专利名称：Ldl受体相关蛋白1与蛋白2及对骨与软骨疾病状态的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及如下发现，即LRP-1与LRP-2基因在骨组织细胞中表达，特别涉及诊断骨与软骨疾病状态、鉴定治疗骨与软骨疾病状态的化合物及通过调节骨细胞中的LRP-1或LRP-2蛋白活性来治疗骨与软骨疾病状态的方法。
相关申请此申请要求2002年5月13日提交的美国临时申请第60/380,227号与2003年4月16日提交的美国临时申请第60/463,419号的优先权，其内容在此引入作为本文的参考。
背景技术：
低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLRs)是细胞表面受体，通常参与细胞内膜的循环与胞饮。LDLRs的功能包括，(1)将细胞外成分转运进入内涵体室(endosomal compartment)内，及(2)维持体内胆固醇内环境稳定的脂蛋白代谢。
LDLRs为受体超家族成员，其还包括LDL受体相关蛋白(LRPs)。在脂质代谢中，LRPs的作用比LDLRs的作用更加局限。除转运及脂质代谢外，该LRPs还参与诸如信号转导的其它细胞过程，其显著影响细胞的代谢及生理学。
现已鉴定了一些LRPs，包括LRP-1、LRP-1b、LRP-2、LRP-5、LRP-6、LRP-7、LRP-8、LRP-9、LRP-10及LRP-11(Strickland et al.(2002)Trendsin Endocrinology and Metabolism 13(2)66-74；Herz and Strickland(2001)The Journal of Clinical Investigation 108(6)779-784；及Herz(2001)Neuron 29571-581)。类似LDLRs，所有LRPs含有跨膜序列并为多功能性蛋白。LRPs相互之间只有微小的差别，并具有相似的结构基序(structural motifs)，包括，例如EGF样重复区、YWTD重复区、O-连接糖功能区域(domains)、互补样重复区域及细胞浆功能区域。LRPs可与多种细胞内和细胞外分子结合。这样的细胞内分子包括适配子(衔接子)(adaptor)蛋白与支架(scaffold)蛋白(例如，Dab-1、FE65及PSD-95)而且这种细胞外分子包括脂蛋白、蛋白酶、细菌毒素、抗体、病毒及蛋白酶抑制剂复合体。
乳铁传递蛋白，一种在乳汁和上皮分泌物中的80kDa的糖蛋白，在免疫反应中由炎症细胞释放。其循环在血浆中的浓度为2-7μg/ml，并被认为是参与了铁离子代谢、免疫反应及胚胎发育的调节。
发明概述本发明基于如下发现，即LRP-1和LRP-2基因在骨组织细胞中表达。
本发明的一方面涉及诊断骨疾病状态的方法。
在一个实施例中，该方法包括提供来自怀疑患有或有风险发展为骨疾病状态的个体的检测样本(例如骨组织)，及定量分析LRP-1基因的表达水平。该检测样本中所述LRP-1基因的表达水平，如果与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨疾病状态。
在另一个实施例中，该方法包括提供来自怀疑患有或有风险发展为骨疾病状态的个体骨组织的检测样本，及定量分析LRP-2基因的表达水平。该检测样本中所述LRP-2基因的表达水平，如果与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨疾病状态。
在另一个实施例中，该方法包括提供来自怀疑患有或有风险发展为骨疾病状态的个体的检测样本(例如骨组织)，及定量分析LRP-1蛋白的活性。该检测样本中所述LRP-1蛋白的活性，如果与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨疾病状态。
在另一个实施例中，该方法包括提供来自怀疑患有或有风险发展为骨疾病状态的个体骨组织的检测样本，及定量分析LRP-2蛋白的活性。该检测样本中所述LRP-2蛋白的活性，如果与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨疾病状态。
本发明的另一方面涉及鉴定用于治疗骨疾病状态的候选化合物的方法。
在一个实施例中，该方法包括将化合物与表达LRP-1基因的细胞(例如骨组织细胞(如，成骨细胞、诸如SaOS-2的成骨样细胞、骨细胞或破骨细胞))接触，及定量分析该细胞中LRP-1基因的表达水平。在该化合物存在下的所述LRP-1基因的表达水平，如果与没有该化合物存在时不同，则显示该化合物是治疗骨疾病状态的候选化合物。
在另一个实施例中，该方法包括将化合物与表达LRP-2基因的骨组织细胞(如，成骨细胞、诸如SaOS-2的成骨样细胞、骨细胞或破骨细胞)接触，及定量分析该细胞中LRP-2基因的表达水平。在该化合物存在下的所述LRP-2基因的表达水平，如果与没有该化合物存在时不同，则显示该化合物是治疗骨疾病状态的候选化合物。
在另一个实施例中，该方法包括将化合物与表达编码LRP-1蛋白的LRP-1基因的细胞接触，及定量分析该细胞中LRP-1蛋白的活性。在该化合物存在下的所述LRP-1蛋白的活性，如果与没有该化合物存在时不同，则显示该化合物是治疗骨疾病状态的候选化合物。
在另一个实施例中，该方法包括将化合物与表达编码LRP-2蛋白的LRP-2基因的骨组织细胞接触，及定量分析该细胞中LRP-2蛋白的活性。在该化合物存在下的所述LRP-2蛋白的活性，如果与没有该化合物存在时不同，则显示该化合物是治疗骨疾病状态的候选化合物。
本发明还包括通过调节骨组织细胞中的LRP-1或LRP-2水平或活性来治疗骨疾病状态的方法。
在一个实施例中，该方法包括给予个体其所需的有效剂量的药物组合物，由此调节骨组织细胞中的LRP-1或LRP-2蛋白水平。可通过提供并表达编码LRP-1或LRP-2的核酸、提供LRP-1或LRP-2蛋白，或者提供并表达与编码LRP-1或LRP-2蛋白的序列互补的核酸(即反义分子)，来调节LRP-1或LRP-2蛋白的水平。
在另一个实施例中，该方法包括给予个体其所需的有效剂量的药物组合物，由此调节骨组织细胞中的LRP-1或LRP-2蛋白活性。可通过提供LRP-1或LRP-2蛋白激动剂、提供LRP-1或LRP-2蛋白的拮抗剂，或者提供抗LRP-1或LRP-2蛋白的抗体，来调节LRP-1或LRP-2蛋白的活性。
可直接将药物组合物介入所述的骨组织细胞。该药物组合物也可不通过直接介入骨组织细胞的方式对个体给药，从而调节该骨组织细胞中的LRP-1活性。
诊断骨疾病状态、鉴定治疗骨疾病状态的候选化合物、及使用包括LRP-1与LRP-2来治疗骨疾病状态的方法属于本发明的范围。
天然产生的LRP-1或LRP-2蛋白、其片段、其生物活性部分及其衍生物统称为“LRP-1或LRP-2多肽或蛋白”。编码此种多肽或蛋白的核酸分子统称为“LRP-1或LRP-2核酸”(例如，天然产生的基因或重组基因)。LRP-1或LRP-2分子指LRP-1或LRP-2核酸、多肽及抗体。
本文所用术语“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)及DNA或RNA的类似物。DNA或RNA类似物可由核苷酸类似物合成。所述的核酸分子可以是单链或双链。
本文所用术语“基因”和“重组基因”指包括至少一个编码LRP-1或LRP-2蛋白的开放读码框架的核酸分子。可选择地，所述基因进一步包括非编码序列，例如调控序列和内含子。
本文所用术语LRP-1或LRP-2蛋白的“生物活性部分”包括LRP-1或LRP-2蛋白的片段，其参与例如分子内或分子间的相互作用。分子间相互作用可以是特异结合的相互作用或酶的相互作用(例如，该相互作用可以是瞬时的相互作用和形成或断开共价键的相互作用)。分子间相互作用可以是LRP-1或LRP-2分子与非LRP-1或LRP-2分子间的相互作用，或者是第一LRP-1或LRP-2分子与第二LRP-1或LRP-2分子间的作用。LRP-1或LRP-2蛋白的生物活性部分包括含有氨基酸序列的肽，该氨基酸序列充分同源于或衍生自LRP-1或LRP-2蛋白的氨基酸序列，其包括少于LRP-1或LRP-2蛋白全长序列的氨基酸序列，并表现至少一种LRP-1或LRP-2蛋白活性。通常，生物活性部分包括具有至少一种LRP-1或LRP-2蛋白活性的功能区域或基序，该活性例如，转运作用、脂质代谢及信号转导。LRP-1或LRP-2蛋白的生物活性部分可以是氨基酸长度为例如10、25、50、100、200或更长的多肽。LRP-1或LRP-2蛋白的生物活性部分可用作开发调节LRP-1或LRP-2介导活性的制剂的靶标，该活性例如转运作用、脂质代谢及信号转导。
本文所用术语“LRP-1或LRP-2活性”、“LRP-1或LRP-2的生物活性”或“LRP-1或LRP-2功能活性”指由LRP-1或LRP-2多肽、蛋白或核酸分子产生的活性。例如，LRP-1或LRP-2活性可以是由生理环境中的LRP-1或LRP-2产生的活性，该生理环境是例如LRP-1或LRP-2反应细胞或诸如蛋白底物的LRP-1或LRP-2底物上的生理环境。LRP-1或LRP-2活性可以在体或离体测定。在一个实施例中，LRP-1或LRP-2活性为直接活性，诸如与LRP-1或LRP-2靶分子的作用。“靶分子”或“结合伴侣”是与LRP-1或LRP-2蛋白天然结合或相互作用的分子。
LRP-1或LRP-2活性可以是间接活性，例如，由LRP-1或LRP-2蛋白与LRP-1或LRP-2配体相互作用介导的细胞信号活性。
LRP-1分子或LRP-2分子或者两者的异常表达或活性可介导与骨代谢相关的病症。“骨代谢”指骨结构形成或退化的直接或间接作用，例如骨形成、骨吸收及两条代谢途径的平衡。此术语还包括由骨组织细胞(例如破骨细胞和成骨细胞)中LRP-1或LRP-2分子介导的活性，其依次导致骨的形成和退化。例如，LRP-1或LRP-2分子可支持骨吸收破骨细胞的不同活性，如刺激单核细胞与单个核巨噬细胞向破骨细胞的分化。
因此，调节骨组织细胞产生的LRP-1或LRP-2分子可影响骨的形成和退化，因此可用于治疗骨病症。
该病症的例子包括但不限于骨质疏松、骨营养不良、骨质软化症、佝偻病、囊性纤维性骨炎、肾性骨营养不良、骨硬化、抗惊厥治疗、骨质减少、骨成纤维发生不全(fibrogenesis-imperfecta ossium)、继发性甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、甲状旁腺功能亢进、硬化症、阻塞性黄疸、药物诱导的代谢、骨髓瘤、慢性肾病、佝偻病、结节病(sarcoidosis)、糖皮质激素抗性、吸收不良综合症、脂肪痢、热带性腹泻(tropical sprue)、特发性高钙血症、乳热(milk fever)、派杰氏病(Paget’s disease)及成骨不全。
本文所用“错误表达或异常表达”指在RNA或蛋白水平的非野生型的基因表达。其包括非野生水平的表达，即过-或低-表达；在基因表达的时间或程度上区别于野生型的表达类型，例如，在预定的发展时期或状态表达增加或降低(与野生型比较)；在变化的形式区别于野生型的表达类型，例如，在预定细胞类型或组织类型中，表达增加或降低(与野生型比较)；在拼接方式、翻译氨基酸序列、转移后修饰或所表达多肽的生物活性上区别于野生型的表达类型；在环境刺激或细胞外刺激对所述基因表达的效果上区别于野生型的表达类型，例如在增加或降低的刺激强度存在下表达增加或降低(与野生型比较)。
本文所用“化合物”包括，例如核酸、蛋白、肽、肽模拟物、peptoids(类胨)或小分子。“激动剂”指能增强LRP-1或LRP-2蛋白活性的化合物，其可以是天然产生的LRP-1或LRP-2配体。“拮抗剂”指抑制LRP-1或LRP-2蛋白活性的化合物。
本文所用“个体”指人或非人类动物。
本发明还涉及通过测定和调节骨组织或软骨细胞中乳铁传递蛋白与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP-1或LRP-2)或MAP激酶的相互作用来诊断和治疗骨或软骨疾病状态。
一方面，本发明涉及测定个体是否患有或有风险发展为骨或软骨疾病状态的方法。所述的方法包括提供来自个体的检测样本(例如，骨或软骨组织样本)，及测定该检测样本中乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白或p42/44 MAP激酶的相互作用水平。如果在该样本中这种作用的水平与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨或软骨疾病状态。乳铁传递蛋白与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白或p42/44 MAP激酶的相互作用可通过，例如测量乳铁传递蛋白与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白的结合、由LRP-1或LRP-2介导的乳铁传递蛋白胞饮作用、或p42/44MAP激酶的磷酸化作用来测定。
另一方面，本发明涉及用于治疗骨或软骨疾病状态的候选化合物的鉴定方法。该方法包括将化合物介入到含有乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白、或p42/44 MAP激酶的系统中，及测定该乳铁传递蛋白与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白或p42/44 MAP激酶的相互作用水平。该系统可以是细胞系统，例如，含有成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞或软骨细胞，或无细胞系统。如果在化合物的存在下，该乳铁传递蛋白与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白或p42/44 MAP激酶的相互作用的水平不同于没有该化合物存在时的水平，则显示所述化合物是治疗骨或软骨疾病状态的候选化合物。
另一方面，本发明还涉及通过调节骨组织或软骨细胞中乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白或p42/44 MAP激酶的相互作用来治疗骨或软骨疾病状态的方法。在一个实施例中，通过提供LRP-1、LRP-2或p42/44 MAP激酶的激动剂(例如外源乳铁传递蛋白多肽)来调节其相互作用。在另一个实施例中，通过提供LRP-1、LRP-2拮抗剂(例如，受体相关蛋白)或p42/44 MAP激酶的拮抗剂(例如，AP42/44 MAP激酶抑制剂，即诸如PD98059和U-0126的抑制p42/44 MAP激酶表达、磷酸化或活性的化合物)来调节所述的相互作用。所述的LRP-1、LRP-2或p42/44 MAP激酶的激动剂或拮抗剂可被直接介入骨组织或软骨细胞。这些激动剂或拮抗剂可单独或组合、顺序或同时、结合或不结合其它骨或软骨治疗方法使用。
