专利名称：一种银杏内酯针剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药物制剂的制备方法，更具体地说，涉及一种银杏内酯B针剂的制备方法。
背景技术：
从银杏叶中提取的多种有效成分中，银杏内酯类(A，B，C，等)为其重要成分；而在银杏内酯类中，又以银杏内酯B(Ginkgolide B，以下简称GB)生物活性最强，约为银杏内酯A的2～3倍，故倍受人关注。但由于GB在银杏叶中含量较低及分离纯化较困难等原因，故用混合内酯(含内酯A，B，C)做针剂的见有报道，用GB单体制备针剂的国内尚未见报道。
在国外文献中，多见对GB的药理研究，仅见有法国Beaufour-lpsen公司用GB单体制成的针剂(代号BN52021)，治疗与血小板活化因子(PAF)拮抗剂相关的某些疾病(如溃疡、过敏、哮喘、某些炎症、脏器移植的异体排斥等)进行临床试验的报道，但目前尚无正式产品问世。
银杏内酯B的化学结构中含有三个内酯环，在中性或酸性条件下为闭环形式，在水中难溶解，制备针剂较困难；当在碱性条件下，pH值在7.4～12为开环形式，随着pH值的增加，可有一个、二个乃至三个内酯完全开环成盐。开环后的内酯在水中易溶解，便于制成针剂，但化学性质也变得对热不大稳定，所以须制成冻干针剂保存使用。制备较复杂需特殊设备，还有文献报道认为GB闭环结构型式为其主要活性型式，开环后活性减弱[US Patent，No.5798342]。
“BN 52021”是部分开环形式制备的GB冻干粉针剂，这也许是其临床效果未达到预期的原因之一[Brochet B，etalJ Neurology，Neurosurgery andPsychiatry.1995，58360-362]。国内张平[中国专利申请号02134223.7]、陈仲良[中国专利申请号00115134.7]等也是用碱开环法制备银杏混合内酯针剂。
由银杏叶中提取所得纯品均为闭环形式，性质稳定，难溶于水。曾见有用丙二醇等为溶剂制备银杏混合内酯针剂的[中国专利申请号97107809.2]，经本发明人试验，它对GB的溶解度不够理想。因此，寻找研制银杏内酯B针剂的新方法，成为当务之急。
发明内容
本发明的目的在于弥补上述现有技术中的不足之处，而提供一种制备简便、效果好的银杏内酯B针剂的制备方法。
本发明的目的是通过如下措施来实现。选纯品GB(闭环形式)为原料药，溶解于注射用的非水溶剂—低分子量的聚乙二醇(PEG-400或PEG-300)中，聚乙二醇可单独使用，或与无水乙醇组成的混合溶剂使用；PEG与乙醇的比例(按体积计)可在0.5∶0.5～0.9∶0.1范围，优选0.6∶0.4以上，即PEG所占比例较大些为好；混合溶剂中可加或不加助溶剂表面活性剂，如吐温类(吐温-80等)，按重量计GB∶吐温＝1∶1～1∶3范围为好，可使GB溶液在稀释注射时不易析出，充分搅拌或超声震荡，进行后处理；所述的后处理是指过滤、灌封、灭菌、检测，即得产品，使用前稀释于适量的等渗氯化钠注射液中，摇匀、供静脉注射使用。
本发明的针剂相比现有技术具有如下优点制备工艺简便，不需冻干设备，即将GB加选用的“溶剂”溶解，经过滤、灌封、灭菌，即得。每毫升含10-20毫克GB的灭菌溶液。临用前稀释于适量的等渗氯化钠注射液中，含GB 4-40毫克/100毫升，供静脉滴注用。
用本法制备的GB针剂化学性质稳定，加热灭菌后用高效液相色谱法检测，质量合格未见有明显的分解产物，稳定性试验证明性质稳定。经药效学实验，对大鼠MCAT模型最低有效剂量为4-8mg/kg/日，证明对心脑血管病有治疗作用。
具体实施方法下面列举5个实施例，结合实施例及主要药效学实验对本发明作进一步说明。
实施例1GB 20,000mgPEG-400(或PEG-300)加至 1000ml配制称取GB置容器中，加入溶剂PEG，搅拌或超声震荡溶解，加溶剂至全量，混合均匀；经过滤、灌封、灭菌，即得。
临用前稀释于适量的等渗氯化钠注射液中(4-40毫克/100毫升)，静脉滴注。
实施例2GB 10,000mgPEG-400(或PEG-300)加至 1000ml配制方法同实施例1。
实施例3GB 20,000mgPEG-400(或PEG-300)加至 1000ml(注PEG-400∶乙醇＝0.5∶0.5～0.9∶0.1；PEG-300代替PEG-400)配制取GB置容器中，加入事先按预定比例混合好的混合溶剂，然后按实施例1的方法制得本发明产品。
实施例4GB 10,000mg混合溶剂(PEG-400-乙醇)加至 1000ml(注PEG-400∶乙醇＝0.9∶0.1；PEG-400可用PEG-300代替)配制方法同实施例3。
实施例5GB15,000mg吐温-80 20,000mg混合溶剂(PEG-400-乙醇)加至1000ml(注PEG-400∶乙醇＝0.5∶0.5)配制称取GB置容器中，将吐温-80加入事先按预定比例混合好的混合溶剂中，再将三者混好的混合溶剂加入GB中，搅拌或于超声波震荡器中超声使溶解，加混合溶剂至全量，混匀。经过滤、灌封、灭菌，即得。
