生产疫苗的连续细胞系的制作方法

专利名称：生产疫苗的连续细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学和生物技术领域。具体而言，其涉及生产一种适于生产抗动物疾病的疫苗的细胞系，所述动物疾病更具体为疱疹病毒(herpesviruses)引起的禽类疾病，所述疱疹病毒更具体为α疱疹病毒(Alphaherpesviruse)。其还涉及生产一种细胞系，该细胞系适于分离现有的和新出现的α疱疹病毒，例如无毒型(avirulent)、强毒型(virulent)和超强毒型(very virulent)(或极超强毒型(hypervirulent))马立克氏病(Marek′s disease，MD)病毒株。
马立克氏病在全世界范围内的一种鸡的毁灭性疾病。其由马立克氏病病毒(MDV)、一种α疱疹病毒引起，并且特征为T细胞淋巴瘤、多神经炎、全身免疫抑制和少见的动脉硬化症5。已经鉴定了3种MDV血清型，其中只有血清型1(MDV-1)是病原性的，而MDV血清型2(MDV-2)和血清型3(火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkeys，HVT))不引起MD。MDV感染导致出现α疱疹病毒亚科(alphaherpesvirinae)常见的潜伏感染期，然而，当和这个病毒亚科的其它成员比较，MDV具有独特的性质，因为其能引起肿瘤并整合进入宿主细胞基因组中11，12。
MD可以通过免疫接种控制，但是尽管接种疫苗，还是进化了越来越多的病原性MDV株4。这些毒株被分类称为所谓的强毒型(virulent，v)、超强毒型(very virulent，vv)或超超强毒型(very virulent plus，vv+)毒株28，35。使用HVT接种可以保护鸡抗vMDV的感染，但是不能保护抗1970年代晚期新出现的vvMDV38。含有MDV-2株或HVT和MDV-2组合的疫苗在1980年代被成功使用6，34，37，39，但是近年来分离了新的vv+MDV-1株如648A和584A，其可以破坏二价疫苗并引起急性一过性麻痹以及使在感染后头两周内的死亡率显著升高15，37。vv+MDV的出现导致美国引入了CVI988/Rispens疫苗，其自1970年代在欧洲使用21，22， 36，40。
不但在美国，而且在欧洲都报道了从接种疫苗的畜群中分离新的高致病性的毒株。报道了C12/130株的临床特征及细胞向性(cellular tropism)的变化3。MDV毒性的稳步升高及出现更急性的神经元形式的MD的机制还不明了，但是疫苗配方和应用形式可能对这些现象具有影响38。MDV在体外显示了高度的细胞结合，而MD疫苗，除了一些HVT配方，为使用前保存在液氮中的被该制备物感染的活的鸡细胞。
MDV的体外培养是非常烦琐、费力并且很难标准化。现在意识到一些糖蛋白对在培养细胞中生长病毒是必需的，也就是说，例如没有gE或gI的病毒更本不在培养物中散布(Shumaccher等，J.Virol.7511307-11318，2001)。在家禽中生产用于防止MDV感染和MD的疫苗的一个重要成本因素是使用细胞培养物。到目前为止，只在原代鸡或鸭细胞中可能有效生长MDV。通常，选择用来生产MDV疫苗的培养细胞是鸡胚胎成纤维细胞(CEF)38。这些CEF还用于分离得自外周血细胞(PBC)形式的临床病例的MDV或自转化的肿瘤T细胞经诱导裂解性MDV复制后得到的MDV。或者，为分离强毒型的且不适于细胞培养物的病毒株或分离株，可以使用原代鸡肾细胞(CKC)或鸭胚胎成纤维细胞(DEF)。对从临床样品中分离MDV，这些细胞证明比CEF好。所有已知在培养物中支持MDV生长的系统都依赖于产生原代细胞培养物，在CKC的情况下，不得不从含胚卵甚至孵化的禽类中连续制备该原代细胞培养物。制备原代细胞的方法不但费力而且成本高。这反映在生产疫苗的大约30％的成本是用于制备鸡胚胎成纤维细胞。疫苗生产十分依赖于来自于不含特异病原体(SPF)禽群的连续而可靠的受精卵的供应。SPF禽群在特殊条件下饲养并且定期证明其不含禽类病原体。受精的SPF卵的供应的任何中断都将中断MDV疫苗的生产。
即使在鸡肾(CKC)或鸭胚胎成纤维细胞上成功繁殖并分离了强毒型野外MDV毒株，适应后，MDV或强毒型毒株的疫苗也只能在CEF细胞中有效生长。许多在禽类或哺乳动物的连续细胞系上繁殖MDV株的尝试都失败了。失败的原因或者是因为病毒在异源细胞上生长后缺少重要特征或者只能证明感染失败。然而近十年，报道产生了用MDV组成型感染的(constitutively infected)细胞系。例如Abujoub等示出(ActaVirologica 43186-191，1999和EP0775743)CHCC-OU2细胞，CEF细胞的永生衍生物，可以用强毒型或无毒型MDV毒株潜在感染。然而，MDV需要长时期才能对细胞培养物系统产生适应，其中可能发生各个病毒的遗传或抗遗传组合物的变化。用CHCC-OU2细胞系，需要4周培养才可见MDV特异的空斑。只要细胞未长满，所得CEF细胞系OU2.1和OU2.2便含有强毒型和诱导肿瘤的MDV的潜在形式。只要在培养物中建立了细胞细胞间的接触，就可以诱导从潜伏到裂解感染的转换。细胞只用一种毒株潜在感染并且在长满时及通过未真正了解的某种机制，开始了裂解循环复制。总之，在这个系统中，需要繁殖的每个病毒需要一种特异的细胞系，且需要长时间的适应，并且细胞难于生长。