“乳铁传递蛋白多肽”可以是天然产生的多肽、重组多肽或合成多肽。野生型乳铁传递蛋白多肽的变体(例如，含有至少2个(例如，4、6、8、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700)氨基酸的野生型乳铁传递蛋白多肽片段、或含有乳铁传递蛋白多肽序列的重组蛋白，其保持了野生型乳铁传递蛋白多肽的生物活性)属于本发明的范围。所述的乳铁传递蛋白多肽可以是哺乳动物来源的，例如来自于人或牛的乳汁。结合于该多肽的金属离子可以是铁离子(如天然产生的乳铁传递蛋白多肽)、铜离子、铬离子、钴离子、锰离子、锌离子或镁离子，或任何诸如钪或铋的能共存的金属离子。
本发明的一个或更多个实施方案的详细描述如以下给出的详细说明中所述。本发明的其它特征、目的及优点在详细说明及权利要求中是显而易见的。
详细说明所述的LRP-1和LRP-2核酸分子、蛋白、蛋白同源物、激动剂、拮抗剂及抗体可用于以下的一种或多种方法中a)筛选分析；b)预测医学(例如，诊断分析、预后分析、监控临床试验及药物遗传学)；及c)治疗方法(例如治疗与预防)。
如以下的进一步描述，所述的LRP-1和LRP-2核酸分子可用于，例如LRP-1或LRP-2蛋白(例如，通过在基因治疗应用中的宿主细胞中的重组表达载体)的表达，LRP-1或LRP-2 mRNA(例如，在生物样本中)或LRP-1或LRP-2基因的遗传调节的检测，及LRP-1或LRP-2活性的调节。所述的LRP-1或LRP-2蛋白可用于治疗以LRP-1或LRP-2底物的产物或者LRP-1或LRP-2抑制剂产物不足或过度产生为特征的病症。此外，所述LRP-1或LRP-2蛋白可用于筛选天然产生的LRP-1或LRP-2底物、筛选调节LRP-1或LRP-2活性的药物或化合物，同时也用于治疗以LRP-1或LRP-2蛋白产物或者LRP-1或LRP-2蛋白形式产物不足或过度产生为特征的病症，其中该LRP-1或LRP-2蛋白形式产物与LRP-1或LRP-2野生型蛋白比较，具有降低、异常或非需要的活性(例如，诸如骨质疏松症、派杰氏病及骨发生不全的骨病症)。而且，所述的抗LRP-1或LRP-2抗体可用于检测和分离LRP-1或LRP-2蛋白，调节LRP-1或LRP-2蛋白的生物利用度，及调节LRP-1或LRP-2活性。
本发明提供了评价化合物与个体LRP-1或LRP-2多肽的诸如结合的相互作用能力的方法。该方法包括将该化合物与该个体的LRP-1或LRP-2多肽接触；及评价该化合物与该个体LRP-1或LRP-2多肽的诸如结合的相互作用能力、或与该个体LRP-1或LRP-2多肽形成复合物的能力。该方法可离体(例如在无细胞系统中)或在体(例如在双杂交相互作用陷阱分析(two-hybrid interaction trap assay)中)进行。该方法可用于鉴定天然产生的与个体LRP-1或LRP-2多肽相互作用的分子。其还可用于发现天然或合成的个体LRP-1或LRP-2多肽的抑制剂。以下对筛选方法做进一步的详细讨论。
筛选分析本发明提供鉴定分子、即候选或试验化合物或制剂(例如，蛋白、肽、肽模拟物、peptoids、小分子或其它药物)的方法(本文也指“筛选分析”)，其中所述分子可与LRP-1或LRP-2蛋白结合，对例如LRP-1或LRP-2表达、或者LRP-1或LRP-2活性具有刺激或抑制作用，或者对例如LRP-1或LRP-2底物的表达或活性具有刺激或抑制作用。由此鉴定的化合物可用于在治疗方案中调节靶基因产物(例如，LRP-1或LRP-2基因)的活性，发挥靶基因产物的生物功能、或鉴定破坏正常靶基因相互作用的化合物。
在一个实施方案中，本发明提供筛选候选或试验化合物的分析，该化合物为LRP-1或LRP-2蛋白或多肽或其生物活性部分的底物。在另一个实施方案中，本发明提供筛选候选或试验化合物的分析，该化合物可与LRP-1或LRP-2蛋白或多肽或其生物活性部分结合或调节其活性。
本发明中的试验化合物可使用本领域公知的组合库方法中无数途径中的任何途径来获得，包括生物库、peptoid库(具有肽功能，但具有新的抗酶降解的非肽骨架，虽然如此却保留活性的分子库；参见例如Zuckermann，R.N.et al.(1994)J.Med.Clam.372678-85)；空间寻址的平行固相或溶液相库；需要解旋(deconvolution)的合成库方法；“一小珠一化合物(one-bead one-compound)”库方法；及使用亲和层析选择的合成库方法。该生物库与peptoid库途径局限于肽库，而其它的4条途径适于肽、非肽低聚体或小分子的化合物库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145).
分子库合成方法的实施例可在本领域的现有技术中发现，例如DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann et al.(1994).J.Med.Chem.372678；Cho et al.(1993)Science 2611303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.ED.Engl.332059；Carell et al(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.371233中所述。
化合物库能在溶液中(例如，Houghten(1992)Biotechniques13412-421)、或在小珠上(Lam(1991)Nature 35482-84)、芯片上(Fodor(1993)Nature 364555-556)、细菌(Ladner，美国专利第5,223,409号)、孢子(Ladner，美国专利第5,223,409号)、质粒(Cull et al.(1992)Proc NatlAcad Sci USA 891865-1869)或在噬菌体上(Scott and Smith(1990)Science249386-390；Devlin(1990)Science 249404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.876378-6382；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310；及上文的LADNER所述)存在。
在一个实施方案中，分析是细胞为基础的分析，其中表达LRP-1或LRP-2蛋白或其生物活性部分的细胞与试验化合物接触，及对试验化合物调节LRP-1或LRP-2活性的能力进行测定。通过监测例如转运作用、脂质代谢、信号转导或细胞活性的其它方面(例如细胞增殖、矿物沉积或溶解或蛋白的合成)来测定试验化合物调节LRP-1或LRP-2活性的能力。所述细胞，例如，可以是哺乳动物来源的，例如，人。
也可评价所述试验化合物对LRP-1或LRP-2结合于化合物(例如，LRP-1或LRP-2底物)的调节能力、或者其结合于LRP-1或LRP-2的能力。其可通过，例如，将该化合物(例如底物)与放射性同位素或酶标记连接来实现，这样通过检测复合物中被标记的该化合物(例如底物)可以测定结合到LRP-1或LRP-2的所述化合物(例如底物)。可选择地，LRP-1或LRP-2可与放射性同位素或酶标记连接来监测试验化合物对复合物中LRP-1或LRP-2结合于LRP-1或LRP-2底物的调节能力。例如，可使用125I、35S、14C或3H直接或间接地标记化合物(例如LRP-1或LRP-2底物)，并通过直接的放射线记数或通过闪烁记数来检测放射性同位素。可选择地，可使用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶进行酶性标记，并通过测定适合底物向产物的转化来检测所述的酶标记。
在有或没有对任何相互作用因子标记时，可对化合物(例如LRP-1或LRP-2底物)与LRP-1或LRP-2相互作用的能力进行评价。例如，在没有对该化合物或所述LRP-1或LRP-2标记时，可使用微小生理机能检测器来检测化合物与LRP-1或LRP-2的相互作用(McConnell，H.M.et al.(1992)Science 2571906-1912)。本文所用的“微小生理机能检测器”(例如细胞传感器)为一种分析仪器，其可通过光寻址电位传感器(LAPS)测量细胞酸化其环境的比值。此酸化比值的变化可用作化合物与LRP-1或LRP-2间相互作用的指示剂。
在另一个实施方案中，本发明还提供了无细胞分析，其中LRP-1或LRP-2蛋白、或者其生物活性部分与试验化合物接触，及对该试验化合物与LRP-1或LRP-2蛋白、或者其生物活性部分的结合能力进行评价。优选的可用于本发明的分析的LRP-1或LRP-2蛋白生物活性部分包括参与与非LRP-1或LRP-2分子相互作用的片段，例如具有高度表面概率值的片段。
分离蛋白的溶解或膜结合形式(例如LRP-1或LRP-2蛋白或其生物活性部分)可用于本发明的无细胞分析。当使用该蛋白的膜结合形式时，应使用溶解性试剂。此溶解性试剂的例子包括非离子活性剂，例如n-辛基葡糖苷、n-十二烷基葡糖苷、n-十二烷基麦芽甙、辛醇-N-甲基葡糖胺(glucamide)、葵酰基-N-甲基葡糖胺、TritonX-100、TritonX-114、Thesit、异十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸酯(盐)(CHAPS)、3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸酯(盐)(CHAPSO)或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐(酯)。
无细胞分析包括在使两种成分相互作用并结合的条件和足够的反应时间下，制备靶基因蛋白与试验化合物的反应混合物，由此形成可被移去或检测的复合物。
两分子间的相互作用也可检测，例如通过荧光能量传输(fluorescenceenergy transfer(FET))(参见例如Lakowicz et al.美国专利第5,631,169号；Stavrianopoulos et al.美国专利第4,868,103号)来检测。选择第一“供体”分子上的荧光团标记，使得其发出的荧光能量被第二“受体”分子上的荧光标记吸收，该第二“受体”分子由于吸收能量而能够产生荧光。可选择地，该“供体”蛋白分子可简单地使用色氨酸残基的天然荧光能量。选择能发出不同波长的光的标记，使得该“受体”分子的标记有别于该“供体”。因为标记间能量的转移效率与所述分子间分隔的距离有关，因此可对所述分子间的空间关系作出评估。在所述分子间发生结合的情况下，在分析中所述的“受体”分子标记的荧光释放应是最大。FET结合事件可通过本领域公知的标准荧光检测手段来进行常规测量(例如，使用荧光分析仪)。
在另一个实施方案中，可使用实时的生物分子相互作用分析(BIA)(参见例如，Sjolander，S.and Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.632338-2345及Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)来实现LRP-1或LRP-2蛋白与靶分子的结合能力测定。“表面细胞质团共振(plasmon resonance)”或“BIA”可在没有标记任何相互作用因子(例如BIAcore)的情况下实时地检测生物特异的相互作用。所述结合表面的质量变化(指示结合事件)可导致接近表面的折射率变化(表面细胞质团共振(SPR)的光学现象)，从而产生可用作生物分子间实时反应指示的可检测的信号。
在一个实施方案中，所述的靶基因产物或试验物质被锚定在固相上。在反应结束时可检测锚定在固相上的所述的靶基因产物/试验化合物复合物的。优选地，所述靶基因产物可被锚定在固体表面，同时可直接或间接地用本文所述的可检测标记来标记所述的试验化合物(其没有锚定)。
优选固化LRP-1或LRP-2、抗LRP-1或LRP-2抗体、或其靶分子，来促进一种或两种蛋白的复合形式与未复合形式分离，同时调节分析的自动化。试验化合物与LRP-1或LRP-2蛋白的结合，或者在有或没有候选化合物存在时的LRP-1或LRP-2蛋白与靶分子的相互作用，可在适合容纳所述反应剂的任何容器中完成。这类容器的例子包括微滴定板、试管、及微型离心管。在一个实施方案中，可提供加有功能域的融合蛋白，该功能域可使所述蛋白中一种或两种都结合到基质上。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/LRP-1或LRP-2融合蛋白或者谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白可被吸附在谷胱甘肽琼脂糖凝胶小珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微滴定板，其随后与该试验化合物结合或者该试验化合物与所述非吸附靶蛋白或者LRP-1或LRP-2蛋白结合，该混合物在有益于复合物形成的条件下孵育(例如，在盐与pH的生理条件下)。孵育后，洗涤所述的小珠或微滴定板小孔以除去任何未结合的成分，在小珠情况下的固化基质，如此形成的复合物可直接或间接检测，例如上文所述。可选择地，所述复合物可从所述的基质分离，并使用标准的技术来分析LRP-1或LRP-2的结合或活性水平。
在基质上固化LRP-1或LRP-2蛋白、或者靶分子的其它技术包括使用生物素和链霉素抗生物素蛋白(streptavidin)的共轭作用。生物素化LRP-1或LRP-2蛋白或者靶分子可使用本领域公知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)利用生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备，并固化在streptavidin包被的96孔板(Pierce Chemical)的小孔中。
为进行所述分析，将非固化成分加入到含有锚定成分的包被表面。反应结束后，在可将任何形成的复合物保持固化在该固体表面上的条件下除去(如通过洗涤)未反应的成分。锚定在该固体表面的复合物的检测可通过许多方法来实现。当上述非固化成分被预先标记，则在该表面检测到固定的标记表明形成了复合物。当上述非固化成分未预先标记，则可用间接标记检测锚定在该表面上的复合物，例如，使用对固化成分特异的标记抗体(该抗体可直接或间接用例如标记的抗Ig抗体来标记)。
