质粒所转化细菌和真核细胞合成人的AMEP。更确切地，使用大肠杆菌(DH5α克隆)作为细菌生产系统，胫骨颅骨肌(muscle tibiacranial)作为真核细胞生产系统，但酵母或所有其它生产系统也都能够使用。
证明AMEP对血管生成的所有阶段(内皮细胞的迁移、增殖、粘附、凋亡和形成毛细血管结构)和肿瘤侵入与形成转移的抑制作用，可以提供一种治疗癌症的新的抗肿瘤药物。事实上，与迄今为止在文献中描述的其它血管生成抑制剂相反，AMEP发挥了一种内在的抗侵入、抗转移和抗血管生成活性，这种活性是多能性的和独特的。它同时抑制各种来源的内皮细胞(无论是大血管或微血管，无论是转化的或未转化的)的迁移和增殖、以及细胞(在纤维蛋白原、玻连蛋白和纤连蛋白上)的粘附和在体外三维模型中毛细血管结构的形成。还证明了AMEP的促凋亡作用。在体内，AMEP通过抑制形成血管和转移散布，特别是表达整联蛋白αvβ3的细胞的转移散布而阻断了肿瘤的生长。
本发明因此涉及提供一种治疗和/或预防一般癌症疾病以及发病机理归因于血管生成的疾病(例如炎症、牛皮癣、动脉硬化症、黄斑变性等)的新方法。
在本发明的药物中，所述活性剂与任何药学可接受的载体相配合，这些载体是本技术领域的技术人员已知的，并适合于其用药方式。因此，本发明的药物可以采用下述方式用药-单独施用，通过全身、局部、或口服或作为植入体，-采用细胞或基因治疗，-与其它活性组分配合，
-以任何制药形式，例如纳米颗粒形式。
由下面参照附图所作的说明可体现出本发明的其它优点和特征，这种说明涉及AMEP的制备及其在体外与体内的抗血管生成、抗侵入和抗转移活性，其附图中-
图1表示在a中，可见在纯化后SDS-PAGE中的融合蛋白(谷胱甘肽S-转移酶-AMEP)。Coomassie蓝染色后在36kDa可见到单一条带。b中所示为纯化的AMEP的免疫印迹。可见到兔的抗解离素抗血清在10kDa处的单一条带。
-图2表明AMEP对CPAE粘附在纤维蛋白原(30微克/毫升)、玻连蛋白(10微克/毫升)和纤连蛋白(40微克/毫升)上的影响。在粘附实验(在材料与方法中说明)前，这些细胞用AMEP或14氨基酸片段预处理24小时。这些实验以三份进行，重复三次。这些结果用与对照相比的百分数表示(平均值±SEM)。
-图3表明AMEP对内皮细胞的形态与迁移的影响。在照片B、D、E上表示出迁移的前沿，分别为对照条件、5微克/毫升和10微克/毫升的AMEP(相差显微镜)。
-图4表示AMEP抑制CPAE迁移的剂量关系。在3天期间内每天测量细胞迁移的前沿位置。这些结果是五次实验的平均值，以与对照相比的百分数表示(平均值±SEM)。
-图5表示AMEP抑制CPAE增殖的剂量关系。在AMEP或含有RGDC序列的这个结构域的片段存在下，这些细胞培养48小时，用1μCi氚标记的胸腺嘧啶核苷培养18小时。然后测量掺入的放射性。这些结果是五次实验的平均值，用与对照相比的百分数表示(平均值±SEM)。
-图6表示使用HMEC-1时AMEP对毛细血管结构形成的影响。在没有AMEP(照片A、B)或有AMEP(5微克/毫升)(照片C、D)的情况下，被内皮细胞覆盖的cytodex珠掺入纤维蛋白凝胶中。
-图7表明相对于对照(A、D)，在有5微克/毫升AMEP(照片B)或有10微克/毫升AMEP(照片C、E)的情况下，使用CPAE时AMEP对纤维蛋白凝胶中毛细血管形成的影响。
-图8表明AMEP抑制肿瘤生长。曲线的每个点表示裸鼠的测量的肿瘤体积。这个实验的对照组以及AMEP组均使用了五只动物，对它们处理了14天。柱状图表示每个组5只鼠的平均肿瘤体积。这个图代表了3个不同的实验。
-图9表明使用黑素瘤细胞时，AMEP抑制肺的转移灶的数量。每个点表示在C57B1/6鼠的肺中计算的转移灶的数量。该实验使用了每组12只动物。柱状图表明对照组与处理组转移灶的数量的平均值。这个实验是两个不同的实验的代表。
-图10表明，与对照鼠的肺相比，用AMEP处理的C57B1/6鼠肺的肺转移灶(黑斑点)的数量的抑制状况。
下面的说明使用了在文献中通常描述的分子生物学技术，例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，分子克隆(Molecular Cloning)；实验室手册，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor纽约，(Sambrook等人，1989)；DNA克隆实用方法(Practical Approch)，第I和II卷(D.N.Glover等，1985)；B.Perdal，分子克隆的实用指南(Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(eds.)，分子生物学的现行规程(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley andSons，Inc.(1994)。
于是，核酸应该理解是一种嵌合化合物，它含有称之为核苷酸的共价结合的亚单位。这些核苷酸包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，其均可以是单链的或双链的。DNA包括cDNA(互补的)、基因组DNA、合成DNA和半合成DNA。编码蛋白质的核苷酸或核酸序列称之有义序列。重组DNA分子应该理解是一种采用分子生物学技术处理的DNA分子。
