专利名称：雄激素受体复合物-相关蛋白的制作方法
相关申请本申请是2001年2月12日提交的美国申请流水号09/781,693和2001年1月17日提交的美国临时申请流水号60/262,312的部分继续申请，并且要求这两个申请的优先权，这两个申请的内容皆列入本文作为参考。
背景技术：
已鉴定出多个相对于健康细胞而言在肿瘤细胞中超表达的基因。对这些基因的鉴定有望为抗癌药物的开发和癌症诊断提供药物靶。肝癌细胞中的类固醇受体(例如雄激素受体)的数目相对于它们附近的健康肝细胞而言表现为有所增加。
类固醇激素一般通过与其特异性的核受体结合以形成复合物，该复合物反过来用作转录因子，籍此发挥其生理学作用。所述复合物与类固醇-应答基因的启动子中的特定核苷酸序列(类固醇应答元件)结合，以利于这些基因的转录。
概述本发明基于对一种人蛋白质的发现，所述蛋白质在肝癌细胞中超表达(相对于附近的正常细胞而言)，并与雄激素受体结合，增强受体反式激活雄激素-应答基因的能力。因此，将这种新发现的人蛋白质称为“雄激素受体复合物-相关蛋白”或“ARCAP”。以下显示的是全长人ARCAP cDNA(称为SEQ ID NO1)，下划线的为起始和终止密码子CCGGCTCAGGCAGAGCCATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCCACACCTGTTGTGGGACGTGAGGAAAAGGTCCCTCGGGCTGGAGGACCCGTCCCGGCTGCGGAGTCGCTACCTGGGAAGAAGAGAATTTATCCAAAGATTAAAACTTGAAGCAACCCTTAATGTGCATGATGGTTGTGTTAATACAATCTGTTGGAATGACACTGGAGAATATATTTTATCTGGCTCAGATGACACCAAATTAGTAATTAGTAATCCTTACAGCAGAAAGGTTTTGACAACAATTCGTTCAGGGCACCGAGCAAACATATTTAGTGCAAAGTTCTTACCTTGTACAAATGATAAACAGATTGTATCCTGCTCTGGAGATGGAGTAATATTTTATACCAACGTTGAGCAAGATGCAGAAACCAACAGACAATGCCAATTTACGTGTCATTATGGAACTACTTATGAGATTATGACTGTACCCAATGACCCTTACACTTTTCTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGTTAGGTGGTTTGATACACGCATCAAAACTAGCTGCACAAAAGAAGATTGTAAAGATGATATTTTAATTAACTGTCGACGTGCTGCCACGTCTGTTGCTATTTGCCCACCAATACCATATTACCTTGCTGTTGGTTGTTCTGACAGCTCAGTACGAATATATGATCGGCG
AATGCTGGGCACAAGAGCTACAGGGAATTATGCAGGTCGAGGGACTACTGGAATGGTTGCCCGTTTTATTCCTTCCCATCTTAATAATAAGTCCTGCAGAGTGACATCTCTGTGTTACAGTGAAGATGGTCAAGAGATTCTCGTTAGTTACTCTTCAGATTACATATATCTTTTTGACCCGAAAGATGATACAGCACGAGAACTTAAAACTCCTTCTGCGGAAGAGAGAAGAGAAGAGTTGCGACAACCACCAGTTAAGCGTTTGAGACTTCGTGGTGATTGGTCAGATACTGGACCCAGAGCAAGGCCGGAGAGTGAACGAGAACGAGATGGAGAGCAGAGTCCCAATGTGTCATTGATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATCAAGATGGTTTGAAGAAGCAAGTGAGGTTGCACAAAGCAATAGAGGACGAGGAAGATCTCGACCCAGAGGTGGAACAAGTCAATCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTCCCATCAAGTCCTGATTTGGAAGTGAGTGAAACTGCAATGGAAGTAGATACTCCAGCTGAACAATTTCTTCAGCCTTCTACATCCTCTACAATGTCAGCTCAGGCTCATTCGACATCATCTCCCACAGAAAGCCCTCATTCTACTCCTTTGCTATCTTCTCCAGACAGTGAACAAAGGCAGTCTGTTGAGGCATCTGGACACCACACACATCATCAGTCTGATAACAATAATGAAAAGCTGAGCCCCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGTTTTAAGTTTGCACTACAGCACAGAAGGAACAACTACAAGCACAATAAAACTGAACTTTACAGATGAATGGAGCAGTATAGCATCAAGTTCTAGAGGAATTGGGAGCCATTGCAAATCTGAGGGTCAGGAGGAATCTTTCGTCCCACAGAGCTCAGTGCAACCACCAGAAGGAGACAGTGAAACAAAAGCTCCTGAAGAATCATCAGAGGATGTGACAAAATATCAGGAAGGAGTATCTGCAGAAAACCCAGTTGAGAACCATATCAATATAACACAATCAGATAAGTTCACAGCCAAGCCATTGGATTCCAACTCAGGAGAAAGAAATGACCTCAATCTTGATCGCTCTTGTGGGGTTCCAGAAGAATCTGCTTCATCTGAAAAAGCCAAGGAACCAGAAACTTCAGATCAGACTAGCACTGAGAGTGCTACCAATGAAAATAACACCAATCCTGAGCCTCAGTTCCAAACAGAAGCCACTGGGCCTTCAGCTCATGAAGAAACATCCACCAGGGACTCTGCTCTTCAGGACACAGATGACAGTGATGATGACCCAGTCCTGATCCCAGGTGCAAGGTATCGAGCAGGACCTGGTGATAGACGCTCTGCTGTTGCCCGTATTCAGGAGTTCTTCAGACGGAGAAAAGAAAGGAAAGAAATGGAAGAATTGGATACTTTGAACATTAGAAGGCCGCTAGTAAAAATGGTTTATAAAGGCCATCGCAACTCCAGGACAATGATAAAAGAAGCCAATTTCTGGGGTGCTAACTTTGTAATGAGTGGTTCTGACTGTGGCCACATTTTCATCTGGGATCGGCACACTGCTGAGCATTTGATGCTTCTGGAAGCTGATAATCATGTGGTAAACTGCCTGCAGCCACATCCGTTTGACCCAATTTTAGCCTCATCTGGCATAGATTATGACATAAAGATCTGGTCACCATTAGAAGAGTCAAGGATTTTTAACCGAAAACTTGCTGATGAAGTTATAACTCGAAACGAACTCATGCTGGAAGAAACTAGAAACACCATTACAGTTCCAGCCTCTTTCATGTTGAGGATGTTGGCTTCACTTAATCATATCCGAGCTGACCGGTTGGAGGGTGACAGATCAGAAGGCTCTGGTCAAGAGAATGAAAATGAGGATGAGGAATAATAAACTCTTTTTGGCAAGCACTTAAATGTTCTGAAATTTGTATAAGACATTTATTATATTTTTTTCTTTACAGAGCTTTAGTGCAATTTTAAGGTTATGGTTTTTGGAGTTTTTCCCTTTTTTTGGGATAACCTAACATTGGTTTGGAATGATTGTGTGCATGAATTTGGGAGATTGTATAAAACAAAACTAGCAGAATGTTTTTAAAACTTTTTGCCGTGTATGAGGAGTGCTAGAAAATGCAAAGTGCAATATTTTCCCTAACCTTCAAATGTGGGAGCTTGGATCAATGTTGAAGAATAATTTTCATCATA