在一个实施方案中，使用可与LRP-1或LRP-2蛋白或者靶分子反应的抗体来进行该分析，但该抗体不干扰该LRP-1或LRP-2蛋白与其靶分子的结合。通过抗体连接，这种抗体能衍生至所述平板的小孔并通过抗体将未结合的靶标、或LRP-1或LRP-2蛋白捕获到所述小孔中。检测这种复合物的方法，除上述用于GST-固化复合物的方法，还包括使用可与LRP-1或LRP-2蛋白或者靶分子反应的抗体对复合物进行免疫分析，及依赖于检测与该LRP-1或LRP-2蛋白或者靶分子相关的酶活性的酶联分析。
可选择地，无细胞分析可在液相中进行。在此种分析中，通过多种标准技术中的任何技术将反应产物与未反应的成分分离，其中所述标准技术包括但不限于差速离心(参见，例如Rivas，G.，and Minton，A.P.，(1993)Trends Biochem Sci 18284-7)；层析法(凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析)；电泳(参见，例如Ausubel，F.et al.，eds.Current Protocols inMolecular Biology 1999，J.WileyNew York.)；及免疫共沉淀(参见，例如Ausubel，F.et al.，eds.(1999)Current Protocols in Molectilar Biology，J.WileyNew York)。这种树脂与色谱技术是本领域所属技术人员公知的(参见，例如Heegaard，N.H.，(1998)J Mol Recognit 11141-8；Hage，D.S.，andTweed，S.A.(1997)J Chromatogr B Biomed Sci Appl.699499-525)。此外，如本文所述，可常规地使用荧光能量转移来检测结合，而不用从溶液中进一步纯化所述复合物。
在优选的实施方案中，所述分析包括将该LRP-1或LRP-2蛋白或者其生物活性部分与已知的化合物接触，该化合物能结合LRP-1或LRP-2形成分析混合物，将该分析混合物与试验化合物接触，并测定该试验化合物与LRP-1或LRP-2蛋白相互作用的能力，其中上述测定试验化合物与LRP-1或LRP-2蛋白相互作用的能力包括检测，与该已知化合物相比地，该试验化合物优选结合于LRP-1或LRP-2或者其生物活性部分的能力，或调节靶分子活性的能力。
所述靶基因产物可在体与诸如蛋白的一种或多种细胞或细胞外大分子相互作用。为了讨论的目的，此种细胞或细胞外大分子本文称为“结合伴侣”。破坏这种相互作用的化合物可用于调节该靶基因产物的活性。这种化合物包括但不限于，诸如抗体、肽及小分子的分子。本发明实施方案使用的优选靶基因/产物为本发明鉴定的LRP-1或LRP-2基因。在一个可选择的实施方案中，本发明提供测定所述试验化合物对LRP-1或LRP-2蛋白活性的调节能力的方法，其中所述调节是通过调节LRP-1或LRP-2靶分子的下游作用因子的活性来实现。例如，如上文所述，可检测适当靶标上的作用因子分子的活性，或可检测适当靶标上的作用因子分子的结合。
为鉴定干扰靶基因产物与其细胞或细胞外结合伴侣的相互作用的化合物，制备含有该靶基因产物及该结合伴侣的反应混合物，在条件与时间充分的情况下，使该两种产物形成复合物。为试验抑制性试剂，在有或没有该试验化合物存在下，提供该反应混合物。该试验化合物可最初包括在该反应混合物中，或者在该靶基因与其细胞或细胞外结合伴侣加入之后加入。在没有该试验化合物或有安慰剂存在时，孵育对照反应混合物。随后检测该靶基因与其细胞或细胞外结合伴侣间的任何复合物的形成。在所述对照反应中而不在含有该试验化合物的反应混合物中形成该复合物，表明该化合物能干扰该靶基因与其相互作用的结合伴侣的相互作用。此外，含有该试验化合物和正常靶基因产物的反应混合物中的复合物形成可与含有该试验化合物和突变靶基因产物的反应混合物中的复合物形成进行比较。这种比较在需要鉴定化合物是破坏突变的而非正常的靶基因产物的相互作用时，显得很重要。
可采用异源或同源的形式来进行这些分析。异源分析包括在固相的表面锚定所述的靶基因产物或所述的结合伴侣，及在反应结束时检测锚定在该固相上的复合物。在同源分析中，全部反应在液相中完成。在任一途径中，反应试剂的加入顺序可以不同，从而获得有关所试验混合物的不同信息。例如，干扰该靶基因产物与该结合伴侣间相互作用(例如通过竞争)的试验化合物，可通过在有该试验物质存在下进行反应来鉴定。可选择地。干扰已经形成的复合物的试验化合物，例如具有较高结合常数能从该复合物中替换某一成分的化合物，可通过在复合物形成后向反应混合物中加入该试验化合物来测试。以下对其各种形式做简要描述。
在异源分析系统中，将靶基因产物或可相互作用的细胞或细胞外结合伴侣两者之一锚定在固体表面(例如，微滴定板)，同时直接或间接标记未锚定的物质。通过非共价或共价结合将该锚定物固化。可选择地，可用对该待锚定物质特异的已固化抗体将该物质锚定在该固体表面。
为实施该分析，将该固化物质的伴侣与或不与该试验化合物暴露于所述的包被表面。反应结束后，除去未反应的成分(例如通过洗涤)，并且任何形成的复合物将保持固化在所述的固体表面。当该非固化物作了预先标记时，则在该表面检测到固化的标记表明形成了复合物。当该非固化物未作预先标记时，可使用间接的标记检测锚定在该表面的复合物，例如，使用对最初的非固化物质特异的标记抗体(可利用例如标记的抗Ig抗体直接或间接标记该抗体)。依据反应成分加入的顺序，可鉴定抑制复合物形成或干扰已经形成的复合物的试验化合物。
可选择地，可在有或没有所述试验化合物存在时，在液相中进行该反应，从未反应的成分中分离反应产物，并检测复合物，例如，使用对某一结合成分特异的固化抗体来锚定在溶液中形成的任何复合物，并使用对其它伴侣特异的抗体来检测锚定的复合物。再者，依据向液相中加入反应物的顺序，可鉴定抑制复合物或干扰已经形成的复合物的试验化合物。
在本发明可选择的实施方案中，可使用同源分析。例如，制备该靶基因产物及与其相互作用的细胞或细胞外结合伴侣产物形成的复合物，其中标记该靶基因产物或其结合伴侣，但由于复合物的形成使该标记产生的信号淬灭(参见，例如美国专利第4,109,496号，其使用此途径进行免疫分析)。加入竞争并替换已形成的复合物中某一物质的试验物质将导致产生高于本底的信号。通过此方法，可鉴别干扰基因产物与结合伴侣相互作用的试验物质。
另一方面，所述的LRP-1或LRP-2蛋白在双杂交分析或三杂交分析中可用做“诱饵蛋白”(参见例如，美国专利第5,283,317号；Zervos et al.(1993)Cell 72223-232；Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel et al.(1993)Biotechniques 14920-924；Iwabuchi et al.(1993)Oncogene 81693-1696；及Brent的国际公开WO94/10300)，用于鉴定与LRP-1或LRP-2结合或者相互作用(“LRP-1或LRP-2-结合蛋白”或者“LRP-1或LRP-2-bp”)并参与LRP-1或LRP-2活性的其它蛋白。这种LRP-1或LRP-2-bps可以是信号的活化剂或抑制剂，该信号通过LRP-1或LRP-2蛋白、或者LRP-1或LRP-2靶标做为例如LRP-1或LRP-2介导信号途径的下游元件来传递。
该双杂交系统是依据大多数转录因子的分子特性，其包括可分隔的DNA结合与活化区。简而言之，该分析使用两个不同的DNA构建。在一个构建中，将编码LRP-1或LRP-2蛋白的基因融合到编码已知转录因子的DNA结合区的基因(例如，GAL-4)。在另一个构建中，从DNA序列库来源的编码未鉴定蛋白(“被捕获者”或“样本”)的DNA序列，融合到编码该已知转录因子的活化区的基因(可选择地，该LRP-1或LRP-2蛋白可融合到活化剂区域)。如果该“诱饵”和该“被捕获”蛋白能够相互作用，在体形成LRP-1或LRP-2依赖的复合物，该转录因子的DNA结合与活化区会紧密地接近。这种接近可使报道基因(例如，lacZ)发生转录，该基因可操作地连接到对该转录因子产生反应的转录调节位点。可检测报道基因的表达，并分离含有该功能性转录因子的细胞克隆，且该细胞克隆可用于获得编码与LRP-1或LRP-2蛋白相互作用的蛋白的克隆基因。
在另一个实施方案中，鉴定了LRP-1或LRP-2表达的调节剂。例如，将细胞或无细胞混合物与候选化合物接触，并相对于没有该候选化合物存在时的LRP-1或LRP-2的mRNA或蛋白表达水平评价其LRP-1或LRP-2的mRNA或蛋白的表达。当有该候选化合物存在时的LRP-1或LRP-2的mRNA或蛋白的表达高于没有其存在时的水平，则该候选化合物被鉴定为LRP-1或LRP-2的mRNA或蛋白表达的刺激剂。可选择地，当有该候选化合物存在时的LRP-1或LRP-2的mRNA或蛋白的表达低于(具有统计学意义的显著性减少)没有其存在时的水平，则该候选化合物被鉴定为LRP-1或LRP-2的mRNA或蛋白表达的抑制剂。通过本文所述的检测LRP-1或LRP-2的mRNA或蛋白的方法可测定LRP-1或LRP-2的mRNA或蛋白表达的水平。
另一方面，本发明涉及将两个或更多个本文所述的分析组合。例如，可使用细胞或无细胞分析来鉴定调节试剂，并且该试剂对LRP-1或LRP-2蛋白活性的调节能力可在体内做进一步证实，例如，在诸如骨病症动物模型的动物中，该病症如骨质疏松、派杰氏病剂成骨不全症。
本发明还涉及通过上述筛选分析鉴定的新试剂。据此，在适合的动物模型中，进一步使用如本文所述鉴定的试剂(例如，LRP-1或LRP-2调节试剂、反义LRP-1或LRP-2核酸分子、LRP-1或LRP-2-特异抗体、或LRP-1或LRP-2结合伴侣)来测定使用这种试剂的治疗功效、毒性、副作用、或作用机制也属于本发明的范围。此外，通过上述筛选分析鉴定的新试剂可用于本文所述的治疗中。
预测医学本发明还涉及预测医学领域，其中将诊断分析、预兆分析、及监测临床试验用于预测(预报)目的并由此来治疗个体。
通常，本发明提供，测定个体是否具有与编码LRP-1或LRP-2的基因的损伤或错误表达相关病症的风险。
这种病症包括，例如与LRP-1或LRP-2基因错误表达相关的病症；骨病症。
所述方法包括如下的一种或多种在该个体的组织中，检测影响LRP-1或LRP-2基因表达的突变存在或不存在，或检测所述基因表达的控制区域的突变(例如，5’控制区的突变)存在或不存在；
在所述个体的组织中，检测改变该LRP-1或LRP-2基因结构的突变存在或不存在；在所述个体的组织中，在mRNA水平检测该LRP-1或LRP-2基因的错误表达，例如，检测mRNA的非野生型水平；在所述个体的组织中，在蛋白水平检测该LRP-1或LRP-2基因的错误表达，例如，检测LRP-1或LRP-2多肽的非野生型水平；在优选的实施方案中，该方法包括确定至少存在下列一种从LRP-1或LRP-2基因缺失一个或多个核苷酸；一个或多个核苷酸插入该基因，点突变，例如，该基因的一个或多个核苷酸的取代；该基因的总染色体重排，例如，移位、倒置或缺失。
例如，所述遗传性损伤的检测可包括(i)提供包括寡核苷酸的探针/引物，该寡核苷酸含有能与有义或反义序列杂交的核苷酸序列区，该有义与反义序列来自与所述LRP-1或LRP-2基因相关的其天然产生的突变，或者天然的5’或3’侧翼序列；(ii)将所述的探针/引物暴露于该组织的核酸；及通过所述探针/引物与所述核酸的杂交(例如原位杂交)来检测所述遗传性损伤存在或不存在。
在优选的实施方案中，错误表达的检测包括确定至少存在以下一种LRP-1或LRP-2基因的信使RNA转录产物水平的变化；该基因的信使RNA转录产物的非野生型拼接型的存在；或LRP-1或LRP-2的非野生型水平。
本发明的方法可用于出生前或测定个体的后代是否具有某种病症的风险。
在优选的实施方案中，该方法包括测定LRP-1或LRP-2基因的结构，异常的结构表明具有该病症的风险。
在优选的实施方案中，该方法包括将来自该个体的样本与该LRP-1或LRP-2蛋白的抗体或与该基因特异杂交的核酸接触。这些及其它的实施方案如下所述。
诊断与预测分析本发明的诊断与预测分析包括评估LRP-1或LRP-2分子表达水平的方法及鉴定LRP-1或LRP-2分子序列变体和突变的方法。
表达的监控与表达谱分析通过从试验个体获得生物样本，并将该生物样本与能够检测LRP-1或LRP-2蛋白或编码LRP-1或LRP-2蛋白的核酸(例如，mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触，使得能够检测该生物样本中的LRP-1或LRP-2蛋白或核酸的存在，由此评价生物样本中的LRP-1或LRP-2蛋白或者核酸的存在、水平或不存在。术语“生物样本”包括分离自个体的组织、细胞及生物液体，以及个体中存在的组织、细胞及液体。优选的生物样本为血清。LRP-1或LRP-2基因的表达水平可通过多种途径来测量，包括但不限于测量该LRP-1或LRP-2基因编码的mRNA；测量该LRP-1或LRP-2基因编码的蛋白的含量；测量该LRP-1或LRP-2基因编码的蛋白的活性。
可通过原位和离体形式来测定细胞中与LRP-1或LRP-2基因对应的mRNA水平。
该分离的mRNA可用于杂交或扩增分析，其包括但不限于，Southern或Northern分析，聚合酶链式反应及探针芯片。一种优选的检测mRNA水平的诊断方法包括将该分离的mRNA与核酸分子(探针)接触，该核酸分子能与被检测基因编码的mRNA杂交。该核酸探针可以是例如全长LRP-1或LRP-2核酸，如SEQ ID NO1的核酸序列或其一部分，如在严格的条件下，能够满足与LRP-1或LRP-2的mRNA或基因组DNA特异杂交的，核苷酸长度至少为7、15、30、50、100、250或500的寡核苷酸。该探针可放置在芯片(例如，如下所述的芯片)的某个位置。其它在诊断分析中使用的适合的探针如本文所述。
在一种形式中，将mRNA(或cDNA)固化在表面上并与该探针接触，例如，通过在琼脂糖凝胶上电泳所分离的mRNA并将该mRNA从该凝胶转移至诸如硝酸纤维的膜上。在可选择的形式中，将该探针固化在表面上并将该mRNA(或cDNA)与该探针接触，例如在下文所述的二维芯片阵列中。本领域所属技术人员可采用公知的mRNA检测方法来检测LRP-1或LRP-2基因编码的mRNA水平。