DNA编码序列应该理解是一种双螺旋DNA序列，它们处在适当的调控基因序列控制之下，这种序列在体外或在体内的细胞中被转录并翻译成多肽。由氨基末端5′的起始密码子决定编码序列的起始，由羧基端3′的终止密码子决定翻译的终止。聚腺苷酸化信号(转录终止)一般定位在编码序列的3′处。控制转录和翻译的这些序列是调控DNA序列，例如启动子、刺激因子(stimulator)，因此使得宿主细胞中的编码序列能够表达。
启动子序列是一个能结合细胞中的RNA聚合酶并能启动编码序列转录的DNA区域。
编码序列在细胞中处在转录和翻译序列控制之下，其中RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA(信使RNA)，后者然后翻译成蛋白质。
表达质粒是一种染色体外的环状双链DNA分子，它含有调控序列，其间插入结构基因(相应于所需蛋白质的DNA序列)。它可独立地在细菌中复制。
表达载体是一种核酸分子，它含有至少一个独立的复制起始位点和诱导型启动子，并且其可被引入宿主细胞中，例如细菌或真核细胞。在这种载体中，可以插入称之为插入序列的编码序列，这种序列相应于所需的蛋白或肽。
I-方法1)细胞培养J.Badet博士(真核细胞生物技术实验室，Créteil大学，法国)提供CPAE细胞(牛的肺动脉内皮细胞)。这些细胞在MEM培养基中培养，该培养基添加了20％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100UI/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素(Gibco，Paisley，UK)。所有下面列出的培养基(“完全培养基”)都含有同样浓度的青霉素/链霉素和CPAE细胞使用的L-谷氨酰胺。它们可以用于传代12-20次。Ades博士(控制与预防疾病中心，Atlanta，GA)提供HMEC-1细胞(人的微血管系统内皮细胞)，在用SV40基因和T大抗原转染人的真皮内皮细胞时，该博士确定了这种细胞系。在全MCDB131培养基(Sigma，St.Louis，MO)中培养HMEC-1细胞，该培养基添加了10％FCS、10纳克/毫升EGF(Collaborative BiomedicalProducts)和1微克/毫升氢化可的松(Sigma)。按照Jaffe等描述的方法，在实验室中从脐带提取了HUVEC细胞(人脐带静脉内皮细胞)。这些脐带用0.2％胶原酶进行控制消化(Boehringer Manneheim GmbH，Manneheim，Allemagne)。原代细胞在M199全培养基中培养，该培养基补充了20％FCS、75mM HEPES、3.7mM pH 7.5的碳酸氢钠和5微克/毫升两性霉素B(Life technologies，法国)。HMVEC-d细胞(真皮微血管系统内皮细胞，Biowhittaker Europe，比利时)在由生产商提供的全培养基(EGM-2MV)中传代4-6次，该培养基补充了10％FCS。C51细胞(鼠的结肠癌)在RPMI+10％FCS全培养基中培养。3T3细胞(鼠的成纤维细胞瘤)在DMEM+10％FCS全培养基中培养，MDA MB 231细胞(人乳腺癌细胞)使用DMEM全培养基，其中添加了10％FCS，如3T3成纤维细胞癌一样。B16F10细胞(鼠的黑素瘤细胞)在DMEM+10％FCS和1.5克/升碳酸氢钠的培养基中培养。
根据Herren等(Néosystéme，法国)描述的方法，兔在接种AMEP片段后得到了抗解离素的抗体。这个片段由12个氨基酸构成，并且含有RGDC序列；其分子量是1.4kDa。
2)在细菌系统中构建与合成人的AMEP制备AMEP与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质。为此，编码AMEP(Met-420至Glu-511)的SEQ ID NO1的276个核苷酸的cDNA片段采用PCR(聚合酶链反应)扩增。这个cDNA在pGEX-6P质粒中在BamH1位点进行亚克隆(Amersham Pharmacia Biotech)。使用异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(1mM)在大肠杆菌(DH5α)中诱导合成GST-AMEP融合蛋白质，例如采用Smith和Johnson(1988年)描述的方法。简要地，在用1％Triton X100溶解细菌，接着采用超声波降解法处理后，使用谷胱甘肽-琼脂糖进行亲合层析，使用还原型谷胱甘肽(5mMTris，HCl，pH8.0)洗脱，其中含有5mM还原型谷胱甘肽(Sigma)(最终为pH7.5，临时制备)，以纯化GST-解离素。检测SDS-PAGE的单一条带，该条带相应于这种融合蛋白质的分子量(36kDa)(图1a)。
为了检测相应于在体外不同血管生成模型上AMEP的肽活性，我们根据Amersham说明书，用特定的蛋白酶“PreSccisionTM蛋白酶”从GST裂解出AMEP，这种酶本身是与GST偶联的蛋白酶(AmershamBuckinghashire)。
然后，根据Sigma的说明书，使用谷胱甘肽-琼脂糖柱的亲合层析纯化AMEP。AMEP由91个氨基酸构成，其估计的分子量是9.7kDa。
采用免疫印迹法(图lb)和采用高效液相层析法(HPLC)分析了AMEP的纯度。蛋白质浓度通过BCA实验测定(Pierce，Perbio，Science，法国)。