临用前稀释于适量的等渗氯化钠注射液中(4-40毫克/毫升)，静滴。
银杏内酯B注射液两种溶媒对MCAT大鼠脑梗塞范围的影响地点北京中医药大学药理系[试验材料]一、药物与试剂受试药银杏内酯B注射液(1)解放军总医院开发部提供，每支5ml，每毫升含银杏内酯B10mg，溶媒为溶媒1(不含吐温-80)，大鼠用量16、8、4mg/kg/日。
受试药银杏内酯B注射液(2)解放军总医院开发部提供，每支5ml，每毫升含银杏内酯B10mg，溶媒为溶媒2(含吐温-80)，大鼠用量16、8、4mg/kg/日。
金纳多注射液德国威玛舒培博士药厂产品，每支5ml，每毫升含黄酮苷0.84mg，批号1060602，人用量为20-40ml/人/日，大鼠用量6.7ml/kg/日。
化学试剂FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工厂生产，用1mol/L盐酸配制；红四氮唑(TTC)，北京化工厂生产，批号950221。
二、动物SD大鼠，雌雄兼用，体重190～210g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK 11-00-0008。
三、仪器XTT实体显微镜，北京电光科学仪器厂生产；恒温水浴振荡器SHZ-22型，江苏大仓医疗器械厂生产；电子分析天平，AEG-220型，日本岛津产。
一、银杏内酯B注射液对大脑中动脉血栓模型(Middle Cerebral ArteryThrombosis MCAT)大鼠神经症状的影响(一)分组及给药实验动物随机分为十一组，即MCAT模型组、溶媒1组、溶媒2组、银杏内酯B注射液(1)16、8、4mg/kg组、银杏内酯B注射液(2)16、8、4mg/kg组、金纳多注射液6.7ml/kg组、假手术组。造模前预防给药两天(ip)，每天一次；造模后即刻舌下静脉给药一次，第四次给药(ip)后一小时取材。给药组给予相应的药物；溶媒1组和溶媒2组分别给予相应的溶媒1.6ml/kg体重；MCAT模型组、假手术组给予生理盐水1.6ml/kg体重。
(二)实施造模手术大鼠腹腔注射12％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉。按Tamura等的方法[Tamura A，Graham DI，McCulloch J et al.Focal Cerebral ischemia inthe rat.1.Description Of technique and early neuropathological consequences followingmiddle Cerebral artery occlusion.J Cereb Blood Flow Metab，1981；153]，稍加修改。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切去，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处向口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。将吸有50％氯化铁溶液(1mol/L盐酸)10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上[刘小光，徐理纳一种能评价溶栓药和抗拴药的大鼠大脑中动脉血栓模型。药学学报1995，30662]，约30min待血管颜色变黑后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。
(三)行为检测在术后不同时间(6h，24h)，按Bederson等[Lundy EF.SolikBS，Frank RS et al Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils.JPharamacol Method，1986，16201]的方法并加以改进，对动物进行行为评分。1.提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分；如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘的屈曲又有内旋者，记为1分。2.将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力记为0分；如向手术对侧推动时阻力下降者，记为1分。3.将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分；手术对侧前肢肌张力下降记为1分。4.提鼠尾离开地面约一尺，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分。根据以上标准评分，满分为4分，分数越高，动物的行为障碍越严重。