GTGAAAATGTTGGTTCAAATAAATTTCTACACTTGCCATTTGCATGTTTGTTGCTTTCTAATTAAAGAAACTGGTTGTTTTAAAAAAAAAAAAAAGGAATTC(SEQ ID NO1)本发明的特征在于分离的核酸，该核酸具有在严紧条件下可与单链探针杂交的链，其序列是SEQ ID N01或SEQ ID NO1的互补物。所述核酸的长度至少为15个(例如至少为30，50，100，200，500或1000)个核苷酸。
在“严紧条件下”杂交指的是在65℃，0.5 X SSC下杂交，接着在45℃，0.1 X SSC下洗涤。
“分离的核酸”是这样一种核酸，其结构与任何天然核酸或跨越三个以上分离的基因的天然基因组核酸的任何片断的结构有所不同。因此，该术语覆盖例如，(a)一种DNA，其具有天然基因组DNA分子的部分序列，但是，其侧翼序列不是在天然状态下侧翼于生物体基因组的该DNA分子部分的编码序列；(b)以使所得分子不同于任何天然载体或基因组DNA的方式掺入载体或掺入原核或真核生物基因组DNA的核酸；(c)分离的分子，例如cDNA，基因组片断，通过聚合酶链反应(PCR)产生的片断，或限制性片断；和(d)为杂合基因，即编码融合蛋白的基因的一部分的重组核苷酸序列。从此定义中特别排除的是不同的(i)DNA分子，(ii)转染细胞，或(iii)细胞克隆的混合物中存在的核酸，例如DNA文库，如cDNA或基因组DNA文库中的核酸。
通过测定ARCAP mRNA是否在组织或细胞中表达或超表达，可使用本发明的核酸来诊断肝癌。该核酸可用作基于PCR的检测方法中的引物，或用作核酸印迹(例如Northern印迹)中的标记探针。
以下是选自人ARCAP cDNA序列的一些PCR引物对的例子(1)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCCA(SEQ ID NO2)，和ACAGTTCCATCTTCACCACAAGAGAG(SEQ ID NO10)；(2)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC(SEQ ID NO2)，和CCGATCATATATTCGTACTGAGCTGT(SEQ ID NO11)；(3)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC(SEQ ID NO2)，和GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATCTGA(SEQ ID NO12)；(4)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC(SEQ ID NO2)，和ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG(SEQ ID NO13)；(5)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC(SEQ ID NO2)，和
GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA(SEQ ID NO14)；(6)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC(SEQ ID NO2)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；(7)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC(SEQ ID NO2)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(8)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC(SEQ ID NO3)，和CCGATCATATATTCGTACTGAGCTGT(SEQ ID NO11)；(9)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC(SEQ ID NO3)，和GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATACTGA(SEQ ID NO12)；(10)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC(SEQ ID NO3)，和ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG(SEQ ID NO13)；(11)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC(SEQ ID NO3)，和GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA(SEQ ID NO14)；(12)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC(SEQ ID NO3)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；(13)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC(SEQ ID NO3)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(14)ACAGCTCAGTACGAATATATGATCGG(SEQ ID NO4)，和GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATACTGA(SEQ ID NO12)；(15)ACAGCTCAGTACGAATATATGATCGG(SEQ ID NO4)，和ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG(SEQ ID NO13)；(16)ACAGCTCAGTACGAATATATGATCGG(SEQ ID NO4)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；(17)ACAGCTCAGTACGAATATATGATCGG(SEQ ID NO4)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(18)CTACTGGAATGGTTGCCGTT(SEQ ID NO5)，和GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATACTGA(SEQ ID NO12)；(19)CTACTGGAATGGTTGCCGTT(SEQ ID NO5)，和ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG(SEQ ID NO13)；(20)CTACTGGAATGGTTGCCGTT(SEQ ID NO5)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；
