专利名称：将mal蛋白作为肿瘤标记的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及将MAL蛋白作为上皮性肿瘤及其他人类病理学中的新型标记与分子目标的应用。本发明主要包括制药/生物诊断部分，用于卫生保健/临床领域。
背景技术：
对不同类型肿瘤诊断和/或预后的描述，是通过肿瘤形态学检查、肿瘤细胞组织学分析以及与肿瘤进展相关的标记的表达的免疫组织化学分析来实现的。而在某些情况下，遗传学及细胞遗传学资料或其他任何天然资料也支持了这些评估。特异标记表达的或特异标记表达缺少的免疫组织化学分析是有助于对肿瘤形成阶段进行详细描述并建立导向治疗的方法之一(Rosai and Ackermann，1996)。
人类MAL基因最初是在寻找T淋巴细胞分化处理中表达的基因时被鉴定出来的(Alonso and Weissman，1987)，它位于人类2号染色体的短臂上(Alonso et al.，1988)。除了T淋巴细胞之外，MAL基因还在髓磷脂形成细胞(少突胶质细胞与许旺氏细胞)(Kim etal.，1995；SchaerSchaeren-Wiemers et al.，1995)及一些上皮源性的极化细胞株(Zacheti et al.，1995；-Belmonte et al.，1998)中表达。由MAL基因编码的蛋白(简称为MAL)，是一种约17,000道尔顿、具有若干疏水性片段及一些潜在免疫原性疏水区的膜内在蛋白(integral membrane protein)(Alonso and Weissman 1987；Weissman and Alonso 1989)。一种能够识别人类MAL蛋白，被称为单克隆抗体6D9的小鼠单克隆抗体的出现，开辟了对MAL的生物化学及功能描述的道路(Martn-Belmonte et al.，1998；Millán and Alonso，1998)。当与富含糖脂与胆固醇的细胞膜段相关联时，MAL蛋白能得以提纯。上述的细胞膜段由复杂的脂质膜混合物组成，后者的主要特性是4℃下不溶于非离子去污剂(如三硝基甲苯(Triton)-100)(Brown and Rose，1992)。在完整的细胞当中，这些膜形成名为″脂质筏″的细微区域，分布于细胞表面或细胞内部(Simons and Ikonen，1997；Brown and London，2000)。脂质筏的存在最初是用来解释极化上皮细胞中，特定蛋白质是如何转运到细胞顶端表面的(Simonsand Wanding-Ness，1990)，而最近发现，其他细胞类型的细胞内蛋白质转运，以及T淋巴细胞、B淋巴细胞、肥大细胞与成纤维细胞中的细胞信号传导过程，也涉及了这些脂质筏。在极化的上皮细胞及T淋巴细胞中，MAL主要分布在细胞内结构上，而较少分布在质膜上(Millán et al.1997)。在一系列研究中，使用了反义寡核苷酸来降低MAL蛋白，并使用了被称为马-达二氏犬肾细胞系(MDCK)及Fischerrat tyroid(FRT)细胞的上皮极化细胞作为模型。这些研究表明，MAL蛋白是一种蛋白装置的基本成分，后者参与了转运到膜内在蛋白、以及糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白及分泌蛋白顶端表面，(Puertollano etal.，1999；Cheong et al.，1999；Martn-Belmonte et al.，2000，2001)。在T淋巴细胞中，除了在胞内运输中可能发挥作用外(Millán etal.，2002)，MAL蛋白还可能参与了细胞信号传导过程，这提示MAL蛋白与LCK蛋白酪氨酸激酶(这类细胞中激活装置的一种基本成分)有关联(Millán and Alonso，1998；Alonso and Millán，2001)。
