治疗疾病和损伤用的氧化氮供体的制作方法

专利名称：治疗疾病和损伤用的氧化氮供体的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病和损伤的治疗，尤其涉及包括氧化氮供体和细胞疗法治疗疾病和损伤的方法和化合物。
背景技术：
在美国，中风是第三大死因，也是造成残疾的主要原因。大脑某个部位梗塞就会发生中风，造成大脑供血受阻导致脑组织死亡。伴随急性中风的大脑梗塞会引发突发的并且明显的神经损伤。其它神经疾病也会导致组织死亡和神经损伤。
药物干预尝试增大大脑中风区域的血流量使组织得以恢复，但无临床效果。正如Harrison(第九版，1980，p.1926)内科原理所述，除实验证据……[大脑血管舒张剂]由氧化氮法测得，增加了大脑血流量，它们并未在进一步的人类中风病例中被证明是有效的，无论是局部缺血发病阶段，血栓形成阶段或疾病确立阶段。烟酸，Priscoline，酒精，罂粟碱和5％二氧化氮的吸入剂都是如此。相反，这个研究结果提示血管舒张剂甚至是有害的，它们通过降低全身血压而减少颅内吻合流，或者通过扩张大脑正常部位的血管从梗塞部位盗血。
此外，心血管系统疾病在全球范围是死亡率和发病率最高的疾病。比如，心脏衰竭的发病率在激增，表现为心脏无法将足够的血液供给身体的各个器官。大约有500万美国人患病，每年增加约500000的新病人，而每年造成250000的病人死亡。尽管在过去的20年里，治疗不断有新的突破，但心脏衰竭病人数持续增加，同时成为发达国家经济发展的阻碍。
心脏衰竭的临床症候群变现为由于心脏的输出量失调和静脉压升高引起的典型症状。而且，心脏衰竭是一种进行性的紊乱，心脏功能会不断恶化且无法逆转。因此，心脏衰竭会造成心脏的输出量不足。
心脏衰竭有两种类型，一种是右侧心脏不能将静脉血泵入肺循环，造成体内积水导致肿胀和水肿。另一种是左侧心脏不能将血液泵入体循环，造成左心室后积水而引起肺内水肿。
心脏衰竭主要的后果是体液积滞。如果心脏泵血效能降低，机体需通过激素和神经信号来增加血容量等方式弥补。引起心脏衰竭的因素有很多，如，心脏组织的病变导致心肌细胞死亡，丧失功能。心肌细胞不断死亡是引起左心室功能障碍的一个原因。
现在有多种治疗和预防心脏衰竭的方法，例如，干细胞再生心脏细胞用于急性心脏局部缺血和/或梗塞或动物模型的心脏损伤。在一个特殊的病例中，由供体腿骨分离的活的骨髓基质细胞培养扩增，标记，注射到基因纯化的成年大鼠受体的心肌层。移植4天至12周的时间里收集心脏，对移植位点检测发现在心肌层环境中，移植的基质细胞表现出生长潜能(Wang，et，al)。
来自D3品系的多能胚胎干(ES)细胞的心肌细胞通过胚胎样聚集体(胚状体)可以在体内分化。在整个分化阶段，细胞可通过全细胞膜片夹技术，形态学，基因表达模拟鉴定(Maltsev，et，al.，1994)。此外，多能小鼠ES细胞可以分化成心肌细胞并可表达哺乳动物心脏的主要特征(Maltsev，et，al.，1993)。
干细胞，不管它们的来源(胚胎，骨髓，骨骼肌等)，有分化成多种，如果不是全部，细胞类型的潜能。干细胞可以分化成功能性的心肌细胞。因此，基于干细胞的心脏衰竭治疗方法优于现有的传统治疗。
相应的，需要一种治疗疾病或损伤病人的方法，这种方法将细胞治疗和使用氧化氮供体相结合。
发明概述根据本发明，提供了一种促进神经发生的方法，通过给予需要促进神经发生的病人治疗量的磷酸二酯酶抑制剂化合物。也提供了一种可以促进神经发生的化合物，含有足以促进神经发生的有效量的磷酸二酯酶抑制剂。还提供了一种促进神经发生的磷酸二酯酶抑制剂。进一步，提供了一种增大脑细胞生成和促进细胞结构和受体改变的方法，通过在需要增大的位点给予有效量的磷酸二酯酶抑制剂化合物。提供了一种提高神经和认知功能的方法，通过给予病人有效量的磷酸二酯酶抑制剂化合物。
附图的简明描述以下的详细描述和附图相结合，进一步阐明本发明的优点，其中

图1A-D显示大脑血管周长；图2A-C显示增值的大脑内皮细胞；图3A-C显示DETANONOate诱导的血管发生，三维成像分析；图4A-E显示DETANONOate体外诱导的血管发生；图5显示Sildenafil诱导的毛细管形成的定量数据柱状图；图6A-I显示Slidenafil对细胞的处理效应；图7A和B分别显示用Sildenafil处理后cGMP在小脑和皮层的水平和非缺血大鼠对照；图8显示经Sildenafil处理的大鼠的局部CBF及对照；图9A和B分别显示粘性去除试验和mNSS试验结果；图10A和B分别为用本发明的治疗方法处理室下区的BrdU阳性细胞的结果的照片和图表；图11A和B分别为用本发明的治疗方法处理血管的BrdU阳性细胞的结果的照片和图表；图12A-C照片显示本发明的方法用大脑衍生内皮细胞诱导内皮血管的形成及对照；图13图表显示和对照比较本发明的治疗方法增加VEGF分泌；图14A-G照片显示本发明治疗的结果；图15A-C柱状图显示非局部缺血年轻成年大鼠在DETANONate或生理盐水处理14及42天后，在齿状回(图15A)，室下区(图15B)和嗅球(图15C)中BrdU免疫活性细胞的数量；图16A-C柱状图显示非局部缺血老龄大鼠在DETANONate或生理盐水处理14及42天后，在齿状回(图16A)，室下区(图16B)和嗅球(图16C)中BrdU免疫活性细胞的数量；图17A-D显示SNAP处理对梗塞体积(图17A)，转圈试验(图17B)，粘性去除试验(图17C)和动物体重(图17D)的影响；图18A和B照片显示在非缺血大鼠皮层(图18A和B中的N)和局部缺血2小时到7天的大鼠的同侧皮层中，PDE5A1(图18A)和PNE5A2(图18B)mRNA的RT-PCR结果。

发明内容
总体而言，本发明提供了一种方法和一种化合物，它将细胞治疗和氧化氮供体和PDE抑制剂相结合，用于治疗多器官系统的疾病或损伤。这种结合疗法增加了两种治疗方法的疗效，而治疗风险没有增加。治疗的优点在于通过诱导神经发生，血管发生及薄壁细胞结构和功能的改变增加了器官的可塑性，而且，由于协同效应，药物剂量可以减少，从而限制药物毒副作用的发生。此外，PDE抑制剂可单独给药用于治疗。
“PDE抑制剂”指一种抑制PDE的化合物，如Slidenafil(ViagraTM)。PDE抑制剂是一种试剂，它降低(如选择性降低)或消除磷酸二酯酶的活性，如PDE1-10(如磷酸二酯酶5，磷酸二酯酶10)，及其它任何磷酸二酯酶。在本发明的方法和化合物的上下文中，磷酸二酯酶抑制剂包括盐，酯，酰胺，前体药物和其它活性试剂(如PDE)衍生物。磷酸二酯酶抑制剂放大了任何NO产生的效应。磷酸二酯酶抑制剂可用于舒血管和改善血管功能。
这些抑制剂化合物包括但不限于洛利普南，茶碱，己酮可可豆碱，环鸟苷酸，Zaprinast，IBMX，米利酮，5-(2-乙氧基-5-吗啉代乙酰基苯基)-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-(5-吗啉代乙酰基-2-n-丙氧基苯基)-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7-H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基磺酰基)-苯基-]1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7-H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-烯丙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基磺酰基)-苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-乙氧基-5-[4-(2-丙基)-1-哌嗪基磺酰基]-苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-乙氧基-5-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基磺酰基]苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[5-[4-(2-羟乙基-)-1-哌嗪基磺酰基]-2-n-丙氧基苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基羰基)苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，和5-[2-乙氧基-5-(1-甲基-2-咪唑基)苯基]-1-甲基-3-n-丙基-1，6-二氢-7-H-比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮。
磷酸二酯酶抑制剂也包括灰链菌酸衍生物，2-苯基嘌呤酮衍生物，苯基吡啶酮衍生物，融合的和缩聚的嘧啶，嘧啶并嘧啶衍生物，嘌呤化合物，喹唑啉化合物，苯基嘧啶酮衍生物，咪唑喹喔啉酮衍生物或其氮杂类似物，苯基吡啶酮衍生物及其它。磷酸二酯酶抑制剂特例包括1，3-二甲基-5-苄基吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，2-(2-丙氧基苯基)-6嘌呤酮，6-(2-丙氧基苯基)-1，2-二氢-2-氧吡啶-3-酰胺(3-carboxamide)，2-(2-丙苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶4(3H)-酮，7-甲硫基-4-氧-2-(2-丙氧基苯基)-3，4-二氢-嘧啶并[4，5-d]嘧啶，6-羟基-2-(2-丙氧基苯基)嘧啶-4-酰胺，1-乙基-3-甲基咪唑并[1，5a]喹喔啉-4(5H)-酮，4-苯基甲基胺-6-氯-2-(1-咪唑基)喹唑啉，5-乙基-8-[3-(N-环己基-N-甲基氨基甲酰基)-丙氧基]-4，5-二氢-4-氧-吡啶并[3，2-e]-吡咯并[1，2-a]吡嗪，5’-甲基-3’-(苯基甲基)-螺[环戊烷-1，7’(8’H)-(3’H)-咪唑并[2，1b]嘌呤]4’(5’H)-酮，1-[6-氯-4-(3，4-亚甲基二氧苄基)-氨基喹唑啉基-2-]哌啶-4-羧酸，(6R，9S)-2-(4-三氟甲基-苯基)甲基-5-甲基-3，4，5，6a，7，8，9，9a-八氢环戊烷[4，5]-咪唑并[2，1-b]嘌呤-4-酮，1t-丁基-3-苯甲基-6-(4-吡啶基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶-4-酮，1-环戊基-3-甲基-6-(4-比啶基)-4，5-二氢-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，2-丁基-1-(2-苄氯)6-乙氧基-羰基苯并咪唑，和2-(4-羧哌啶)-4-(3，4-亚甲基二氧苄基)氨基-6-硝基喹唑啉，和2-苯基-8-乙氧基环庚咪唑。