另外，生长在OU-OCL2细胞的强毒型Md11株可以在易感鸡中诱导肿瘤。最近，测试了连续非洲绿猴肾细胞系对MDV生长的敏感性。有报道几轮盲传和3周适应后，可以产生极低滴度的MDV血清型1(MDV-1)和血清型3(MDV-3)(即低水平的感染病毒)。如上述，当疫苗株不得不适应这些细胞时，长时期的适应细胞培养系统易于导致非所需的遗传变化，其可以引起例如疫苗失败。家禽工业一直需要可用于生产马立克氏病疫苗的连续细胞系。尽管发展了许多禽类或哺乳动物细胞系(见例如EP0748867和EP0884382)，在本发明之前，还没有连续细胞系可以在疫苗生产中作为有效的鸡胚成纤维细胞(CEF)的替代物。从这些连续细胞系中回收的MDV病毒的滴度比不上从原代细胞系中回收的病毒滴度。另外，许多极超强毒型和强毒型MDV株不能在以前建立的连续细胞系或者原代细胞系中繁殖。
本发明提供了一种生产能够支持疱疹病毒株生长的基本上没有哺乳动物或禽类病毒的连续细胞系的方法，所述方法包含用包含来自疱疹病毒、优选α疱疹病毒的核酸片段的载体感染或转染细胞，并在适合所述核酸表达及所述细胞或其子代繁殖的条件下培养所述被感染的或转染的细胞或其子代。鉴于所述细胞系基本上不含病毒，所以先决条件是这样的核酸自身不编码复制型疱疹病毒，以便可以随后用被繁殖的疱疹病毒株进行感染。因此，本文所述的连续细胞系自身不是一种病毒产生者，但用疱疹病毒株接种后用于培养或生长疱疹病毒到足够的滴度以例如生产疫苗。例如所述疱疹病毒的核酸或其片段包含编码结构蛋白质或糖蛋白或其片段的核酸。疱疹病毒的例子包括水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒等。因此本发明提供了可以支持疱疹病毒，包括极超强毒型、强毒型及无毒型MDV株生长的连续细胞系，其不需要所述毒株进行适应便可进行疫苗生产。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了用包含糖蛋白E(gE)基因或其功能性片段的核酸或其片段的载体感染或转染的细胞的应用。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种核酸，其中所述核酸包含马立克氏病病毒糖蛋白gE或其功能性片段或糖蛋白gE基因等价物。优选地所述糖蛋白gE基因衍生自α疱疹病毒。本文所用“其功能性片段”指基因/核酸片段，其表达产物保留了在所述连续细胞系中支持/维持病毒生长、优选疱疹病毒生长的性质。本文所用糖蛋白gE基因“等价物”是任何类似基因(即功能性等价物)例如得自另一种疱疹病毒的糖蛋白gE基因，如α疱疹病毒，其表达产物具有在所述连续细胞系中支持/维持病毒生长的性质。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种核酸，其中所述核酸包含马立克氏病病毒糖蛋白gL基因或其功能性片段或糖蛋白gL基因等价物。优选所述糖蛋白gL基因衍生自α疱疹病毒。本文所用“其功能性片段”指基因/核酸片段，其表达产物保留了在所述连续细胞系中支持/维持病毒生长，优选疱疹病毒生长的性质。本文所用糖蛋白gL基因“等价物”是任何类似基因(即功能性等价物)例如得自另一种疱疹病毒的糖蛋白gL基因，如α疱疹病毒，其表达产物具有在所述连续细胞系中支持/维持病毒生长的性质。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种核酸，其中所述核酸包含马立克氏病病毒糖蛋白gI基因或其功能性片段或糖蛋白gI基因等价物。优选所述糖蛋白gI基因衍生自α疱疹病毒。本文所用“其功能性片段”指基因/核酸片段，其表达产物保留了在所述连续细胞系中支持/维持病毒生长，优选疱疹病毒生长的性质。本文所用糖蛋白gI基因“等价物”是任何类似基因(即功能性等价物)例如得自另一种疱疹病毒的糖蛋白gI基因，如α疱疹病毒，其表达产物具有在所述连续细胞系中支持/维持病毒生长的性质。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种生产能够支持马立克氏病病毒株生长的连续细胞系的方法，所述方法包括用包含马立克氏病病毒株的核酸或其片段的载体感染或转染细胞并在适合所述核酸表达及所述细胞或其子代繁殖的条件下培养所述被感染的或转染的细胞或其子代。先决条件是这种核酸不编码复制型马立克氏病病毒本身，以便可以随后用被繁殖的疱疹病毒株进行感染。本文所用连续细胞系是已建立的/维持的细胞系，其可以无限制的生长并可以传至少10代。而且，尽管提供了来自疱疹病毒的核酸片段，要求所述连续细胞系不含哺乳动物和禽类病毒，如，顺便提及，曾发现鹌鹑细胞系QT-35就不是这样，其原来被MDV潜在感染。术语“细胞或其子代”应理解为所述细胞可以使用几种商业获得的培养基，在已知适于繁殖禽类细胞的条件下从单个细胞被培养及扩增已产生细胞系。“感染”或“转染”指DNA转移病毒或其片段进入禽类或哺乳动物细胞中。基因转移进细胞的方法是本领域技术人员已知的。例如，转染方法可以包括已知的用于转移DNA进入细胞的技术，如磷酸钙沉淀法、凝聚胺(polybrene)法、DEAE-葡聚糖法、LIPOFECTIN法、电穿孔法或原生质体融合。