可通过核酸扩增来评价样本中由LRP-1或LRP-2两者之一编码的mRNA水平，例如，通过RT-PCR(Mullis(1987)美国专利第4,683,202号)、连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88189-193)、自主序列复制系统(Guatelli et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)、转录扩增系统(Kwoh et al.，(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)、Q-Beta复制酶(Lizardi etal.，(1988)Bio/Technology61197)、滚动循环复制(Lizardi et al.，美国专利第5,854,033号)或任何其它的核酸扩增方法，随后使用本领域公知的技术来检测所扩增的分子。本文所用的扩增引物定义为可退火于的基因的5’或3’区域(正链负链、分别地、或反之亦然)的一对核酸分子并且其间含有短的区域。通常，扩增的引物约为10～30核苷酸长度，且侧翼连接到约为50～200核苷酸长度的区域。在适合的条件并有适合的试剂存在时，这种引物可允许含有由该引物侧翼连接的核苷酸序列的核酸分子的扩增。
对于原位方法，可制备/处理细胞或组织样本并固化在通常是玻片的支持物上，并随后与探针接触，该探针可与编码待分析的LRP-1或LRP-2基因的mRNA杂交。
在另一个实施方案中，该方法进一步将对照样本与能检测LRP-1或LRP-2的mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，并将该对照样本中LRP-1或LRP-2的mRNA或基因组DNA的存在与所述试验样本中LRP-1或LRP-2的mRNA或基因组DNA的存在进行比较。在另一个实施方案中，如美国专利第5,695,937所述的基因表达的系列分析被用于检测LRP-1或LRP-2转录产物的水平。
可使用多种方法来测定由LRP-1或LRP-2编码的蛋白水平。通常，这些方法包括，将选择性结合于该蛋白的诸如抗体的试剂与样本接触，以评估该样本中的该蛋白水平。在优选的实施方案中，该抗体负载可检测的标记。抗体可以是多克隆抗体、或更优选为单克隆抗体。可使用完整的抗体或其片段(例如，FAB或F(ab′)2)。针对所述探针或抗体的术语“标记”应包括通过将可检测的物质偶联(即物理连接)到该探针或抗体来对该探针或抗体进行直接标记，也包括通过与可检测物质反应对该探针或抗体进行间接标记。可检测物质的例子如本文所提供的。
该检测方法可用于离体及在体检测生物样本中的LRP-1或LRP-2蛋白。检测LRP-1或LRP-2蛋白的离体技术包括酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫共沉淀、免疫荧光、酶免疫分析(EIA)、放射性免疫分析(RIA)及Western印记分析。检测LRP-1或LRP-2蛋白的在体技术包括将标记的抗LRP-1或LRP-2抗体介入个体。例如，可用放射活性标志物来标记该抗体，该标志物在个体中的存在及位置可通过标准的成像技术来检测。在另一个实施方案中，所述样本被标记(例如生物素化)，并随后与该抗体接触，该抗体例如放置在抗体芯片上的抗LRP-1或LRP-2抗体(如下所述)。该样本可例如用偶联于荧光素标记的抗生物素蛋白来检测。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述对照样本与能够检测LRP-1或LRP-2蛋白的化合物或试剂接触，并将该对照样本中LRP-1或LRP-2蛋白的存在与所述试验样本中LRP-1或LRP-2蛋白的存在进行比较。
本发明还包括用于检测生物样本中LRP-1或LRP-2存在的试剂盒。例如，该试剂盒可包括能够检测生物样本中LRP-1或LRP-2蛋白或mRNA的化合物或试剂；及标准。该化合物或试剂可包装在适合的容器中。该试剂盒进一步包括使用该试剂盒检测LRP-1或LRP-2蛋白或核酸、或者该LRP-1或LRP-2蛋白的激动剂或拮抗剂的用法说明。
对于抗体为基础的试剂盒，该试剂盒包括(1)结合到对应于标志物的多肽的第一抗体(例如，粘附于固体支持物)；及可选择地，(2)不同的第二抗体，其或与该多肽结合或与该第一抗体结合，并结合有可检测试剂。
对于寡核苷酸为基础的试剂盒，该试剂盒包括(1)寡核苷酸，例如，可检测标记的寡核苷酸，其能与编码对应于标志物的多肽的核酸序列杂交，或(2)用于扩增对应于标志物的核酸分子的一对引物。该试剂盒还可包括缓冲试剂、防腐剂、或蛋白稳定剂。该试剂盒还可包括检测可检测试剂的必需成分(例如，酶或底物)。该试剂盒还可包括对照样本或对照样本系列，可对其进行分析并与所含的试验样本比较。该试剂盒的每种成分可在单独的容器中封装，并且所有的各种容器可与解释使用该试剂盒进行分析所得结果的说明书一同装在一个包装内。
本文所述的诊断方法可鉴定患有或有风险发展为与错误表达的、或异常的、或非需要的LRP-1或LRP-2表达或活性相关的疾病或病症。本文所用术语“非需要”包括在生物反应中出现的非需要现象例如，诸如骨质疏松症、派杰氏病及骨发生不全的骨病症。
在一个实施方案中，鉴定了与异常的或非需要的LRP-1或LRP-2表达或活性相关的疾病或病症。从个体获得试验样本并评估LRP-1或LRP-2蛋白或核酸(例如，mRNA或基因组DNA)，其中，LRP-1或LRP-2的蛋白或核酸的水平(例如存在或不存在)可对患有或有风险发展为与异常的或非需要的LRP-1或LRP-2表达或活性相关的疾病或病症的个体作出诊断。本文所用“试验样本”指从感兴趣的个体中获得的生物样本，包括生物体液(例如，血清)、细胞样本或组织。
本文所述的预测分析可用于确定个体可否给予试剂(例如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白、肽、核酸、小分子或其它药物候选者)来治疗与异常的或非需要的LRP-1或LRP-2表达或活性相关的疾病或病症。例如，此种方法可以用于确定个体可否通过用于诸如骨质疏松症、派杰氏病及骨发生不全的骨病症的试剂有效治疗。
另一个方面，本发明还涉及具有多种数字化编码数据记录的计算机媒介。每个数据记录包括代表样本中LRP-1或LRP-2表达水平的数值，及该样本的描述符。该样本描述符可为该样本、从中得到该样本的个体(例如病人)、诊断或治疗(例如，优选的治疗)的标识符。在优选的实施方案中，该数据记录进一步包括代表非LRP-1或LRP-2的基因(例如，与LRP-1或LRP-2病症相关的其它基因，或芯片上的其它基因)的表达水平的数值。该数据记录可建成表格，例如，构成诸如关系数据库(例如，Oracle或Sybase数据库环境的SQL数据库)的数据库的一部分的表格。
本发明还涉及评估样本的方法。该方法包括提供样本(例如从所述个体中)，及测定该样本中的基因表达谱，其中该表达谱包括代表LRP-1或LRP-2表达水平的数值。该方法还包括将该数值或该表达谱(即多个数值)与参考数值或参考表达谱比较。该样本的基因表达谱可通过本文所述的任何方法获得(例如，通过提供从所述样本获得的核酸，并将该核酸与芯片接触)。该方法可用于诊断个体中诸如骨质疏松症、派杰氏病及骨发生不全的骨病症，其中LRP-1或LRP-2表达的增加/降低表明该个体患有或有倾向患有诸如骨质疏松症、派杰氏病及骨发生不全的骨病症。该方法可用于监测对个体中诸如骨质疏松症、派杰氏病及骨发生不全的骨病症的治疗。例如，可测定从正在接受治疗的个体获得的样本中的所述基因表达谱。该表达谱可与参考表达谱或在治疗前或该病症发病前从该个体获得的表达谱比较(参见，例如Golub et al.(1999)Science 286531)。
另一方面，本发明涉及评价试验化合物的方法(也参见上述的“筛选分析”)。该方法包括提供细胞及试验化合物；将该试验化合物与该细胞接触；从该接触细胞中获得个体的表达谱；及将该个体表达谱与一种或多种参考表达谱比较。所述的表达谱包括代表LRP-1或LRP-2表达水平的数值。
在一个优选的实施方案中，将该个体表达谱与目标表达谱(例如正常细胞的或所希望的细胞状态的表达谱)比较。如果与未接触细胞的表达谱比较，该个体表达谱与该目标表达谱更加相似，则可顺利地对所述的试验化合物做出评价。
另一方面，本发明涉及评价个体的方法。该方法包括a)从个体获得样本，例如从护理者(caregiver)(例如，从所述个体获得所述样本的护理者)获得；b)测定该样本的个体表达谱。可选择地，该方法进一步包括以下的一步或两步c)将该样本表达谱与一种或多种参考表达谱比较；及d)选择与该个体参考表达谱最相似的参考表达谱。该个体表达谱与该参考表达谱包括代表LRP-1或LRP-2表达水平的数值。各种常规的统计学方法可用来比较两个参考表达谱。一种可能的度量(metric)是所述两种表达谱不同的距离矢量的长度。该个体与参考表达谱均表示为多维矢量，其中每一维都是所述表达谱中的数值。
该方法可进一步包括将结果传输给护理者。该结果可以是所述个体表达谱、所述个体表达谱与另一表达谱的比较结果、最相似的参考表达谱或前述的任何描述符。该结果可通过计算机网络进行传输，例如该结果可以是计算机传输的形式，如内含在载波中的计算机数据信号。
本发明还涉及具有实现如下步骤的执行代码的计算机媒介接收个体表达谱；访问参考表达谱的数据库；及，或者i)选择与该个体表达谱最相似的匹配参考表达谱，或者ii)确定对该个体表达谱与至少一种参考表达谱的相似性的至少一个比较分数。该个体表达谱及所述参考表达谱均包括代表LRP-1或LRP-2表达水平的数值。
变体和突变体的检测本发明的方法还可用于LRP-1或LRP-2基因中遗传学变化的检测，由此确定具有改变后基因的个体是否有风险患有以LRP-1或LRP-2蛋白活性或核酸表达的错误调节为特征的病症(例如，骨质疏松症、派杰氏病或成骨不全)。在优选实施方案中，该方法包括检测所述个体样本中基因变化存在与否，该变化的特征为至少一种变化影响编码LRP-1或LRP-2-蛋白基因的完整性、或LRP-1或LRP-2基因的错误表达。例如，通过确定存在至少一种以下情况可检测此种遗传学变化1)LRP-1或LRP-2基因中一个或多个核苷酸的缺失；2)在LRP-1或LRP-2基因中插入一个或多个核苷酸；3)LRP-1或LRP-2基因中一个或多个核苷酸的取代；4)LRP-1或LRP-2基因的染色体重新排列；5)LRP-1或LRP-2基因信使RNA转录产物的水平变化；6)LRP-1或LRP-2基因的异常修饰，如对基因组DNA的甲基化形式；7)LRP-1或LRP-2基因信使RNA转录产物的非野生型拼接形式的存在，8)LRP-1或LRP-2-蛋白的非野生型水平，9)LRP-1或LRP-2基因的等位缺失，及10)LRP-1或LRP-2-蛋白的不适当的翻译后修饰。
在诸如锚定PCR或RACE PCR的聚合酶链式反应中，或者可选择地在连接酶链式反应中(LCR)，可不使用探针/引物检测基因变化，其中后者可特别适用于检测LRP-1或LRP-2基因的点突变。这种方法可以包括如下步骤从个体中收集细胞样本，从该样本中分离核酸(例如，基因组的、mRNA或二者)，在能够产生LRP-1或LRP-2基因(如果存在)杂交与扩增的条件下，将该核酸样本与一种或多种与LRP-1或LRP-2基因特异杂交的引物接触，及检测扩增产物存在与否，或检测该扩增产物的大小并与对照样本的长度比较。预计PCR或LCR可理想地用作初步扩增步骤，且可与任何用于检测本文所述的突变的技术协同使用。可选择地，可使用本文所述的或本领域公知的其它方法。
在另一个实施方案中，通过检测限制性内切酶切开方式的变化来鉴定样本细胞中LRP-1或LRP-2基因的突变。例如，将样本与对照DNA分离、扩增(可选地)、用一种或多种限制性内切酶消化，并测定片段的长度尺寸(例如通过凝胶电泳并进行对比)。样本与对照之间DNA片段长度尺寸的不同表面该样本DNA有突变。而且，序列特异核酶的作用(参见例如美国专利第5,498,531号)可用于记录由核酶切位点的产生或缺失确定的特异突变的存在。
在其它实施方案中，可通过将样本与对照核酸杂交(例如DNA或RNA、诸如基于芯片的阵列的二维阵列)，来鉴定LRP-1或LRP-2中的遗传学突变。这种阵列包括多种地址，其中每一个都与其它有位置区别。不同的探针位于所述多种地址中的每一地址。探针可互补于LRP-1或LRP-2核酸或其潜在变体(例如，等位变体)的某区域。对LRP-1或LRP-2核酸的某区域，探针可具有一个或多个错配(例如，不稳定错配)。该阵列可具有高密度的地址，例如，可含有数百或数千寡核苷酸探针(Cronin，M.T.et al.(1996)Human Mutation 7244-255；Kozal，M.J.et al.(1996)NatureMedicine 2753-759)。例如，在如上Cronin，M.T等所述的含有光生成DNA探针的二维阵列中可鉴定LRP-1或LRP-2中的遗传学突变。简而言之，通过制备连续叠加探针的线性阵列，可将探针的第一杂交阵列用于扫描样本与对照中DNA的伸展片段(stretches)，并由此鉴定序列间的碱基变化。此步骤可进行点突变的鉴定。随后使用第二杂交阵列，其通过使用对所有被检测的变体或突变互补的、较小的、特异化探针阵列，来进行特异突变的特征分析。每个突变阵列含有平行探针组合，其中一种与该野生型基因互补另一种与该突变基因互补。
在另一个实施方案中，本领域公知的多种序列反应中的任何一种可用于对LRP-1或LRP-2基因直接测序，并通过将该样本LRP-1或LRP-2序列与对应的野生型(对照)序列比较来检测突变。当进行诊断性分析((1995)Biotechniques 19448)时，可使用自动测序方法，包括质谱测序。
其它检测LRP-1或LRP-2基因突变的方法包括使用防止裂解试剂作用来检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链分子中的错配碱基的方法(Myers et al.(1985)Science 2301242；Cotton et al.(1988)Proc.Natl AcadSci USA 854397；Saleeba et al.(1992)Methods Enzymol.217286-295)。
在另一个实施方案中，为检测与定位从样本细胞中获得的LRP-1或LRP-2 cDNA中的点突变，在错配裂解反应中使用一种或多种蛋白，该蛋白可识别所定义的系统中的双链DNA中的错配碱基对(所谓的“DNA错配修复”酶)。例如，大肠杆菌(E.coli)的mutY酶在G/A错配中切除A，而HeLa细胞来源的胸腺嘧啶DNA糖基化酶在G/T错配中切除T(Hsu et al.(1994)Carcinogenesis 151657-1662；美国专利第5,459,039号)。