本发明有关的其它有效磷酸二酯酶V抑制剂包括IC-351(ICOS)；4-溴-5-(吡啶基甲基氨基)-6-[3-(4-氯苯基)丙氧基]-3(2H)哒嗪酮；1-[4-[(1，3-苯并二氧-5-甲基)氨基]-6-氯-2-喹唑啉基]-4-哌啶-羧酸，单钠盐；(+)-顺-5，6a，7，9，9a-六氢-2-[4-(三氟甲基)-苯基甲基-5-甲基-环戊-4，5]咪唑并[2，1-b]嘌呤-4(3H)-酮；furazlocillin；顺-2-己基-5-甲基-3，4，5，6a，7，8，9，9a-八氢环戊[4，5]咪唑并[2，1-b]嘌呤-4-酮；3-乙酰-1-(2-苄氯)-2-丙基吲哚-6-羧酸盐；4-溴-5-(3-吡啶基甲基氨基)-6-(3-(4-苄氯)丙氧基)-3-(2H)哒嗪酮；1-甲基-5-(5-吗啉代乙酰基-2-n-丙氧基苯基)--n-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并(4，3-d)嘧啶-7-酮；1-[4-[(1，3-苯并二氧-5-甲基)氨基]-6-氯-2-喹唑啉基]-4-哌啶羧酸，单钠盐；Pharmaprojects No.4516(Glaxo Wellcome)；Pharmaprojects No.5051(Bayer)；Pharmaprojects No.5064(Kyowa Hakko；参见WO 96/26940)；Pharmaprojects No.5069(Schering Plough)；GF-196960(Glaxo Wellcome)；和Sch-51866。
其它磷酸二酯酶V抑制剂包括但不限于DMPPO(Eddahibi(1988)Br.J.Pharmacol.，125(4)681-188)，和1-芳基萘木酚素系列物，包括1-(3-溴-4，5-二甲氧基苯基)-5-氯-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基羰基]-2-(甲氧基羰基)萘氯化氢(27q)(Ukita(1999)J.MED.Chem.42(7)1293-1305)。
“多器官系统”指影响多个器官的系统。这些器官包括但不限于心脏，肝和脑。
“氧化氮供体”指一类能够供给氧化氮或促进氧化氮增加的化合物。提供氧化氮的化合物族包括DETANONOate(DETANONO，NONOate或1-取代二氮烯-1-鎓-1，2-二醇酯(1-substituted diazen-1-ium-1，2-diolates)，为包括[N(O)NO]-官能团的化合物DEA/NO；SPER/NO；DETA/NO；OXI/NO；SULFI/NO；PAPA/NO；MAHMA/NO和DPTA/NO)，PAPANONOate，SNAP(S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺)，硝普酸钠和硝化甘油钠。能促进氧化氮增加的化合物，如磷酸二酯酶抑制剂和L-精氨酸。
这里的“促进神经发生”指神经发生被促进或增强，包括但不限于，新神经元生长或已有神经元生长增强，也指薄壁细胞及促进组织可塑性的细胞的生长和增殖。神经发生也包括但不限于轴突和树突的延伸和突触发生。
这里的“增大”指在特定环境要求下，生长被促进或抑制。因此，如果要求额外的神经元生长，氧化氮供体加入可起到促进作用。氧化氮供体或氧化氮源使大脑组织通过提高受体活性，促进细胞形态变化和细胞增殖，补偿由损伤，神经退化或老化引起的伤害。
这里的“神经”或“认知”功能指大脑的神经生长增强了病人思考，活动或更多的能力。用氧化氮治疗后，人脑细胞数增加，促进了认知，记忆和运动能力。而且，患有神经疾病或损伤的病人接受氧化氮治疗后认知，记忆，运动功能也有改善。
这里的“细胞疗法”包括但不限于干细胞给药，干细胞是一种普通的母细胞，它的子代分化成不同的细胞类型。干细胞有不同的来源，包括但不限于胚胎，骨髓，肝，间质，脂纺组织以及本领域技术人员熟知的其它干细胞来源。这些干细胞可给药或植入它们自然发生部位中需要的区域，或以本领域技术人员熟知的任何方式经工程改造植入。因此，通过各种基因工程方法，包括但不限于转化，剔除及类似的方法。干细胞可经工程改造提高存活率或满足其它需要。
这里的“富集”包括但不限于，通过适当加入或增加物质的数量或质量来提高产量。在本发明中，在心肌膜内或周围加入或增加功能较强的心肌细胞产生富集。
这里的“细胞群恢复”包括但不限于，在心肌膜内或周围加入或补充心细胞。这些细胞加强了现有功能细胞的活性，由此，代替和/或增强了已有的心细胞。
本发明的目的是，通过增大治疗效应促进神经元损伤或其它损伤的结果的改善，如神经发生和增大细胞的变化从而促进功能的提高。比如，中风后神经或功能缺失的病人，CNS损伤和患有神经退行性疾病的病人。这些发现提供了一种手段，在CNS损伤或退化后，可以提高脑的补偿机制从而改善功能。氧化氮给药诱导神经元和细胞改变可以促进中风，损伤，老化和退行性疾病后功能的改善。这一途径也可以使患有神经疾病的病人受益。这些神经疾病包括但不限于ALS，MS和Huntington’s病。此外，本发明的方法和化合物可以提高细胞治疗的疗效。
CNS损伤后在适当的时间给予氧化氮可以促进大脑的神经发生。氧化氮也可以增大细胞治疗的疗效。在初始试验中，使用DETA/NO，一种长半衰期(约50小时)的化合物，可产生NO。在中风发生24小时和24小时后给药，可鉴定新神经元数目增加。较佳的是，本发明的化合物可直接给药到损伤位点，比如，可通过口服，腹腔注射，静脉注射或其它本领域技术人员熟悉的方式给药达到预期结果。如果治疗需要，也可全身给药。
这里包括的实验数据显示了一种药物干预，目的在于诱导NO的生成从而促进神经发生。采用了三种化合物DETANONOate，Sildenafil(ViagraTM)和SNAP。这些化合物已经成功的诱导了神经发生，改善了中风后功能上的不良后果。使用的化合物可以通过血脑屏障。神经发生是神经科学研究主要的最终目的。找到一种新的促进神经元产生的方法为治疗各种神经疾病，CNS损伤和神经退化开创了新的机遇。它可能增大了未损伤大脑的神经元生成从而增强了功能。
这类促进神经元生成的药物市场很广，氧化氮供体DETANONO只是其中一种可促进神经发生的化合物。增加神经发生可以成为一种在老化，损伤和疾病中提高，改善神经，行为，认知功能的方法。
近年来，任何一种疾病引起的心脏衰竭导致功能退化的机制已经被阐明，它一定程度上缘于心脏细胞持续死亡(Sabbah，2000)。这个问题的解决方法是使用新的心脏细胞补充或恢复心肌层。这些心脏细胞可以代替死亡的细胞或额外增加已有的功能心脏细胞的数量，因此改善了病变心脏的泵血功能。本发明是基于细胞治疗来治疗疾病的。尽管干细胞有不同来源(胚胎，骨髓，肝，脂肪组织等)，它们重要的共性是有分化成机体各种不同细胞类型的潜能。如前所述，显示干细胞可以分化成心肌细胞(Maltsev et al.，1993和1994)。
本发明比现有的治疗方法都要优越，例如，现行的心脏衰竭的治疗方法主要基于药物的使用，打乱了神经体液系统。此外，现有的外科治疗包括心脏移植和使用心室或双心室辅助装置。本发明的优点在于通过直接针对根本的病因，即收缩单位的丧失，治疗心脏衰竭。干细胞可分化为收缩单位，恢复心肌层，帮助病变心脏整体功能恢复。用干细胞恢复心肌层是一种新的方法，并且直接针对问题的中心。其它优点包括没有药物治疗常引起的副作用和没有心脏移植和其它器官移植需面对的免疫排斥。
本发明有取代许多现行外科治疗甚至药物治疗的潜力。已有的装置可以通过导管将干细胞释放到病变的心脏，无需开腔手术。此外，本发明在人体医学环境和兽医学环境同样适用。
本发明治疗损伤或疾病，改善和/或维持正常功能，更特殊的是，本发明用于增大细胞治疗，疗效更明显。干细胞移植后分化为受损的细胞类型，受损细胞得以富集和/或恢复，功能也得到改善。因此，收缩单位的增加增强了心脏的功能。此外，干细胞也可以释放多种物质如营养因子。因此，例如，营养因子的释放诱导血管发生(增加血管数量)以此增强心脏功能和/或治疗心脏衰竭。所以，干细胞也可通过处理分化成功能性心肌细胞之外的多种机制增强心脏功能和/或治疗心脏衰竭。
将干细胞移植到心肌层的一般方法如下，干细胞和氧化氮供体或PDE抑制剂给药到患者体内，给药可以是皮下的不经肠的包括静脉的，关节内的，肌肉的，腹腔的和鼻内的给药以及鞘内的和融合技术给药。
“干细胞”指任何细胞治疗形式，包括但不限于造血细胞，移植到人体后有再生能力可以变成细胞系限制的祖细胞，并进一步分化增殖成特定的细胞系。这里的“干细胞”指造血细胞而不是其它类型的细胞。进一步，若无说明，“干细胞”指人造血干细胞。
“干细胞”或“多能干细胞”相互交替使用，指一种干细胞，有1)生成所有确定细胞系的子代细胞的能力；2)干细胞包括多能造血干细胞的所有血细胞类型及其子代细胞，通过自我更新能够完全重组一个无免疫应答的宿主。
骨髓是一种软组织，存在于长骨髓腔，某些哈氏导管，以及网状软骨或松质骨的小梁间隙。骨髓有两种类型红质，生命早期在所有骨中存在，成年后只存在于某些部位(如网状软骨)与血细胞和血红蛋白的产生有关(因此呈红色)；黄质，主要有脂肪细胞(因此呈黄色)和连接组织构成。