3)免疫印迹法100微克已纯化的AMEP放在电泳凝胶上，该凝胶由聚丙烯酰胺-12％SDS构成，再转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher和Schuell)。该膜用TBS缓冲液饱和1小时(Tris缓冲液10mM Tris，pH7.5；200mM NaCl/吐温(0.05％)，含有10％奶粉)，然后使用以1∶1000稀释的抗AMEP多克隆兔抗血清(Néosystem，法国)孵育，或用抗-GST抗体(Amersham)孵育。在五次TBS/吐温洗涤后，根据生产者的说明书(DAKO)，使用以1∶2000稀释的与过氧化物酶偶联的适当第二抗体孵育该膜1小时。该膜在同样漂洗缓冲液中洗涤五次，再根据化学发光方法ECL(Amersham)检测信号。
4)纤维蛋白原与玻连蛋白和纤连蛋白的粘附-第一种技术实验过程中内皮细胞与AMEP点状培养。
通过用1.5mM EDTA培养，从培养箱分离下CPAE，再按照5×105细胞/毫升在粘附缓冲液中(140mM NaCl、10mM Hepes、5mM葡萄糖、5.4mM KCL、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MnCl2、pH7.4)制成悬浮液。然后，在室温下，100微升细胞悬浮液与AMEP(5微克/毫升)放在一起，然后放入96孔板的孔中(Greiner，D.Dutcher)，与50微升纯化的纤维蛋白原(40微克/毫升，在PBS中；Kabi)、10微克/毫升玻连蛋白(Sigma)、30微克/毫升纤连蛋白(Sigma)、或1％BSA(牛血清白蛋白)作为阴性对照，在4℃预先培养一夜。CPAE细胞在37℃培养20分钟后，该板用200微升粘附缓冲液洗涤两次，非特异性位点用添加1％BSA的PBS在37℃饱和1小时。接着，该板再用含有1％BSA的粘附缓冲液洗涤两次。用200微升含有1％BSA的粘附缓冲液洗涤孔三次，除去未粘附的细胞。测量细胞的磷酸酶活性能够定量粘附细胞。简要地，100微升的3毫克/毫升的对硝基酚磷酸酯(溶于含有0.1％triton X100的pH5.5乙酸盐缓冲液中的溶液)添加到这些孔中，再在37℃培养2小时。添加1N NaOH终止该反应。采用ELISA阅读器(Titertek Twinreader)，读取在405nm吸收后测量出释放的对硝基酚(它表示粘附细胞数)。每个实验进行三次。
-第二种技术在分离之前，在终浓度为5微克/毫升AMEP下培养CPAE细胞24小时。方案的后续部分与前面描述的相同，但后续部分没有加入AMEP进行进一步的细胞培养。
5)内皮细胞的迁移模型在24孔板中实施迁移模型。将1.5％琼脂糖溶于培养基中，以便在孔中形成凝胶。一半的琼脂糖圆柱体这时插入孔中。把CPAE细胞添加到孔的余下空间中，并培养直到其融合。取出琼脂糖片，以便有可能使细胞迁移，再往培养基添加AMEP，达到所要求的浓度。然后，透明的毫米方格纸放在培养箱下面，以便借助目镜测微器在倒置显微镜下测定细胞迁移速度。这些成对进行的实验重复三次。用与对照相比的百分数表示这些结果。
6)细胞增殖模型按照每个孔(96孔板，Greiner)20000个细胞在全培养基中培养这些细胞。在24小时后，这些细胞在不足相应于全培养基浓度一半的浓度的培养基中进行培养，以便在增补的24小时内诱导这些细胞达到G0/G1期。然后，在有或没有AMEP的条件下，这些细胞用全培养基培养30小时。这时，向这些细胞中添加氚标记的胸腺嘧啶核苷(每个孔1μCi)，再培养18小时。根据所描述的使用Skatron的方案(Skatron，Lier，Norvége)，借助滤纸，定量分析通过细胞加入的氚标记的胸腺嘧啶核苷，这时添加闪烁液体，其后采用计数方法测定放射性。用与对照相比的百分数表示这些结果。
7)分析凋亡和细胞周期(使用Hoechst 33342)和量化早期凋亡(使用膜联蛋白V(Annexine V))-使用Hoechst 33342(Sigma)的活细胞DNA特异性染色技术。
这些内皮细胞(CPAE)进行胰蛋白酶化，细胞悬浮液调整到1×106个细胞/毫升。添加Hoechst 33342染料达到20微克/毫升，并且在室温与搅拌下，将这些细胞培养30分钟。采用流式细胞仪(FACS)分析凋亡细胞百分数。这些细胞在暗处(37℃)孵育30分钟，再进行细胞周期分析。
-使用膜联蛋白V的技术(R&D系统)在1毫升反应缓冲液(100微升10×结合缓冲液(100mM Hepes/NaOH pH7.4，1.5MNaCl、50mM KCl、10mM MgCl2、18mM CaCl2)、100微升碘化丙啶(起始浓度50微克/毫升)、10微升膜联蛋白V-FITC和790微升去离子水)中将1×106个内皮细胞(CPAE)的沉淀物重悬。该悬浮液在室温暗处培养15分钟，再采用流式细胞仪分析凋亡细胞百分数。
8)在两种纤维蛋白凝胶的血管生成模型中毛细血管结构的形成其中一种模型使用CPAE细胞群落，并且根据Pepper等(1999)描述的方法使用。简要地，10000个CPAE在96孔板的2％琼脂糖上聚集达24小时。取出三个聚集物，放在纤维蛋白凝胶中纯化的纤维蛋白原(3毫克/毫升，Kabi)向MEM培养基渗析，然后与20％FCS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、2μM抑酶肽(aprotinin)和所需浓度的AMEP混合。这时加入人的凝血酶(1UI/毫升，Sigma)，以便在表面得到纤维蛋白凝胶，在其表面添加了增添抑酶肽(2μM)的全培养基，每三天更换培养基。从培养24小时开始可以观察到毛细血管结构形成。在倒置显微镜下拍照这些毛细血管照片，再用照片测量这些结构的尺寸。统计分析(Mann-Whtney方法)能够确定这些结构的尺寸是否不同。