(21)CTACTGGAATGGTTGCCGTT(SEQ ID NO5)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(22)ATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATC(SEQ ID NO6)，和GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATACTGA(SEQ ID NO12)；(23)ATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATC(SEQ ID NO6)，和ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG(SEQ ID NO13)；(24)ATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATC(SEQ ID NO6)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；(25)ATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATC(SEQ ID NO6)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(26)TCCAACTCAGGAGAAAGAAATGACCTC(SEQ ID NO7)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；(27)TCCAACTCAGGAGAAAGAAATGACCTC(SEQ ID NO7)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(28)GCCACTGGGCCTTCAGCTCA(SEQ ID NO8)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(29)GTGCTAACTTTGTAATGAGTG(SEQ ID NO9)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(30)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT(SEQ ID NO17)，和CCGATCATATATTCGTACTGAGCTGT(SEQ ID NO11)；(31)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT(SEQ ID NO17)，和AACGGGCAACCATTCCAGTAG(SEQ ID NO18)；(32)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT(SEQ ID NO17)，和GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATCTGA(SEQ ID NO12)；(33)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT(SEQ ID NO17)，和ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG(SEQ ID NO13)；(34)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT(SEQ ID NO17)，和GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA(SEQ ID NO14)；(35)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT(SEQ ID NO17)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；(36)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT(SEQ ID NO17)，和
CACTCATTACAAAGTTAGCAC(SEQ ID NO19)；(37)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT(SEQ ID NO17)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(38)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC(SEQ ID NO20)，和ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG(SEQ ID NO13)；(39)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC(SEQ ID NO20)，和GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA(SEQ ID NO14)；(40)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC(SEQ ID NO20)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；(41)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC(SEQ ID NO20)，和CACTCATTACAAAGTTAGCAC(SEQ ID NO19)；(42)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC(SEQ ID NO20)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(43)CCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGT(SEQ ID NO21)，和GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA(SEQ ID NO14)；(44)CCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGT(SEQ ID NO21)，和TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC(SEQ ID NO15)；(45)CCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGT(SEQ ID NO21)，和CACTCATTACAAAGTTAGCAC(SEQ ID NO19)；(46)CCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGT(SEQ ID NO21)，和TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG(SEQ ID NO16)；(47)GCCACTGGGCCTTCAGCTCA(SEQ ID NO22)，和CACTCATTACAAAGTTAGCAC(SEQ ID NO19).