在其它实施方案中，使用电泳迁移的变化来鉴定LRP-1或LRP-2基因的突变。例如，单链构象的多态性(SSCP)可用于检测突变型与野生型核酸间的电泳迁移差别(Orita et al.(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA862766，也参见Cotton(1993)Mutat.Res.285125-144；和Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.973-79)。样本与对照LRP-1或LRP-2核酸的单链DNA片段可以变性并允许复性。依据序列该单链的二级结构可以变化，所产生的电泳迁移变化使得可检测甚至一个碱基的改变。可用标记的探针来标记或检测该DNA片段。通过使用RNA(而不是DNA)可增强该分析的敏感性，其中二级结构对序列的改变更加敏感。在优选的实施方案中，根据电泳迁移的变化，所述方法使用异源核酸双链分析来分离双链异源核酸分子(Keen et al.(1991)Trends Genet 75)。
在另一个实施方案中，突变或野生型片段在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动可使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)来分析(Myers et al.(1985)Nature 313495)。当DGGE做为分析方法使用时，DNA应被修饰来保证其不完全变性，例如通过PCR来加入高变性温度的富含GC的DNA的约40bp长的GC发夹。在进一步的实施方案中，使用温度梯度代替变性梯度，来鉴定对照与样本DNA迁移的差别(Rosenbaum andReissner(1987)Biophys Chem 26512753)。
用于检测点突变的其它技术的例子包括但不限于，选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸(Saiki et al.(1986)Nature 324163)；Saiki et al.(1989)Proc.Natl Acad.Sci USA 866230)。检测点突变的进一步的方法为如Xu等所述((2001)Nature Biotechnol.19148)的寡核苷酸的化学连接。如果在样本核酸中所查询位点的核苷酸与该查询寡核苷酸互补，则邻近的寡核苷酸(其一选择性地退火于所查询位点)会连接在一起；可通过例如与该寡核苷酸结合的荧光染料来监测这种连接。
可选择地，本发明与依赖于选择性PCR扩增的等位特异扩增技术可协同使用。作为特异扩增引物使用的寡核苷酸可将感兴趣的突变承载在其分子中央(使得依赖特异杂交来扩增)(Gibbs et al.(1989)Nucleic AcidsRes.172437-2448)，或者一条引物的3’端的末端，其中在适合的条件下，错配可阻滞或减少聚合酶的扩展(Prossner(1993)Tibtech 11238)。此外，理想的是在突变区域介入新的限制性位点从而形成以切除为基础的检测方法(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell Probes 61)。应想到，在某些实施方案中，同样可使用用于扩增的Taq连接酶来进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88189)。这种情况下，只有在5’序列的3’末端完全匹配时才发生连接，使得可以通过检查扩增存在与否来检测特异位点的已知突变的存在。
另一方面，本发明涉及一组寡核苷酸。其包括多种寡核苷酸，其中每一种至少部分与LRP-1或LRP-2核酸互补(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、95％、97％、98％或99％互补)。
在优选的实施方案中这组寡核苷酸包括第一和第二寡核苷酸。该第一和第二寡核苷酸可与LRP-1或LRP-2基因序列的、或者LRP-1或LRP-2基因序列的互补序列的相同或不同区域杂交。不同的区域可以是在相同的链上的不同的但重叠的、或非重叠的。该第一与第二寡核苷酸可与相同或不同链上的位点杂交。
可使用这组寡核苷酸，例如，来鉴定SNP’s，或鉴定LRP-1或LRP-2的特异等位基因。在优选的实施方案中，这组寡核苷酸的每一种在查询位置具有不同的核苷酸。在一个实施方案中，这组寡核苷酸包括两种寡核苷酸，其中每个在某位置与不同的等位基因互补，例如，双等位(biallelic)或多态性位点(polymorphic locus)。
在另一个实施方案中，这组寡核苷酸包括4种寡核苷酸，每一种在查询位置具有不同的核苷酸(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶)。该查询位置可以是SNP或突变位点。在另一个优选的实施方案中，这组寡核苷酸的序列彼此是相同的(除长度不同)。这些寡核苷酸可采用不同的标记，使得与某一等位基因杂交的寡核苷酸产生的信号区别于与另一等位基因杂交的寡核苷酸产生的信号。在另一个实施方案中，该组寡核苷酸中至少一种在除查询位置外的位点有核苷酸改变，例如降低该寡核苷酸Tm的不稳定突变。在另一个实施方案中，这组寡核苷酸中至少一种含有非天然产生的核苷酸，例如，次黄嘌呤核苷。在优选的实施方案中，这些寡核苷酸粘附于固体支持物，例如，粘附到阵列的不同地址或不同的小珠或纳米颗粒。
在优选的实施方案中，这组寡核苷酸可用于特异扩增(例如，通过PCR)或检测LRP-1或LRP-2核酸。
本文所述的方法可通过，例如使用预包装的含有至少一种本文所述的核酸或抗体试剂的诊断试剂盒，其可方便地用于例如以临床组合形式诊断表现出疾病或病症的症状或家族史的患者，该疾病或病症有LRP-1或LRP-2基因参与。
做为代用标志物的LRP-1或LRP-2分子的作用该LRP-1或LRP-2分子同样可用作病症或疾病状态的标志物、疾病状态前兆的标志物、疾病状态易患病体质的标志物、药物活性的标志物、或者个体药物基因组表达谱的标志物。使用本文所述方法，可检测LRP-1或LRP-2分子的存在与否或其含量，并可关联到体内的一种或多种生物学状态。例如，该LRP-1或LRP-2分子作为一种或多种病症、或疾病状态、导致疾病状态的健康状况的替代标志物。本文所用“替代标志物”是与疾病或病症的存在与否、或疾病或病症的进程(例如，与肿瘤存在与否关联)关联的目标生物化学标志物。这种标志物的存在与含量是所述疾病的独立标志。因此，这些标志可用来表示特定的治疗阶段在减轻疾病状态或病症中是否有效。当通过常规方法学评价疾病状态或病症的存在或程度(例如，早期肿瘤)有困难时，或当在潜在危险的临床终点到达之前需要对疾病的进程进行评价时，替代标志物特别有用(例如，远在心肌梗塞或重度AIDS的不理想临床表现之前，可使用胆固醇水平作为特定标志物进行心血管疾病评价，使用HIV RNA水平做为替代标志物进行HIV感染分析，)。本领域使用的替代标志物的例子包括Koomen et al.(2000)J.Mass.Spectrom.35258-264；和James(1994)AIDS Treatment NewsArchive 209。
该LRP-1或LRP-2分子还可用作药效学标志物。本文所用的“药效学标志物”是指与药物作用特异相关的目标标志物。药效学标志物的存在与含量与将要给予此药物的疾病状态或病症没有关系；因此，该标志物的存在与含量表明了个体中该药物的存在与活性。例如，药效学标志物可以表明生物组织中该药物的浓度，其中根据该药物的水平，该标志物在该组织中或者表达或转录、或者不表达或转录。在此方式下，该药物的分布或摄取可通过该药效学标志物来监测。类似地，该药效学标志物的存在或含量可与药物的代谢产物的存在或含量有关，所以该标志物的存在或含量表明了体内该药物的相对衰减速率。药效学标志物在增加药物效果的检测敏感性中特别有用，特别是当该药物以较低剂量给药时。由于甚至少量的药物可足够活化标志物(例如，LRP-1或LRP-2标志物)的多个转录或表达周期，扩增后的该标志物的含量比该药物本身更容易检测。而且，该标志物由于其本身的特性可更容易检测，例如使用本文所述的方法，可在免疫为基础的检测系统中使用抗LRP-1或抗LRP-2抗体来对LRP-1或LRP-2蛋白标志物检测，或者使用LRP-1或LRP-2特异的放射性标记探针来检测LRP-1或LRP-2 mRNA标志物。此外，药效学标志物的使用可在可能的直接观察范围外对药物治疗产生的风险提供基于机理的预测。本领域药效学标志物应用的例子包括Matsuda et al.美国专利第6,033,862号；Hattis et al.(1991)Env.Health Perspect.90229-238；Schentag(1999)Am.J.Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3S21-S24；和Nicolau(1999)Am，J.Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3S16-S20。
所述的LRP-1或LRP-2分子也可用作药物基因组标志。本文所述的“药物基因组标志”是指目标生物化学标志，其与个体的特异临床药物反应或敏感性有关(参见，例如McLeod et al.(1999)Eur.J.Cancer351650-1652)。该药物基因组标志物的存在与含量与给药前预测的该个体对该特异药物或药物类别的反应有关。通过评价个体中一种或多种药物基因组标志物的存在或含量，可选择对该个体最适合的药物治疗，或者预计具有更大的成功性的药物治疗。例如，根据针对个体中特异肿瘤标志物的RNA或蛋白的存在与含量(例如，LRP-1或LRP-2蛋白或RNA)，可选择药物或治疗进程，其对个体中可能存在的特异肿瘤的治疗是比较理想的。类似地，LRP-1或LRP-2 DNA中特异序列突变的存在与否与LRP-1或LRP-2药物反应有关。因此该药物基因组标志物的使用使得不必调节治疗就可确定对每一个体应用最适合的治疗。
治疗方法本发明提供治疗有风险(或者容易)患有或已患有与异常或非需要的LRP-1或LRP-2表达及活性相关的病症的预防性和治疗性方法。本文所用术语“治疗”定义为，为了治疗、治愈、减轻、解除、改变、矫正、改善、改进或影响该疾病的目的，对患者应用或给予治疗性试剂、或者对从患者中分离的组织或细胞株应用或给予治疗性试剂，其中该患者患有疾病、有疾病症状或有疾病的易患病体质。治疗性试剂包括但不限于，小分子、肽、抗体、核酶及反义寡核苷酸。
针对治疗的预防性与治疗性方法，根据药物基因组学知识，可对该治疗进行特异的定制或修改。本文所用的“药物基因组学”是指针对临床开发和市场销售的药物的诸如基因测序、统计遗传学及基因表达分析的基因组技术的应用。更具体地，该术语指对患者的基因是如何决定其对药物的反应这一问题的研究(例如，患者的“药物反应表型”或“药物反应基因型”)。因此，本发明的另一方面提供使用本发明的LRP-1或LRP-2分子、或者LRP-1或LRP-2调节剂，根据个体的药物反应基因型，定制个体的预防性或治疗性治疗的方法。药物基因组学使得临床医生或内科医生能够选定使患者从中获得最大利益的预防性或治疗性治疗，并避免使患者发生毒性药物副作用的治疗。
一方面，本发明提供通过给予该个体调节LRP-1或LRP-2表达或者至少一种LRP-1或LRP-2活性的LRP-1、或LRP-2、或试剂，从而预防个体的与异常或非需要的LRP-1或LRP-2表达及活性相关的病症或疾病状态的方法。有风险患上某些疾病的个体，可通过例如本文所述的诊断性或预测性分析中的任意一种或组合来鉴定，其中所述疾病归因于或由异常或非需要的LRP-1或LRP-2表达及活性引起。在显现LRP-1或LRP-2异常的特征症状之前，可给予预防性试剂，这样才能预防疾病或病症，可选择地，延缓其进程。根据LRP-1或LRP-2异常的类型，例如LRP-1或LRP-2、LRP-1或LRP-2激动剂、LRP-1或LRP-2拮抗剂可用于治疗该个体。根据本文所述的筛选分析可鉴定适合的试剂。
基因产物的异常水平、表现异常活性的基因产物的存在，有可能(至少是部分地)引起某些LRP-1或LRP-2相关病症。如此，这种基因产物水平或活性的降低可带来疾病症状的改善。
如本文所述，可通过用于抑制靶基因产物表达或活性的技术来实现对LRP-1或LRP-2相关病症的成功治疗。例如，根据本发明，经证明能表现负调节活性地化合物(如用上述分析鉴定的试剂)，可用于预防或改善LRP-1或LRP-2相关病症的症状。此种分子可包括但不限于肽、磷酸化肽、小有机或无机分子、或抗体(包括，例如多克隆、单克隆、人源化、抗同型、嵌合的或单链抗体，及Fab、F(ab′)2和Fab表达库片段、scFV分子及其抗原决定簇结合片段)。
此外，根据本发明，抑制靶基因表达的反义及核酶分子也可用于降低靶基因的表达水平，因此有效地降低靶基因的活性水平。而且，三螺旋分子可用于降低靶基因的活性水平。反义、核酶及三螺旋分子如上所述。
也可能使用反义、核酶及三螺旋分子降低或抑制突变基因表达的同时，还会降低或抑制由正常靶基因等位基因产生的mRNA的转录(三螺旋)或翻译(反义、核酶)，这样存在的正常靶基因产物的浓度可能会低于正常表型所需的浓度。在这种情况下，可将编码并表达显示正常靶基因活性的靶基因多肽的核酸分子通过基因治疗的方法介入到细胞中。可选择地，例如，在该靶基因编码细胞外蛋白的情况中，可优选将正常靶基因蛋白一同介入该细胞或组织，从而维持所需的细胞或组织靶基因的活性水平。
使用核酸分子治疗或预防以LRP-1或LRP-2表达为特征的疾病的另一方法是通过使用对LRP-1或LRP-2蛋白特异的适合体(aptamer)分子来实现的。适合体是具有三级结构的核酸分子，该结构使其可与蛋白配基特异结合(参见例如，Osborne，et al.(1997)Curr.Opin.Chem Biol.15-9；and Patel，D.J.(1997)Curr Opin Chem Biol 132-46)。在许多情况下，由于核酸分子比治疗性蛋白分子更方便介入到靶细胞中，适合体能够提供特异降低LRP-1或LRP-2蛋白活性而无需介入具有多能性作用的药物或其它分子的方法。
可产生对靶基因产物特异并可降低靶基因产物活性的抗体。因此，通过例如负调节技术介入，这种抗体适合于LRP-1或LRP-2相关病症的治疗。对于抗体的介绍，参见上述抗体部分。