总而言之，骨髓是一种复杂的组织，包括造血干细胞，红白血细胞及其前体细胞，间充质干细胞，基质细胞及其前体，以及一组细胞包括成纤维细胞，网状细胞，脂肪细胞和内皮细胞。它们形成“基质”的连接组织网状结构。基质中的细胞通过细胞表面蛋白和分泌生长因子直接相互作用在形态上调控造血细胞的分化，同时参与骨结构的建立和维持。用动物模型进行研究发现，骨髓含“基质前体”细胞，能够分化为软骨，骨，以及其它连接组织细胞(Beresford，J.N.成骨干细胞和骨及骨髓的基质系统，Clin.Orthop.，240270，1989)。最新证据显示这些多能基质干细胞或间充质干细胞被活化后能够形成多种不同的细胞系(即骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞等)。然而，间充质干细胞在组织中和许多其它细胞(即红细胞，血小板，嗜中性细胞，淋巴细胞，单核细胞，嗜酸性细胞，嗜碱性细胞，脂肪细胞等)共存，含量极小，且随年龄增长而减少，它们在许多生物因子的影响下能够分化为一类连接组织。
所以，发明人已经开发了一种方法，从组织中分离和纯化分化前的人间充质干细胞，然后培养使其扩增成为一种骨骼肌治疗的有效工具。目的在于更大的增加间充质干细胞的数量，然后利用这些细胞指导和/或增加机体正常的修复再生功能。大量收集间充质干细胞，将其用于组织的受损区域，在体内增强或刺激再生和/或修复，通过随后的活化和分化改善不同假器官装置的移植粘性，增强造血细胞的生成，等等。
多种实验流程被开发出来，在修复，移植的位点转化，固定，激活被扩增，纯化的间充质干细胞，包括在骨髓缺损位点注射细胞，与假器官一起培养细胞及假器官移植等。因此，通过在分化前分离纯化和扩增细胞，然后根据它们所在受损组织的定位特征或移植前体外预处理控制其分化过程，培养扩增的未分化的间充质干细胞可用于不同的治疗目的以阐明多种代谢性骨病变，骨髓发育异常，软骨缺失的细胞分子，遗传失调，韧带和肌腱损伤及其它骨骼肌和连接组织紊乱的机制。
同样，多种实验流程被开发出来，在修复，移植的位点转化，固定，激活间充质干细胞或祖细胞，通过采用多种穿孔陶制载体，包括将细胞注射到损伤部位。
人间充质干细胞有多种来源，包括股骨头部松质骨填充物，可在退行性关节病人进行髋关节或膝关节替换手术时获得，以及从正常供体和需要接受骨髓移植的癌症病人吸取收集的骨髓。尽管收集到的骨髓根据其来源(即骨头片，外周血等)经多种不同机械分离过程制备，进行细胞培养分离，分离过程的关键步骤是采用了一种特别制备的培养基，它含有某些试剂，不仅可维持间充质干细胞不分化，而且使其直接粘附于培养皿表面。通过生成一种介质，使在骨髓样品中含量极少的有用的间充质干细胞有选择性粘附力，可以将其从骨髓中的其它细胞(红，白血细胞，其它分化的间充质细胞等)中分离出来。
如上所述，这种完全培养基可以应用于多种基于开始所采用的特定收集方法而选择的分离过程，制备收集到的骨髓进行细胞培养分离。就这一问题，如果使用的是松质骨髓，骨髓加到完全培养基中，混匀分散，离心使骨髓与骨碎片分离。将含有骨髓细胞的完全培养基依次通过16，18，20号针头的注射器，骨髓细胞(主要含红，白血细胞，极少量间充质细胞)被分散成单个细胞。机械分离法比任何酶分离过程都要优越，因为机械分离过程中细胞很少发生变化，而酶过程中细胞往往受到损伤，尤其是培养粘性和选择性分离所需的蛋白结合位点和/或间充质干细胞特异性抗体产生所需要的蛋白位点。单细胞悬液(约50-100×10sup.6个具核细胞)倒入100毫米平板，选择性分离出间充质干细胞。
若用吸出骨髓作为人间充质干细胞源时，骨髓干细胞(含少量或不含骨碎片但含大量血)加到完全培养基中。用Percoll(Sigma，St.Louis，Mo.)梯度分级，在下面的实施例1中有详述。Percoll梯度将占多数的红细胞和单核造血细胞与含有骨髓衍生的间充质干细胞的低密度血小板组分相分离。就这一点，血小板组分，含有约30-50×10.sup.6个具核细胞，血小板数量不确定，其中只有50-500个间充质干细胞，具体数量和供体年龄有关。低密度血小板组分倒入Petri平板，基于其细胞粘性进一步分离。
就这一点，骨髓细胞无论来自松质骨或是髂骨吸出(即初级培养物)都在完全培养基中生长，并根据实施例1中所设条件，可在Petri平板表面粘附1-7天。由于第三天后，细胞粘附没有增加，选择三天作为标准时间，用新鲜培养基替换原培养基将未粘附的细胞从培养物中清除。然后，每4天更换培养基，直到平板上细胞连片生长，约14-21天，这表示未分化的人间充质干细胞约增加10.sup.3-10.sup.4倍。
然后，细胞经一种释放试剂如胰蛋白酶EDTA(乙二胺四乙酸)液(0.25％胰蛋白酶，1毫摩尔/升EDTA(1×)，Gibco，Grand Island，N.Y.)或一种螯合剂如EGTA(乙二醇双[2-氨基乙醚]N，N′四乙酸，SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo.)分离。用螯合剂比胰蛋白酶好，因为胰蛋白酶可能裂解间充质干细胞的结合蛋白。由于这些结合蛋白包括识别位点，如果要产生单抗，则应使用螯合剂，如EGTA而不是胰蛋白酶作为释放剂。然后，将释放剂灭活，分离出的未分化的间充质干细胞培养物，用完全培养基洗涤后待用。
这些结果表明在一定条件下，培养扩增的间充质干细胞移植到多孔磷酸钙陶器中培养可以分化为骨细胞。尽管，我们并不很清楚什么内在因子影响间充质干细胞分化为骨而不是软骨细胞，是多孔磷酸钙陶器中的微观结构而不是扩散小室提供生长和营养因子，间充质干细胞可与这些因子直接接触，影响其分化为骨细胞。
因此，分离并培养扩增的间充质干细胞可在特定环境和/或某些因子的影响下分化产生组织修复所需的细胞表型。
给药单剂量间充质干细胞可以有效降低或清除T细胞对异源组织或“非己”组织的反应，尤其在这样的病例中，T淋巴细胞对从间充质干细胞分离后的异源细胞保持其无免疫反应的特性(即耐受或无反应性)。
间充质干细胞剂量范围很广，适用于任何特殊病例的要求，一般而言，对于非肠胃道给药，约0.01-5百万细胞受体每千克体重。所用细胞数根据受体体重和身体状况，给药次数或频率，及本领域技术人员熟知的变数而定。间充质干细胞可以通过适合要被移植的组织，器官或细胞的途径给药。可以全身给药，即非肠胃道的，静脉注射，或特定组织器官如骨髓，靶向释放。人间充质干细胞可通过皮下移植或注射到连接组织如肌肉的方式给药。
可将细胞悬浮于一种合适的稀释剂，浓度约0.01-5×106细胞/毫升。注射液适当的赋形剂应和细胞及受体在生物学上是可配伍的，如生理盐水缓冲液或其它合适的赋形剂。药物成分必须根据标准方法进行配方，生产，储存，并有适当的灭菌处理及稳定剂。
尽管本发明并无限制，较佳的是，间充质干细胞从骨髓中分离，经培养，即在体外，纯化，扩增以获得这里所述方法所需的足够数量的细胞。间充质干细胞，在骨中发现的成多能胚细胞，在骨髓(1∶100000)及其它间充质组织中存在的几率很低。见，Caplan和Haynesworth，U.S.Pat.No.5486359。间充质干细胞的基因传导见Gersonet al U.S.Pat.No.5591625。
除另外说明，遗传操作方法见Sambrook和Maniatis，分子克隆实验室操作指南，第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)。
本发明的方法和药物组成的详述见附录A，并全面结合参考文献。这里所给出的具体实施例并非详尽无遗，可能包括本领域技术人员熟知的在设计和方法学上的变化的其它设计。基本上能被利用的本领域技术人员熟知的任何不同的设计，方法，结构，原料都不会背离本发明的精神。
方法分子生物学一般方法本领域熟知的标准分子生物学技术不再具体描述，参见Sambrook et al，分子克隆实验室操作指南，Cold SpringHarbor Laboratory Press，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，分子生物学通用操作流程，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，分子克隆操作指南，John&Sons，N.Y.(1988)；Watson et al.，重组DNA，Scientific American Books；N.Y.和Birren et al(eds)基因组分析实验室操作指南丛书，1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.(1998)。方法学在美国专利4666828，4683202，4801531，5192659和5272057中详述，并结合参考文献。聚合酶链式反应(PCR)参见PCR操作流程方法及应用指南，Academic Press，San Diego，CA(1990)。原位(细胞内)PCR和流式细胞仪可用于检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni et al，1996，Blood 873822)。
免疫学一般方法本领域熟知的免疫学标准技术不再具体描述，参见Stites et al.(eds)，基础和临床免疫学(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)和Mishell，Shiigi(eds)，细胞免疫学方法精选，W.H.Freeman&Co.，N.Y.(1980)。
给药本发明药物的给药和剂量应符合医学用药规范，并考虑病人的临床状况，给药位点及方法，给药时间表，病人年龄，性别，体重及其它因素。根据本领域熟知的这些考虑因素决定药物“有效量”。这个量必须有效地改善包括但不局限于提高存活率或更快恢复，或改善或消除症状，以及其它通过本领域技术人员选用来作为适当的衡量指标。
在本发明的方法中，本发明的化合物可以有多种给药方式。应当注意可以化合物或药学上可接受的盐的形式给药，可以单独或作为活性成分和药学载体，稀释剂，佐剂结合给药。化合物可以口服，皮下给药或非肠胃道给药包括静脉，动脉，肌肉，腹腔和鼻内给药以及鞘内和融合技术给药。化合物移植也有效。治疗对象是暖血动物，特别是哺乳动物包括人。药学上可接受的载体，稀释剂，佐剂及移植载体一般指惰性，无毒固体或液体填充剂，稀释剂或胶囊内的原料，与本发明的活性成分不反应。
应当注意人的治疗时间比这里所列的实施例中的小鼠或其它实验动物的治疗时间要长，治疗时间的长短与疾病过程的长短及药效是相关的。剂量可以是单一剂量或几天的一段时间中给予多样的剂量，但单一剂量较佳。
剂量可以是单一剂量或几天的一段时间中给予多样的剂量。治疗时间的长短一般与疾病过程的长短，药效及治疗对象的种系是相关的。