第二个模型使用根据Nehl等描述技术的约150微米的珠。使用的细胞是HMEC-1，CPAE不能用于这个模型中。在前述模型中也不能使用HMEC-1。HMEC-1细胞经过与这些珠在全培养基中37℃培养4小时，它们粘附在Cytodex 3珠(Sigma)上。这些珠这时再在大体积的全培养基中制成悬浮液，达到30个细胞/珠，并且每30分钟搅拌5分钟，以30转/分搅拌12小时，接着以同样速度继续培养4天。整个珠表面覆盖细胞时，这些珠在800g下离心5分钟，以便浓缩这些珠并将其加入到与所述前面模型的相同纤维蛋白凝胶中，定量方法与结果分析方法也相同。与使用CPAE的模型相反，毛细血管结构仅在37℃培养3天后出现。
9)制备电转的质粒AMEP的cDNA在pBi载体的Eco RV位点进行亚克隆(Clonetech，Palo Alto，CA USA)。这种载体中，所需基因的表达在含有Tet-On真核细胞基因的表达系统中受四环素诱导的启动子的控制下。Tet-On载体表达rtTA反式激活子(反式四环素转录激活子)，且Tet-tTS载体表达tTS沉默子(四环素转录沉默子)。纯化质粒以便除去任何内毒素(Maxi endo freeKit，Quiagen)。纯化的质粒DNA以要求的浓度溶于无内毒素的0.9％无菌NaCl中。
10)在裸鼠和C57B1/6鼠的肌肉中电转编码人AMEP的基因20微克pBi-AMEP质粒、10微克Tet-off质粒和20微克tet-On质粒溶于30微升0.9％无菌NaCl中，再注入鼠龄8周的裸鼠或C57B1/6鼠的胫骨颅骨肌肉中，如Mir等(Mir等，1999)描述的，通过腹膜内接种戊巴比妥使这些鼠预麻醉。简要地，使用一种合适的鼠脚垫，并有两块钢板的电极，以频率1Hz施加8个200伏/厘米电脉冲达20毫秒。该电极与PS-15电脉冲发生器(Jouan，St Herblain，法国)相连。不含有AMEP的基因的同样质粒构成阴性对照。
11)无胸腺鼠的肿瘤生长模型(MDA-MB-231细胞)预培养直至达到80％融合的MDA-MB-231细胞经取下、洗涤后，然后在PBS中再制成悬浮液(20×106细胞/毫升)。200微升的细胞悬浮液注入到如前面描述的预处理8周裸鼠的背部皮下。根据数学公式[(两个径之和除以2)3/0.52]，测量肿瘤的两个径就能够计算出其体积。肿瘤体积达到18毫米3时，在鼠的饮水中添加200微克/毫升强力霉素(四环素的稳定类似物)(Sigma-Aldrich，Saint Quentin Fallavier，法国)，并且补加5％葡萄糖，以便诱导在鼠的肌肉中表达AMEP。在诱导后14天期间观察肿瘤尺寸。
12)肿瘤血管生成的量化(皮下实体瘤的免疫组织化学和图像分析)这些肿瘤组织在乙醇中进行固定。在石蜡中制备5微米切片。用3％H2O2处理10分钟消除内生的过氧化物酶，以便在免疫组织化学中能够使用这些切片。在用蒸馏水洗涤切片，再用1∶10 Optimax血清(bioGenex，San Ramon，CA)饱和10分钟后，这些切片用大鼠抗-CD31抗体(内皮细胞的粘附分子)按1∶50培养1小时。用Optimax洗涤4分钟两次后，这些切片用与生物素偶联的山羊抗-大鼠的多克隆抗体(1/50)培养，接着用Optimax洗涤4分钟，洗涤两次。这些再用DAB生色底物处理10分钟，用蒸馏水洗涤，用Mayer的苏木精着色本底，并装在Pertex中。所有这些切片进行免疫标记，并在同一天着色本底，这样保证标准化标记的强度。
对于每只动物，使用AxiophotZeiss(德国)显微镜，3CCD Sony照相机(分辨率768×576像素)对用CD31标记的切片的代表性组织学样品进行图像分析。选择放大倍数×100有可能使整个样品数字化。这些样品只是考虑肿瘤组织，坏死和纤维蛋白结构域除外。如果样品尺寸太大，每个样品的整个样品表面或8个邻近视场进行数字化。采用基于Linux的特定程序分析这些图像，得到定量指数0-255。可将这些图像转化成不同灰度水平的数字化彩色图像。一种只是由栗-红色血管组成的理论图像对应于指数255，而无血管的图像(全部蓝色标记)的指数定为0。对于图像的每个像素，其值定为0-255，并且可得到每个图像的这些数字平均值。每只动物的最后指数是由8个邻近视场平均值计算得到的。
13)同源转移的肿瘤模型(肺部转移，B16F10细胞)在注入B16F10鼠的黑素瘤细胞前三天，C57B1/6鼠的饮水中加入200微克/毫升强力霉素(Sigma-Aldrich)，以便诱导C57B1/6鼠肌肉中表达AMEP。这些细胞预培养直到50％融合，然后洗涤，再按照4×106个细胞/毫升在PBS中再制悬浮液。一百微升细胞悬浮液注入鼠的后眼眶窦中的静脉内。在接种这些细胞后7天处死这些鼠，取出肿瘤，在双目放大镜下，计数黑色肺部转移灶。
II-结果1)AMEP抑制内皮细胞在纤连蛋白、玻连蛋白和纤维蛋白原上的粘附作用在AMEP或由12个氨基酸(其中有RGDC片段)组成的1.4kDa的AMEP片段(Néosystem，法国)存在下，实施了在方法中描述的两种粘附技术。为了确定AMEP的作用方式是否不同于对照RGD肽，使用了这种肽(“1.4kDa-肽”)。
在进行粘附实验之前，用1.4kDa-肽(1微克/毫升)点状培养内皮细胞达30分钟时，观察到在玻连蛋白(49±1.2％的抑制作用)和在纤维蛋白原(50±2.4％的抑制作用)上细胞粘附作用显著降低。这个结果就并不令人惊奇，因为这个片段可阻断在内皮细胞表面上存在的整联蛋白αvβ3与其优选底物相互作用。在这些同样的条件下，在可比较的摩尔浓度(10微克/毫升，未示出)下，没有检测到AMEP对内皮细胞粘附在这些底物上有任何显著的影响。
相反地，用AMEP或用与前面同样摩尔浓度的1.4kDa-肽预培养这些细胞24小时后，得到相反的结果AMEP抑制内皮细胞在玻连蛋白、纤连蛋白和纤维蛋白原上的粘附作用，其抑制作用达30％，而1.4kDa-肽没有任何显著的作用(图2)。