在用LRP-1或LRP-2蛋白或抗原决定簇对动物或人类个体注射来刺激抗体产生对该个体是有害的情况下，可以通过使用抗独特型(idiotypic)抗体来产生针对LRP-1或LRP-2的免疫反应(参见例如Herlyn，D.(1999)Ann Med 3166-78；and Bhattacharya-Chatterjee，M.，and Foon，K.A.(1998)Cancer Treat Res.9451-68)。如果抗同型抗体介入到哺乳动物或人类个体中，其会刺激抗-抗-同型抗体的产生，该抗-抗-同型抗体对该LRP-1或LRP-2蛋白特异。针对LRP-1或LRP-2表达为特征的疾病的疫苗也可通过此方式产生。
在该靶抗原为细胞内的并使用全抗体的例子中，优选内在化抗体。Lipofectin或脂质体可用于将结合于该靶抗原的该抗体或其Fab区片段传输进细胞内。当使用该抗体的片段时，优选结合于该靶抗原的最小的抑制片段。例如，可使用具有与该抗体Fv区对应的氨基酸序列的肽。可选择地，也可给予与细胞内靶抗原结合的单链中性化抗体。可通过例如在该靶细胞群中表达编码单链抗体的核酸序列来给予此种单链抗体(参见例如，Marasco et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907889-7893)。
该鉴定的能够抑制靶基因表达、合成或活性的化合物能以治疗有效剂量给予患者来预防、治疗或改善LRP-1或LRP-2相关病症。治疗的有效剂量指该化合物的剂量足以产生该病症症状的改善。可通过如上所述的标准药学步骤来测定此化合物的毒性和治疗效果。
从细胞培养分析与动物研究中获得的数据可用于组方在人体使用的剂量范围。该化合物的剂量优选位于循环浓度的剂量范围内，该范围包括其几乎没有或无毒性的ED50。根据所使用的剂型、给药途径，该剂量可在此范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，其治疗有效剂量可从细胞培养分析中初步估计。细胞培养中确定的剂量可形成动物模型中剂量，从而获得包括其IC50(即，该试验化合物的可实现症状半数最大抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。此资料可用于更准确的确定人体使用的剂量。可测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱。
确定针对个体的治疗有效剂量的另一个实施例能够直接分析该试验个体血清中“游离”和“结合”化合物的水平。这种分析可使用通过分子印记技术产生的抗体模拟物或“生物传感器”。使用能调节LRP-1或LRP-2活性的化合物做为模板或“印记分子(imprinting molecule)”，在可聚合单体与催化试剂聚合之前对其进行空间组织。随后去除该印记后分子剩下聚合体基质，其含有重复的该化合物的“阴性图像”并可在生物分析条件下选择性地再结合该分子。此技术的详细综述可参见Ansell，R.J.et al(1996)Current Opinion in Biotechnology 789-94及Shea，K.J.(1994)Trends in Polymer Science 2166-173文中所述。此“印记的”亲和基质经过配基结合分析，其中该固化的单克隆抗体成分可由适合的印记基质来代替。通过这种途径使用这种基质的例子可参见Vlatakis，G.et al(1993)Nature 361645-647所述。通过同位素标记，该可调节LRP-1或LRP-2表达或活性的化合物的游离浓度，可被容易地检测到并可用于IC50的计算中。
此种“印记”亲和基质也可设计为含有荧光基团，其光子发散特性在与目标化合物局部和选择性结合后发生可测量的变化。可使用适合的光纤设备容易地对这些变化进行实时分析，从而可根据个体的IC50快速地优化试验个体的使用剂量。此“生物传感器”的基本的例子如Kriz，D.et al(1995)Analytical Chemistry 672142-2144中所述。
本发明的另一方面涉及为治疗目的调节LRP-1或LRP-2表达和活性的方法。据此，在一个示范性实施方案中，本发明的调节方法包括将细胞与能够调节该细胞相关的一种或多种LRP-1或LRP-2蛋白活性的LRP-1或LRP-2、或试剂接触。调节LRP-1或LRP-2蛋白活性的试剂可以是本文所述的试剂，例如核酸或蛋白、天然产生的LRP-1或LRP-2蛋白靶分子(例如，LRP-1或LRP-2底物或受体)、LRP-1或LRP-2抗体、LRP-1或LRP-2激动剂或拮抗剂、LRP-1或LRP-2激动剂或拮抗剂的肽模拟物或其它小分子。
在一个实施方案中，该试剂刺激一种LRP-1或LRP-2活性。此刺激试剂的例子包括活化LRP-1或LRP-2蛋白及编码LRP-1或LRP-2的核酸分子。在另一个实施方案中，该试剂抑制一种或多种LRP-1或LRP-2活性。此抑制试剂的例子包括反义LRP-1或LRP-2核酸分子、抗LRP-1或LRP-2抗体及LRP-1或LRP-2抑制剂。这些调节方法可离体进行(例如，用该试剂培养该细胞)或可选择地在体内进行(例如，给予个体该试剂)。因此，本发明可提供治疗患有以LRP-1或LRP-2蛋白或核酸分子的异常或非需要的表达或活性为特征的病症或疾病的个体的方法。在一个实施方案中，该方法包括给予能够调节(例如，上调或下调)LRP-1或LRP-2表达或活性的试剂(例如，通过本文所述的筛选分析鉴定的试剂)或组合试剂。在另一个实施方案中，该方法包括给予LRP-1或LRP-2蛋白或核酸分子做为降低LRP-1或LRP-2异常或非需要表达或活性的补充治疗。
在LRP-1或LRP-2异常下调或增加LRP-1或LRP-2活性可能有有益作用的情况下，需要LRP-1或LRP-2活性的刺激作用。例如，在LRP-1或LRP-2下调或增加LRP-1或LRP-2活性可能有有益作用的情况下，需要LRP-1或LRP-2活性的刺激作用。同样地，在LRP-1或LRP-2异常上调或降低LRP-1或LRP-2活性可能有有益作用的情况下，需要LRP-1或LRP-2活性的抑制作用。
药物基因组学通过本文所述的筛选分析鉴定的、对LRP-1或LRP-2活性(例如，LRP-1或LRP-2基因表达)具有刺激或抑制作用的LRP-1或LRP-2分子，以及试剂或调节剂，可给予个体来治疗(预防性或治疗性)与异常或非需要的LRP-1或LRP-2活性相关的病症(例如，诸如骨质疏松症、派杰氏病或成骨不全的骨病症)。可考虑将药物基因组学(即，个体基因型与该个体对外来化合物或药物反应的关系的研究)与上述治疗协同使用。通过改变该药理学活性药物的剂量与血液浓度关系引起的治疗代谢差异可导致严重的毒性或治疗的失败。因此，内科医生或临床医生可考虑使用从相关药物基因组学研究中获得的知识来确定是否给予LRP-1或LRP-2分子、或者LRP-1或LRP-2调节剂，以及定制使用LRP-1或LRP-2分子、或者LRP-1或LRP-2调节剂治疗的剂量或治疗方案。
药物基因组学涉及在受作用的个体中由于药物分布的变化及异常作用引起的对药物的反应的临床显著的遗传变异。参见例如，Eichelbaum，M.et al.(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23983-985及Linder，M.W.etal.(1997)Clin.Chem.43254-266。通常，可区分两种类型的药物基因组学状态。遗传状态以改变药物对机体作用途径的单一因素遗传(改变药物作用)，或者遗传状态以改变机体对药物作用途径的单一因素遗传(改变药物代谢)。这些药物基因组学状态能以罕见的遗传缺失或以天然产生的多态性形式发生。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺失(G6PD)为常见的遗传酶不全病变，其主要的临床症状是在摄取氧化剂药物(抗疟疾药、磺胺药、止痛药、呋喃西林)和蚕豆后产生红细胞溶解。
一种用于鉴定预测药物反应的基因的药物基因组学途径，称为“基因组范围关系(genome-wide association)”，其主要依赖于由已知基因相关标志物构成的人类基因组的高分辨率的图谱(例如，“双等位”基因标志物图谱，其由人类基因组上的60,000-100,000个多态性的或变异的位点构成，其中每一位点有两个变体)。此高分辨率的遗传图谱可与统计学显著数量的患者中每个的基因组图谱比较，该患者参加了鉴定与特定观测的药物反应或副作用相关的标志物的II/III期临床试验。可选择地，高分辨率的遗传图谱可产生自人类基因组中几千万已知的单核苷酸多态性(SNPs)的组合。本文所用“SNP”是发生在DNA片段中的单个核苷酸碱基的通常变异。例如，在DNA的每1000个碱基中可发生一次SNP。尽管其绝大多数似乎与疾病无关，但SNP可参与疾病的过程。如果给定一个以这种SNPs发生率为基础的遗传学图谱，则可根据个体基因组的SNPs特定形式对他们进行遗传学分类。在这种情况下，考虑到这些遗传相似个体中的普遍特性，可对遗传相似个体类别定制治疗方案。
可选择地，称为“候选基因途径”的方法可用于鉴定能够预测药物反应的基因。根据此方法，如果编码药物靶标的基因是已知的(例如，本发明的LRP-1或LRP-2蛋白)，在人群中所有该基因的通常变体可被相当容易地鉴定，并且可检测该基因的一种翻译对比另一种翻译是否与特定的药物反应有关。
可选择地，称为“基因表达谱”的方法可用于鉴定能够预测药物反应的基因。例如，给予药物的动物的基因表达(例如，本发明的LRP-1或LRP-2分子或LRP-1或LRP-2调节剂)可给出与毒性相关的基因途径是否开启的指示。
从多于一种上述药物基因组学方法产生的的信息可用于确定对个体进行预防性和治疗性治疗的适合剂量及治疗方案。当使用LRP-1或LRP-2分子、或者LRP-1或LRP-2调节剂(例如使用本文所述的示范性筛选分析中的一种所鉴定的调节剂)对个体进行治疗时，应用此知识来进行剂量或药物选择，可避免不良反应或治疗的失败，从而增强治疗性或预防性效果。
本发明进一步提供鉴定新试剂或组合的方法，其以对一种或多种本发明的一种或多种LRP-1或LRP-2基因编码的基因产物的活性调节试剂的鉴定为基础，其中这些产物可与细胞对治疗试剂的抗性关联。特别是，由本发明的LRP-1或LRP-2基因编码的蛋白的活性可用作克服试剂抗性的鉴定试剂的基础。通过阻断一种或多种该抗性蛋白的活性，诸如人类细胞的靶细胞可对试剂的治疗变得敏感，而未调节的靶细胞对该试剂有抗性。
对试剂(例如，药物)对LRP-1或LRP-2蛋白表达或活性的影响的监测可用于临床试验。例如，由本文所述的筛选方法确定的试剂，其增加LRP-1或LRP-2基因表达、蛋白水平、或上调LRP-1或LRP-2活性的作用效果可在表现为降低的LRP-1或LRP-2基因表达、蛋白水平、或下调的LRP-1或LRP-2活性的个体的临床试验中得到监测。可选择地，由筛选方法确定的试剂的降低LRP-1或LRP-2基因表达、蛋白水平、或下调LRP-1或LRP-2活性的作用效果可在表现为增加的LRP-1或LRP-2基因表达、蛋白水平、或上调的LRP-1或LRP-2活性的个体的临床试验中得到监测。在这些临床试验中，LRP-1或LRP-2基因的表达或活性，优选其它参与例如LRP-1或LRP-2相关病症的基因可用做特定细胞的表型的“读出”或标志物每一种本发明的新化合物均可用作用于骨植入、移植、修补等等的生物活化成分。特别是在骨疾病状态的临床治疗中同时需要营养和药物干预时，它们也可作为营养制剂或药物制剂来使用。
在诊断骨疾病、监测骨生长及发育或跟踪骨疾病的治愈与复原过程中，上述方法可单独或组合使用。
本发明还基于对骨组织或软骨细胞中乳铁传递蛋白与LRP-1和LRP-2相互作用并诱导MAP激酶的磷酸化的意外发现。在诊断与治疗骨与软骨疾病状态及鉴定治疗该疾病状态的治疗性化合物中可监测骨组织或软骨细胞中乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或MAP激酶的相互作用本发明的诊断方法包括将从试验个体获得的样本(例如，骨或软骨组织样本)中的乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白、或p42/44 MAP激酶的相互作用水平与从正常个体(即未患有骨或软骨病症的个体)获得的样本进行比较。该相互作用可通过，例如测量乳铁传递蛋白与LRP-1或LRP-2的结合、由LRP-1或LRP-2介导的乳铁传递蛋白内吞作用、或p42/44 MAP激酶的磷酸化作用、或者任何本领域公知的方法来检测。乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用水平的增加或降低表明该试验个体患有或有风险发展为骨或软骨疾病状态。该方法可单独或与其它诊断骨或软骨病症的步骤结合使用。
本发明还提供用于鉴定与制备化合物(例如，蛋白、肽、肽模拟物、peptoids、抗体或小分子)的方法，其可调节(增加或降低)细胞(例如，骨组织或软骨细胞)中乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用。由此鉴定的化合物可用于，例如预防与治疗骨或软骨病症。
可使用上述多种途径中的任何一种来获得本发明的候选化合物。为鉴定调节乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用的化合物，将含有乳铁传递蛋白及LRP-1、LRP-2、或P42/44 MAP激酶的系统(细胞系统或无细胞系统)与候选化合物接触，并将其乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白、LRP-2蛋白、或p42/44 MAP激酶的相互作用水平相对于没有该候选化合物存在的情况进行评价。在细胞系统中(例如，含有骨组织或软骨细胞的系统)该细胞可以是天然表达乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的细胞，或者是经修饰以表达重组乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的细胞，例如，含有与标志基因融合的乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2或p42/44 MAP激酶基因的细胞。通过上述方法或其它本领域公知的方法可测定乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用水平，或者标志蛋白间的相互作用水平。如果有该候选化合物存在时的乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用水平，或者标志蛋白间的相互作用水平高于或低于没有该候选化合物存在时的水平，则该候选化合物可鉴定为具有预防及治疗骨或软骨疾病状态的作用。