如果本发明的化合物通过非肠胃道给药，一般配方成一个单位剂量的注射剂形式(溶液，悬浮液，乳剂)。适合注射的药学配方包括无菌水溶液或分散体，和重新组成无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如水，酒精，多元醇(如，甘油，丙二醇，液体聚乙二醇，等等)，及其适当的混合物和植物油。
合适的流动性可以通过以下方法维持，例如，用卵磷脂包被，分散剂时将药物制成适当的颗粒大小及使用表面活性剂。非水载体如棉籽油，芝麻油，橄榄油，大豆油，玉米油，葵花油，或花生油和酯类，如肉豆蔻酸异丙酯，也可作为溶剂系统。此外，可加入各种提高制剂稳定性，无菌性和等渗性的添加剂，包括抗菌防腐剂，抗氧化剂，螯合剂和缓冲液。通过不同的抗细菌和抗真菌试剂可预防微生物引起的变质，如对羟基苯甲酸酯类，氯丁醇，酚，山梨酸，等等。在许多情况下，需加入等渗剂，如糖类，氯化钠等等。延长注射剂型的吸收时间可加入阻滞吸收试剂，如单硬脂酸铝，明胶。根据本发明，任何载体，稀释剂，或佐剂与化合物都应当是可配伍的。
无菌注射溶液的制备应当结合本发明实际操作中所用的化合物，加入适当的溶剂量及其它所需成分。
本发明的药学配方可以注射配方给病人给药，可以含有任何可配伍的载体，如不同的载体，佐剂，添加剂和稀释剂；本发明的化合物也可以以下形式非肠胃道给药，如缓释皮下植入或靶向释放系统如单抗，载体释放，离子渗透，大分子基质，酯质体和微球体。本发明有用的释放系统实施例包括5225182，5169383，5167616，4959217，4925678，4487603，4486194，4447233，4447224，4439196，4475196。许多其它如植入剂释放系统和模型是本领域技术人员熟知的。
本发明的化合物的药学配方可以口服给药。传统的方法，如片剂，悬浮剂，溶液，乳剂，胶囊，粉末，糖浆等都适用。较佳的是成熟的技术，通过口服或静脉给药，且能维持其生物活性。
在一个实施例中，本发明的化合物可以首先通过静脉注射给药，以达到合适的血液浓度。然后，通过口服给药维持血药浓度。其它上述的给药形式，也可以根据具体病情采用。给药量根据接受治疗的病人，范围在约100微克每千克体重至100毫克每千克体重每天，较佳范围在10毫克每千克体重至10毫克每千克体重每天。
实施例1NO对血管发生和血管内皮生长因子(VEGF)的影响在病灶内陷大脑局部缺血大鼠模型上研究。与对照相比，在中风24小时后给大鼠全身注射一种NO供体，DETANONOate，在三维激光扫描共焦显微镜下观察，发现明显扩大了血管的周长，增加了大脑内皮细胞增值的数量和缺血区新生血管的数量。通过ELISA法检测到用DETANONOate治疗显著提高了缺血区VEGF的水平，用毛细血管形成检测法研究DETANONOate是否通过活化可溶性鸟苷酸环化酶加快缺血脑区的血管发生。DETANONOate诱导毛细管形成被可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂，1H-[1，2，4]氧杂重氮盐并[4，3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)完全抑制。用抗VEGF受体2的中和型抗体阻断VEGF的活性明显减弱了DETANONOate诱导的毛细管的形成。此外，给中风24小时的大鼠全身给药磷酸二酯酶5抑制剂(Sildenafil)明显增加了缺血部位的血管发生。Sildenafil和环鸟苷酸(cGMP)类似物也诱导毛细管生成。这些发现提示外源NO加快缺血大脑血管发生，是通过NO/cGMP途径调节的。而且，数据显示NO在一定程度上通过VEGF可以提高缺血大脑中血管发生。
用氧化氮(NO)供体治疗中风降低了功能的神经缺失。NO是一种多效分子，会影响许多生理病理功能。用NO供体治疗动物会引起大脑神经发生区的细胞增殖，例如室下区，齿状回。然而，神经功能改善的机理尚不明确。
NO治疗中风的一个潜在治疗靶点是血管发生。对中风的动物以生血管前体试剂给药，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)明显降低了神经功能失调。用NO供体培养人血管平滑肌细胞增加了VEGF合成，而NO合成酶(NOS)拮抗剂NW-硝基-1-精氨酸甲酯(L-NAME)降低了VEGF生成。内皮NO合成酶(eNOS)缺失的小鼠在缺血肢表现出明显的血管发生损伤，表明NO调节缺血组织的血管发生。因而，在NO，VEGF和血管发生之间看来好象是有关的。但是，NO供体对中风后VEGF和血管发生的作用尚未研究。相应地，NO通过环鸟苷酸(cGMP)途径增加VEGF加快血管发生的作用在病灶内陷大脑缺血大鼠模型上被检测。
材料和方法动物模型雄性Wistar大鼠重320-380克。在大脑中动脉(MCA)的起始段用一插入器将其封闭。
实验流程1)检测外源性NO是否影响缺血动物的新血管形成，将一NO供体(Z)-1-[N-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)aminio]diazen-1-ium-1，2-diolate(DETANONOate)，半衰期57小时，在生理条件下给药于缺血大鼠。中风24小时后大鼠(n＝8)静脉注射DETANONOate(0.4毫克每千克体重)然后连续六天，每天腹腔注射。给缺血大鼠(n＝8)注射等量的衰变的DETANONOate作为对照。所有大鼠在中风14天后处死。
2)检测外源性NO对脑部VEGF水平的作用，给缺血大鼠分别DETANONOate(0.4毫克每千克体重)或生理盐水(n＝3每实验组)，具体方法同1。中风7天后处死大鼠。
3)检测增加cGMP水平是否促进缺血脑部血管发生。Sildenafil溶于3毫升水(2毫克每千克体重)，喂给中风24小时的缺血大鼠(n＝8)，连续7天。中风14天后处死。
溴脱氧鸟苷标记溴脱氧鸟苷(BrdU，Sigma Chemical)，胸腺嘧啶类似物，可在细胞分裂S期结合到DNA中，用于有丝分裂标记。缺血大鼠MCA阻塞1天后，连续13天腹腔注射BrdU(50毫克每千克)。
三维成像及分析为检测缺血大脑新血管形成，给MCAo 14天的大脑缺血大鼠静脉注射异硫氰酸荧光素(FITC)标记的右旋糖苷(2×106分子量，Sigma，St.Louis.MO；50毫克/毫升的0.1毫升)。迅速将大脑取出放入4％的多聚甲醛4℃48小时。用振动切片机切冠状切面(100微米)。如前所述，切片用Bio-Rad MRC 1024(氩和氪)激光扫描共焦成像系统Zeiss显微镜(Bio-Red，Cambridge，MA)分析。从每个大鼠脑部的前囟门5.2毫米到-8.8毫米处以2毫米间距切片，选取七个100μm厚的冠状切面。从切片中选择有同侧和对侧大脑半球中的八个脑区(耳间8.8毫米，囟门0.8毫米)。这些脑区在x-y方向上以512×512象素(276×276平方微米)用4×扫描框，在z轴上以1微米的步长用25个光切面在40×物镜下观察。分别测量血管分支点，节段长度和直径。成像和分析盲法进行。
免疫组织化学及定量分析对于BrdU免疫染色，脑切片(6微米)在50％甲酰胺2×SSC于65℃温育2小时，2N HCl于37℃温育30分钟，在此过程中DNA变性。切片用tris缓冲液冲洗，经1％H2O2处理封闭内源过氧化物酶。然后，切片用鼠源的抗BrdU单抗(1∶1000，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)温育过夜再用生物素标记的二抗(1∶200，Vector，Burlingame，CA)温育1小时。
为定量BrdU免疫活性的内皮细胞，给每个大鼠的缺血病灶区十个扩张的血管进行内皮细胞和BrdU免疫活性内皮细胞计数。对侧的同源区进行相同的计数。数据用每只大鼠免疫活性内皮细胞数占总内皮细胞数的百分比表示。
如前所述，在用抗-von Willebrand因子抗体免疫染色的冠状切片上测量血管周长。
ELISA检测VEGF解剖缺血区及对侧脑半球同源组织。组织匀浆，在4℃于10000g离心20分钟，收集上清夜，用市售试剂盒进行大鼠VEGF(R&D，systems)ELISA检测。
毛细管形成检测进行体外血管生成检测。0.8毫升生长因子减量的Matrigel(BectonDickinson)加入预冷的35毫米培养皿在37℃下聚合2-5小时。小鼠大脑衍生内皮细胞(2×104个细胞)在含有DETANONOate，Sildenafil，1H-[1，2，4]氧杂重氮盐并[4，3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)，8-Br-cGMP，或大鼠抗小鼠VEGF受体2(VEGFR2，DC101，Imclone System)中和型抗体的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养3小时。随机抽取培养皿的三个区域成像，测量三个或更多个细胞的连续带的长度，作为毛细管形成的定量测量。
统计分析采用Student-Newman-Keuls法进行方差分析(ANOVA)，数据用平均值±标准差表示。P＜0.5作为显著。
结果体内DETANONOate和Sildenafil对血管发生的作用为检测外源性的NO是否增加缺血大脑的血管发生，中风24小时的大鼠用DETANONOate连续7天给药，结果显著(p＜0.01)扩大了缺血病灶周围的血管周长(图1A和1D)，但未扩大对侧脑半球的血管(图1B和1D)，和对照的同侧血管比较(图1C和1D)。扩大的薄壁管的内皮细胞有BrdU免疫活性(图2A和2B)定量分析显示在用DETANONOate处理的大鼠脑内增殖的内皮细胞数显著增加(图2C)。为进一步检测血管发生，用软件进行三维分析，测量节段数，长度和血管直径。用DETANONOate处理显著(p＜0.05)增加了缺血边界的毛细管节段数(图3A和表1)，和用相同体积衰变了的DETANONOate处理的缺血大鼠比较(图3B和表1)。在DETANONOate处理组中，毛细节段的直径较小长度较短(图3A和表1)，提示这些是新生血管。在用Sildenafil处理的大鼠体内也可观察到显著增加的血管发生(表1)。