本发明的范围还包括由第一引物和第二引物组成的扩增引物对，每个引物的长度为20-40(例如20-35和20-30)个核苷酸。第一引物含有SEQ IDNO2，第二引物含有SEQ ID NO10，11，12，13，14，15或16；第一引物含有SEQ ID NO3，第二引物含有SEQ ID NO11，12，13，14，15或16；第一引物含有SEQ ID NO4，第二引物含有SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物含有SEQ ID NO5，第二引物含有SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物含有SEQ ID NO6，第二引物含有SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物含有SEQ ID NO7，第二引物含有SEQ ID NO15或16；第一引物含有SEQID NO8，第二引物含有SEQ ID NO16；第一引物含有SEQ ID NO9，第二引物含有SEQ ID NO16；第一引物含有SEQ ID NO17，第二引物含有SEQID NO11，18，12，13，14，15，16或19；第一引物含有SEQ ID NO20，第二引物含有SEQ ID NO13，14，15，16或19；第一引物含有SEQ ID NO21，第二引物含有SEQ ID NO14，15，16，或19；或第一引物含有SEQ ID NO22，第二引物含有SEQ ID NO19。
用上述的一对引物扩增人核酸模板所得的核酸可用作杂交探针，用于检测人ARCAP mRNA。
本发明的范围还包括用于诊断肝癌的试剂盒。该试剂盒含有一个或多个上述引物或探针。还可包含其它组分，如DNA聚合酶、PCR缓冲液或可负载或固定一个或多个上述引物或探针的固体支持物。
本发明提供了检测肝癌的方法。该方法包括提供受试者的样品(例如血样，如淡黄色层(buffy coat sample))，并通过用上述的一个引物对和探针分别进行扩增和杂交来测定ARCAP基因表达水平。如果样品中的ARCAP基因表达水平高于制备自正常受试者的样品中的相应水平，就表示受试者患有肝癌。受试者可能是发展成肝癌的风险较高的人，例如是乙型肝炎、丙型肝炎或肝硬化的患者或其亲属，或是肝癌患者的亲属。令人出乎意料的是，使用该方法诊断肝癌的准确率为98％以上，远远优于基于甲胎蛋白(AFP)水平的常用方法的70％准确率。
本发明还提供了确定肝癌时期的方法。该方法包括提供肝癌患者的样品(例如血样，如淡黄色层)，并通过用上述的一个引物对和探针分别进行扩增和杂交来测定ARCAP基因表达水平。通过将样品中的ARCAP基因表达水平与制备自其他不同时期的肝癌患者的样品中的相应水平进行比较，来确定患者的癌症时期。
从以下的详细描述和权利要求书中可明显看出本发明的其它特征或优点。
详细描述本发明涉及新鉴定的ARCAP基因，相对于正常肝细胞而言，该基因在肝细胞癌的细胞中超表达。除了差异表达外，还发现ARCAP能结合雄激素受体，并增强其反式激活活性。这些观察结果暗示ARCAP经由雄激素受体复合物激活促分裂基因，所述基因是雄激素-应答基因(即其启动子含有雄激素应答元件的基因)，ARCAP的超表达通过有利于雄激素-应答性促分裂基因的由雄激素受体-介导的反式激活而导致癌症，抑制ARCAP表达或活性会减少这些雄激素-应答性促分裂基因的表达，使癌细胞回复为较正常的表型。因此，ARCAP是新的癌症药物靶。
ARCAP分子可用作失调或疾病状态的标记，疾病状态前兆的标记，疾病状态体质(predisposition)的标记，药物活性的标记或受试者的药物基因组学分布图的标记。使用本文所述的方法，ARCAP分子的存在、缺乏和/或存在的量可被检测出来，并且可与体内的一种或多种生物学状态相联系。例如，ARCAP分子可用作一种或多种失调或疾病状态或导致疾病状态的病症的替代标记。本文所用的“替代标记”是与疾病或失调的不存在或存在相关的、或与疾病或失调的进程(例如与肝癌的存在或不存在)相关的客观生物化学标记。所述标记的存在或存在的量并不依赖于疾病。因此，可以使用这些标记来显示某个特定的疗程是否能有效缓解疾病状态或失调。当通过标准的方法学难以评估疾病状态或失调的存在或程度时(例如早期肿瘤)，或需要在到达潜在危险的临床终点之前评估疾病进程时，替代标记特别有用(例如，可以赶在心肌梗死或充分出现AIDS症状这些不好的临床后果之前，使用胆固醇水平作为替代标记来评估心血管疾病，以及使用HIV RNA水平作为替代标记来分析HIV感染)。本领域中使用替代标记的例子描述于Koomen et al.(2000)J.Mass.Spectrom.35258-264；和James(1994)AIDSTreatment News Archive 209。