在各种类型的细胞中，将蛋白转运到质膜是细胞正常功能的一个基本过程。细胞极性的丧失是肿瘤转变及其他病理的一个极其普通的现象(Schoenenberger and Matlin，1991；Fish and Molitoris，1994)，并且是引起上述这些病理的最有可能的原因之一。无论是肿瘤转变如何影响转运装置组分，还是一些转运装置组分表达的维持或丧失如何影响肿瘤的晚期进展或治疗，人们对其了解的都不是很详细。所有这些考虑已引导了我们去检测MAL蛋白在不同上皮细胞及其他细胞类型的表达，并在比较MAL蛋白在正常组织与在来源于相同组织的不同类型肿瘤中的表达时，研究MAL蛋白的亚细胞表达和/或分布是否存在差异。尽管MAL蛋白在上皮细胞转运过程中具有重要的作用，但到目前为止，还没有人使用MAL蛋白作为标记以鉴定肿瘤或其他影响上皮细胞的病理。中隔膜的主要B细胞淋巴瘤与MAL表达具有良好的相关性(Copie-Bergman et al.，1999)。除此之外，当病理所影响的细胞是通常表达有MAL的细胞(如T淋巴细胞、肥大细胞、髓磷脂形成细胞或其他任何细胞类型)时，也并没有使用MAL蛋白作为标记。目前还无法确定，MAL在纵隔B细胞淋巴瘤的表达是否是由于MAL在这些细胞中的异常表达所造成，还是恰恰相反，表明了较少的淋巴细胞数，而后者可能是纵隔B细胞淋巴瘤的预兆。
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发明内容
发明简要描述被称为MAL的膜内在蛋白已被鉴定为上皮细胞内极化转运装置的一个基本组分(Puertollano et al.，1999，Martn-Belmonte et al.，2000 and 2001)。为了鉴定表达MAL蛋白的不同细胞类型，并接着研究MAL蛋白表达和/或分布的变化与病态细胞阶段进展的相关性，我们通过使用能够识别人类MAL蛋白的小鼠单克隆抗体6D9，第一次对MAL在许多人类组织上的表达进行了广泛的免疫组织化学分析。该分析有助于我们鉴别MAL在上皮细胞、T淋巴细胞、肥大细胞与髓磷脂形成细胞等特殊类型上的表达。在针对各种肿瘤类型(作为影响这些肿瘤类型的病理学例子)的免疫组织化学研究中，我们发现了一些特殊肿瘤类型并没有显示出MAL的表达和/或存在MAL细胞分布的任何变化。这一发现提示，对MAL在肿瘤与其他病理组织表达和/或分布的研究，有助于对病理样本作出更好的鉴定，有助于预后判断或诊断，有助于早期肿瘤形成的检测以及更好地了解肿瘤的转变。本发明独特之处在于通过检测MAL蛋白，以此作为标记，对肿瘤或其他影响上皮细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、髓磷脂形成细胞或其他通常表达有MAL的细胞类型(除纵隔初期B细胞淋巴瘤外)的病理进行预后判断或诊断。本发明的另一个特殊目的是使用能特异识别MAL蛋白的单克隆或多克隆抗体来检测MAL蛋白。制备与开发能够特异识别MAL蛋白的单克隆或多克隆抗体的工序及方法，在本技术领域里得到了广泛的描述以及很好的认识(Martin-Belmonte etal.，1998；Millán et al.，1998)，因此，使用这些抗体检测肿瘤细胞的MAL蛋白，是本发明的一个部分。本发明的一个更特殊的目的是使用单克隆抗体抗-MAL 6D9，通过免疫组织化学来检测并鉴定正常细胞及肿瘤细胞的MAL蛋白。另一方面，对编码MAL蛋白的核苷酸序列的鉴定，如RNA，其表达结果表明MAL蛋白能够由本技术领域的现有工序及工具实现(Sambrook et al.，1989)，以及其他技术，如使用特异互补探针的Northern blot分析，或者使用模板cDNA的聚合酶链式反应，都是本发明的一部分。