本文所用载体包括任何基因运送载体，其可以运送核酸进入所述细胞中，如例如质粒载体(pcDNA3，Invitrogen)。本文所用核酸指疱疹病毒，优选α疱疹病毒，甚至更优选马立克氏病病毒如例如等同于α疱疹病毒糖蛋白E(gE)或其片段的基因的核酸序列。优选的马立克氏病病毒株选自于马立克氏病病毒癌基因血清型1(MDV-1)和/或非癌基因血清型2(MDV-2)和/或非癌基因血清型3(MDV-3)、火鸡疱疹病毒(HVT)。本发明的这种核酸可以在细胞自己的调节元件或异源调节元件(即组成性活性调节元件或可诱导调节元件)的控制下组成性或暂时性表达。在一个优选的实施方案中，本发明所述的核酸的表达产物具有在所述连续细胞系中支持/维持病毒，优选禽类病毒(例如，马立克氏病病毒、水痘-带状疱疹病毒、新城病病毒(Newcaster Disease Virus，NDV)、传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)、鸡贫血病毒(CAV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus，ILV)、禽类白血性增生病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)、网状内皮增生症病毒(ReticuloendotheliosisVirus，REV)及禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)等)生长的功能性质。
所述细胞系的多种培养条件包括关于特殊营养物、氧气、张力、二氧化碳及降低血清水平的培养基配方可以选择并且本领域技术人员可以将其优化。优选本发明所述感染的或转染的细胞包含脊椎动物细胞。甚至更优选所述感染的或转染的细胞包含禽类细胞。例如，所述细胞可以衍生自肌肉组织，及肌肉成肌细胞(muscle myoblast cell)。按照本发明，可以使用任何肌肉成肌细胞，例如所述肌成纤维细胞可以得自人、灵长类、鸡、鹌鹑、火鸡、鹅、鸽子、野鸡、北美鹑(bobwhite)的肌肉组织。肌细胞系可以使用已知的脊椎动物细胞培养技术培养及维持。在一个优选的实施方案中，所述成纤维细胞得自鹌鹑如例如QM细胞。优选QM细胞是QM7细胞，保藏号为ATCC CRL-1632。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种核酸，其中所述核酸包含马立克氏病病毒糖蛋白gE基因或其功能性片段或糖蛋白gE基因等价物。优选所述糖蛋白gE基因衍生自马立克氏病病毒血清型1和/或血清型2和/或血清型3。本文所用“其功能性片段”指指基因/核酸片段，其表达产物保留了在所述连续细胞系中支持/维持病毒生长、优选马立克氏病病毒生长的性质。本文所用糖蛋白gE基因“等价物”是任何类似基因(即功能性等价物)例如得自另一种疱疹病毒的糖蛋白gE基因，如α疱疹病毒，其表达产物具有在所述连续细胞系中支持/维持或增强病毒生长的性质。另一个优选的实施方案中，所述马立克氏病病毒包含无毒型马立克氏病病毒株如例如Rispens CVI988。本发明涵盖了可以在所述连续细胞系中复制的所用减毒的马立克氏病病毒/疫苗株。本发明提供了一种生产能够支持马立克氏病病毒株生长的连续细胞系的方法，所述方法包括用包含马立克氏病病毒株的核酸或其片段的载体感染或转染细胞并在适合所述核酸表达及所述细胞或其子代繁殖的条件下培养所述感染的或转染的细胞或其子代，其中所述连续细胞系不需要病毒进行适应就可以支持马立克氏病病毒株的生长。本文所用“不需要适应”指本发明的所述连续(即永生/可维持)细胞系可以在1或2次传代后就支持马立克氏病病毒以高滴度(即，以可比于或甚至优于原代细胞系，例如鸡胚胎成纤维细胞的水平)生长及生产性感染。
在另外一个实施方案中，本发明提供依据本发明方法可获得的一种细胞或其子代。此外，本发明提供从一种本发明的细胞或其子代获得的细胞制备物。更优选的所述细胞或其子代或细胞裂解产物被马立克氏病病毒血清1型减毒株感染或转染。本发明提供了应用以本发明的一种包含马立克氏病病毒株核酸或其片段和/或衍生于其制备物的载体感染或转染的细胞以制备在脊椎动物、优选禽类中能够诱导一定程度的抗疾病保护作用(例如，产生免疫力)的疫苗。本发明也涉及一种生产数量上适于疫苗目的的马立克氏病病毒的制备方法。本发明提供一种生产能够诱导一种免疫反应对抗脊椎动物、优选禽类疾病的方法，包含培养一种本发明的细胞和收集其细胞培养组分。也理解所述马立克氏病病毒株可以作为非裂解性或裂解性感染而维持于所述细胞系中(即，SOgE)，且本发明的所述细胞系能够体内感染脊椎动物，优选禽类以产生抗马立克氏病的免疫保护作用。
此外，本发明提供一种生产单价和多价疫苗的方法，所述疫苗用于保护脊椎动物、优选禽类抵抗例如除马立克氏病病毒以外的其他致病因素引起的感染。可以理解本发明的所述细胞系(例如SOgE)可被载体感染或转染，例如一种马立克氏病病毒载体，其包含马立克氏病病毒基因组或其部分，所述部分包括编码一种或多种异源蛋白质或多肽的基因(例如，致病因素的抗原性肽)，所述异源蛋白质或多肽可用于抵抗马立克氏病病毒以外的其他脊椎动物致病因素。可被用于生产抗疾病疫苗的致病因素的实例包括新城病病毒(NDV)，传染性法氏囊病病毒(IBDV)，传染性支气管炎病毒(IBV)，鸡贫血病毒(CAV)，传染性喉气管炎病毒(ILV)，禽类白血性增生病毒(ALV)，火鸡星形网状内皮增生症病毒(RV)和禽流感病毒(AIV)。事实上，可以理解任何异源性基因序列可被构建到所述载体内，其包含本发明的用于生产疫苗即多价疫苗的所述核酸。优选这样的异源基因序列涵盖用于增强或活化宿主的细胞和/或体液免疫反应的一种基因产物，或编码一种诱导抗任何病原体种类(优选为脊椎动物病原体，更优选为禽类病原体)的保护性免疫反应的抗原决定簇或结合中和抗体的抗原的基因产物。例如，编码马立克氏病病毒3个血清型的一种或多种的抗原性肽的基因或基因片段。这样的抗原性肽可被用在一种多价疫苗给予脊椎动物以便于产生一种抗马立克氏病病毒感染的完全的保护效应。
