使用具有preptin功能的化合物的方法

专利名称：使用具有preptin功能的化合物的方法
技术领域：
本发明涉及可用作间充质细胞来源细胞的增殖、增加和分化试剂的化合物，和及涉及含有这种化合物作为活性成分的组合物。更特别地，本发明涉及生物活性化合物，包括preptin，preptin类似物和preptin激动剂，以及它们的盐和衍生物，这些化合物的新用途，含有这些化合物的药物组合物，以及使用这些化合物的方法。化合物的新用途涉及它们的刺激细胞增殖和分化的能力，这些细胞包括成纤维细胞和胰腺β-细胞以及它们的细胞前体，并且包括这些化合物在各种疾病、紊乱和症状中的用途，包括用于治疗患有糖尿病的人和用于内部和外部创伤愈合的应用。
背景技术：
胰岛β-细胞在生理学中起重要作用，包括分泌胰岛素，胰岛素是一种肽激素，对中间代谢产生重要作用。糖尿病的特征在于高血糖症和β-细胞功能被改变。1型糖尿病的特征在于由于胰岛β-细胞的自体免疫被破坏，胰腺就早期缺乏内分泌功能，导致低胰岛素症和高血糖症。2型糖尿病是一种由遗传因子与环境影响之间相互作用产生的多基因的、异质性疾病。参见，例如，Kecha-Kamoun等(2001)Diabetes MetabRes Rev，17146-152。虽然2型糖尿病最初表现为高胰岛素症，但是由于缺乏β-细胞功能以及最终β-细胞衰竭，导致胰岛素水平最终下降。从正常的葡萄糖耐受进展到葡萄糖耐受降低，到2型糖尿病，和到晚期2型糖尿病，都与β-细胞功能改变、β-细胞减少和最后胰岛素分泌下降相关。参见，例如Dickson等(2001)J.Biol.Chem.，27621110-21120。
胰岛β-细胞是糖尿病研究的核心。β-细胞是分泌胰岛素来满足其他组织的代谢需求的葡萄糖反应细胞。外周胰岛素抵抗以及产生的高血糖症表征了2型糖尿病。β-细胞通常以提高胰岛素分泌能力和β-细胞质量来弥补胰岛素抵抗。但是由于β-细胞不能维持足以克服逐渐升高的对胰岛素的抵抗的胰岛素生成水平，高血糖症进一步恶化(Kaytor等(2001)J Biol Chem.1616)。最后，β-细胞的衰退主要是功能衰竭，但是最后发展为β-细胞减少，如在1型糖尿病中所见的那样。
最显著的功能性β-细胞缺陷之一是缺乏急性葡萄糖诱导的胰岛素分泌(GIIS)。β-细胞最初适应逐渐升高的对胰岛素需求，但是当2型糖尿病恶化时，发生代谢失调。一种假设是β-细胞能够去分化，导致特化功能丧失，例如GIIS。β-细胞的去分化作用已经在部分胰腺切除的大鼠模型中被报道，该模型包括胰岛素基因表达降低(Weir等(2001)Diabetes，50副刊1，S154-S159)。
完整的信号事件网络按照控制β-细胞质量以适应对胰岛素的需求来起作用。一些证据表明β-细胞生长增强部分地是在于循环生长因子。参见，例如，Flier等(2001)Proc.Natt.Acad.Sci.USA，987475-7480，其中报道将正常胰岛植入胰岛素抵抗小鼠的胰腺或肾囊中会引起β-细胞质量的显著增加。
鉴定相关生长因子以及刺激内源生长路径的用途将会被用于增加，例如β-细胞质量。已经报道在多个糖尿病的动物模型中进行增加β-细胞质量的尝试。参见，例如，Efrat，S.(2001)Diabetes，50副刊1S189-S190；和Tourrel等(2002)Diabetes，511443-1452。
一般认为，在胎儿期中，胰岛素样生长因子2(IGF-II)在细胞生长和胰腺分化中起重要作用。IGF-II局限在哺乳动物胎儿和成体胰腺中，在胰岛导管上皮、β-细胞前体中被表达(Ilieva等(1999)Pancreas，19297-303)。在成人胰腺中，仅在β-细胞和导管细胞中发现IGF-II的免疫反应性(Portela-Gomes等(2000)Journal of Endocrinology，165245-251)。Preptin是一种34个氨基酸的肽，被报道是与胰岛素原样生长因子II(pro-IGF-II)的Asp69-Leu102相对应，存在于胰岛的β-细胞内，与胰岛素一起发生由葡萄糖介导的共分泌。参见Cooper和Buchanan，“具有Preptin功能性的肽”，WO 00/78805(PCT/NZ00/00102)。已经报道Preptin能增强、但不是起始胰岛素分泌。参见Buchanan等(2001)Biochem.J.360431-439。
发明概述本发明部分地基于发现preptin和其他肽具有能够例如刺激成纤维细胞和胰岛β-细胞增殖的能力。还基于这种化合物能够促进其他细胞分化为成纤维细胞和胰岛β-细胞，例如成纤维细胞和胰岛β-细胞的祖细胞，确定这些化合物是有用的。
一个方面，本发明特征在于用于在个体中治疗细胞量减少、细胞数量减少和/或细胞功能下降的症状的方法。该方法包括给个体施用有效量的preptin、preptin类似物、或preptin激动剂、其盐以及其衍生物的一种或多种。如在此所用，β-细胞包括胰岛β-细胞。
个体可能患有例如与部分β-细胞损失相关的疾病，例如β-细胞缺失少于约80％β-细胞损失。这种疾病的一个例子包括，但是不限于，2型糖尿病。该个体还患有例如与更实质的或完全的β-细胞损失相关的疾病，其特征在于例如小于约80％β-细胞损失。这种疾病的一个例子包括，但是不限于，1型糖尿病和晚期的2型糖尿病。
