专利名称：肿瘤坏死因子受体－免疫球蛋白的融合蛋白用于急性肺损伤药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域，更具体地涉及肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白的融合蛋白(简称为“TNFR-Ig融合蛋白”)在治疗急性肺损伤方面的用途。
背景技术：
自从严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS)发生以后，曾波及全球30多个国家，总发病人数已经超过7500人，死亡超过600人。SARS具有强烈的传染性，可迅速向周边地区播散和暴发流行，死亡率可高达到14％-15％，影响了世界各国的政治和经济的发展。
SARS是一种新的病原物，致死率高，传染性强。对其流行病学、病原学、免疫学等方面的了解还非常有限，临床治疗还没有确切有效的药物，疫苗的开发还刚刚起步。因此，WHO和各国科学家均认为，这种状况显然还要持续相当长一段时间，并且不排除再次爆发的可能性。因此，研制SARS防治药物，特别是能够有效降低死亡率的药物，已成为全球关注的焦点。
大部分SARS感染者病情恶化后会表现出急性呼吸困难综合症(ARDS，Acute Respiratory Distress Syndrome)和急性肺损伤(ALI，Acute Lung Injury)，一些重症的患者还会出现休克或多器官功能障碍综合征(MODS)。正是这些肺部的急性病变和严重损伤导致了SARS患者的最终死亡。
因此，本领域迫切需要开发新的有效治疗急性肺损伤的药物。
肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α)是机体内的一种多功能免疫调节分子，它可以和细胞膜上的受体结合发挥作用，往往引起靶细胞的死亡或招引免疫效应细胞在局部的聚集，参与多种生理、病理与免疫过程。
对TNF受体(TNF receptor，TNFR)的研究表明，有I型、II型两种肿瘤坏死因子受体，均为I型跨膜糖蛋白。其中以II型分布更为广泛，与肿瘤坏死因子的亲和力更强。两种受体虽然需位于细胞膜上才可以发挥向细胞内传递信号的功能，但仍有部分从细胞表面脱落至体液内，称为可溶性受体。进一步的研究表明，这种可溶性的受体可以中和TNF，在体内对TNF的活性起负调节作用。
TNFR-Ig融合蛋白是将基因工程和免疫学技术相结合，利用受体-免疫球蛋白融合技术(又称“免疫粘附”技术(Immunoadhesion Technology))，生产出重组人II型TNFR-Ig融合蛋白。其原理是利用基因工程技术，将受体的细胞外区与免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)的Fc段基因融合，在体外表达出相应的融合蛋白。
然而，迄今为止尚没有将TNFR-Ig融合蛋白用于治疗急性肺损伤的报道。
发明内容
本发明的目的就是一种有效治疗急性肺损伤的药物，所述药物的活性成分是TNFR-Ig融合蛋白。
在本发明的第一方面，提供了一种肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白的融合蛋白的用途，用于制备治疗急性肺损伤的药物。
在一优选例中，所述的急性肺损伤是由SARS冠状病毒感染引起的。
在另一优选例中，所述药物中TNFR-Ig融合蛋白的重量含量为1-99％。
在另一优选例中，所述的TNFR-Ig融合蛋白的N-末端的235个氨基酸残基为人II型肿瘤坏死因子受体细胞外段的序列，其C-末端的232个氨基酸残基为人免疫球蛋白γ1链的可结晶片段序列。
在另一优选例中，所述药物的给药途径是静脉注射或静脉滴注。
在另一优选例中，所述药物的给药剂量是每天0.1-3mg TNFR-Ig融合蛋白/千克体重。更佳地，所述药物的给药剂量是每天0.5-2mg TNFR-Ig融合蛋白/千克体重。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究发现，TNFR-Ig融合蛋白可以非常有效地治疗急性肺损伤，在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“TNFR-Ig融合蛋白”指由肿瘤坏死因子受体的细胞外段与免疫球蛋白的Fc片段所形成的融合蛋白。优选的TNFR是II型肿瘤坏死因子受体。此外，在TNFR和Ig部分之间宜具有长度为10-30个氨基酸的肽接头。
TNFR-Ig融合蛋白的制法和结构是已知，例如美国Immunex公司产品EnbrelTM就是一种人II型TNFR-Ig融合蛋白，其N-末端的235个氨基酸残基为人II型肿瘤坏死因子受体细胞外段的序列；其C-末端的232个氨基酸残基为人免疫球蛋白γ1链的可结晶片段序列(IgG1 Fc)，对于TNFR-Ig融合蛋白的制备方法，可参见中国专利申请01132074.5(2001年10月31日申请，申请人上海中信国健药业有限公司)。