本发明更进一步提供了依据本发明方法可获得的疫苗。这样的疫苗可使用疫苗生产领域内技术人员熟悉的方法生产。疫苗可以是用所述载体感染或转染的细胞系的悬浮形式，所述载体包含一种本发明的马立克氏病病毒株的核酸或其片段，所述细胞系感染了马立克氏病病毒疫苗株/减毒株和/或其它病毒如疱疹病毒，并支持其生产性复制，所述马立克氏病病毒疫苗株/减毒株优选为血清型1和/或血清型2和/或血清型3(即，单独，即，单价疫苗)或其合组(即，多价疫苗)。此外，一种本发明的疫苗可自超声破碎细胞、例如SOgE细胞后的不含细胞的病毒悬液和/或细胞裂解物或裂解成分中产生，所述细胞感染了马立克氏病病毒疫苗株/减毒株，优选血清型1和/或血清型2和/或血清型3(例如，单独或其组合)，和/或其它病毒，如疱疹病毒，并支持其生产性感染。可以理解使用本领域的重组技术可工程化本发明的载体以编码已知可增强脊椎动物免疫反应(即，能够刺激1或2类主要组织相容性复合体的分子呈现)的异源蛋白质，因此增强给予的疫苗的总体的保护效应。
本发明提供一种用包含本发明的马立克氏病病毒株核酸或其片段的载体感染或转染的细胞来生产和/或维持和/或分离疱疹病毒，优选α疱疹病毒的应用。疱疹病毒例如包括水痘-带状疱疹病毒，巨细胞病毒，EB病毒，单纯疱疹病毒等。在一个优选的实施方案中，本发明提供用包含本发明的马立克氏病病毒株核酸或片段的载体感染或转染的细胞来生产和/或维持和/或分离极超强毒型的和/或强毒型的和/或无毒型的马立克氏病病毒株的应用。这样的细胞可被用作适合的底物来繁殖极超强毒型的病毒株如EU1、648A和584A株，和/或强毒型病毒株如RB1B株，和/或无毒型病毒株如584Ap80C和CVI988。本发明包含选自血清型1，血清型2，血清型3组中的所有马立克氏病病毒株。血清型1包括所有强毒型毒株和它们的减毒衍生毒株。血清型2由天然无毒型鸡病毒组成，血清型3，已知如火鸡疱疹病毒(HVT)，包括能够在鸡体内复制的无毒型火鸡病毒。已知所述马立克氏病病毒株包含天然的或经过遗传修饰的病毒株。
本发明包含一种生产和/或分离和/或维持一种超强毒型(vv)、超超强毒型(vv+)、极超强毒型和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株的方法，其包含用疱疹病毒感染本发明的能够支持马立克氏病病毒株生长的细胞，在适宜所述细胞繁殖的条件下培养所述细胞，并生产、维持和分离所述疱疹病毒。本发明更进一步提供一种依据本发明方法获得的疱疹病毒。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种生产和/或分离和/或维持超强毒型(vv)、超超强毒型(vv+)、极超强毒型和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株的方法，其包含使用超强毒型(vv)、超超强毒型(vv+)、极超强毒型和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株感染本发明的能够支持马立克氏病病毒株的生长的细胞，在适宜所述细胞繁殖的条件下培养所述细胞，并生产、维持和分离所述超强毒型(vv)、超超强毒型(vv+)、极超强毒型和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株。本领域已知培养脊椎动物/禽类细胞适宜的条件。本发明更进一步提供了依据本发明方法获得的超强毒型(vv)、超超强毒型(vv+)、极超强毒型和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株。
另外，本发明所述的能够支持马立克氏病病毒株生长的细胞优选培养在存在遗传霉素(G-418)或其衍生物或类似物，或任何其它的当存在新霉素抗性基因时无毒性的药物并可用于筛选的条件下。一种G-418衍生物在此被用作一种相似属性的G-418来源的物质。G-418的类似物在此被用作一种具有化学结构和化学性质类似于G-418的物质(Gibco，LifeTechnologies)。
本发明更进一步提供了本发明的能够支持马立克氏病病毒株的生长的细胞在产生一种疱疹病毒的诊断性抗原中的应用，所述疱疹病毒优选为α疱疹病毒且更优选马立克氏病病毒。事实上，已知任何异源基因序列均可被构建到包含本发明的所述核酸的所述载体内以用于生产诊断性抗原。例如，编码马立克氏病病毒3个血清型的一种或多种的非共同抗原性肽的基因或基因片段，或编码其它疱疹病毒特异性抗原性肽的基因或基因片段。这样的特异性病毒抗原可被用于诊断鸟的特异性病毒感染，且也被用于疫苗生产。此外，本发明提供一种生产马立克氏病病毒的诊断性抗原的方法，其包含提供一种感染了本发明的马立克氏病病毒株并能够支持其生长的本发明的细胞并从其中分离成分。