2)AMEP抑制内皮细胞的迁移图3显示了在我们的迁移模型中，与对照(不存在该结构域A、B)相比，在添加5微克/毫升(C、D)和10微克/毫升(E、F)AMEP后内皮细胞的情况。在AMEP存在下，观察到内皮细胞形态的变化非常明显这些内皮细胞形成了长的伪足，细胞彼此间的粘附作用改变了，许多细胞也分离了(10微克/毫升)。这种现象在细胞迁移前沿(D、F)更加可见。AMEP对这些细胞迁移速度的影响是与剂量相关的(2-10微克/毫升)，在10微克/毫升时，这些细胞的迁移完全被抑制(图4)，1.4kDa-肽(1微克/毫升)则相反，它没有任何的抑制作用。
3)AMEP对细胞增殖的影响与该12个氨基酸的片段(1.4kDa-肽)——它对内皮细胞的增殖没有任何影响，不管其使用浓度(1-100微克/毫升，未示出)如何)——相反，AMEP从2微克/毫升起就显著地抑制它们的增殖作用(降低40％)(图5)。这个作用在5微克/毫升是最大的，并且其增殖作用抑制达到60％(在10微克/毫升下有相同的百分数)。应指出，在免疫印迹法中预先使用的针对AMEP的兔多克隆血清(Néosystem，法国)可比较地抑制所述细胞的增殖作用(65±0.1％)。
为了分析AMEP作用的特异性，我们曾研究了在下述细胞表面上有或没有整联蛋白αvβ3时，AMEP对大血管或微血管原始内皮细胞增殖作用的影响，以及对已知癌细胞增殖作用的影响，其中一个已知的靶为AMEP。在下面表1中列出的这些结果表明，AMEP可比较地抑制不同型的内皮细胞，而对各种不同源的癌细胞(成纤维细胞、乳房、结肠)增殖作用没有任何影响，它们在其表面上有一点或没有整联蛋白αvβ3(分别是MDA MB 231、C51、3T3)。有利地，根据表达整联蛋白αvβ3的细胞增殖作用，观察到AMEP的重要抑制作用。
表1
表1涉及AMEP对内皮细胞和癌细胞增殖的影响。这些实验重复五次(平均值±SEM)。列出的数字表示，与在相同条件下进行的对照实验(没有AMEP)相比，使用5微克/毫升AMEP对所列细胞增殖抑制的百分数。
4)证明AMEP对内皮细胞的促凋亡活性使用了两种能够测定凋亡细胞百分数的技术。其中一种技术使用Hoechst 33342，它能够保持活细胞，因此能够观察细胞周期的不同期。使用膜联蛋白-V的技术能够测定内皮细胞的早期凋亡(观察其表面上的磷脂酰丝氨酸)。这些方法得到的结果是相近的，即在AMEP存在下凋亡细胞百分数是对照的3倍(下面表2)。相反，与诱导凋亡的大多数分子不同，在AMEP存在下(未示出)使用Hoechst 33342时，没有证明细胞周期有任何改变。
表2
表2涉及凋亡的细胞百分数。根据在材料与方法中描述的两种方法进行流式细胞仪(FACS)分析。这些实验进行三次。平均值±SEM。
5)在纤维蛋白凝胶的两种血管生成模型中AMEP抑制毛细血管结构形成微血管的内皮细胞比较适合于研究血管生成，这就是为什么我们使用HMEC-1的原因(Nehls和Herrmann，1995)。这些细胞在珠上培养，然后加入纤维蛋白凝胶中(图6，对照A、B)。在培养三天后观察到AMEP(5微克/毫升)对毛细血管结构形成的抑制作用(C)，在10天后变得很惊人，管的尺寸降低90％(D)。前面的研究针对确定使用CPAE作为内皮细胞时AMEP对血管生成不同阶段的影响，因此，我们想证实这个结构域对另一种血管生成模型的影响。这些细胞仅能在使用珠的模型中使用，因为它们的形态不发生适应改变；CPAE的聚集是唯一的研究AMEP对体外血管生成的影响的办法。在纤维蛋白凝胶中加入聚集物后24小时出现了这些毛细血管结构。图7汇集了在培养3天后拍摄的照片。与对照(A、D)相比，添加5微克/毫升(B)或10微克/毫升(C、E)AMEP可诱导毛细血管结构解体，导致内皮细胞死亡(未示出)。在对照条件下，一直培养到6天都能观察到这些结构的长度增加(未示出)。
6)AMEP对裸鼠上肿瘤生长与肿瘤血管生成的抑制作用在鼠肌肉中，在电转AMEP的编码基因，接着用强力霉素诱导其表达后，在裸鼠中产生了AMEP。
如图8所表明的，AMEP组的肿瘤体积明显地低于对照组，在处理14天后观察的抑制作用达到78％。在处理仅7天后观察到类似的抑制百分数。使用这些同一肿瘤的切片量化了肿瘤内的血管生成。下面表3列出的结果表明，AMEP对肿瘤生长的强抑制作用是与在用AMEP处理的肿瘤内血管数受到显著抑制(53.4％)相关的。
这些结果表明，AMEP在体内在未表达整联蛋白αvβ3的肿瘤模型中起很强的作用。
下面表3示出肿瘤血管化的统计指数，其指数是用表达或未表达AMEP的鼠的代表性肿瘤切片样品，通过数字化与计算机图像分析处理后得到的。
表3
7)AMEP抑制同源鼠的肿瘤转移形成用强力霉素诱导在C57B1/6鼠的肌肉中产生AMEP。在用AMEP处理的鼠组中观察到，与对照组相比，处理7天后肿瘤转移数抑制作用异乎寻常地达到74.2％(图9、10)。
III-讨论在血管生成的过程中，内皮细胞被激活，它们获得了血管生成的表型。它们这时在其表面具有整联蛋白αvβ3和Metargidin(在来自成熟血管的内皮细胞上未检测的分子)(Herren等，1997)。
得到的全部结果表明，AMEP具有的抗血管生成活性远大于1.4kDa-肽具有的活性。如果AMEP与1.4kDa-肽都具有在内皮细胞与整联蛋白αvβ3结合中涉及的RGD序列，可以认为AMEP的作用不限于阻断整联蛋白αvβ3的功能。AMEP似乎具有在细胞水平上可能与信号作用改变相关的独有活性(通过整联蛋白αvβ3和/或通过Metargidin传送的信息)。