DETANONOate和Sildenafil对脑内VEGF水平的作用为检测给药DETANONOate是否增加VEGF在大脑内的水平，用ELISA检测大鼠内源VEGF。结果显示用DETANONOate处理显著(p＜0.05)增加缺血边界的VEGF水平，从对照组(n＝3)的13.4±1.5皮克/毫升增加到实验组(n＝3)的28.9±1.0皮克/毫升。由于NO增加cGMP，DETANONOate可经cGMP途径诱导VEGF。测量了用PDE5抑制剂(Sildenafil)处理的大鼠的VEGF大脑水平，结果显示Sildenafil显著(p＜0.05)增加了缺血边界的VEGF水平(34.4±2.9皮克/毫升对对照组13.4±1.5皮克/毫升，每组n＝3)。
可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂和中和VEGFR2对DETANONOate诱导毛细管形成的作用为支持DETANONOate通过活化可溶性鸟苷酸环化酶增加缺血大脑的血管发生这一假设，通过毛细管形成检测试验进一步分析DETANONOate对血管发生的作用。当小鼠大脑衍生内皮细胞用DETANONOate培养(0.2微摩尔，图4B和4E)和仅用DMEM培养(图4A和4E)比较，看到毛细管发生显著增加。但是，当内皮细胞用DETANONate培养时有ODQ，一种可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂存在时，DETANONOate诱导的毛细管发生被完全抑制了(图4C和4E)，表明NO/cGMP信号途径参与调节DETANONOate对血管发生的作用。为检测DETANONOate是否也通过增加VEGF促进血管发生，将内皮细胞在DETANONOate(0.2微摩尔)和一种抗小鼠VEGFR2(DC101，10微克/毫升)中和型抗体中培养3小时。抗体是有活性的。内皮细胞经VEGFR2抗体处理显著(p＜0.05)降低了DETANONOate诱导毛细管发生(图4D和4E)，提示VEGF参与DETANONOate诱导血管发生。
Sildenafil对毛细管形成的作用内皮细胞在Sildenafil(100-500纳摩尔)中培养产生浓度依赖的毛细管形成(图5)。8-Br-cGMP(1毫摩尔)，cGMP的类似物，也显著(p＜0.05)增加毛细管形成(图5)。ODQ(10微摩尔)显著抑制Sildenafil诱导的毛细管形成(图5)，表明Sildenafil的血管发生依赖于内皮细胞内的sGC的活性。ODQ没有显著抑制8-Br-cGMP诱导毛细管形成(图5)，证实此作用不依赖于可溶性鸟苷酸环化酶活性。
讨论本实验的主要发现是1)中风24小时后给予DETANONOate或Sildenafil增加缺血大脑VEGF的合成促进血管发生；2)ODQ，一种可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂，完全抑制DETANONOate诱导毛细管发生；3)Sildenafil，一种PDE5抑制剂，诱导毛细管发生；4)用VEGFR2中和型抗体阻断VEGF活性减弱DETANONOate诱导毛细管形成；综上，这些数据表明外源性NO通过NO/cGMP途径促进缺血区血管发生，PDE5抑制剂(Sildenafil)增强血管发生。这些数据也提示NO，VEGF和血管发生有关。
NO在血管发生中有重要作用。然而，NO对缺血大脑血管发生的作用尚未研究。缺乏eNOS的小鼠对肢体缺血的反应中表现自发血管发生的严重损伤，给药L-精氨酸促进血管发生。在本实验中，DETANONOate给药显著增加缺血边界扩张血管的数量和内皮细胞的增殖，这和NO诱导血管扩张和内皮细胞增值的数据是一致的。
NO激活可溶性鸟苷酸环化酶，由此增加靶细胞内的cGMP。PDE5酶高度特异性水解cGMP，柠檬酸Sildenafil是一个有效的PDE5抑制剂，可以引起细胞内cGMP22积累。DETANONOate诱导的毛细管形成可被ODQ，一种可溶性鸟苷酸环化酶选择性抑制剂完全抑制，提示DETANONOate可以通过鸟苷酸环化酶的活化提高大脑血管发生。这些结果和以前报道的NO在血管发生中激活可溶性鸟苷酸环化酶一致。为进一步证明在缺血大脑，cGMP的增加对NO增进的血管发生有作用，给中风24小时的大鼠给予PDE5抑制剂(Sildenafil)。数据显示Sildenafil处理提高了缺血边界的血管发生。而且，Sildenafil和8-BrcGMP(cGMP类似物)在大脑衍生内皮细胞培养物中诱导毛细管形成。ODQ显著抑制Sildenafil，但不抑制8-BrcGMP诱导的毛细管形成，表明这一反应依赖于sGC的基础活性。因此，这一数据支持在缺血大脑NO/cGMP途径调节DETANONOate诱导的血管发生这一结论。
VEGF调节血管发生，NO和VEGF相互作用促进血管发生。高浓度的NO供体下调内皮细胞内VEGF的表达。相反，最近的研究表明内源性NO提高VEGF的合成。eNOS缺陷型小鼠对后肢缺血表现明显的血管发生损伤，给药VEGF不能改善损伤的血管发生，表明NO是VEGF诱导的血管发生的下游调节物。VEGF引起的血管发生和组织的微环境有关。数据显示外源NO提高缺血大脑的VEGF水平，阻断VEGF活性，减弱了DETANONOate诱导的毛细管形成，提示NO诱导脑内VEGF合成，而VEGF至少在一定程度上调节DETANONOate诱导的血管发生。这些发现和以前研究的NO供体衍生的NO增加VEGF合成这一结论是一致的。此外，PDE5抑制剂，Sildenafil，增加缺血大脑VEGF的脑内水平，提示cGMP极有可能对NO诱导的VEGF合成有作用。这一发现和以前对培养的人关节软骨细胞cGMP并不参与NO诱导的VEGF的上调的研究结果也是一致的。其原因可能是细胞类型不同，但尚未阐明。
血管发生是由两个生长因子家族严格调控的，VEGF和血管生成素家族，及内皮细胞和胞外基质的相互作用。VEGF和血管生成素基因的上调和中风后大脑血管发生是一致的。而且，中风诱导大脑血管内皮细胞中VEGF受体1和2的表达。给药NO供体可以在星形细胞和内皮细胞内增加内源VEGF，增加的VEGF通过和内皮细胞中上调的VEGF受体的相互作用增强缺血大脑的血管发生，这和以前证明的用VEGF治疗实验性中风增加神经发生的结论是一致的。新生血管在缺血脑中发挥作用，它们通过长期灌流功能得以修复。因此，NO和VEGF的相互作用提示用NO供体和VEGF联合治疗对血管发生有协同作用。
图1显示大脑血管周长。DETANONOate处理可扩张缺血边界的大脑血管(图1A)，但不扩张对侧脑半球同源区的血管(图1B)。图1C显示缺血边界的一根扩张血管，来自一只具有代表性的用降解的DETANONOate处理的大鼠。定量数据(图1D)显示用DETANONOate治疗中风显著增加血管周长，和对照鼠同侧血管周长相比。*p＜0.01vs同侧的。C中标线＝50微米。
图2显示增殖的大脑内皮细胞。图2A显示经DETANONOate处理的大鼠的一根扩张的薄壁血管的BrdU免疫活性内皮细胞(箭头)。图2B显示对照组大鼠的一根扩张血管的BrdU免疫活性内皮细胞(箭头)。尽管缺血诱导内皮细胞增殖(图2C，对照)，DETANONOate处理显著增加内皮细胞增殖数量(图2C，DETANONO)。*p＜0.01vs对侧脑半球，#p＜0.05vs对照组同侧脑半球。B中标线＝10微米。
图3显示DETANONOate诱导血管发生，三维成像分析。电脑成像来源于三维激光扫描共焦显微镜成像。DETANONOate处理增加新生血管数量(图3A)，和对照组大鼠的新生血管数比较(图3B)。然而，DETANONOate并不改变对侧脑半球的血管形态(图3C)。图像中的绿色和红色分别代表血管半径大于或小于7.5微米。像的大小是276×276×25立方微米，单位为微米。
图4显示DETANONOate诱导体外血管发生。小鼠脑衍生内皮细胞在不含DETANONOate(图4A)，含DETANONOate(0.2微摩尔，图4B)，含DETANONOate和ODQ(图4C)或VEGFR2抗体(图4D)的DMEM中培养3小时。DETANONate诱导毛细管形成(图4B)，这一作用被ODQ(图4C)或VEGFR2抗体(图4D)抑制。类似的结果至少在四次实验中获得。柱状图(图4E)显示毛细管形成的定量数据。*p＜0.05vs对照，#p＜0.05vsDETANONOate(0.2微摩尔)。NO 0.1和0.2代表DETANONOate0.1和0.2微摩尔。DC101代表VEGFR2抗体。
图5柱状图显示Sildenafil诱导毛细管形成的定量数据。Sildenafil(100-500纳摩尔)和8-BrcGMP诱导的毛细管形成，ODQ显著抑制Sildenafil(300纳摩尔)诱导的毛细管形成但不减弱8-BrcGMP诱导的毛细管形成。*p＜0.05vs对照，#p＜0.05vsSildenafil 300纳摩尔。Sil.＝Sildenafil。
实施例2方法用雄性Wistar大鼠进行内陷大脑中动脉阻塞，中风发生2或24小时后连续7天口服Sildenafi(Viagra)，2或5毫克/千克每天。缺血大鼠口服相同量的自来水作为对照。进行功能结果试验(错步，粘性去除)。中风28天后处死大鼠分析室下区和齿状回的梗塞体积和新生细胞。测量另外大鼠的脑cGMP水平，PDE5，局部大脑血流量。
结果在所有实验中，Sildenafil处理后显著(p＝0.05)增强神经修复。实验组间无明显的梗塞体积差异。Sildenafil处理显著(p＝0.05)增加室下区和齿状回的BrdU免疫活性细胞数量和未成熟神经元，正如在同侧室下区和纹状体中III-微管蛋白(TuJ1)免疫反应性所示。Sildenafil给药后皮层cGMP水平显著提高，非缺血和缺血大脑中均有PDE5mRNA存在。
结论大鼠中风2或24小时后Sildenafil给药提高大脑cGMP水平，引发神经发生，减少神经缺失。这些数据显示此药在临床治疗性功能失调时可促进中风后的恢复。
氧化氮(NO)是可溶性鸟苷酸环化酶的强激活剂，在靶细胞引起cGMP形成。磷酸二酯酶5(PDE5)高度特异性水解cGMP，参与cGMP信号调控。Sildenafil是一种新的PDE5抑制剂，引起胞内cGMP积累。中风大鼠NO供体给药显著提高大脑cGMP水平，诱导细胞生成，改善功能修复。功能恢复一定程度上由于NO给药引起的cGMP水平提高。因此，中风大鼠给药Sildenafil，一种PDE5抑制剂，在中风恢复过程中促进神经功能改善。
