专利名称：一种新的蚯蚓纤溶酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及从蚯蚓提取一种新的纤溶酶，并且涉及这种纤溶酶的制备方法，含有这种纤溶酶的组合物，以及这种纤溶酶在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的用途。
目前，由于各种原因引起的血液栓塞疾病，如脑血栓、心肌梗塞，冠心病，肢体血管栓塞等的发病率呈上升趋势；仅我国每年用于防治和康复等方面的费用高达数千亿元人民币，此类疾病严重危害了患者的生存质量，增加了患者家庭及社会的负担。因而，针对此类疾病的临床用药的研究开发也进展迅速；临床上较为常用的治疗方法为突击性溶栓疗法，常见的药物为尿激酶、降纤酶等。此类药物必须在患者发病后六小时内用药，通过快速溶栓，避免因缺血造成的不可逆性的半暗带死亡，从而不给患者留下后遗症。这就要求溶栓药物具有高效的溶解血栓的作用，同时无毒副作用。
目前，国内上市或在研的溶栓药物很多从原料来源上，可分为四类(1)基因重组产品如重组链激酶、重组水蛭素、t-PA等。
(2)生物工程产品如葡激酶、纳豆激酶等。
(3)生化药品如尿激酶、降纤酶、蛇毒纤溶酶、蚓激酶等。
其中，基因重组产品多为胞内蛋白，分泌型表达系统甚少，因而其菌体分离、破壁、复性等工序设备成本较高。另外，按新生物制品规程要求，其临床前材料准备的工作量大，耗时过长。
微生物发酶生产的溶栓酶类，此类新药多属再研阶段，资金投入有限，发展滞后于生化药品，如纳豆激酶虽然比活较高，但活性构象不稳定，常温下易失活，不适合作为药剂使用。其它枯草杆菌、根霉的纤溶酶研发正在进行，品质尚待验证。
我国上市的溶栓类生化药物，主要为蛇毒降纤酶、尿激酶等，品质上都存在着不足，降纤酶只在体内激活人体纤溶系统，不直接溶栓。尿激酶制剂中存在二聚体，易导致过敏反应。
近年来，关于蚯蚓纤溶酶的研究与开发十分活跃。蚯蚓纤溶酶的同功酶多达十余种，分子量、等电点差异不大，批量制备单组分制剂较为困难。
本发明的目的是提供一种蚯蚓纤溶酶一种特殊的同工酶的分离方法。利用该方法可以从赤子爱胜蚓(产地中国，Eisenia felida)分离到一种分子量在21千道尔顿(KD)左右的一种新的纯的纤溶酶，它与其它组分分子量差异较大，易于纯化和批量制备，并且活性好、比活高、无毒性；分子量小、抗原反应低，是较为理想的蚯蚓纤溶酶单组分制剂原料，是理想的溶栓药物。
因此，本发明的另一个目的是提供一种来自赤子爱胜蚓的分子量是21KD的单一组分的纤溶酶。
本发明的再一个目的是提供含有所述纤溶酶的溶栓药物组合物。
本发明的再一个目的是提供所述纤溶酶在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的用途。
本发明的蚯蚓纤溶酶比活较高，且活性稳定，4℃下保存2年不变，水溶液常温下放置2年活性只降低5％。多组份制剂经数年上万个病例，无过敏反应发生。上述验证说明，蚯蚓纤溶酶在比活、活力稳定性及低抗原性等方面能达到作为临床抗栓药物的品质要求，在解决了批量提取单组分的技术问题，该酶单组份制剂极有希望获得临床批件。
本发明的目的是这样实现的用无毒盐优选氯化钠洗净蚯蚓，将洗净的蚯蚓磨碎，离心，取上清液进行亲和层析之后进行分子筛层析，最后进行离子交换层析，收取高丰度蛋白峰。
优选地，本发明所用亲和层析的亲和胶是用胰蛋白酶抑制剂偶联的CNBr活化琼脂糖。
优选地，本发明所用分子筛层析柱是Sephacryl S-100。
优选地，本发明所用离子交换层析柱是Sepharose Fast Flow离子交换柱。
本发明的优点在于通过不同的纯化方法的特定组合，使赤子爱胜蚓的21KD纤溶酶组分的分子量与其它组分的分子量差异拉大，丰度集中，易于分离，并且该方法适合商业化生产。本发明的优点还在于前处理采取水-醇提取、分段醇沉。免除了水提法所需高速离心工序，大幅度降低设备投入。分离纯化采用特异性高的配基进行亲合层析。采用疏水层析法免除了透析、除盐工序。