细胞粘附作用是一种在细胞迁移中涉及的现象；但是，我们认为抑制粘附作用不是构成抑制内皮细胞迁移原因的唯一机制因此，10微克/毫升AMEP足以完全阻断内皮细胞的迁移，而对于这个同样的浓度，AMEP对粘附的抑制作用只是部分的。
AMEP对血管生成关键阶段的这种异乎寻常的抑制活性被其抗增殖作用增强(直到60％抑制内皮细胞增殖)。有意义地，AMEP诱导抑制内皮细胞增殖与可检测的细胞周期变化无关联。
在血管生成的最后阶段时，这些细胞构成管，这些管吻合有可能形成血管腔。我们根据在材料中描述的两种技术，使用微血管内皮细胞(HMEC-1)和大血管内皮细胞(CPAE)在体外再次产生这种现象。值得注意的是，在AMEP存在下，在使用HMEC-1的模型中，观察到毛细血管结构形成的总抑制作用。与直到现在我们所观察到使用其它的血管生成抑制剂相反，AMEP诱导早期预先形成(12h)的CPAE管的致死性解体。事实上，CPAE的增殖和迁移速度比HMEC-1高得多(未示出)，这样能够解释AMEP对两种血管生成模型影响的双重性。
这些研究工作还表明，在体内，AMEP抑制肿瘤血管生成导致异乎寻常的抑制肿瘤生长，甚至对还未表达整联蛋白αvβ3的已知肿瘤也如此。另外，证明了在肺转移模型中AMEP的显著的抗迁移作用。
最后，用10微克/毫升AMEP处理内皮细胞可诱导能用相差显微镜可观察死亡内皮细胞数的增加(漂浮在培养培养基中)(图3)。但是，这种产品对凋亡的作用(对还存活细胞可计量的现象)是适度的(被因子3增强)。因此，AMEP具有的特点是强抗血管生成作用与由新近以Anoikis名称描述的现象(Frisch，2000年；Zhu等，2001年)诱导细胞死亡相关联。
因此，AMEP的独到之处在于具有抑制血管生成的所有阶段的能力，其中包括内皮细胞的迁移与增殖，这样不同于直到现在已发现的其它分子(参见血管抑素，抑制内皮细胞的增殖，O′Reilly等，1994年；Wu等，1997年；Sim等，1997年)，或也抑制它们的增殖以及它们迁移的内皮抑素(endostatin)，后者只是当用例如VEGF或bFGF之类的血管生成因子诱导其迁移时才如此(O′Reilly等，1997年；Sim等，2000年；Yamaguchi等，1999年)。此外，在体外AMEP分别对迁移与血管生成的影响是惊人的完全停止内皮细胞迁移，也没有毛细血管结构形成。
出乎意料地，在细菌中合成的重组蛋白质形式的AMEP对所描述的整个体外实验的强抑制作用，可用在哺乳动物中重新合成的AMEP在体内得到的结果加以证实。有利地，AMEP对无胸腺模型中肿瘤生长的抑制作用是与在体外血管生成的所有阶段的肿瘤内血管数降低(即AMEP抑制的直接结果)相关的。此外，AMEP对使用黑素瘤细胞的肿瘤转移形成的抗侵入作用是与AMEP对在体外这些同样细胞的特别抗增殖作用相关的。
参考文献目录Brooks，P.C.，Clark，R.A.和Cheresh，D.A.(1994)，血管生成的血管整联蛋白αvβ3要求，Science 264，569-571。
Eliceiri，B.P.，Llemke，R.，Stromblad，S.等(1988)，在血管生成期间，持续的促细胞裂解剂-激活蛋白激酶活性的整联蛋白αvβ3要求，140，1255-1263。
Eliceiri，B.P.，和Cheresh，A.(2000)，在血管生成期间αv整联蛋白的作用，Cancer J.6(suppl3)，S245-S249。
Folkman，J.(1984)，血管生成中内皮细胞作用是什么？Lab.Invest.51，601-604。
Hammes，H.P.，Brownlee，M.，Jonczyk，A.等(1996)，皮下注入玻连蛋白受体-型整联蛋白的环肽拮抗剂抑制视网膜的新血管化作用，Nat Med 2，529-533。
Frisch SM.(2000)，Anoikis.Methods Enzymol.322，472-479。
Herren，B.，Raines，E.和Ross，R.(1997)，在培养的人血管细胞中与在体内解离素样的蛋白质表达，FASEB J.，11，173-180。
Howard，L.，Nelson，K.K.，Maciewicz，R.A.和Blobel，C.(1999)，金属蛋白酶解离素MCD9和MCD15与含有两个SH3结构域的蛋白质、endophilinI和SH3PX1的相互作用，J.Biol.Chem.274，31693-31699。
Jaffer，E.A.，Hoyer，L.W.和Nachman，R.L.(1973)，采用培养的人内皮细胞合成抗血友病的因子抗原，J.Clin.Invest.52 2757-2764。
Kang，I-C.，Lee，Y-D和Kim，D-S.(1999)，新的解离素salmosin抑制肿瘤血管生成，Cancer research，59，3754-3760。
Kostetsky，P.V.，和Artemjev，I.V.(2000)，含有生物活性RGD的抗粘附肽环(ArgGlyAspPhe-D-val)的构象分析，Biochemistry，65，1041-1048。
Klein，S.，Glancotti，F.，Presta，.，Albelda，S.，Buck，C.A.h和Rifkin，D.B.(1993)，基本成纤维细胞生长因子调节在微血管内皮细胞中整联蛋白的表达，Mol.Biol.Cell，4，973-982。
Krtschmar，J.，Lum，L和Blobel，C.(1996)，Metargidin，一种膜-挂接金属蛋白酶-有结合RGD整联蛋白序列的解离素蛋白质，J.Biol.Chem.271，4593-4596。