材料和方法Sildenafil是一种弱碱性化合物，在生理pH下只能部分电离，在大鼠体内半衰期为0.4小时。Viagra片剂(含100毫克Sildenafil，市售)称重并粉碎。
动物模型本试验中使用的雄性Wistar大鼠重320-380克。在大脑中动脉(MCA)的起始段用一插入器将其封闭。
实验流程实验为检测Sildenafil给药是否影响细胞增殖和神经学行为，Sildenafil溶解在3毫升的自来水中，大鼠MCA梗塞2小时后以2毫克/千克(n＝10)或5毫克/千克(n＝9)剂量连续口服7天。另一组缺血大鼠(n＝10)在MCA梗塞24小时后口服Sildenafil(2毫克/千克)连续7天。缺血大鼠(n＝9)口服相同体积自来水作为对照。功能试验和体重测量在缺血前和MCA梗塞后4，7，14，21和28天时进行。所有的大鼠在MCA梗塞28天后处死。实验也为检测Sildenafil给药是否影响大脑cGMP水平，非缺血大鼠喂服Sildenafil 2毫克/千克(n＝6)或自来水(n＝10)7天。这些大鼠在最后喂药1小时后处死测大脑cGMP水平。实验也为检测Sildenafil对大脑血流量(CBF)和血压的作用，非缺血大鼠(n＝6)喂服Sildenafil，30分钟后持续180分钟测量局部CBF和平均动脉血压。实验也为了检测大脑PDE5，非缺血大鼠和缺血大鼠在缺血发生2，4，24，48和168小时后处死(n＝3每时间点)。逆转录(RT)一聚合酶链式反应检测脑组织PDE5。
脑组织测量cGMPcGMP水平用市售低pH免疫试验试剂盒(R&D Systems Inc)测定。非乙酰化步骤的灵敏度约为0.6皮摩尔/毫升。快速取脑，分离皮层和小脑。脑组织称重在10倍体积含1毫摩尔/升3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的0.1N HCl中匀浆。
RT-PCR分析为检测PDE5在大鼠脑组织中是否存在，根据公开的PDE5A1和PDE5A2的序列合成引物。5’引物5’-AAAACTCGAGCAGAAACCCGCGGCA-AACACC-3’，3’引物5’-GCATGAGGACTTTGAG-GCAGAGAGC-3’扩增编码大鼠PDE5A1 N-末端的cDNA片段。5’引物5’-ACCTCTGCTATGTTGCCCTTTGC-3’，3’引物5’-GCATGAGGACTTTGAGGCAGA GAGC-3’扩增编码大鼠PDE5A2的cDNA片段。从脑组织中抽提总RNA逆转录合成cDNA。样品在95℃变性2分钟，然后扩增40循环。每一循环95℃变性30秒，62℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。样品(30微升每孔)用含溴化乙锭的1.5％琼脂糖电泳。
体重减少动物在内陷缺血前和之后4，7，14，21和28天称重。减少的体重用缺血前体重的百分数表示。
错步试验在缺血前和之后4，7，14，21，28天进行错步试验测试大鼠前肢定位功能失调。将大鼠放在升高的有不同大小的六边形的格栅上，爪子放在格子的边线上。它们移动的时候爪子可能在线间打滑或从格子间滑落。计数大鼠跨过格子的步数(每个前肢的移动)，记录每个前肢的总错步数。
粘性去除试验粘性去除试验用于测试体感缺失，在MCA梗塞前和之后4，7，14，21和28天时进行。
溴脱氧鸟苷标记溴脱氧鸟苷(BrdU)用于测定细胞增殖。从中风那天起连续15天腹腔注射BrdU(50毫克/千克，Sigma)。缺血28天后处死大鼠，测定室下区和齿状回的细胞增殖(见实验流程1，共4组)。
免疫组化对于BrdU免疫染色，脑切片(6微米)在50％甲酰胺2×SSC于65℃温育2小时，2N HCl于37℃温育30分钟，在此过程中DNA变性。切片用tris缓冲液冲洗，经1％H2O2处理封闭内源过氧化物酶。然后，切片用BrdU一抗(1∶100)室温温育1小时再用生物素标记的二抗(1∶200，Vector)温育1小时。反应产物用3’3’-二氨基联苯胺-四氢氯化物(DAB；Sigma)。对于鉴定未成熟神经元的III-微管蛋白(TuJ1)免疫染色，12片冠状切片在抗TuJ1(1∶1000)抗体中4℃温育过夜，然后和生物素标记的马源的抗小鼠免疫球蛋白抗体室温温育30分钟。BrdU和TuJ1双免疫荧光染色测定在切片上BrdU免疫活性细胞是否表达神经元表型。
成像分析和定量检测用石蜡包埋的6微米厚切片进行BrdU免疫活性细胞测定。11个BrdU免疫染色的切片在40倍物镜下(Olympus B×40)通过MCID计算机成像分析系统(Imaging Research)数字化分析。BrdU免疫活性细胞核在电脑显示屏上计数并在1倍焦平面上避免取样过量。室下区的侧脑室的同侧和对侧壁以及齿状回中的所有的BrdU免疫活性阳性细胞和都要计数。对于室下区，胼胝体膝节中间10.6毫米和前连合中间8.74毫米间每40片选取一片切片，共选7片。对于齿状回，颗粒体细胞层中间5.86毫米和2.96毫米间每50片选取一片切片，共8片。室下区和齿状回的BrdU免疫活性细胞核用每平方毫米的细胞数表示(均值±标准差)。取每个实验动物7个切片(室下区)和8个切片(齿状回)的密度均值。在室下区和纹状体中的TuJ1免疫活性细胞计数，用每个切片的TuJ1免疫活性细胞数表示(均值±标准差)。
相对红细胞流速度监控组织中的相对红细胞流速度用激光Doppler流速计(PefiFlux PF4流速计；Perimed AB)探针测定。在头骨前囟点后2毫米中线侧6毫米处钻一直径为1.5毫米的小洞，硬脑膜保持完整。洞上加一点矿物油，探针放在膜表面上0.5毫米处。Sildenafil给药30分钟后测相对流速。测量反映相对局部的CBF。其值用对侧脑半球值百分比表示。
梗塞体积测定在7个苏木精和伊红染色的切片上用Global Laboratory Image分析程序(Data Translation)测定梗塞体积。两个脑半球面积和梗塞面积(平方毫米)在计算机上追踪后计算。梗塞体积(立方毫米)用面积和切片间隔厚度乘积计算得到。梗塞体积用对侧脑半球梗塞体积百分比表示(间接体积计算)。
统计分析对于神经功能恢复和体重的分析，由于数据不符合正态性和方差相同，用GEE分析法代替ANOVA。用配对t检验或秩和检验检验室下区，齿状回，纹状体的两侧细胞增殖的差异。GEE法用来研究治疗对室下区，齿状回，纹状体的两侧细胞增殖的作用。所有值均用均值±标准差表示。设定p＝0.05。
结果Sildenafil对细胞增殖的作用缺血的大鼠中风发生2或24小时后用Sildenafil(2或5毫克/千克)处理，和对照大鼠比较，两个脑半球的齿状回中的BrdU免疫活性细胞数有显著(p＜0.05)增加(表1)。和对照比较，所用剂量为2毫克/千克(2或24小时)时，同侧室下区BrdU免疫活性细胞数有显著(p＜0.05)增加，所用剂量为5毫克/千克(2小时)时，两侧室下区BrdU免疫活性细胞数均有显著(p＜0.05)增加(表1)。
图6显示Sildenafil处理作用，在缺血28天后增加了TuJ1免疫活性细胞。图6A是一只大鼠的样本，和对侧室下区比较(图6B)同侧室下区中的TuJ1免疫活性细胞数有大幅度增加。室管膜细胞(图6A和B箭头)不是TuJ1免疫活性的。TuJ1免疫活性细胞在同侧纹状体中成簇存在(图6C)，和对侧脑半球同源组织比较(图6D)。抗TuJl和BrdU抗体双重免疫染色显示BrdU免疫活性细胞(图6E和G，绿色，箭头)是TuJ1免疫活性的(图6E和F，红色，箭头)。图6E是图6F和G的重合图。图6H和1分别显示室下区(n＝6每组)和纹状体(n＝6每组)的TuJ1免疫活性细胞定量数据。(*p＝0.05，**p＝0.01，#p＝0.05vs对照组。LV表示侧室。图1B和G中标线10微米，C中标线20微米)。
表1新生细胞的脑内密度

新生细胞的密度以每mm2的BrdU免疫活性细胞数表示(均值±标准差)。
★P＜0.05，P＜0.01vs对照组。
Sildenafil对未成熟神经元的作用Sildenafil给药大幅度增加同侧室下区(图6A)和纹状体(图6C)中TuJ1免疫活性细胞。TuJ1免疫活性细胞在同侧纹状体中成簇存在(图6C)。一些TuJ1免疫活性细胞表现BrdU免疫活性(图6E-6G)。定量测定显示和对照比较Sildenafil以2或5毫克/千克给药显著(p＝0.05)增加同侧和对侧室下区的TuJ1免疫活性细胞数(图6H)。和对侧脑半球同源组织及对照的同侧纹状体比较Sildenafil也显著增加同侧纹状体的TuJ1细胞数(图6I)。
Sildenafil对神经学结果的作用缺血大鼠在缺血发生2小时后，Sildenafil以2或5毫克/千克给药，和对照大鼠比较，在4-21天的错步试验(表2)和粘性去除试验(表3)结果有显著改善。而且，Sildenafil以2或5毫克/千克给药显著降低了动物体重的减少(表4)。相反，缺血28天后测量梗塞体积无明显的组间差异(表5)，提示梗塞体积对功能的改善无作用。Sildenafil也以2毫克/千克的剂量在缺血大鼠缺血24小时后给药，在7-28天的错步试验(表2)和粘性去除试验(表3)中结果有显著改善(p＝0.05)。缺血4，7，14，21和28天，经Sildenafil处理的大鼠体重减少显著(p＝0.05)降低(表4)。然而梗塞体积在实验组和对照组间无显著差异(表5)。
Sildenafil对cGMP的作用在非缺血对照组中，小脑cGMP水平(图7A，对照)高于皮层水平(图7B，对照)，这和以前的研究结果是一致的。和对照组比较，Sildenafil以2或5毫克/千克的剂量给药7天显著(p＝0.05)增加了cGMP皮层水平(图7B)。
Sildenafil对局部CBF的作用和对照大鼠比较，Sildenafil以2毫克/千克的剂量对非缺血大鼠给药显著增加了局部CBF水平(图8)。Sildenafil给药后，局部CBF持续显著增加了70分钟(图8)。