本发明更进一步提供了一种本发明的疫苗用来生产预防和/或治疗脊椎动物疾病的药物。优选的所述脊椎动物疾病是禽类疾病，更优选的是马立克氏病病毒相关疾病。药物的适当的基本成分是本领域已知的。本发明包括预防性和治疗性疫苗。本发明更进一步提供了保护脊椎动物对抗疾病的方法，其包含给所述脊椎动物(合适的受者)施用本发明的疫苗和一种药学可接受的载体。本发明更一进步提供了一种免疫接种脊椎动物(例如，动物，人类，家禽)以抵抗传染性疱疹病毒的方法，其包含给脊椎动物施用一种有效免疫量的本发明的疫苗。可配制活的重组病毒疫苗或灭活的重组病毒疫苗。可使用常规方法，包括在本发明的细胞系内繁殖病毒，以生产活病毒疫苗制备物，然后作为药物施用于脊椎动物。可采用本领域技术人员熟悉任何将疫苗给予脊椎动物的方法，例如通过肌肉，皮下，腹腔内，静脉内，或卵内(inovo)注射。优选通过设计的疫苗所针对的病原体的自然感染途径导入病毒疫苗制备物。或者，这样一种疫苗可经口-鼻或口腔施用。为了生产灭活疫苗，病毒可在本发明的细胞系中生长，由例如甲醛或β-丙内脂灭活。灭活的病毒可与适合的佐剂一起配制以增强免疫反应。这样的佐剂包括，但不限于，矿物胶，例如氢氧化铝；表面活性剂如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子；肽；油乳剂；和潜在的有用的佐剂如BCG和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。本领域内已知药学可接受的载体，其包括，但不限于，盐，缓冲盐，葡萄糖，水，甘油，无菌等渗水缓冲液，和其组合。此类可接受的载体的一个实例是生理性平衡的培养基，其含有一种或多种稳定剂如稳定的水解蛋白质，乳糖，二甲基亚砜等。更优选载体是无菌的。合适的受者可以是脊椎动物，优选为禽类。
实施例1动物。使用白色Lohmann选定的来航鸡(LSL)(Lohmann，Cuxhaven，Germany)并在刚刚孵出时在翅膀上扎上条带。动物在笼中喂养，随意获得食物和水。
细胞和病毒。如先前的描述制备鸡胚胎成纤维细胞(CEF)(Schumacher et al.，2000)。鹌鹑肌肉QM7细胞(ATCC细胞号CRL-1632)被用于生产永久细胞系。使用的MDV株是CVI988(MarekVac forte，Lohmann，Cuxhaven，Germany)，584Ap80C37，RB1B(由Dr.T.F.Davison，Compton，UK惠赠)，和EU1。从一种MDV感染性BAC克隆(Schumacheret al.，2000)重建的584Ap80C株或其US2-阴性的衍生的BAC20病毒在CEF29上繁殖。MDV株EU1是1992年从意大利的已用HVT疫苗免疫接种的鸡群中分离的病毒。EU1的PCR实验显示没有鸡传染性贫血病毒、禽类白血性增生和网状内皮增生症病毒以及传染性法氏囊病病毒感染，且不能在CEF上繁殖。为了生产病毒，10只鸡肌肉内注射(i.m.)EU1株。感染后10天，经Histopaque密度离心(Sigma，Munich，Germany)收集被感染的鸡的外周血(PBMC)和脾单核细胞并贮存在液氮中。
质粒。经聚合酶链反应(PCR)扩增糖蛋白E开放读框，MDV疫苗株RispensCVI988的US8同源基因17，33，各种引物均使用100pmol，5′-引物为5′-CATAAGCATGCGAGTCAGCGTCATAATGTG-3′，而3′-引物为5′-CAAGGGCCCATCAGTGGTATAAATCTAAGC-3′。生成的1.4kbp片段被限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI切开，克隆在pcDNA3(Invitrogen)载体相同的位点生成重组载体pcMgE30。
PCR分析。一种PCR分析gE开放读框(见上)，其它PCR分析被感染的细胞上MDV的gE基因(Lee et al.，2000)。使用100pmol的正向引物(5′-GCATATCAGCCTGTTCTATC-3′)和反向引物(5′-AACCAATGGTCGGCTATAAC-3′)完成定向MDVgB基因17，33的PCR分析25。在2个方案中，各自的引物与DNA混合，进行35个循环(95℃30秒，50℃30秒，72℃30秒)。使用地高辛配基标记的gB或gE序列作为探针29，采用Southern印迹验证PCR产物的特异性。
间接免疫荧光分析。为进行间接免疫荧光分析(IIF)，细胞在6孔板(Greiner)或玻璃载玻片上生长。感染后细胞以90％丙酮固定不同时间，如上描述正确完成IIF，普通荧光显微镜分析样品(29，30)。使用的抗体是抗gB单克隆抗体(mab)2K11；Dr.J.-F.Vautherot，INRA，Nouzilly，法国，惠赠)或感染MDV-1的鸡的恢复期血清(抗-MDVI)29。