Mir，L.M.，Bureau，MF.，Gehl，J.，Rangara，R.，Rouy，D.，Caillaud，JM.，Delaere，P.，Branellec，D.，Schwartz，B.和Scherman，D.(1999)，高-效基因转移到用电脉冲调节的骨骼肌中，Prc.Natl.Acad.Sci.USA，96，4262-4267。
Nehls，V.和Herrmann，R.(1995)，纤维蛋白凝块构型决定毛细血管形态和内皮细胞迁移，Microvasc.Res.50，311-322。
O′Reilly，M.S.，Holmgren，L.，Shing，Y.，Chen，C.，Rosentahl，R.A.，Moses，M.，Lane，W.S.，Cao，Y.，Sage，E.H.和Folkman，J.(1994)，血管抑素，一种新的血管生成抑制剂，它通过Lewis肺肿瘤调节抑制转移，Cell，79，315-328。
O′Reilly，M.S.，Boehm，T.，Shing，Y，Fukai，N.，Vasios，G.，Lane，W.S.，Flynn，E.，Birkhead，J.R.，Olsen，B.R.和Folkman，J.(1997)，内皮抑素内皮细胞与肿瘤生长的内源抑制剂。Cell 88，277-285。
Pepper，M.S.，Montesano，R.，Vassali，J.D.和Orli，L.(1991)，软骨细胞抑制在体外内皮细胞芽(sprout)的形成涉及转化β生长因子的证据，J.Cell.Physiol.146，170-179。
Primakoff，P.和Myles，D.G.(2000)，有粘附性和蛋白酶活性的ADAM基因组表面蛋白质，TIG 16，83-87。
Sim，B.K.，O′Reilly，M.S.，Liang，H.，Fortier，A.H.，He，W.，Madsen，J.W.，Lapcevich，R.和Nacy，C.A.(1997)，一种重组人血管生成原蛋白质抑制实验原始和转移的癌，Cancer Res.57，1329-1334。
Smith，D.S.和Johnson，K.S.(1988)，与谷胱甘肽S-转移酶融合时，单步骤纯化在大肠杆菌中表达的多肽，Gene 67 31-40。
Sim，B.K.，MacNonald，N.J.和Gubish，E.R.(2000)，血管抑素和内皮抑素肿瘤生长的内源抑制剂，Cancer Metastasis Rev.19，181-190。
Wolfsberg，T.，Primakoff，P.，Myles，D.G.和White J.M.ADAM(1995)，新一组含有解离素和金属蛋白酶结构域的膜蛋白质在细胞-细胞和细胞-基质相互作用中的多能功能，J.Cell.Biol.131，275-278。
Wu，Z.，O′Reilly，Folkman，和Shing，Y(1997)，用重组鼠的血管抑素抑制肿瘤生长。Biochem.Biophys.Res.Commun.236，651-654。
Yamaguchi，N.，Anand-Apte，B.，Lee，M.，Sasaki，T.，Fukai，N.，Shapiro，R.，Que，T.，Lowik，C.，Timpl，R.和Olsen，B.R.(1999)，内皮抑素抑制VEGF-诱导的内皮细胞迁移和肿瘤生长，与锌的结合无关，EMBO J.18，4414-4423。
Yeh，CH.，Peng，H-C.，Huang，T-F(1998)，抗黏着蛇毒蛋白(accutin)，一种新的解离素，通过以整联蛋白αvβ3拮抗剂起作用和诱导apoptosis抑制在体外与在体内的血管生成，Blood，92，3268-3276。
Zhang，X-P，Kamata，T.，Yokoyama，K.，McLaughlin，W.，Takada，Y.(1998)，MDC-15重组解离素样的结构域(metargitin，ADAM-15)与整联蛋白αvβ3特异性相互作用，J.Biol.Chem.273，7345-7350。
Zhu，Z，Sanchez-Sweatman O，Huang X，Wiltrout R，Khokha R，Zhao Q，Gorelik E.(2001)，cloudman S91黑素瘤细胞的anoikis和转移可能性。Cancer Res.61，1707-1716。
序列表<110>国家健康与医学研究院<120>Adamalysin的解离素结构域在抗血管生成、抗侵入和抗转移组合物中的应用<130>18723PCT<140>PCT/FR02/02691<141>2002-07-26<150>FR01/10015<151>2001-07-26<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>276<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(1)..