大鼠脑中的PDE5RT-PCR分析表明PDE5A1(257bp)和PDE5A2(149bp)在非缺血大脑组织中均有转录，表明有PDE5存在(数据未显示)。和非缺血对照大鼠比较，MCA梗塞后由带密度(n＝3每时间点)测定的PDE5A1和PDE5A2 mRNA水平无统计学差异。
讨论本研究表明用Sildenafil治疗病灶大脑缺血大鼠显著改善神经功能，显著增加缺血脑中的BrdU和TuJ1免疫活性细胞数。此外，Sildenafil给药显著提高皮层cGMP水平。因此，数据显示cGMP水平增加是Sildenafil给药调节神经功能改善的结果。
表2错步试验

数值是缺血后特定天数的试验数据，以均值±标准差表示★P＜0.05，P＜0.01vs对照组。
表3粘性去除试验

数值表示均值±标准差★P＜0.05，P＜0.01vs对照组。
PDE5是一种重要的cGMP水解酶。在非缺血大鼠皮层观察到PDE5mRNA和以前的实验发现大鼠中有PDE5 mRNA及其蛋白这一结果是一致的。Sildenafil柠檬酸盐是PDE5强抑制剂，引起细胞内cGMP积累。这一数据表明Sildenafil给药表明显著增加大脑cGMP水平。平行发现，给大鼠大脑切片局部给予zaprinast，它是一种PDE5选择性抑制剂，会导致cGMP释放的增加。由此，数据显示Sildenafil影响大脑PDE5。cGMP调节血管肌肉的舒血管效应。Sildenafil给药逐渐增加非缺血大鼠的CBF，和以前的体内体外试验结果一致。Zaprinast给药引起大鼠基底动脉扩张，也引起狗的大脑动脉扩张。Sildenafil以5毫克/千克的剂量给药会降低收缩期动脉血压，效应至少持续6小时。然而，Sildenafil对CBF的影响无神经保护作用，因为梗塞体积未减少，而且即使在缺血24小时后第一次Sildenafil给药是有效的，这也超过了神经保护的治疗窗。
本研究的另一发现是Sildenafil治疗显著增加了室下区和齿状回的祖细胞增殖和未成熟神经元数，由TuJ1免疫染色测定。DETANONOate给药，它是一种NO供体给药，显著提高神经发生。NO活化可溶性鸟苷酸环化酶导致cGMP形成，而Sildenafil抑制PDE5活性从而抑制cGMP降解。综上，这些数据显示cGMP调节神经发生。这些发现和以前的研究结果cGMP依赖的蛋白激酶1提高感觉神经元祖细胞增殖是一致的。值得注意的是室下区的神经元祖细胞迁移到嗅球，之后分化为成熟的神经元。这些数据和观察到的嗅觉的记忆通过cGMP浓度调节这一现象是一致的。神经元cGMP水平参与轴突和树突导向的调节。通过信号增加胞内cGMP可将轴突和树突导向从相斥转为相吸。此外，cGMP可增加海马神经元培养物和PC12细胞的神经突起。而且，老龄大鼠cGMP基线水平降低，这是由于和成年大脑比较老龄大脑中的磷酸二酯酶更加活跃地降解cGMP。老龄大脑中NO和cGMP合成降低对学习和记忆有重要影响。神经发生可以改善功能。例如，齿状回神经发生更频繁的小鼠在海马依赖性试验中表现更出色，而在这些试验中神经发生降低伴随相应的损伤。因此，Sildenafil治疗后的神经发生的增加对功能的改善有作用。总之，本研究结果表明中风后Sildenafil给药促进大鼠的功能恢复，增强神经发生。
图7显示用Sildenafil治处理非缺血大鼠(n＝6)后小脑(图7A)和皮层(图7B)的cGMP水平，对照组n＝10。
表4动物体重减轻

数值表示均值±标准差。
★P＜0.05，P＜0.01vs对照组。
表5 梗塞体积组梗塞体积％Sildenafil 2mg/kg，2h 35.2±3.3Sildenafil 5mg/kg，2h 37.7±4.3Sildenafil 2mg/kg，24h35.5±0.9对照 38.3±1.7梗塞体积是以相对于对侧脑半球的受损百分数表示(均值±标准差)。
实施例3雄性Wistar大鼠(n＝32)进行大脑中动脉阻塞手术(MCAo)，然后随机分成4个处理组，每组8只，处理在中风1天后进行。处理组包括1)生理盐水磷酸缓冲液(PBS)；2)亚治疗的DETANONOate(NN)，剂量0.4毫克/千克(ip)；3)亚治疗的hMSCs(1×106细胞，iv)；4)亚治疗的NN和hMSCs联合用药。功能结果测定包括神经学严格尺度(Neurologic Severity Scale，18点尺度)(NSS)和中风前，治疗前，治疗后7和14天的的粘性去除试验。治疗前组间数据很平衡(p＞0.30)。hMSC和NONO的相互作用可在14天观察到(p＞0.86)。然而在14天hMSC对NSS有一综合效应。用hMSC，NONO联合治疗的大鼠和对照组比较在14天NSS有显著(p＝0.01)改善，而和对照组大鼠比较，在14天hMSC低剂量组中的大鼠NSS的改善并不明显(p＝0.05)。在14天，对照组和NONO组间(p＝0.64)，hMSC和hMSC+NONO组间(p＝0.48)均无显著差异。相同的处理效应在14天的粘性去除试验也可观察到，hMSC+NONO组大鼠和对照组比较有显著(p＝0.01)改善。和对照比较，在14天hMSC低剂量组(如亚治疗量)和NONO亚治疗量组均无明显改善，p值分别为0.06和0.64。在7天，和对照组比较，神经功能NSS的改善仅在hMSC和NONO联合用药组观察到(p＝0.03)。这些数据表明和PBS对照组比较亚治疗量的hMSC和NO供体(DETA-NONOate)联合用药显著改善了功能结果。
缺血大脑的梗塞体积和MSCs和MCAo大鼠PBS(34.9±7.4％)对照组比较，hMSC(30.7±6.2％)组或NONOate(32.2±6.2％)组和hMSCs和NONOate(28.7±6.7％)联合用药组大鼠的缺血损伤体积都没有显著降低。HMSCs用人染色体特异性抗体(MAB1281)经免疫组化鉴定。脑组织中的hMSCs衍生细胞用MAB1281染色鉴定。在非hMSCs处理大鼠中未发现MAB1281阳性细胞。经MAB1281鉴定的MSCs存货并在受体大鼠的整个受损脑部都有分布。在多个区域都可观察到MAB1281阳性细胞，包括同侧脑半球的皮层和纹状体，大部分MAB1281阳性hMSCs位于缺血边界区。对侧脑半球则极少分布。HMSC和联合用药组在MAB1281细胞数增加上无显著差异。这些数据表明大脑梗塞体积并不受联合治疗的影响，进入大脑的MSCs细胞数也没有因为NO的联合给药而发生变化。
神经发生各组接收处理后连续14天注射BrdU(50毫克/千克，ip)。BrdU是胸腺嘧啶类似物标记新合成的DNA从而鉴定新生细胞。图9显示和PBS对照组(图9a，29.8±8.8/切片)比较，hMSC(2b，40.6±10.7)或/和NONOate(图9c，43.6±10.0/切片；图9d，67.4±22.8/切片)处理组与PBS对照组相比(图9a，29.8±8.8/切片)(p＜0.05)。巨噬样细胞胞质中发现的BrdU不计数。复染显示BrdU阳性细胞表达神经元标记NeuN，神经特异性烯醇化酶(NSE)和星形细胞标记GFAP。BrdU活性细胞表达NeuN，NSE和GFAP百分率分别约为3％，3％，6％。这些数据表明单独的亚治疗量NO供体和MSC治疗和PSC对照组处理动物比较并没有显著增加神经发生，而联合治疗显著促进了缺血大脑的神经发生。
血管发生扩张的薄壁血管称为母血管，在大脑缺血时的血管发生中发现。图10显示和MCAo对照组比较hMSCs处理组和NONOate处理组的同侧脑半球的扩张血管在BrdU免疫活性内皮细胞(图10a)数量上有显著增加(p＜0.05)。和hMSCs或NONOate单独处理组比较，亚治疗量的hMSCs/NONOate联合治疗组的同侧脑半球的BrdU活性内皮细胞显著增加(图10b，p＜0.05)。这些数据表明NO供体和MSC联合治疗比单治疗显著增加了血管发生。
联合治疗后增强的血管发生在图11中也有显示，图11是用1)PBS；2)NONOate；3)hMSCs；4)hMSCs+NONOate治疗MCAo后，缺血边缘血管的三维图像。图11A显示FITC-右旋糖苷灌流的大脑微血管的原始复合图像。图11B和C是由计算机得到的从原始图像衍生而来的三维图像。图11B中不同颜色代表不同血管，之间无连接。图11C中的绿色和红色分别标志血管直径小于7.5微米(红色)和大于7.5微米(绿色)。三维定量数据显示和对照MCAo大鼠比较，hMSCs和或不和NONOate联合治疗都显著(p＜0.05)增加同侧脑半球边缘区的血管分支点数。和对侧脑半球同源组织比较，hMSCs或/和NONOate处理组及PBS对照组同侧脑半球的毛细管节段显著短(p＜0.05)，表明中风后在同侧脑半球有新生血管。和对侧脑半球同源区和对照MCAo动物比较，hMSCs治疗后的同侧边缘区血管直径显著增加(p＜0.05)。扩张的血管在缺血后可发展成毛细管。和对照MCAo动物比较，单用hMSC或hMSC与NONOate联合治疗的动物的同侧脑半球的血管表面积显著增加(p＜0.05)。综上，这些数据表明单用hMSC或hMSC与NONOate联合治疗增强了缺血大脑的血管发生。这些数据补充了BrdU血管发生的数据，表明联合用药促进血管发生。
诱导血管发生的增强也可在体外大脑衍生内皮细胞小管形成试验得到证实。图12显示和对照培养基比较(DMEM，图12a)hMSC上清液(图12b)和NONOate(图12c)强烈诱导大脑衍生内皮细胞形成内皮小管。内皮细胞有大量胞间接触形成毛细管网状结构。和对照培养基(DMEM，1.4±0.1毫米/平方毫米)比较，hMSCs(6.9±0.72毫米/平方毫米)培养物上清液和NONOate处理组(4.6±0.6毫米/平方毫米)中的小管总长度显著增加(p＜0.01)。和NONOate比较，hMSCs培养物上清液的中的小管总长度显著增加。这些数据显示hMSCs和NONOate都促进毛细管形成。
VEGF为进一步研究诱导血管发生和神经发生的机制，联合治疗诱导神经营养和生长因子的表达这一现象被检测。数据以MCAo动物接受MSCs，DETANONOate，联合(MSC+NONO)治疗，对照PBS处理后大脑内血管内皮生长因子(VEGF)水平表示。图13显示用三明治ELISA方法，和MCAo对照组比较，hMSCs和NONOate联合处理组中的内源性细胞分泌的VEGF(大鼠VEGF)显著增加。在单hMSCs处理组中大鼠VEGF分泌仅有很少量增加。和MCAo对照组比较，单一剂量NONOate单处理组的VEGF无显著增加。这些数据表明亚治疗量的MSC+NONO联合治疗比单治疗显著增强VEGF的分泌。