ARCAP分子也可用作药物动力学标记。本文所用的“药物动力学标记”是与药效特别相关的客观生物化学标记。药物动力学标记的存在或存在的量与服药所医治的疾病状态或失调不相关；因此，标记的存在或存在的量可指示受试者体内药物的存在或活性。例如，药物动力学标记可指示生物组织中药物的浓度，因为在与药物水平有关的组织中，标记或者被表达或转录，或者不被表达或转录。按照这种方式，通过药物动力学标记可监测药物的分布或摄入。类似地，药物动力学标记的存在或存在的量可与药物代谢产物的存在或存在的量相关，使得标记的存在或存在的量可指示药物在体内的相对分解速率。药物动力学标记对增加药效检测的敏感性特别有用，当以低剂量给药时更是如此。由于甚至少量药物也可以有效激活多轮标记(如ARCAP标记)的转录或表达，被扩增的标记在量上比药物自身更容易被检测到。另外，由于标记自身的特性，标记也更容易被检测到；例如，使用本文所述的方法，可在基于免疫的ARCAP蛋白标记检测系统中使用抗-ARCAP抗体，或者，可以使用经放射性标记的ARCAP-特异性探针来检测ARCAP mRNA标记。另外，使用药物动力学标记可为在可能的直接观察结果范围之外进行的药物治疗所导致的风险提供基于机理的预测。本领域中使用药物动力学标记的例子描述于Matsuda et al.US 6,033,862；Hattis et al.(1991)Env.Health Perspect.90229-238；Schentag(1999)Am.J.Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3S21-S24；和Nicolau(1999)Am，J.Health-Syst.Pharm.56Suppl.3S16-S20。
ARCAP分子也可用作药物基因组学标记。本文所用的“药物基因组学标记”是与受试者的特定临床药物反应或敏感性有关的客观生物化学标记(参见例如McLeod et al.(1999)Eur.J.Cancer 351650-1652)。药物基因组学标记的存在或存在的量与在给药前预测的受试者对特定的一种药物或一类药物的反应有关。通过评估受试者体内一种或多种药物基因组学标记的存在或存在的量，可选择出最适合受试者，或者经预测成功的可能性更大的药物疗法。例如，基于受试者体内特定肿瘤标记的RNA或蛋白质(如ARCAP蛋白或RNA)的存在或存在的量，可选择出最适于治疗受试者体内可能存在的特定肿瘤的药物或疗程。类似地，ARCAP DNA中特定序列突变的存在或缺乏可与ARCAP药物反应有关。因此，使用药物基因组学标记可以对每个受试者使用最合适的治疗，而无需不得不实施常规疗法。
通过用一对引物进行扩增可以测定ARCAP基因的表达水平，所述引物对如SEQ ID NO2和SEQ ID NO10，11，12，13，14，15或16；SEQ ID NO3和SEQ ID NO11，12，13，14，15或16；SEQ ID NO4和SEQ ID NO12，13，15或16；SEQ ID NO5和SEQ ID NO12，13，15或16；SEQ ID NO6和SEQ IDNO12，13，15或16；SEQ ID NO7和SEQ ID NO15或16；SEQ ID NO8和SEQ ID NO16；SEQ ID NO9和SEQ ID NO16；SEQ ID NO17和SEQ IDNO11，18，12，13，14，15，16或19；SEQ ID NO20和SEQ ID NO13，14，15，16或19；SEQ ID NO21和SEQ ID NO14，15，16或19；或SEQ ID NO22和SEQ ID NO19。或者，通过与核酸探针杂交(例如Northern印迹)也可进行测定，所述探针如用上述的一个引物对扩增人核酸模板所得的核酸。
扩增模板可以是纯化或非纯化形式的DNA(即cDNA)或RNA(即总RNA或mRNA)。它可得自患者的生物样品(例如活检样品，如肝脏活检样品，或者血液样品，例如淡黄色层样品)。
通常，引物的长度为14-40个核苷酸(PCR Application Manual，Boehringer Mannheim，1995，page 37)。本发明的范围还包括长度短于上述例子(即SEQ ID No2-22)，但仍可用于检测人ARCAP mRNA的几个核苷酸长的引物。通过测定它们是否可用于由人ARCAP核酸模板产生预期大小的PCR产物，即可鉴定出所述引物。也可使用比上述例子长的引物(例如长度为20-40，20-35，或20-30个核苷酸的引物)来检测人ARCAP mRNA。例如，可在人ARCAP基因序列的5’-末端或3’-末端添加额外的核苷酸。可在5’-末端添加非-人ARCAP基因序列。非-人ARCAP序列的例子是含有限制性位点的序列，所述位点便于扩增产物的克隆。
通过电泳在凝胶(例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶)上分辨，或者通过与探针杂交，可肉眼观察到扩增产物。可将探针固定于固体支持物的表面，所述支持物如膜(尼龙膜或硝酸纤维素膜)，玻璃或塑料聚合物。通过在80℃烘烤或UV交联可将探针固定在膜上。探针也可与包被于玻璃表面的物质(例如聚赖氨酸)共价连接。或者，可在固体底物上，在精确的位置处从头合成探针。参见Schena et al.，1995，Science 270467；Kozal et al.，1996，NatureMedicine 2(7)753；Cheng et al.，1996，Nucleic Acids Res.24(2)380；Lipshutzet al.