(276)<223>Metargidin的解离素结构域的编码序列<400>1atg gct gct ttc tgc gga aat atg ttt gtg gag ccg ggc gag cag tgt48Met Ala Ala Phe Cys Gly Asn Met Phe Val Glu Pro Gly Glu Gln Cys1 5 10 15gac tgt ggc ttc ctg gat gac tgc gtc gat ccc tgc tgt gat tct ttg96Asp Cys Gly Phe Leu Asp Asp Cys Val Asp Pro Cys Cys Asp Ser Leu20 25 30acc tgc cag ctg agg cca ggt gca cag tgt gca tct gac gga ccc tgt144Thr Cys Gln Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Ser Asp Gly Pro Cys35 40 45tgt caa aat tgc cag ctg cgc ccg tct ggc tgg cag tgt cgt cct acc192Cys Gln Asn Cys Gln Leu Arg Pro Ser Gly Trp Gln Cys Arg Pro Thr50 55 60aga ggg gat tgt gac ttg cct gaa ttc tgc cca gga gac agc tcc cag240Arg Gly Asp Cys Asp Leu Pro Glu Phe Cys Pro Gly Asp Ser Ser Gln65 70 75 80tgt ccc cct gat gtc agc cta ggg gat ggc gag taa276Cys Pro Pro Asp Val Ser Leu Gly Asp Gly Glu85 90<210>2<211>91<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Ala Phe Cys Gly Asn Met Phe Val Glu Pro Gly Glu Gln Cys1 5 10 15Asp Cys Gly Phe Leu Asp Asp Cys Val Asp Pro Cys Cys Asp Ser Leu
20 25 30Thr Cys Gln Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Ser Asp Gly Pro Cys35 40 45Cys Gln Asn Cys Gln Leu Arg Pro Ser Gly Trp Gln Cys Arg Pro Thr50 55 60Arg Gly Asp Cys Asp Leu Pro Glu Phe Cys Pro Gly Asp Ser Ser Gln65 70 75 80Cys Pro Pro Asp Val Ser Leu Gly Asp Gly Glu85 90
权利要求
1.一种活性剂在制备抑制血管生成或侵入和/或转移形成的药物中的应用，所述的活性剂选自一种蛋白物质或核酸分子，所述的蛋白物质包含Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物、或由Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物组成，所述的核酸分子包含编码Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物的多核苷酸序列、或由编码Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物的多核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的Adamalysin是Metargidin。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的蛋白物质包含Metargidin的全部或部分解离素结构域或其衍生物、或由Metargidin的全部或部分解离素结构域或其衍生物组成，该结构域的氨基酸序列如SEQID NO2所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的核酸分子包含编码Metargidin的全部或部分解离素结构域的多核苷酸序列或其互补序列或衍生物、或由编码Metargidin的全部或部分解离素结构域的多核苷酸序列或其互补序列或衍生物组成，编码该结构域的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的核酸分子是一种载体或是与一种表达载体结合。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述的核酸分子存在于用所述分子转化的细胞中，以便在体内表达所述的全部或部分解离素结构域。
7.根据上述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于所述的药物用于治疗和/或预防癌症、转移过程、炎症、牛皮癣、动脉硬化症或黄斑变性。
全文摘要
本发明涉及一种活性剂在制备抑制血管生成或侵入和/或转移形成的药物中的应用，所述的活性剂选自一种蛋白物质或核酸分子，所述的蛋白物质包含Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物、或由Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物组成，所述的核酸分子包含编码Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物的多核苷酸序列或由编码Adamalysin的全部或部分解离素结构域或其衍生物的多核苷酸序列组成。优选地，所述的Adamalysin是Metargidin。
文档编号A61K48/00GK1535156SQ02814760
公开日2004年10月6日 申请日期2002年7月26日 优先权日2001年7月26日
发明者韦罗妮克·特罗雄, 韦罗妮克 特罗雄, 娜 索里亚, 陆核, 克洛迪娜·索里亚 申请人:国家健康与医学研究院