实施例4对正常非缺血动物诱导细胞增殖给正常年轻成年大鼠NO供体给药，在三个脑区齿状回，嗅球(OB)和室下区(SVZ)检测其对诱导细胞增殖的作用。选择一种NO供体，DETANONOate，因为这种化合物是一种高效NO供体，在生理条件下半衰期57小时(Beckman，1995Estevez et al.，1998)。年轻雄性Wister大鼠(3-4月)在实验第一天接受连续4次静脉注射DETANONOate(0.1毫克/千克，每15分钟，总剂量0.4毫克/千克)然后连续六天腹腔注射DETANONOate(0.4毫克/千克)。对照组大鼠注射生理盐水。BrdU作为有丝分裂标记检测细胞增殖。动物从第一天实验起连续15天腹腔注射BrdU(50毫克/千克，Sigma)。在14天和42天将动物处死。BrdU免疫活性细胞核在电脑显示屏上计数并在1倍焦点平面上避免取样过量。结构通过对每个切片(OB)选择设定区域或对每个切片(SVZ和齿状回)分析整个结构取样(Zhang et al.，2001)。这些区域内所有BrdU免疫活性阳性细胞核数用BrdU免疫活性阳性细胞数/平方毫米表示。所选切片的密度取平均得到每个动物的密度均值(Zhang et al.，2001)。
图15显示接受DETANONOate给药的年轻成年大鼠脑内细胞增殖。在齿状回(图15A)，SVZ(图15B)和OB(图15C)中观察到BrdU活性细胞数显著增加。齿状回中大于95％的新生细胞表达神经元标记NeuN和MAP2，表明这些细胞有整合到组织中的潜能。SVZ和OB中的细胞不能被双标记的免疫组织化学鉴定。但在形态上它们和增殖细胞相似。侧室SVZ中的祖细胞迁移到嗅球(Alvarez-Buylla et al.，2000)。因此这些数据明确表明NO在发育大脑中和细胞增殖，迁移有关，在成年大脑中诱导细胞增殖和迁移。在这些研究中仅细胞增殖在两个实验组都测定，细胞增殖的行为和功能的影响未测定。但是，有数据支持齿状回中的细胞增殖可以改善小鼠的学习(Gould和Gross，2002)。
年轻成年大鼠(3-4月)通过NO供体诱导神经发生，在老龄鼠中检测这一现象是否存在。为验证这一假设，18个月雄性Wister大鼠接受DETANONOate处理，实验流程和年轻大鼠相同。图16显示三个脑区，齿状回(图16A)，SVZ(图16B)，OB(图16C)中的细胞增殖，描述方法同年轻鼠。和年轻大鼠一样，DETANONOate显著增加了增殖细胞数。生理盐水处理组动物，SVZ和齿状回中的细胞增殖基线下降了约2个数量级。在老龄大鼠和年轻大鼠的SVZ和齿状回中，DETANONOate增加细胞增殖的比率相近。老龄大鼠OB中增殖细胞数的相对增加没有年轻大鼠幅度大。这可能因为和年轻大鼠比较，老龄大鼠细胞丧失了迁移的潜能。
这些数据提供了新的重要的观察结果。一个是细胞增殖在老龄动物体内可以像年轻动物一样被诱导，且增殖的百分数也相似。然而，很明显的，细胞增殖的绝对数量老龄大鼠比年轻大鼠降低了。老龄动物细胞增殖的功能联系未测定，因此我们没有数据说明枢锥细胞增加是否可以改善功能。
NO供体增强中风后的功能恢复已有数据显示DETANONOate在非缺血年轻大鼠和内陷中风的年轻大鼠中诱导细胞增殖(Zhang et al.，2001)。中风后一天开始治疗可以得到显著的功能效果。因此，数据显示在动物被诱导发生包括大脑中动脉(MCA)的缺血中风1天后给予可释放NO的药学试剂给药，可以改善功能结果(Zhang et al.，2001)。
至于NO试剂诱导神经发生和功能改善的特异性，问题在于DETANONOate有特异性作用还是类似的可供给NO的其它试剂同样有效，为检测这个问题，大鼠用另一种NO供体，S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP，Sigma)处理，其结构不同于DETANONOate。年轻雄性成年Wister大鼠接受内陷MCA阻塞手术(Zhang et al.，1997)。内陷MCA梗塞24小时后给大鼠静脉注射SNAP，剂量30微克/千克，然后以300微克/千克/小时灌输60分钟。对功能结果测定，用转圈试验评价运动功能例如协调和平衡(Zhang et al.，2000)，粘性去除试验测定前肢体感运动不对称性(Schallert et al.，2000)，治疗前和治疗后2，4，7和14天测体重。中风14天后将动物处死测梗塞体积(Zhang et al.，1997)。图17显示生理盐水和SNAP处理组的梗塞体积和功能性结果测量值。对照组和非对照处理组(图17A)间大脑梗塞体积无显著差异。然而，中风4天后转圈试验(图17B)和粘性去除试验(图17C)的结构有显著改善，这些效果一直持续到中风14天后动物被处死。动物体重(图17D)，作为一般生理健康指标，中风7天后和生理盐水对照组比较，显著增加。这些数据明确表明NO供体如SNAP治疗不影响大脑梗塞体积(图17A)，对动物功能改善有显著的好处。因此，治疗的作用是一种修复治疗，而不是神经保护治疗。这些数据表明药学试剂，如NO供体，可以增强中风后的功能。这些动物功能的改善和大脑的变化和重塑相关。神经发生，细胞增殖以及血管发生和突触蛋白水平提高是由NO供体分子诱导的。
NO是一种可溶性鸟苷酸环化酶激活剂，导致靶细胞内cGMP增加(Ignarro，1989；Garthwaite和Boulton，1995)。cGMP和轴突延伸的变化以及神经元连接的修饰相关(Williams et al.，1994)。cGMP可能在促进大脑可塑性中起了重要作用。大鼠接受NO供体处理后大脑cGMP水平增加，表明NO供体进入大脑(Zhang et al.，2001)。另一种诱导大脑cGMP增加的方法是抑制降解cGMP酶的活性。磷酸二酯酶5(PDE5)高度特异性水解cGMP(Corbin和Francis，1999；Kotera etal.，2000)。所以，一种在脑内降低cGMP降解，因而提高cGMP水平的方法是降低或抑制PDE5。为测定PDE5抑制剂化合物给药后的作用，在中风发生24小时后连续7天给成年雄性大鼠喂服sildenafil(2毫克/千克)。图18显示大脑内有PDE5存在。通过一个功能结果测定试验显示，给动物喂服Sildenafil显著改善功能(Zhang et al.，2002)。此疗效并不是通过降低大脑梗塞产生的，和其它NO供体相似。因此，这些数据显示cGMP是中风后重要的大脑可塑性调节因子。此可塑性也可改善功能反应。
总体而言，这些数据表明影响NO和cGMP的试剂可以改变正常，老化的，损伤的大脑。不仅细胞增殖和血管发生增加了，而且能获得显著的功能疗效。另外有基于细胞的方法诱导中风和神经损伤后大脑的重塑和功能的改善。有一种有临床效果的方法，是采用细胞群，如骨髓基质细胞。这些细胞注射啮齿类动物后进入大脑，引起产生多种神经营养因子和细胞因子的产生，从而重塑大脑，产生显著的功能效果(Review，Chopp和Li.，2002)。
图15包括柱状图，显示非缺血年轻成年大鼠在接受DETANONOate或生理盐水处理后14和42天，齿状回(图15A)，室下区(图15B)，嗅球(图15C)中的BrdU免疫活性细胞数。*p＜0.05和**p＜0.01vs生理盐水处理组。
图16包括柱状图，显示非缺血老龄大鼠在接受DETANONOate或生理盐水处理后14和42天，齿状回(图16A)，室下区(图16B)，嗅球(图16C)中的BrdU免疫活性细胞数。*p＜0.05和**p＜0.01vs生理盐水处理组。
图17显示SNAP处理对梗塞体积(图17A)，转圈试验(图17B)，粘性去除试验(图17C)和体重(图17D)的影响。*p＜0.05和**p＜0.01vs生理盐水处理组。n＝8每组。
图18显示非缺血大鼠皮层(图18A和18B中的N)和大鼠缺血后2小时-7天同侧皮层中PDE5A1(图18A)和PDE5A2(图18B)mRNA的RT-PCR结果。M＝标记物，N＝非缺血大鼠，2小时，4小时，1天，2天和7天＝缺血后时间。
结论基于NO和cGMP的药物治疗诱导大脑的变化，促进中风后功能的恢复，诱导正常年轻和老龄动物细胞增殖和神经发生。这些数据，和其它对于细胞治疗促进大脑可塑性的研究，为治疗神经退化疾病和神经损伤开创了新的机遇。
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权利要求
1.一种促进神经发生的方法，包括以下步骤，给需要促进神经发生的病人给予治疗量的磷酸二酯酶抑制剂化合物。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包括给予病人的细胞治疗。
3.一种促进神经发生的化合物，包含足以促进神经发生的有效量的磷酸二酯酶抑制剂。
4.如权利要求3所述的化合物，进一步包括病人的细胞治疗。
5.一种神经发生促进剂，包括带有药用载体的磷酸二酯酶抑制剂。
6.如权利要求5所述的神经发生促进剂，其中，所述磷酸二酯酶抑制剂增大组织中的氧化氮。
7.如权利要求6所述的神经发生促进剂，其中，所述磷酸二酯酶抑制剂是sildenafil。
8.一种增大神经元产生的方法，通过在需要增大的位点给予有效量的磷酸二酯酶抑制剂。
9.如权利要求8所述的方法，进一步包括位点的细胞治疗。
10.一种增加神经功能的方法，通过给予病人有效量的磷酸二酯酶抑制剂。
11.如权利要求10所述的方法，进一步包括给予病人的细胞治疗。
12.一种增加认知和神经功能的方法，通过给予病人有效量的磷酸二酯酶抑制剂化合物。
13.如权利要求12所述的方法，进一步包括给予病人的细胞治疗。
全文摘要
一种促进神经发生的方法，通过给予需要促进神经发生的病人治疗量的磷酸二酯酶抑制剂化合物。一种用于神经发生的化合物，含有足以促进神经发生的有效量的磷酸二酯酶抑制剂。一种促进神经发生的磷酸二酯酶抑制剂。一种增大脑细胞生成和促进细胞结构及受体改变的方法，通过在需要增大的位点给予有效量的磷酸二酯酶抑制剂化合物。一种提高神经功能和认知功能的方法，通过给予病人有效量的磷酸二酯酶抑制剂。
文档编号A61P25/28GK1638775SQ03804881
公开日2005年7月13日 申请日期2003年1月6日 优先权日2002年1月4日
发明者迈克尔·乔普 申请人:亨利福尔德健康组织