将TNFR-Ig融合蛋白配制成药物的技术、方法、某些适应症都是本领域中已知的。例如，在本领域中，TNFR-Ig融合蛋白已用于治疗类风湿性关节炎。
如本文所用，术语“本发明的药物组合物”指用于治疗急性肺损伤的，含有TNFR-Ig融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物。
在使用药物组合物时，是将安全有效量的TNFR-Ig融合蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)静脉滴注、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
TNFR-Ig融合蛋白可有效治疗急性肺损伤的机理可能如下所述。然而，应理解，本发明的范围并不受该治疗机理的限制。
通过对TNF-α与胸肺良恶性疾病关系研究证明，TNF与胸肺良恶性疾病的发生、发展均有一定关系。研究已表明，肺泡巨噬细胞可产生TNF，TNF与胸肺疾病的发生、发展有着较为密切的关系。在另一方面，TNF对其他继发性细胞因子的释放有重要作用。当各种TNF作用过重过久，肺毛细血管内皮细胞、肺间质和肺泡上皮细胞严重损害，最终产生ARDS。调控体内TNF的水平对肺损伤的防治有重要作用。SARS最终将导致患者肺部急性损伤，而正是TNF-α在人体内水平的异常升高直接引发了肺部的炎症。因此，如果能减低SARS患者免疫系统的反应和降低对肺部造成的损伤，降低SARS患者体内的TNF-α水平到正常的幅度，将能正确处理以及有效治疗和缓解ARDS和ALI的肺部损伤症状程度，同时又能最大程度地减少治疗药物可能对患者产生的副作用，这将对SARS的治疗大有裨益，有助于提高治疗效果，降低SARS患者死亡率。
TNFR-Ig融合蛋白作为一种半衰期长的能够结合TNF的物质，在体内可以与细胞表面上的TNFR竞争性地结合周围的TNF，从而减少结合于细胞上TNFR的TNF的数目，从而减少或消除由TNF所引发的炎症反应，从而有效抑制由SARS等因素导致的急性肺损伤。
本发明的试验结果已表明，TNFR-Ig融合蛋白可非常有效地治疗急性肺损伤。此外，通过有效中和体内过高的TNF，可大大缓解SARS的临床病症，因此，应用重组人II型TNFR-Ig融合蛋白来治疗SARS，对SARS的治疗大有裨益，有助于提高治疗效果，降低SARS患者死亡率。因此本发明的药物组合物是一种有效降低SARS死亡率的药物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1临床前药效学研究本实施例中使用的TNFR-Ig融合蛋白(也称为“rh-TNFRFc”)，其N-末端的235个氨基酸残基为人II型肿瘤坏死因子受体细胞外段的序列；其C-末端的232个氨基酸残基为人免疫球蛋白γ1链的可结晶片段序列(IgG1 Fc)。本制品是采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)无血清连续灌注发酵技术生产，经超滤浓缩、多步层析法纯化后获得纯化的蛋白，最终冻干为临床研究用制剂(参见CN01132074.5)。本品与美国Immunex公司产品EnbrelTM具有相同的分子结构和体外活性、免疫反应性。
本制品为冻干粉针剂，每支含12.5mg TNFR-Ig融合蛋白。应避光保存于2～8℃，避免潮湿。使用前用1毫升含无菌注射用水溶解，用法为静脉滴注。
(a)急性肺损伤试验对rh-TNFRFc进行临床前药效学研究。使用内毒素来诱导大鼠，使之产生急性肺损伤症状，然后用rh-TNFRFc融合蛋白静脉注射大鼠。
结果表明，在本试验中，该药物最低在1mg/kg体重时可产生明显的药效作用。
(b)小鼠注射致死剂量TNF-α和TNFR-Ig融合蛋白的试验在本试验中，通过小鼠注射致死剂量TNF-α模型，研究了皮下注射TNFRFc的体内中和TNFα的情况。
结果显示，给予小鼠腹腔注射重组人TNF-α(R&D systems)1μg/只，小鼠均在24h内死亡(20/20)。而24h前皮下注射rhTNFRFc融合蛋白(50μg/只)组小鼠则无动物死亡(0/20)。该结果证明，rhTNFRFc融合蛋白确实可在体内起到中和TNF-α的作用，且该药物经皮下注射后，至少24h后仍有药理作用。另外两组动物TNF-α给药剂量提高至2μg，结果rhTNFRFc组动物死亡8只(存活率60％)，EnbrelTM组动物死亡7只(存活率65％)；经χ2检验，两组动物存活率无显著差异。
综上所述，静脉注射TNFR-Ig融合蛋白可对内毒素诱导的大鼠急性肺损伤起到防治作用，其作用与剂量呈正相关。