实施例下面通过实施例详细说明本发明，但是这些实施例不在任何方面限制本发明的范围。
实施例1赤子爱胜蚓21KD纤溶酶单一组分的制备材料赤子爱胜蚓(产地中国)制备1、前处理将100克蚯蚓洗净，加蚯蚓重的10％的NaCl，放置10分钟，再洗净。
2、磨碎离心处理过的蚯蚓加等重45％乙醇，用胶体磨磨碎，上清加无水乙醇至乙醇浓度达80％，室温静置过夜，弃去上清，沉淀用pH7.6，0.02MPBS溶解，放置24小时，3000rpm离心30min，取上清液。
3、亲和层析亲合胶用胰蛋白酶抑制剂偶联的CNBr活化琼脂糖(市售)。
层析上述离心的上清液，上亲合层析柱，用pH11的NH4OH解离，解离物倒入透析袋中对生理盐水透析24小时。
4、分子筛层析将透析后的液体用聚乙二醇2万浓缩至袋内液体体积15-20ml，上用生理盐水平衡的Sephacryl S-100(高100cmφ2.5cm)柱(市售)，收集丰度较高的蛋白峰，对pH8.2 0.02MTris-HCl缓冲液透析除盐。
5、离子交换层析
透析后的液体上经上述缓冲液平衡的Sepharose Fast Flow离子交换柱(市售)，用含0.7MNaCl的缓冲液梯度洗脱(0-0.2mol/L)，收集丰度较高的蛋白峰。
6、电泳透析后液体做电泳，使用SDS-PAGE，胶浓度是15％。结果为一条蛋白带，分子量为21KD，具有纤溶活性。此为本发明的纤溶酶。
7、等电点通过等电聚焦电泳试验结果证明该纤溶酶的等电点的pI是大约3.8。
实施例2本发明纤溶酶生物活性的测定纤溶酶生物活性的测定方法是本领域技术人员公知的。参照中华人民共和国卫生部颁标准，“蚓激酶胶囊质量标准”中的“琼脂糖-人血纤维蛋白平板法”，分别加热(60℃，30分钟；80℃，30分钟)和不加热处理，制成加热平板和普通平板，用微量移液管取本发明纤溶酶30微克，加入平板的孔中，37℃下保温6小时，测溶圈面积。测得本发明纤溶酶比活是160000毫克/厘米2，表明本发明的纤溶酶具有较高的溶栓活性。
实施例3本发明纤溶酶热稳定性的测定将本发明纤溶酶分别制备成pH4 0.02MTris-HCl的溶液和水溶液，分别在4℃，15℃，25℃，35℃，45℃，55℃，60℃，70℃下保温1小时，并且分别将其中两个样品在4℃和常温(25℃)常压下长期放置。调整温度至35℃，测定酶活性。结果表明本发明纤溶酶在60℃以下稳定。4℃下保存2年不变，水溶液常温下放置2年活性只降低5％。
实施例4含有本发明纤溶酶的药物组合物的制备取本发明纤溶酶50微克，溶解于5毫升蒸馏水中。密封，常温下放置。
权利要求
1.一种来自赤子爱胜蚓的分子量是21KD的单一组分的纤溶酶。
2.权利要求1的纤溶酶的制备方法，特征在于用无毒盐洗净蚯蚓，将洗净的蚯蚓磨碎，离心，取上清液进行亲和层析之后进行分子筛层析，最后进行离子交换层析，收取高丰度蛋白峰。
3.权利要求2的纤溶酶的制备方法，特征在于所述亲和层析的亲和胶是用胰蛋白酶抑制剂偶联的CNBr活化琼脂糖。
4.权利要求2的纤溶酶的制备方法，特征在于所述分子筛层析柱是Sephacryl S-100。
5.权利要求2的纤溶酶的制备方法，特征在于所述离子交换层析柱是Sepharose Fast Flow离子交换柱。
6.含有权利要求1的纤溶酶的溶栓药物组合物。
7.权利要求1的纤溶酶在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及从蚯蚓提取一种新的分子量大约是21KD的纤溶酶，并且涉及这种纤溶酶的制备方法，含有这种纤溶酶的组合物，以及这种纤溶酶在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的用途。
文档编号A61K38/48GK1537938SQ03121950
公开日2004年10月20日 申请日期2003年4月18日 优先权日2003年4月18日
发明者陶曙光, 郑万强 申请人:陶曙光, 郑万强