细胞极性的丧失在肿瘤转变及其他病理中是一个极其普通的现象，其改变了受影响细胞的形态及特性(Schoenenberger and Matlin，1991；Fish and Molitoris，1994)，并且与其疾病发生有关，这在小窝(caveolin)蛋白中已得到了证实，而后者也是转运装置的组分(Razani et al.，2000)。因此，改变MAL蛋白(为病变细胞转运装置的基本组分)水平的治疗措施，能够引人注目地改变这些细胞的转运(这在正常极化细胞已有发生)(Puertollano et al.，1999，Martn-Belmonte et al.，2000)，并因此改变疾病的进程或其治疗。
发明详细描述我们已经对MAL蛋白在许多人类正常组织中的表达及分布进行了免疫组织化学研究，并把研究结果与肿瘤分析所获得的结果相比较，以作为影响上述这些组织的病理学例子。我们已经发现，MAL的表达水平和/或分布模式在正常组织与一些分析过的肿瘤中存在差异。
1.正常人类组织获得的MAL表达结果MAL蛋白在不同上皮细胞及内分泌腺与外分泌腺的表达，以及在成纤维细胞内皮细胞与骨胳肌及非横纹肌中无可检测得到的表达，是我们在已进行的对正常人类样本免疫组织化学分析(结果归纳于表1)中所发现的一些共同特征。在分析过程中所发现的其他一般观察结果是，MAL表达存在于肥大细胞及外周神经轴突周围的髓磷脂中(表1)。
MAL在正常人类样本表达的免疫组织化学分析中获得的一些显著结果简要描述如下-在皮肤方面，在汗腺外分泌腺细胞的顶端区域及末端汗管发现有MAL表达，但在角质化扁平上皮细胞、真皮或皮下纤维脂肪组织均未发现有MAL表达。
-在评价胃肠道的MAL表达方面，我们分析了食道、胃、回肠、结肠、肝脏及胰腺的样本组织。复层扁平上皮细胞MAL表达呈阳性，而在大部分顶端细胞层，染色尤为强烈。当复层上皮细胞于胃上皮细胞处结束时，胃的扁平柱状上皮细胞(包括粘液产生细胞)MAL表达染色阳性。此外，特别是产生胃酸及内因子的壁细胞及分泌消化酶的主细胞，均与抗MAL抗体产生高度免疫反应。在小肠，包括潘氏细胞(Paneth cells)在内的肠腺基质细胞染色阳性，而越靠近绒毛表面染色越逐渐变弱。MAL在绒毛内的细胞、肠上皮细胞及粘液产生细胞的分布模式与在其他极化上皮细胞中所观察到的相类似，即存在颗粒状核强染色，而在基底面或侧面均检测不到染色。该分布相当于高尔基体区。在培耶氏斑(Peyer plaques)，副皮质区的淋巴细胞以及生发中心一些散在的细胞均呈阳性。形成高内皮微静脉的内皮细胞具有普通的MAL核分布。在穿过所有胃肠道的肠肌丛及粘膜下丛，MAL表达呈强阳性。相反地，粘膜肌鞘的扁平肌以及肌鞘的横纹肌均没有染上抗-MAL抗体。MAL在大肠的表达及分布与以上描述的其在小肠的表达及分布相类似。
-在正常肝脏中，位于小叶中心区周围的肝细胞，抗-MAL抗体染色呈颗粒状胞浆染色。窦状隙表面及枯否(Kupffer)细胞呈阴性，而胆管上皮细胞呈弱阳性。胰腺外分泌部的腺泡细胞呈颗粒状核染色。在胰腺内分泌部，胰岛的一些分散细胞MAL表达呈阳性。
-在泌尿生殖道的许多区域，MAL表达均呈阳性。因此，在肾小管的特定区域发现有MAL表达(图1)。在肾皮质，近曲小管处检测到了MAL，而在远端小管则没有检测到(图1a)。在一些细胞中，染色较为显著，而在其他细胞中则较淡(图1b)。在肾小球染色呈阴性，而在髓质则发现有强MAL表达；在集合小管有其特有的核颗粒分布(图1c及d)。泌尿道(膀胱及尿道)移行上皮细胞的MAL表达呈高度阳性。