本发明还提供通过给予个体其所需的有效剂量的组合物(例如含有LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的激动剂或拮抗剂)来治疗骨或软骨疾病状态的方法。“有效剂量”为在受治疗的个体中能够产生医学理想效果(例如，增加或降低乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用水平)的组合物用量。该术语“治疗”定义为为治愈、减轻、解除、治疗、预防、改善该疾病状态、该疾病状态的症状、该疾病状态的从属疾病状态或该疾病状态的易患病体质的目的，对个体进行组合物的给药，其中该个体具有骨或软骨疾病状态。个体可以是患有骨或软骨疾病状态的人，具有阳性的标志物但没有该疾病状态的临床表现的人，或者由于遗传(例如，家族)、习惯(例如，吸烟)或环境(例如，氡)因素而有风险患有该疾病状态的人。这种骨疾病状态的例子包括但不限于，骨质疏松、类风湿性关节炎、肝性骨营养不良、骨质软化症、佝偻病、囊性纤维性骨炎、肾性骨营养不良、骨硬化、骨质减少、骨成纤维发生不全(fibrogenesis-imperfecta ossium)、次级甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、甲状旁腺功能亢进、慢性肾病、结节病、糖皮质激素诱导的骨质疏松、特发性高钙血症、派杰氏病(Paget’s disease)及成骨不全、骨移植、不愈合骨折及骨缺失。该组合物也可用于刺激软骨细胞，同时具有软骨修复潜能从而治疗人、赛马及其它动物的骨性关节炎及其它关节炎并有助于自体骨和软骨移植。因此，该组合物提供有助于骨与软骨损伤的协同愈合作用。
可通过例如用上述方法测定该个体样本中乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用水平来鉴定待治疗的个体。如果该个体样本中的此种相互作用的水平高于或低于正常个体样本的水平，该个体为接受有效剂量的化合物治疗的候选者，该化合物可降低和增加该个体中乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用水平。该治疗方法可体内或体外再回输、单独或与其它药物或治疗结合进行。
在一种体内的途径中，对该个体给予治疗性组合物(例如，含有调节细胞中乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2、或p42/44 MAP激酶的相互作用的化合物的组合物)。通常，该化合物应悬浮在药物可接受的载体(例如，生理盐水)中并口服给药、静脉内输入或注射、或者皮下、肌内、鞘内、腹腔内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内、肺内灌输。为预防和治疗骨或软骨疾病状态，该化合物可直接对骨或软骨病灶、骨组织或软骨细胞给药。
根据所选择的给药途径；制剂的特性；个体疾病的特性；个体的身高、体重、体表面积、年龄、性别；其它药物的给予；及主治医生的判断，可确定所需剂量。适合的剂量范围是0.01-100.0mg/kg。可以理解由于提供的化合物不同及各种给药途径的疗效不同，所需剂量可在很宽的范围变化。例如，可以理解口服给药的所需剂量高于静脉内注射的给药剂量。通过本领域公知的用于优化的标准的经验方法可调节这些剂量水平的变化。用适合的传输载体(例如，聚合微粒或灌输性设备)来包被该化合物可增加传输的效率，特别是在口服给药中。
可选择地，含有编码乳铁传递蛋白多肽的核酸序列的多核苷酸可对个体给药，例如通过使用本领域公知的聚合的、生物可降解的微粒或微囊传输装置。
实现该核酸摄取的另一个途径是使用通过标准方法制备的脂质体。该载体(vector)可单独合并到这些传输载体中或与组织特异抗体共合并进入。可选择地，可制备含有通过静电或共价力结合于多聚L赖氨酸的质粒或其它载体的分子结合物。多聚L赖氨酸可结合于能与靶细胞上受体结合的配基(Cristiano et al.(1995)J.Mol.Med.73，479)。可选择地，通过使用本领域公知的组织特异转录调节元件(TRE)可实现组织特异靶向。对肌肉内、皮内或皮下位点的“裸DNA”的传输(即，不使用传输载体)是实现体内表达的另一种手段。
在相关的多聚核苷酸(例如，表达载体)中，该编码乳铁传递蛋白多肽的核酸序列可操作地连接到启动子或增强子-启动子组合上。增强子以时间、位置及水平的方式提供表达的特异性。与启动子不同，增强子在启动子存在时可位于转录起始位点不同的距离而发挥功能。增强子也可位于转录起始位点的下游。
适合的表达载体包括质粒及诸如疱疹病毒、反转录病毒、牛痘病毒、减毒牛痘病毒、金丝雀疹病毒、腺病毒及腺病毒相关病毒的病毒载体及其它的病毒载体。
多聚核苷酸可在药物可接受的载体中给药。如医药领域公知的，该剂量可不同。多聚核苷酸的优选给药剂量为大约106～1012的该多聚核苷酸分子拷贝。如果需要，该剂量可重复给药。给药途径可以是上述所列的任何形式。
治疗患有骨或软骨疾病状态的体外再回输策略包括使用编码乳铁传递蛋白的多聚核苷酸转染或转化从该个体获得的细胞。可选择地，通过同源重组的方式在体外利用设计插入启动子的载体来转染细胞，该启动子为细胞基因组中天然产生的内源性乳铁传递蛋白基因转录起始位点上游的新的活化启动子。此“开启”大部分沉默基因的方法是本领域公知的。
对表达所希望水平的乳铁传递蛋白的细胞进行选择和扩增后，该转染或转化后的细胞随后返回该个体。该细胞可以是较宽细胞类型范围中的任何细胞，其包括但不限于，骨髓基质细胞、成骨细胞、软骨细胞或其前体细胞。只要该细胞在该个体中活存，其就可做为乳铁传递蛋白的来源发挥作用。
该体外再回输的方法包括如下的步骤，从个体收获细胞、培养该细胞、使用表达载体转化该细胞、及在适合乳铁传递蛋白基因表达的条件下维持该细胞。这些方法是分子生物学领域公知的技术。可通过用于体外再回输基因治疗的任何标准方法来实现该转化的步骤，其包括磷酸钙、脂质体转染(lipofection)、电转化、病毒感染及基因枪射击法(biolistic)基因转移。可选择地，可使用脂质体或聚合体微粒。随后选择已成功转化的细胞，例如为了乳铁传递蛋白基因的表达。该细胞可随后注入或灌输进入该个体。
以下特定的实施例应理解为仅为示范的目的，而不是对其余公开部分的任何方式的限制，在没有进一步详细说明的情况下，相信本领域所述技术人员可根据本文所述，最大限度地使用本发明。本文所引用的全部出版物在此全部引用做为参考。
原代大鼠成骨细胞样细胞的培养如以往报道(Cornish et al.(1999)Amer.J.Physiol-Endocrinol.Metab.277E779-E783)，从20天的胎鼠颅骨中分离成骨细胞。简而言之，切下颅骨，并收集不含接缝与骨膜的额骨与顶骨。洗涤后，在37℃用3mL的1mg/mL胶原酶处理该颅骨7分钟，共两次。在丢弃这两次消化的上清之后，进一步用3mL的2mg/mL胶原酶(30分钟，37℃)处理该颅骨两次。收集后两次消化的上清、离心并洗涤该细胞。当细胞生长为融合单层时将其传代培养于24孔板。在收获之前，在MEM培养液(minimum essentialmedium)/0.1％牛血清白蛋白培养24小时终止生长。
SaOS-2细胞株培养在含有2.2g/L NaHCO3、10％FBS及10ml/L青霉素-链霉素(GIBCO15140-122)的DMEM(GIBCO 12100-046)培养液中培养人类成骨细胞样骨肉瘤细胞株SaOS-2。细胞接种在75cm2培养瓶中，生长为融合单层时用于总RNA分离或增殖分析。
LRP-1与LRP-2基因表达的检测通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来鉴定LRP-1与LRP-2基因表达。利用修正的硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步RNA提取方法(Chomczynski andSacchi(1987)Analyt.Biochem.162156-159；and Grey et al.(2001)Endocrinology 1421098-1106)从培养的大鼠原代成骨细胞与SaOS-2细胞中分离细胞总RNA。利用Gene QuantTM分光光度仪(Pharmacia，Little Chalfont，UK)通过测量其光密度来测定RNA的浓度与纯度，并用1％琼脂糖凝胶电泳来测定其质量。用DNase处理RNA，并根据以往出版的方法(Grey et al.(2001)Endocrinology 1421098-1106)实施RT-PCR扩增。在自动DNA热循环仪中进行PCR反应(Mastercycler Personal，Eppendorf，Hamburg，Germany)。在94℃，经2分钟的初始变性步骤后，将94℃变性30秒、56℃退火30秒及72℃延伸1分钟的操作进行35个循环，每组循环结束时在72℃最后延伸15分钟。用1％TBE琼脂糖凝胶电泳来观察PCR反应产物。用于扩增LRP-1与LRP-2的引物为LRP-1引物，5’GAG TGT TCC GTG TATGGC AC与5’GAT GCC TTG GAT GAT GGTC；LRP-2引物，5’GTC ACCAGT TCA CTT GCT CC与5’CCA CTC CCA TAA CCA TTCC。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物，并用ABI 377 XL DNA序列仪(PE Biosystems，Foster City，CA)进行测序。在没有反转录存在下进行对照RT-PCR扩增。
出乎意料的是，发现LRP-1可在原代小鼠成骨细胞与SaOS-2细胞中表达。LRP-2只发现在原代大鼠成骨细胞表达而不在SaOS-2细胞中表达。乳铁传递蛋白被鉴定为存在于分离的牛奶中的成骨细胞生长因子。其能有效地刺激培养的大鼠细胞、小鼠细胞及人类来源的细胞的增殖并呈现剂量依赖特征。乳铁传递蛋白还可促进软骨细胞的有丝分裂并诱导成骨细胞分化。且发现其在长期成骨细胞培养中可显著增加矿化骨小结节的数量。乳铁传递蛋白还可抑制由血清撤出而诱导的原代大鼠成骨细胞的细胞凋亡。乳铁传递蛋白在小鼠骨髓培养分析中，可强烈抑制破骨细胞的生成，但不影响成熟的成骨细胞的骨吸收活性。离体时乳铁传递蛋白具有诱导成骨细胞合成代谢并抑制破骨细胞发育的能力表明其可对在体骨具有合成代谢作用。当给予成年小鼠单侧颅骨局部注射乳铁传递蛋白时，的确可剂量依赖地及本质上增加骨形成与骨面积指数。
乳铁传递蛋白与LRP-1、LRP-2及p42/44 MAP激酶间的相互作用已发现乳铁传递蛋白结合低密度脂蛋白受体家族中的两种细胞内成员、LRP-1及LRP-2/megalin。LRP-1与LRP-2可同时在啮齿动物细胞中表达而SaOS-2细胞只表达LRP-1。通过共聚焦显微镜观测发现乳铁传递蛋白被原代大鼠成骨细胞内吞，而且LRP-1/2特异抑制剂、受体相关蛋白(RAP)可阻断该过程。此外，乳铁传递蛋白可激活成骨细胞内的p42/44MAP激酶信号途径。还发现MAP激酶特异抑制剂可抑制乳铁传递蛋白诱导的成骨细胞增殖作用。RAP还可阻断乳铁传递蛋白诱导的成骨细胞增殖作用及MAP激酶的磷酸化，表明成骨细胞中LRP-1/2为乳铁传递蛋白的促有丝分裂作用的介导剂。此外，乳铁传递蛋白能够诱导SaOS-2细胞内的增殖作用。在LRP-1缺失的成纤维细胞中乳铁传递蛋白诱导的增殖作用远没有在LRP-1+/+细胞中观测到的显著。综上，这些资料表明乳铁传递蛋白对骨具有合成代谢作用，并且其对成骨细胞的生长因子样作用很大程度上通过LRP-1介导。此工作进一步提供了LRP受体家族在调节骨生长中起重要作用的证据。
乳铁传递蛋白的三维结构显示其可进一步分为N环(N-lobe)与C环(C-lobe)，其中每个结合一个铁原子。该N环显示出具有可比拟全长蛋白的促有丝分裂作用作用，表明更短的多肽具有治疗的潜能。由于乳铁传递蛋白缓慢降解，每一个环中的潜在活性有可能出现。乳铁蛋白肽(Lactoferricin)，一种显示具有有效灭菌功能的乳铁传递蛋白的N末端短肽，只具有中度的骨生成作用。转铁蛋白(Transferrin)同样不是成骨细胞的潜在促有丝分裂剂。当从乳铁传递蛋白剥离铁并再负载铬或锰离子时，其骨生成活性与铁负载分子类似，表明铁本身对乳铁传递蛋白在成骨细胞中的促有丝分裂活性并不是关键性的。
其它实施方案所有本说明书公开的特征可以任何组合方式组合。本说明书中的每一个特征可由具有相同、等同或相似目的的可选择特征来代替。因此，除非特别说明，公开的每一特征只是一系列总的等同或相似特征的一个示例。
如上所述，本领域所属技术人员可显而易见地确定本发明的基本特征，且在不偏离其精神和范围的情况下，可对本发明做出各种改变和修改来使其适合不同用途与条件。因此其它的实施方案同样包括在本发明的权利要求范围内。
权利要求
1.一种检测患者是否患有或有风险发展为骨疾病状态的方法，所述方法包括提供来自怀疑患有或有风险发展为骨疾病状态的个体的检测样本，及定量分析LRP-1基因的表达水平，其中所述检测样本中所述LRP-1基因的表达水平，如果与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨疾病状态。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的检测样本从骨组织中制备。
3.一种检测患者是否患有或有风险发展为骨疾病状态的方法，所述方法包括提供怀疑患有或有风险发展为骨疾病状态的个体的检测样本，及定量分析LRP-1蛋白的活性，其中所述检测样本中所述LRP-1蛋白的活性，如果与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨疾病状态。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的检测样本从骨组织中制备。
5.一种鉴定治疗骨疾病状态的候选化合物的方法，所述的方法包括将化合物与表达LRP-1基因的细胞接触，及定量分析所述细胞中所述LRP-1基因的表达水平，其中所述化合物存在下的所述LRP-1基因的表达水平，如果与没有所述化合物存在时不同，则显示所述化合物是治疗骨疾病状态的候选化合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述的细胞为成骨细胞、成骨样细胞或骨细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述的细胞为SaOS-2细胞。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述的细胞为破骨细胞。