，1995，Bio Techniques 19(3)442；Pease et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915022；Fodor et al.，1993，Nature 364555；和Fodor et al.，WO92/10092。为了便于检测，可用经标记的扩增引物产生经标记的扩增产物。或者，在扩增后进行化学或酶学标记。标记试剂的例子包括但不限于荧光分子(例如荧光素和罗丹明)，放射性同位素(例如32P和125I)，生色试剂和化学发光试剂。生物素和地高辛配基常用于在膜或塑料聚合物上进行生色检测。如Cy3和Cy5的荧光标记被广泛用于在玻璃上进行检测。另外，人工标记尾(tagging tail)(例如蛋白质或其抗体)可与引物的5’-末端或探针的任一端缀合。参见Stetsenko and Gait，2000，J.Org.Chem.65(16)4900。
以下具体的实施例应被理解成仅是为了阐明本发明，而不以任何方式限制发明内容的其余部分。无需进一步阐述，应相信本领域技术人员基于本文的描述，可最大程度地利用本发明。本文提及的所有出版物皆全文列入本文作为参考。
从血细胞中分离淡黄色层1.每份样品取10ml全血。
2.20℃、3,500rpm(PK-131R，ALC International S.r.l.，Italy)离心15分钟以分离血细胞。
3.用带刻度的滴管取出白血细胞(WBC)，然后将细胞转移至15-mL离心管。
4.在白血细胞中加入3倍体积的磷酸缓冲盐水(PBS)(WBC∶PBS＝1∶3)，充分混合。
5.缓慢地将4mL混合的WBC加至装有2mL Ficoll-Paque的15-mL离心管中(Ficoll-paque∶样品＝1∶2)。不要弄坏WBC与Ficoll-Paque之间的分界面，确保WBC分布在Ficoll-Paque的顶层。
6.20℃、3,500rpm(PK-131R，ALC International S.r.l.，Italy)离心15分钟。
7.用带刻度的滴管(2mL)取出第二层白细胞，将细胞转移至15-mL离心管。
8.在白血细胞中加入2mL PBS(WBC∶PBS＝1∶1)，充分混合。
9.20℃、3,500rpm(PK-131R，ALC International S.r.l.，Italy)离心15分钟。
10.弃上清。
11.用1mL PBS重新悬浮白色的沉淀物。
12.20℃、12,000rpm(PK-131R，ALC International S.r.l.，Italy)离心20分钟。
14.弃上清，将沉淀物(称为淡黄色层)置于两个独立的eppendorf管中。必要时将淡黄色层置于-20℃保存。
分离总RNA1.在含有预先制备的淡黄色层的1.5-mL eppendorf管中加入1mLTRIzol试剂。
2.用移液管抽吸淡黄色层几次以重新悬浮细胞。
3.通过穿过18g针头20次以破碎细胞。
4.在细胞混合物中加入200μL氯仿(TRIzol试剂的1/5体积)，并彻底涡旋。
5.将细胞混合物置于冰上(4℃)放10分钟。
6.4℃、12,000rpm(PK-131R，ALC International S.r.l.，Italy)离心10分钟。
7.将溶液上层(约600μL RNA溶液)转移至1.5-mL eppendorf。
8.在RNA溶液中加入等体积的异丙醇(约600μL)，充分混合。
9.将混合物置于冰上(4℃)放30分钟。
10.4℃、12,000rpm(PK-131R，ALC International S.r.l.，Italy)离心30分钟。
11.除去上清液，留下RNA沉淀物。
12.在RNA沉淀物中加入200μL 75％ Alcl-DEPC(焦碳酸二乙酯，Sigma)。
13.4℃、12,000rpm(PK-131R，ALC International S.r.l.，Italy)离心10分钟。
14.重复步骤11以除去上清液，留下RNA沉淀物。
15.加入10μL ddH2O-DEPC以重新悬浮RNA。
16.将RNA溶液置于4℃过夜。
75％乙醇-DEPC将75mL无水乙醇与25mL ddH2O-DEPC混合以制备75％Alcl-DEPC，4℃保存。
ddH2O-DEPC将1mL DEPC与1,000mL dd H2O混合以制备ddH2O-DEPC，高压灭菌后4℃保存。
RT-PCR1.混合1μL制备出的RNA与99μL ddH2O，使用RNA/DNA计算仪(GeneQuant Pro Classic；Amersham Biosciences)测定RNA的浓度。每个RT-PCR需要10μg总RNA。
2.混合RNA与H2O-DEPC以使终体积为17μL。
3.65℃变性RNA 10分钟。
4.制备逆转录混合物5×第一缓冲液 6λdNTPs 2λ0.1M DTT 2λOligo(dT)(1μg/μL)1λRNA酶抑制剂(27.5u/μL) 1λ
M-MLV逆转录酶(200u/μL) 1λ变性的总RNA(10μg) 17λ8.37℃保温60分钟，接着65℃保温10分钟以获得cDNA(可储存于-20℃)。