ELISA方法检测MDV-1抗体。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆中MDV-1-特异抗体。抗原由感染5天后冻融收集的5×107个BAC20-感染的CEF的裂解物组成。裂解物(溶于5mlPBS)60W超声60秒，离心去除细胞碎片(10,000g，10分钟，4℃)。5×107个未感染的CEF的裂解物作为阴性对照。ELISA板(Nunc)被100μl裂解物包被(终浓度5μl溶解液/ml)16小时，4℃。血浆样品以1∶100稀释度开始按照log2逐步稀释，加入到以2％脱脂乳封闭的板中，达60分钟，25℃。以PBS彻底清洗后，加入100μl抗鸡IgG过氧化物酶缀合物(Sigma)，30分钟，25℃。以PBS最后清洗后，加入100μl TMB底物溶液(Sigma)10分钟，之后加入2M H2SO4终止反应。读取450nm(A450)的吸光值(TecanSPECTRA，Crailsheim，Germany)，如前确定终点(end-point)的抗体滴度20。
实施例2产生组成型表达MDV疫苗株CVI988糖蛋白E的细胞系如早期描述29的磷酸钙沉淀法转染QM7细胞。QM7细胞在6孔板中生长直到细胞大约铺满70％，转染10μg重组质粒pcMgE30。转染的细胞被含有5％FCS的DMEM和1000μg/ml G-418(Gibco-BRL)的培养基覆盖。抗生素存在的情况下，培养细胞2个星期后，单细胞克隆挑选至96孔板中。细胞克隆在96孔板生长铺满后，1:2传代，使用MDVI感染恢复期血清在细胞克隆上完成IIF。鉴定几乎每个细胞均表达MDVgE的细胞克隆(图2)，并命名为SOgE。培养SOgE细胞并隔周检测SOgE细胞的gE表达。当G-418存在时，已证实gE稳定表达超过15个星期。当缺乏药物时，检测到的gE在SOgE细胞的表达达到10个星期。PCR分析1×107细胞DNA证实MDV gE DNA存在于SOgE内，但是不存在于QM7细胞(图3)。
实施例3SOgE细胞表达功能性MDV gE分析gE-阴性MDV在SOgE细胞上的生长解释产生的细胞系功能性表达MDV gE的问题。糖蛋白E显示对于MDV体外生长是必须的30。因此，编码gE-阴性BAC20病毒(Schumacher et al.，2000)的20ΔgE DNA转染SOgE或QM7细胞并观察噬斑形成。但是，IIF后使用抗gB mab2K11，很容易地观察到在SOgE细胞上出现20ΔgE噬斑，在亲代QM7细胞上使用mab可见只有单个被感染细胞(图4)。这些结果证实功能性gE由SOgE细胞产生，其能够在gE-缺陷病毒中对必需的MDV-1gE构成反式互补(trans-complement)。
实施例4SOgE细胞支持一些MDV-1株生长SOgE细胞上出现的20ΔgE噬斑的大小比BAC20病毒在QM7细胞上或gB-阴性病毒突变体在表达gB的QM7细胞上的大。在进一步实验中解释这个意外的发现。评价CEF、QM7和SOgE细胞上无毒型MDV-1株584Ap80C和CVI988以及强毒型RB1B和极超强毒型毒株的噬斑大小。用感染的CEF或PBMC(EU1)与各自的细胞共同培养完成这个实验。可以证实SOgE细胞和584Ap80C、CVI988或RB1B低感染复数感染(MOI＝0.0001；即100PFU每1×106细胞)的CEF细胞共同培养导致噬斑形成(图5)。其与CEF细胞上的噬斑大小相当(图5)。另外，转染SOgE细胞后，有可能从病毒DNA或埃希氏菌属大肠杆菌来源克隆的病毒DNA(BAC20)29直接地重建感染的MDV-1(图5)。因此，直接改造MDV以适应SOgE细胞，无需过长的细胞培养传代是可能的，这对于疫苗生产和分离或产生用于动物实验地强毒型和极超强毒型MDV-1都具有主要的优势。
以上描述的实验提示SOgE细胞代表一种永生细胞底物可有效的繁殖无毒型(疫苗)MDV株以及强毒型、超强毒型和极超强毒型的MDV-1株。因为使用一种允许MDV疫苗株繁殖的永生细胞系，可以促进MD疫苗的生产，CVI988 DNA转染CEF、QM7、或SOgE细胞。转染6天后，当病毒噬斑可见时，收集细胞，1×103感染细胞与1×107未感染的相同细胞共同培养。这个大量的细胞感染5天后，感染的细胞使用胰蛋白酶消化并以十倍稀释度在新鲜产生的CEF、QM7或SOgE细胞上滴定，滴定4天后，细胞被固定，使用2K11抗-gB mab抗体，采用IIF染色确定病毒噬斑量。可以显示在SOgE细胞上CVI988的滴度均数达到1.8×106PFU，但是在QM7细胞上获得的滴度只有3.2×103。在SOgE细胞上的滴度与在原代CEF细胞上的基本上相同。从噬斑大小鉴定和滴定实验结果我们得出结论，强毒型和无毒型疫苗MDV株在SOgE细胞上繁殖，其组成型表达MDV株CVI988 gE，与其在原代CEF细胞上的繁殖比较，是一样的有效或甚至更优。
实施例5SOgE细胞在1天龄鸡体内不产生肿瘤SOgE细胞来源于一种化学诱导的鹌鹑肿瘤，这使其在系统应用全细胞制备物之后导致鸡出现肿瘤的可能性较小。为了说明这个重要的问题，总共18只鸡接种SOgE细胞(12只鸡)或亲代QM细胞(6只鸡)。每只鸡通过肌肉内注射途径获得1×106细胞和腹腔注射途径获得1×106细胞(表1)。在之后的总共12个星期内观察接种的鸡的命运，其后进行尸检(post-mortem examination)。在实验过程中没有一只鸡出现临床症状。而且，所有鸡出现良好的营养状态且在尸检中没有任何肿瘤形成迹象。从这些结果我们得出结论，重组的表达MDV gE的SOgE细胞和亲代QM7细胞都不产生鸡肿瘤，甚至当给予大约100到1000倍疫苗剂量的细胞，也是同样结果。因此，我们认为SOgE细胞用于生产MDV或重组疫苗是安全的。