(四)结果分析对行为检测打分值进行组间比较，t检验。
结果显示，假手术组未见行为异常改变，MCAT模型组、溶媒1、2组大鼠在术后6h，24h均出现偏瘫样症状，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降。银杏内酯B注射液(1)各剂量组的大鼠在术后24h，其神经症状均有不同程度的改善，统计学处理，差异显著(P＜0.05)。
二、银杏内酯B注射液对MCAT大鼠脑梗塞范围的影响动物经末次行为评分后即大鼠造模24小时，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部份在4℃以下冠状切成5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC 1.5ml，1M K2HPO40.1ml)，37℃避光温孵30分钟，再取出，置于10％甲醛液中避光保存。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色[见Lundy EF]。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占总脑重量的百分比作为脑梗塞范围。结果进行组间比较，t检验。结果见表1，2，3。
表-1 银杏内酯B注射液对MCAT大鼠脑组织梗塞范围的影响剂量 例 梗塞组织重量占总脑组别抑制率(％)(mg/kg) 数 重量的百分比(％)溶媒1组- 106.98±1.91银杏内酯B注射液(1)组 16 105.11±1.51* 26.798 104.94±1.76* 29.234 104.86±1.40* 30.37金纳多注射液组 6.7ml 9 4.42±2.18* 36.68假手术组 NS 110±0** 100注与溶媒1组相比*P＜0.05，**P＜0.01。
表-2 银杏内酯B注射液对MCAT大鼠脑组织梗塞范围的影响剂量 例 梗塞组织重量占总脑组别抑制率(％)(mg/kg) 数 重量的百分比(％)溶媒2组 - 10 5.53±1.95银杏内酯B注射液(2)组 16 9 3.75±1.52** 32.198 10 4.64±0.8516.094 10 4.07±1.65* 26.40金纳多注射液组6.7ml 9 4.42±2.1820.07假手术组 NS 11 0±0**100注与溶媒2组相比*P＜0.05，**P＜0.01。
表-3 银杏内酯B注射液对MCAT大鼠脑组织梗塞范围的影响剂量 例梗塞组织重量占总脑组别(mg/kg) 数重量的百分比(％)MCAT模型组NS 6 6.04±1.97溶媒1组 1.6 10 6.98±1.91溶媒2组 1.6 10 5.53±1.95金纳多注射液组6.7 9 4.42±2.18假手术组 NS 11 0±0**注与MCAT模型组相比**P＜0.01。
结果显示，术后24h，除假手术组未见异常改变外，MCAT模型组、溶媒1、2组大鼠、各给药组的大鼠均有不同程度梗塞灶、银杏内酯B注射液(1)可明显减少梗塞程度，与溶媒1组相比具有显著差异(P＜0.05)。银杏内酯B注射液(1)4mg/kg可明显减少梗塞程度，与溶媒2组相比具有显著差异(P＜0.05)。
本发明表明，银杏内酯B注射液可显著减少大鼠局灶性脑缺血的梗塞范围。两种溶媒作用显示，溶媒2对MCAT模型的梗塞范围有一定抑制作用，故银杏内酯B注射液(2)各剂量组与溶媒2比较统计学意义不明显，但从梗塞范围大小来看银杏内酯B注射液(2)对大鼠局灶性脑缺血的梗塞范围的抑制作用更强一些。
权利要求
1.一种银杏内酯B针剂的制备方法，其特征在于包括以下顺序步骤将银杏内酯B原料溶解于注射用非水溶剂聚乙二醇中，聚乙二醇可单独使用或与无水乙醇配成混合溶剂，按体积计，聚乙二醇∶乙醇＝0.5∶0.5～0.9∶0.1，可加或不加表面活性剂，充分搅拌或超声震荡，进行后处理。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的注射用非水溶剂，是低分子量聚乙二醇PEG-400或PEG-300。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于表面活性剂，是吐温类的吐温-80，按重量计，GB∶吐温-80＝1∶1～1∶3。
全文摘要
本发明涉及一种银杏内酯针剂的制备方法，该方法是把银杏内酯B溶于注射用非水溶剂，如聚乙二醇，加或不加无水乙醇成混合溶剂，加或不加表面活性剂，经搅拌或超声震荡，及后处理即得产品，详细步骤和配方见说明书。本发明优点是制备简便，不需冻干设备，化学性质稳定，方便贮运，药效好。本发明产品主要用于治疗心脑血管病。
文档编号A61K31/365GK1513449SQ03137720
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月20日 优先权日2003年6月20日
发明者梅世昌, 陶忠华, 廖杰, 周春喜 申请人:梅世昌, 陶忠华, 廖杰