9.一种鉴定治疗骨疾病状态的候选化合物的方法，所述的方法包括将化合物与表达编码LRP-1蛋白的LRP-1基因的细胞接触，及定量分析所述细胞中所述LRP-1蛋白的活性，其中所述化合物存在下的所述LRP-1蛋白的活性，如果与没有所述化合物存在时不同，则显示所述化合物是治疗骨疾病状态的候选化合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述的细胞为成骨细胞、成骨样细胞或骨细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述的细胞为SaOS-2细胞。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述的细胞为破骨细胞。
13.一种治疗骨疾病状态的方法，所述的方法包括调节骨组织细胞中的LRP-1蛋白水平。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的LRP-1蛋白的表达水平是通过提供并表达编码LRP-1蛋白的核酸来调节的。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述的核酸在所述的骨组织细胞中表达。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述的LRP-1蛋白水平是通过提供LRP-1蛋白来调节的。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述的LRP-1蛋白被介入所述的骨组织细胞中。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述的LRP-1蛋白水平是通过提供并表达与编码LRP-1蛋白的序列互补的核酸来调节的。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述的核酸在所述的骨组织细胞中表达。
20.一种治疗骨疾病状态的方法，所述的方法包括调节骨组织细胞中的LRP-1蛋白的活性。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的LRP-1蛋白活性是通过提供所述LRP-1蛋白的激动剂来调节的。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述的激动剂被介入所述的骨组织细胞中。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述的LRP-1蛋白活性是通过提供所述LRP-1蛋白的拮抗剂来调节的。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述的拮抗剂被介入所述的骨组织细胞中。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述的LRP-1蛋白活性是通过提供抗所述LRP-1蛋白的抗体来调节的。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述的抗体被介入所述的骨组织细胞中。
27.一种检测患者是否患有或有风险发展为骨疾病状态的方法，所述方法包括提供来自怀疑患有或有风险发展为骨疾病状态的个体的骨组织的检测样本，及定量分析LRP-2基因的表达水平，其中所述检测样本中所述LRP-2基因的表达水平，如果与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨疾病状态。
28.一种检测患者是否患有或有风险发展为骨疾病状态的方法，所述方法包括提供来自怀疑患有或有风险发展为骨疾病状态的个体的骨组织的检测样本，及定量分析LRP-2蛋白的活性，其中所述检测样本中所述LRP-2蛋白的活性，如果与正常样本中的不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨疾病状态。
29.一种鉴定用于治疗骨疾病状态的候选化合物的方法，所述的方法包括将化合物与表达LRP-2基因的骨组织细胞接触，及定量分析所述细胞中所述LRP-2基因的表达水平，其中所述化合物存在下的所述LRP-2基因的表达水平，如果与没有所述化合物存在时不同，则显示所述化合物是治疗骨疾病状态的候选化合物。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述的细胞为成骨细胞、成骨样细胞或骨细胞。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述的细胞为SaOS-2细胞。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述的细胞为破骨细胞。
33.一种鉴定用于治疗骨疾病状态的候选化合物的方法，所述的方法包括将化合物与表达编码LRP-2蛋白的LRP-2基因的骨组织细胞接触，及定量分析所述细胞中所述LRP-2蛋白的活性，其中所述化合物存在下的所述LRP-2蛋白的活性，如果与没有所述化合物存在时不同，则显示所述化合物是治疗骨疾病状态的候选化合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述的细胞为成骨细胞、成骨样细胞或骨细胞。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述的细胞为SaOS-2细胞。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述的细胞为破骨细胞。
37.一种治疗骨疾病状态的方法，所述的方法包括调节骨组织细胞中的LRP-2蛋白水平。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述的LRP-2蛋白水平是通过在所述骨组织细胞中介入并表达编码LRP-2蛋白的核酸来调节的。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述的LRP-2蛋白水平是通过在所述的骨组织细胞中介入LRP-2蛋白来调节的。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述的LRP-2蛋白水平是通过在所述的骨组织细胞中介入并表达与编码LRP-2蛋白的序列互补的核酸来调节的。
41.一种治疗骨疾病状态的方法，所述的方法包括调节骨组织细胞中的LRP-2蛋白的活性。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述的LRP-2蛋白活性是通过在所述的骨组织细胞中介入所述LRP-2蛋白的激动剂来调节的。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述的LRP-2蛋白活性是通过在所述的骨组织细胞中介入所述LRP-2蛋白的拮抗剂来调节的。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述的LRP-2蛋白活性是通过在所述的骨组织细胞中介入抗所述LRP-2蛋白的抗体来调节的。
45.一种检测个体是否患有或有风险发展为骨或软骨疾病状态的方法，所述的方法包括提供来自个体的检测样本，及检测所述样本中乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白或LRP-2蛋白的相互作用水平，其中如果在所述样本中所述的乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白或LRP-2蛋白的相互作用水平与正常样本中的相互作用水平不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨或软骨疾病状态。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述的试验样本从骨或软骨组织中制备。
47.一种鉴定用于治疗骨或软骨疾病状态的候选化合物的方法，所述方法包括将化合物介入到含有乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白或LRP-2蛋白的系统中，及检测所述的乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白或LRP-2蛋白的相互作用水平，其中如果在所述化合物存在下的所述乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白或LRP-2蛋白的相互作用水平与没有所述化合物存在时的相互作用水平不同，则显示所述化合物是治疗骨或软骨疾病状态的候选化合物。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述的样本包括成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞或软骨细胞。
49.一种治疗骨或软骨疾病状态的方法，所述方法包括调节骨组织或软骨细胞中乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白或LRP-2蛋白间的相互作用。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述的乳铁传递蛋白多肽与所述的LRP-1蛋白或LRP-2蛋白间的相互作用是通过提供所述LRP-1或LRP-2蛋白的激动剂来调节的。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述的激动剂被介入所述的骨组织或软骨细胞中。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述的激动剂为外源性乳铁传递蛋白多肽。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述的外源性乳铁传递蛋白多肽被介入所述的骨组织或软骨细胞中。
54.如权利要求49所述的方法，其中所述的乳铁传递蛋白多肽与LRP-1蛋白或LRP-2蛋白间的相互作用是通过提供所述LRP-1或LRP-2蛋白的拮抗剂来调节的。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述的拮抗剂被介入所述的骨组织或软骨细胞中。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述的拮抗剂为受体相关蛋白。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述的受体相关蛋白被介入所述的骨组织或软骨细胞中。
58.一种检测个体是否患有或有风险发展为骨或软骨疾病状态的方法，所述的方法包括提供来自个体的检测样本，及检测所述试验样本中乳铁传递蛋白多肽与p42/44 MAP激酶的相互作用水平，其中如果在所述试验样本中所述的乳铁传递蛋白多肽与所述p42/44MAP激酶间的相互作用水平与正常样本中的相互作用水平不同，则显示所述个体患有或有风险发展为骨或软骨疾病状态。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述的试验样本从骨或软骨组织中制备。
60.一种鉴定用于治疗骨或软骨疾病状态的候选化合物的方法，所述方法包括将化合物介入含有乳铁传递蛋白多肽与p42/44 MAP激酶的系统中，及检测所述的乳铁传递蛋白与所述p42/44 MAP激酶间的相互作用水平，其中如果在所述化合物存在下的所述乳铁传递蛋白多肽与所述p42/44 MAP激酶间的相互作用水平与没有所述化合物存在时的相互作用水平不同，则显示所述化合物是治疗骨或软骨疾病状态的候选化合物。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述的样本包括成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞或软骨细胞。
62.一种治疗骨或软骨疾病状态的方法，所述方法包括调节骨组织或软骨细胞中乳铁传递蛋白多肽与p42/44 MAP激酶间的相互作用。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述的乳铁传递蛋白与所述的p42/44 MAP激酶间的相互作用是通过提供所述p42/44 MAP激酶的激动剂来调节的。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述的激动剂被介入所述的骨组织或软骨细胞中。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述的激动剂为外源性乳铁传递蛋白多肽。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述的外源性乳铁传递蛋白多肽被介入所述的骨组织或软骨细胞中。
67.如权利要求62所述的方法，其中所述的乳铁传递蛋白与所述的p42/44 MAP激酶间的相互作用是通过提供所述p42/44 MAP激酶的拮抗剂来调节的。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述的拮抗剂被介入所述的骨组织或软骨细胞中。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述的拮抗剂p42/44 MAP激酶抑制剂。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述的p42/44 MAP激酶抑制剂被介入所述的骨组织或软骨细胞中。
全文摘要
本发明公开了在诊断与治疗诸如骨或软骨病症中的LDL受体相关蛋白1与蛋白2(LRP－1与LRP－2)及乳铁传递蛋白与LRP－1、LRP－2或p42/44MAP激酶间的相互作用。同时也公开了筛选相关治疗化合物的方法。
文档编号A61K48/00GK1662664SQ03815034
公开日2005年8月31日 申请日期2003年5月13日 优先权日2002年5月13日
发明者伊林·科尼什, 伊恩·雷金纳德·里德, 凯·帕特丽夏·帕尔马托, 安德鲁·贝维斯·格雷, 多里特·纳奥特 申请人:伊林·科尼什, 伊恩·雷金纳德·里德, 凯·帕特丽夏·帕尔马托, 安德鲁·贝维斯·格雷, 多里特·纳奥特