实施例6使用SOgE产生的疫苗保护鸡抵抗马立克氏病进行动物实验以比较在SOgE细胞上繁殖的疫苗株Rispens CVI988与在CEF细胞上常规生产的疫苗株的保护能力。1天龄小鸡接受1×106SOgE细胞(组1、表2)，1×106亲代QM7细胞(组4、表1)或CVI988在SOgE细胞(组2、表2)或CEF细胞(组3、表2)上产生的1×103噬斑形成单位。为了避免交叉污染，转染从CEF分离的CVI988 DNA到SOgE或CEF细胞后生产疫苗病毒。转染的细胞与新鲜未感染的细胞共同培养，注射(p.i.)第5天当产生完全的细胞病变效应后收集疫苗病毒。免疫的鸡在免疫12天后遭受极超强毒型MDV-1株EU1感染攻击。在假免疫的动物中(QM7细胞，组4)，小鸡最早在感染7天出现MD，2只鸡分别在第9天和第10天死亡。注射(p.i.)第37天时，所有鸡死于感染(表2)。在SOgE免疫的动物中，4只鸡死于感染，但是有3只鸡存活直到感染70天实验终止(表2)。但是，通过大体病理检查和检测内脏器官肿瘤发现3只存活的鸡呈现MD(表2)。完全相反的，小鸡用SOgE或CEF细胞产生的CVI988免疫后，直到实验结束也不死于MD(表2)。但是，组2和3的一只鸡通过大体病理检查鉴定存在MD迹象(表2)。通过ELISA检测来跟踪经过免疫的且被攻击的鸡体内的血清学抗-MDV-1应答。可以证明得到保护的鸡呈现的ELISA抗体在感染攻击后随时间逐渐上升，但是，接种SOgE或QM7细胞的小鸡不能产生高滴度的抗体。抗体滴度在感染稍后时间有点下降或保持基本上不变(图6)。从这个结果可以得出结论，永生细胞SOgE产生的MD CVI988疫苗与CEF细胞常规产生的疫苗一样都提供了保护。另外，抗MD的保护与逐渐上升的抗-MDV-1抗体一致，其可能提示，通过由裂解复制的疫苗病毒或低水平的EU1复制可使得鸡的免疫系统得到长期增强，而这可能会受到疫苗病毒的存在的调控，这种免疫系统的长期增强是抗致瘤性MD保护作用的一个先决条件。
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表1应用QM7和SOgE细胞后检测鸡体内肿瘤形成
表2免疫接种SOgE细胞产生的疫苗株CVI988、并以极超强毒型EU1株攻击的鸡中的马立克氏病
*0到9周内因EU1感染死亡的动物数，在第10周给出的鸡的数量代表在尸检时发现存在MD的动物数。
图例

图1MDV-1基因组图示和gE开放读框在单一的短区域(Us)中的定位。显示大约180kbp的MDV-1基因组结构和BamHI限制性酶切图。PCR扩增gE开放读框并克隆到pcDNA3载体(Invitrogen)中，置于人类细胞巨病毒即刻早期启动子/增强子控制下。给出的数值范围是kbp或bp。
图2使用兔多克隆gE特异性抗血清30，采用IIF检测SOgE细胞的gE表达量。尽管很容易检测SOgE细胞与抗体的反应性，但没有观察到gE-特异性血清与QM7细胞的反应性。每个图片大小是1,000×650μm。
图3SOgE细胞的聚合酶链反应。SOgE未被感染或被MDV-1株584Ap80C、CVI988或RB1B感染。尽管在所有感染和未感染的SOgE细胞中均检测到gE-特异性序列，但只在感染的细胞内获得一种gB特异性扩增产物。在QM7细胞中，不能检测到gB和gE。给出了扩增产物的大小。使用地高新配基标记的gB或gE序列作为探针验证特异性扩增产物。依据产品说明书使用CSPDTM(Roche Biochemicals)和增强的化学发光检测DNA-DNA杂交。
图4gE阴性细胞的生长和BAC20病毒在表达gE的SOgE细胞或QM7细胞上的生长。转染20ΔgE或BAC20 DNA(Schumacher et al.，2000，2001)到各自的细胞，从转染SOgE细胞3天后，可见20ΔgE噬斑形成，但是在QM7细胞未见。在QM7细胞中，只有单个的感染细胞，没有20ΔgE病毒的噬斑形成。在QM7细胞上，BAC20病毒产生非常小的噬斑，但是在重组体SOgE细胞上可产生大的噬斑。每个图片的大小是1,000×650μm(下面)或300×200μm(上面)。
图5MDV-1株584Ap80C、RB1B和CVI988在CEF和SOgE细胞上的噬斑。疫苗株584Ap80C、CVI988和极超强毒型MDV-1株RB1B诱导的噬斑形成在SOgE细胞铺满后很容易观察到。在CEF细胞上也观察到584Ap80C、CVI988和RB1B病毒噬斑形成。100PFU指示的病毒感染1×106细胞4天后显示的噬斑被固定。每个图片的大小是1,500×1,000μm。
图6接种了在重组的SOgE细胞或在CEF细胞上产生的CVI988的鸡的ELISA滴度。第-12天是接种日，在第0天，以极超强毒型MDV-1株EU1对动物进行攻击。MDV特异性抗体在血浆中的滴度。每个实验组的所有鸡在指定的天内取血，采集2只鸡的血浆样品。自1∶100开始以log2逐步稀释滴定血浆。滴度表示为稀释度，在该稀释度处，反应后的MDV感染的细胞的裂解物在A450nm的读数超过未感染的细胞的裂解物在A450nm的读数3个标准偏差。每组的符号均有解释。
权利要求
1.一种生产能够支持细胞相关性α疱疹病毒生长的连续细胞系的方法，其包括使用疱疹病毒的核酸或其片段感染或转染细胞，在适于所述核酸表达和所述细胞或其子代繁殖的条件下培养所述感染的或转染的细胞或其子代。