实施例2安全性检测利用猫对中试产品进行的一般药理学研究表明，皮下注射4mg/kg或12mg/kg的TNFR-Ig融合蛋白，动物在接下来的6小时内呼吸、血压、心律、心率、心电图方面无明显改变。应用Irwin行为分级法、爬杆法、开阔法、倾斜法等四种方法，观察皮下注射rh-TNFRFc20mg/kg及40mg/kg对小鼠精神神经系统的影响。
结果TNFR-Ig融合蛋白与赋形剂阴性对照组无显著差别。说明使用本发明的方法进行急性肺损伤治疗是安全的。
实施例3药物动力学试验委托国家上海新药安全评价研究中心，利用大鼠进行了TNFR-Ig融合蛋白(包括CN01132074.5中的TNFR-Ig融合蛋白和EnbrelTM)的药物动力学比较研究。皮下给予大鼠3mg/kg本药或EnbrelTM，于给药后不同时间采血，然后利用夹心ELISA检测了大鼠血清中的药物浓度进行分析。
结果提示，CN01132074.5中TNFR-Ig融合蛋白与EnbrelTM在药时曲线下面积、半衰期、峰值浓度等指标上均无显著差异，两者药时曲线接近重合。该结果说明，本品在药物动力学性质上与Enbrel十分接近。
给予小鼠一次性静脉注射160mg/kg(推荐临床应用剂量的400倍)的研究药物，在14天的观察期内，全部动物存活且体重增加，无异常毒性反应现象。
实施例4长期毒性试验此外，用恒河猴进行了本品的4周长期毒性试验，以观察恒河猴皮下注射rh-TNFRFc 4周后对机体产生的毒性反应及其严重程度，提供毒性反应的靶器官及其损害的可逆性，确定无毒性反应的剂量，为拟定人用安全剂量提供参考。
结果显示，在给予剂量分别为0、1、5和15mg/kg，每周注射2次，连续注射4周，动物的一般征状、血液学和血清生化指标、尿液分析、心电图和病理检查等均未发现有明显异常，仅见给药2周后部分动物血清中抗体产生。上述结果与美国FDA公布的关于ENBRELTM的猴4周长期毒性试验的结果非常接近。因此在本试验条件下，猴给药4周是较安全的，安全剂量为15mg/kg。
实施例5给药剂量和方式鉴于rh-TNFRFc用于类风湿性关节炎采用的是皮下给药，为了使其更快地起效，优选采用静脉滴注用于SARS、创伤等引起的急性肺损伤，推荐剂量为皮下注射的一半。
药代动力学和生物利用度试验方法如下在健康志愿者中sc给予10mg和iv给予10mg(N＝6；两组各3人)。对于70kg的个体10mg相当于5.7mg/m2。此研究被认为是给药途径的交叉研究，因为受试者先给予sc随后是iv。注射间隔28天。用非房室模型法测定药代动力学终点。用梯形法则计算AUC；半衰期是-log(2)/β。对于iv给药用72h以后的时间，而sc用144h以后的时间估算回归系数(β)。通过不同途径AUC的比值(sc/iv)计算生物利用度。
结果表明，皮下注射的达峰时间为66h，半衰期为92h，而静脉注射达峰时间为0.8h，半衰期为72h；皮下注射的生物利用度为58％。可见，采用静注12.5mg/次，每周两次的剂量是可行的，也是安全的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗急性肺损伤的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的急性肺损伤是由SARS冠状病毒感染引起的。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物中TNFR-Ig融合蛋白的重量含量为1-99％。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TNFR-Ig融合蛋白的N-末端的235个氨基酸残基为人II型肿瘤坏死因子受体细胞外段的序列，其C-末端的232个氨基酸残基为人免疫球蛋白γ1链的可结晶片段序列。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的给药途径是静脉注射或静脉滴注。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的给药剂量是每天0.1-3mg TNFR-Ig融合蛋白/千克体重。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的给药剂量是每天0.5-2mg TNFR-Ig融合蛋白/千克体重。
全文摘要
本发明涉及药物领域，更具体地涉及肿瘤坏死因子受体－免疫球蛋白的融合蛋白(简称为“TNFR－Ig融合蛋白”)在治疗急性肺损伤方面的用途。含有TNFR－Ig融合蛋白的药物组合物可非常有效地治疗由SARS等因素引起的急性肺损伤。
文档编号A61P31/00GK1565631SQ03129569
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者刘庆法, 王皓, 李晶, 李春澍, 李锐 申请人:上海中信国健药业有限公司