-我们分析过的造血组织包括胸腺、淋巴节及扁桃体。在胸腺，MAL表达主要局限于皮质，髓质染色较低。淋巴节及扁桃体的染色结果十分相似。染色局限于副皮质区淋巴细胞(T-细胞区域)及滤泡内散在的淋巴细胞。与其他内皮细胞缺乏MAL表达相反，高内皮微静脉(毛细血管后微静脉)MAL染色阳性，且通常呈顶端分布。树突状细胞及滤泡树突状细胞则呈阴性染色。
-在肺部，支气管及细支气管的纤毛柱状上皮细胞与粘液产生细胞呈阳性染色。染色局限于细胞的顶端部分。在腺泡，限定肺泡壁的肺I型细胞呈阴性，而分泌表面活性物质成分的肺II型细胞则呈高度阳性。
-在肾上腺，髓质具有强烈标识提示MAL表达，并呈典型颗粒状分布。尽管全部皮质层皆呈阳性，但MAL表达在网状区更为显著。如同我们先前已描述的那样(Martn-Belmonte et al，1998)，甲状腺上皮细胞有MAL染色并呈其特有的颗粒状核分布。在睾丸，间质细胞呈高度抗体染色而支持细胞呈弱染色。前列腺上皮细胞MAL表达也呈阳性。
表1MAL在不同组织分布的简要结果
2.从人类肿瘤获得的MAL表达结果我们应用免疫组织化学法检测MAL在不同类型的肾及甲状腺肿瘤上的表达与分布，并与正常组织相比较。所研究的肾肿瘤包括肾癌的主要类型透明细胞肾癌(5例)、乳头状肾细胞癌(5例)、厌铬(cromophobic)肾细胞癌(5例)、肉瘤样肾细胞癌(2例)及肾脏钩状细胞瘤(3例)。所研究的甲状腺肿瘤包括甲状腺乳头状癌(4例)、滤泡性癌(2例)及未分化癌(1例)。按照已制定的肾脏肿瘤分类标准(Rosai et al.，1992)，通过行切片苏木素染色，根据形态学标准对肿瘤样本进行分类。
肾脏肿瘤透明细胞肾癌占肾细胞癌的70-80％。根据细胞质呈透明或颗粒状外观，在组织学上可以分为两种类型。在任何透明细胞肾癌中均检测不到MAL的表达(图2a)。相反地，颗粒细胞癌的细胞质呈颗粒型强MAL蛋白染色(图2b)。厌铬癌占肾细胞癌的近5％。厌铬癌细胞表现出呈弥漫分布的强染色，在细胞顶端部分及一些细胞中染色较其他细胞强(图2c)。乳头状癌占肾癌的10-15％。这些癌的染色与正常肾脏相似(图2d)。在良性肾肿瘤中，肾脏钩状细胞瘤占肾肿瘤形成的近5％。肾脏钩状细胞瘤检测呈强烈细胞质MAL染色(图2e)。肉瘤样癌占肾细胞肿瘤的近1％。在肉瘤样肾癌中检测不到MAL表达(图2f)。
甲状腺肿瘤乳头状癌占甲状腺肿瘤的近65-80％。在全部乳头状甲状腺癌中，未发现抗-MAL抗体染色。占甲状腺肿瘤10-15％的滤泡性甲状腺癌，在顶端区域呈弥漫性染色，而与此相反，正常甲状腺在此区域呈颗粒状染色。未分化癌(anaplasic carcinoma)是一种罕见的侵袭性肿瘤，占甲状腺癌的5％不到。在未分化癌中，只有一些细胞被染色，且呈膜片状染色，而在正常甲状腺滤泡则为典型的颗粒状。
总之，我们的结果表明1)在许多细胞类型中均有MAL蛋白表达，2)在一些肿瘤类型中，MAL蛋白的表达产生了引人注目的变化，3)在一些肿瘤类型中所观察到的MAL表达的变化，对于肿瘤的恶性进展可能是必需的，并可能决定其形态及特性。因此，MAL蛋白可以作为一种标记，以便更详细地描述通常表达有MAL的肿瘤(第1条和第2条)，而临床控制MAL表达水平可能有助于改变肿瘤的进展或肿瘤治疗(第3条)。虽然我们的研究集中在对上皮肿瘤的分析，但我们的观察结果可以延伸到目前的研究中其他未经鉴定的细胞类型以及肿瘤转变的其他不同病理类型。
图1MAL蛋白在人类肾脏的表达及分布的免疫组织化学分析。(a)肾皮质。近曲小管(箭头所示)为MAL表达阳性，而肾小球(箭头所示)则为阴性。(b)在更高放大倍率下，通过在一些细胞加强染色，可以鉴定区别开近端小管所观察到的染色模式。(c)髓质。集合小管有很强的抗-MAL抗体染色。(d)在更高放大倍率下，可以鉴定出MAL蛋白在集合小管的典型颗粒状核分布(箭头所示)。