2.权利要求1的方法，其中所述感染的或转染的细胞包括脊椎动物细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中所述感染的或转染的细胞包括禽类细胞。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述感染的或转染的细胞包括肌肉成肌细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述肌肉成肌细胞包括QM7。
6.权利要求5的方法，其中所述QM7细胞来源于保藏号为ATCCCRL-1632的细胞。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述核酸包括疱疹病毒糖蛋白gE基因或其功能性片段。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述疱疹病毒包括马立克氏病病毒，优选为血清型1、2或3。
9.权利要求8的方法，其中所述马立克氏病病毒包括一种无毒型马立克氏病病毒株。
10.权利要求9的方法，其中所述无毒株包括Rispens CVI988。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述连续细胞系无需病毒适应就能够支持马立克氏病病毒株的生长。
12.由权利要求1-11中任一项的方法获得的细胞或其子代。
13.由权利要求12的细胞获得的细胞制备物。
14.权利要求12的细胞和/或权利要求13的制备物在制备能够诱导脊椎动物抗疾病保护作用的疫苗中的用途。
15.权利要求14的用途，其中所述脊椎动物是禽类。
16.权利要求12的细胞在产生和/或维持和/或分离极超强毒型和/或超超强毒型、和/或超强毒型、和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株中的用途。
17.权利要求16的用途，进一步包括在存在遗传霉素或其衍生物或类似物的条件下培养含有所述病毒的所述细胞。
18.权利要求16或17的用途，其中所述马立克氏病病毒株包括马立克氏病病毒血清型1。
19.权利要求16-18中任一项的用途，其中所述马立克氏病病毒株包括EU1或RB1B或584Ap80C或CVI988。
20.权利要求16-19中任一项的用途，其中所述马立克氏病病毒株包括天然的或经过遗传修饰的病毒株。
21.权利要求12的细胞在生产马立克氏病病毒的诊断性抗原中的用途。
22.产生和/或分离和/或维持马立克氏病病毒株的方法，其包括用所述病毒株感染权利要求12的细胞，并在适于所述细胞繁殖和马立克氏病病毒的产生、维持和分离的条件下培养所述细胞。
23.权利要求12的方法，包括在存在遗传霉素或其衍生物或相似物的条件下培养含有所述病毒的所述细胞。
24.权利要求22或23的方法，其中所述马立克氏病病毒株包括马立克氏病病毒血清型1和/或血清型2和/或血清型3。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其中所述马立克氏病病毒株包括EU1或RB1B或584Ap80C或CVI988。
26.权利要求22-25中任一项的方法，其中所述马立克氏病病毒株包括疫苗株。
27.一种生产马立克氏病病毒诊断性抗原的方法，其包括提供权利要求12的细胞并分离其成分。
28.一种制备能够诱导脊椎动物抗疾病保护作用的疫苗的方法，包括培养权利要求12的细胞并收集其细胞培养物成分。
29.权利要求28的方法，其中所述脊椎动物是禽类。
30.由权利要求28或29的方法获得的疫苗。
31.权利要求30的疫苗在制备用于预防和/或治疗疱疹病毒诱导的疾病的药物中的用途。
32.权利要求31的用途，其中所述疾病是马立克氏病病毒相关性疾病。
33.权利要求31或32的用途，其中所述脊椎动物是禽类。
34.一种保护脊椎动物抗疾病的方法，其包括给所述哺乳动物的一种适宜受者施用权利要求30的疫苗以及一种药用可接受的载体。
35.权利要求34的方法，其中所述脊椎动物是禽类。
全文摘要
本发明提供了一种用于生产可以支持马立克氏病病毒株的连续细胞系的方法，包括用包含马立克氏病病毒株的核酸或其片段的载体感染或转染一种细胞并在适于表达所述核酸及繁殖所述细胞或其子代的条件下培养所述感染的或转染的细胞或其子代。优选地，所述核酸或其片段包含马立克氏病病毒糖蛋白gE基因或其功能性片段。本发明进一步提供了一种用于产生和/或分离和/或维持一种极超强毒型和/或超强毒型、和/或超超强毒型、和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株的方法，包含用本发明的极超强毒型和/或超强毒型、和/或超超强毒型、和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株感染一种细胞并在适于繁殖所述细胞及产生、维持和分离所述极超强毒型和/或超强毒型、和/或超超强毒型、和/或强毒型和/或无毒型马立克氏病病毒株的条件下培养所述细胞。本发明进一步提供了一种用于制备可以在禽类诱导抗疾病、优选抗马立克氏病病毒相关性疾病的保护作用的疫苗的方法，包括培养本发明的连续细胞系并从中收集细胞培养物组分。
文档编号A61K39/255GK1688335SQ03807605
公开日2005年10月26日 申请日期2003年2月5日 优先权日2002年2月6日
发明者尼古劳斯·奥斯特里德, 丹尼尔·舒马赫 申请人:洛曼动物健康两合公司