9.制备PCR混合物cDNA 1正向引物 0.1λ反向引物 0.1λdNTPs0.2λTaq DNA聚合酶(5u/μL)0.5λ10×PCR缓冲液2.5λddH2O 20.6λ10.通过以110V在1.0％琼脂糖凝胶上电泳20分钟以检测PCR产物。
其它实施方案本说明书中公开的所有特征可以任何组合联合。本说明书中公开的每个特征可被用作相同、相当或类似目的的其它特征所替代。因此，除非另有说明，说明书中公开的每个特征仅是一系列等同或类似特征的一个例子。
本领域技术人员从上述描述中可以容易地确定本发明的必要特征，并且在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行多种改变和修饰以使本发明适用于各种用途和条件。因此，其它实施方案也在下述权利要求的范围之内。
序列表<110>行政院退除役官兵辅导委员会台北荣民总医院创盛基因科技股份有限公司<120>雄激素受体复合物相关蛋白<130>14321-002001<140>US 10/205,737<141>2002-07-25<150>US 09/781,693<151>2001-02-12<150>US 60/262,312<151>2001-01-17<160>22<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>3016<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1ccggctcagg cagagccatg tctcggggtg gctcctaccc acacctgttg tgggacgtga 60ggaaaaggtc cctcgggctg gaggacccgt cccggctgcg gagtcgctac ctgggaagaa 120gagaatttat ccaaagatta aaacttgaag caacccttaa tgtgcatgat ggttgtgtta 180atacaatctg ttggaatgac actggagaat atattttatc tggctcagat gacaccaaat 240tagtaattag taatccttac agcagaaagg ttttgacaac aattcgttca gggcaccgag 300caaacatatt tagtgcaaag ttcttacctt gtacaaatga taaacagatt gtatcctgct 360ctggagatgg agtaatattt tataccaacg ttgagcaaga tgcagaaacc aacagacaat 420gccaatttac gtgtcattat ggaactactt atgagattat gactgtaccc aatgaccctt 480acacttttct ctcttgtggt gaagatggaa ctgttaggtg gtttgataca cgcatcaaaa 540ctagctgcac aaaagaagat tgtaaagatg atattttaat taactgtcga cgtgctgcca 600cgtctgttgc tatttgccca ccaataccat attaccttgc tgttggttgt tctgacagct 660cagtacgaat atatgatcgg cgaatgctgg gcacaagagc tacagggaat tatgcaggtc 720gagggactac tggaatggtt gcccgtttta ttccttccca tcttaataat aagtcctgca 780gagtgacatc tctgtgttac agtgaagatg gtcaagagat tctcgttagt tactcttcag 840attacatata tctttttgac ccgaaagatg atacagcacg agaacttaaa actccttctg 900cggaagagag aagagaagag ttgcgacaac caccagttaa gcgtttgaga cttcgtggtg 960attggtcaga tactggaccc agagcaaggc cggagagtga acgagaacga gatggagagc1020
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<223>引物<400>2atgtctcggg gtggctccta ccca 24
<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3atgactgtac ccaatgaccc ttacac 26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>10acagttccat cttcaccaca agagag 26<210>11<211>26
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<220>
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<223>引物<400>22gccactgggc cttcagctca 20