图2MAL蛋白在不同类型人类肾脏肿瘤的表达及分布的免疫组织化学分析。(a)透明细胞肾癌。在肿瘤细胞中没有发现MAL的表达，但相邻正常细胞染色阳性。(b)颗粒状癌。所有细胞均发现有强染色。(c)厌铬肾细胞癌。全部细胞均发现有弥漫性染色，但细胞的染色强度不同。(d)乳头状肾细胞癌。细胞顶端侧面的染色更为显著，但细胞的染色强度有所不同。(e)肾脏钩状细胞瘤。上皮细胞呈现细胞质颗粒状强染色。(f)肉瘤样肾细胞癌。未发现有抗-MAL抗体活性。
具体实施例方式
范例1.利用单克隆抗体抗-MAL6D9对正常组织及肿瘤组织进行制备、染色及鉴定。
组织样本是作为普通外科标本从de la Princesa医院病理科(马德里)获得的。全部样本用10％中性福尔马林固定，按一般加工方法试验，然后进行石蜡包埋。将5-μM的石蜡切片封片于涂有L-多聚赖氨酸的载片上。石蜡切片脱蜡后，立即在装有200mM柠檬酸缓冲液(P.H.6.0)的高压锅中处理1分钟。然后标本用经Tris-HCI盐缓冲液(P.H.7.6)1∶20稀释的正常兔血清封闭，具体如前所述(Marazuelaet al.，1995)。切片继续用单克隆抗体抗-MAL 6D9的1∶50稀释制剂孵化(该抗体是通过将单克隆抗体的杂交瘤灌入小鼠体内，由产生的腹水中获得)(Martn-Belmonte et al.，1998；Millán et al.1998)，然后用特异抗兔IgG的过氧化物酶标记的兔抗体孵化(Dako A/S，Glostrup，Dinamarca)。每次孵化后，均用Tris-HCI盐缓冲液冲洗3次。切片用含3，3-四氯化二氨基联苯(Sigma Chem.Co.，St.Louis.USA及过氧化氢的Graham-Karnovsky媒介显影。依照普通方法进行切片的苏木素染色(Carazzi法)、脱水干燥及封片。每一标本至少有4个样本标上密码，并由两个专家独立地进行分析。
权利要求
1.一种检测MAL蛋白或其前体物质的应用，其特征在于，以所述检测作为标记，对肿瘤或其他影响上皮细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、髓磷脂形成细胞或其他通常表达有MAL的细胞类型(除纵隔的初期B细胞淋巴瘤外)的病理进行诊断或预后判断。
2.根据权利要求1所述检测MAL蛋白的应用，其特征在于，所述肿瘤为肾及甲状腺肿瘤。
3.根据权利要求1和2所述检测MAL蛋白的应用，其特征在于，它是通过能特异识别MAL蛋白的单克隆或多克隆抗体进行的。
4.根据权利要求3所述检测MAL蛋白的应用，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体抗MAL 6D9。
5.检测MAL蛋白的前体物质的应用，其特征在于，它是以检测编码MAL蛋白的核苷酸序列为基础的，如通过北方墨点法。
6.控制MAL蛋白在肿瘤细胞中的表达的应用，其特征在于，其有助于改变肿瘤的进展过程及其治疗。
全文摘要
本发明涉及一种将MAL蛋白作为上皮性肿瘤及其他人类病理学中的新型标记与分子目标的应用。更特别地，本发明涉及一种检测MAL蛋白或其前体物质的应用，以所述检测作为标记，对肿瘤或其他影响上皮细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、髓磷脂形成细胞或其他通常表达有MAL的细胞类型的病理进行诊断或预后判断。
文档编号A61P35/00GK1643380SQ03805756
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月14日 优先权日2002年3月14日
发明者米格尔·安基尔·阿隆佐·莱布莱罗, 莫妮卡·玛拉祖勒·阿斯比罗斯, 阿格斯丁·路易斯·阿塞多·巴伯拉 申请人:高级科研部理事会