权利要求
1.由第一引物和第二引物组成的扩增引物对，其中第一引物含有SEQ ID NO2，第二引物含有SEQ ID NO10，11，12，13，14，15或16；第一引物含有SEQ ID NO3，第二引物含有SEQ ID NO11，12，13，14，15或16；第一引物含有SEQ ID NO4，第二引物含有SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物含有SEQ ID NO5，第二引物含有SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物含有SEQ ID NO6，第二引物含有SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物含有SEQ ID NO7，第二引物含有SEQ ID NO15或16；第一引物含有SEQ ID NO8，第二引物含有SEQ ID NO16；第一引物含有SEQ ID NO9，第二引物含有SEQ ID NO16；第一引物含有SEQ ID NO17，第二引物含有SEQ ID NO11，18，12，13，14，15，16或19；第一引物含有SEQ ID NO20，第二引物含有SEQ ID NO13，14，15，16或19；第一引物含有SEQ ID NO21，第二引物含有SEQ ID NO14，15，16，或19；或第一引物含有SEQ ID NO22，第二引物含有SEQ ID NO19；每个引物的长度为20-40个核苷酸。
2.权利要求1的引物对，其中每个引物的长度为20-35个核苷酸。
3.权利要求2的引物对，其中每个引物的长度为20-30个核苷酸。
4.权利要求1的引物对，其中第一引物是SEQ ID NO2，第二引物是SEQ ID NO10，11，12，13，14，15或16；第一引物是SEQ ID NO3，第二引物是SEQ ID NO11，12，13，14，15或16；第一引物是SEQ ID NO4，第二引物是SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物是SEQ ID NO5，第二引物是SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物是SEQ ID NO6，第二引物是SEQ ID NO12，13，15或16；第一引物是SEQ ID NO7，第二引物是SEQ ID NO15或16；第一引物是SEQ ID NO8，第二引物是SEQ ID NO16；第一引物是SEQ ID NO9，第二引物是SEQ ID NO16；第一引物是SEQ ID NO17，第二引物是SEQ ID NO11，18，12，13，14，15，16或19；第一引物是SEQ ID NO20，第二引物是SEQ ID NO13，14，15，16或19；第一引物是SEQ ID NO21，第二引物是SEQ ID NO14，15，16，或19；或第一引物是SEQ ID NO22，第二引物是SEQ ID NO19。
5.用权利要求1的引物对扩增人核酸模板所得的核酸。
6.权利要求5的核酸，其中每个引物的长度为20-35个核苷酸。
7.权利要求6的核酸，其中每个引物的长度为20-30个核苷酸。
8.检测肝癌的方法，所述方法包括提供受试者的样品，和通过用权利要求1的引物对扩增或通过与权利要求5的核酸杂交以测定雄激素受体复合物-相关蛋白的基因表达水平，其中，如果样品中的基因表达水平高于制备自正常受试者的样品的相应水平就表示受试者患有肝癌。
9.权利要求8的方法，其中样品是血样。
10.权利要求9的方法，其中样品是淡黄色层样品。
11.权利要求8的方法，其中受试者是乙型肝炎患者或其亲属。
12.权利要求11的方法，其中样品是血样。
13.权利要求12的方法，其中样品是淡黄色层样品。
14.权利要求8的方法，其中受试者是丙型肝炎患者或其亲属。
15.权利要求14的方法，其中样品是血样。
16.权利要求15的方法，其中样品是淡黄色层样品。
17.权利要求8的方法，其中受试者是肝硬化患者或其亲属。
18.权利要求17的方法，其中样品是血样。
19.权利要求18的方法，其中样品是淡黄色层样品。
20.权利要求8的方法，其中受试者是肝癌患者的亲属。
21.权利要求20的方法，其中样品是血样。
22.权利要求21的方法，其中样品是淡黄色层样品。
23.确定肝癌的时期的方法，所述方法包括提供肝癌患者的样品，和通过用权利要求1的引物对扩增或通过与权利要求5的核酸杂交以测定雄激素受体复合物-相关蛋白的基因表达水平，其中，通过将样品中的基因表达水平与制备自其它不同时期的肝癌患者的样品的相应水平进行比较，以显示患者的癌症时期。
24.权利要求23的方法，其中样品是血样。
25.权利要求24的方法，其中样品是淡黄色层样品。
全文摘要
用于检测人ARCAP基因表达的引物和探针。
文档编号A61K38/00GK1497049SQ03143618
公开日2004年5月19日 申请日期2003年7月25日 优先权日2002年7月25日
发明者张泰 , 张泰階 申请人:台北荣民总医院, 创盛基因科技股份有限公司