如在此所用，“preptin”是被分离的、纯的或被纯化的，或者实质上纯的，长34个氨基酸的肽，其序列包括下面的公式(I)显示的序列及其类似物1 510 15 20Asp Val Scr Thr R1R2R3Val Leu Pro Asp R4Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys25 30Phe Phe R5R6Asp Thr Trp R7Gln Ser R8R9Arg Len Formula(I)公式(I)其中R1为Ser或Pro，或它们的保守取代变体；R2为Gin，或Pro或者它们的保守取代变体；R3为Ala或Thr，它们的保守取代变体；R4为Asp或Asn，或它们的保守取代变体；R5为Gln或Lys，或它们的保守取代变体；R6为Tyr或Phe，或它们的保守取代变体；R7为Arg或Lys，或它们的保守取代变体；R8为Ala或Thr，或它们的保守取代变体；和R9为Gly或Gln，或它们的保守取代变体。
Preptin包括人的preptin，大鼠preptin，以及小鼠preptin，以及它们每一种的等位和种属变体。人、大鼠和小鼠的preptin的示例性序列被显示在下面人preptin(SEQ ID NO1)15 10 15 20Asp Val Scr Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys25 30Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Glu Arg Leu大鼠preptin(SEQ ID NO2)1 5 10 15 20Asp Val Ser Thr Scr Gln Val Len Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys25 30Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Len小鼠preptin(SEQ ID NO3)15 10 15 20Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Len Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys25 30Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg LenPreptin的类似物包括preptin的功能性等价物，例如公式(I)的化合物的功能性等价物。至于preptin本身，功能性等价物包括与之发生免疫交叉反应并且具有一种或多种preptin功能的蛋白质，例如具有实质上与preptin相同的功能的那些蛋白(例如SEQ ID NO1-3的任何一种)。各种preptin类似物包括，例如包含preptin的C末端截断，包括preptin 1-33、preptin 1-32、preptin 1-31、preptin 1-30、preptin 1-29、preptin 1-28以及preptin 1-27。其他preptin类似物包括，例如，各种preptin的N末端截断，包括preptin2-34、preptin3-34、preptin4-34、preptin5-34、preptin6-34、preptin7-34以及preptin8-34。其他类似物包括各种具有N末端截断和C末端截断的片段，例如preptin 2-33和preptin 3-32。其他preptin类似物包括包含preptin活性位点的肽。还有属于本发明的保护范围内的其他化合物包括具有一个或多个氨基酸取代的preptin和preptin类似物，优选一个或多个保守性氨基酸取代。其他preptin类似物包括preptin或其类似物的添加和删除的突变体，以及包含、基本上由或由preptin或其片段或突变体与其他氨基酸或肽组成的肽。
“preptin激动剂”是一种化合物，其(1)对preptin结合受体具有高的或其他期望的亲合性，例如约10-7-10-9M的Ka，或者约10-8-约10-9M的Ka，或者更高(其可以例如通过受体结合分析来测定，该分析具有例如在Motulsky和Mahan(1984).Mol.Pharmacol.25∶1中所描述的方案)；和/或(2)如同preptin一样刺激特定细胞增殖，例如成纤维细胞，例如NIH-3T3细胞，或者β-细胞，例如INS-1Eβ-细胞。
本发明的保护范围内的激动剂包括包含、基本上由或者由(A)preptin或其功能性片段，优选在preptin的N末端直接或间接地连接，(B)对应于IGF-II的全部或部分氨基酸序列(即pro-IGF-II1-68)而组成的化合物。这些肽，即肽(A)和(B)可以间接地通过一个和多个其他氨基酸连接，例如精氨酸残基。
还有其他激动剂包括包含、基本上由或者由(A)preptin或其功能性片段，优选在preptin的C末端直接或间接地连接，(C)对应于pro-IGF-II103-156的全部或部分氨基酸序列而组成的化合物。这些肽，即肽(A)和(C)可以间接地通过一个和多个其他氨基酸连接，例如精氨酸残基。
还有其他的激动剂包括包含、基本上由或者由肽(A)和(B)和(C)以任何组合直接地或间接地组成的化合物。因此，这种肽包括，例如肽(B)被直接或间接地连接到肽(A)上，依次被直接或间接地连接到肽(C)上；肽(A)被直接或间接地连接到肽(B)上，依次被直接或间接地连接到肽(C)上；肽(B)被直接或间接地连接到肽(C)上，依次被直接或间接地连接到肽(A)上；等等。
还有其他的激动剂包括包含preptin的全部，即34个氨基酸的序列的pro-IGF-II的片段。
另外地，例如preptin激动剂可以是包含、基本上由或者由少于约87个氨基酸或者超过20个氨基酸组成，以及在连续序列中含有SEQ IDNO1、2或3部的任何部分或全部，优选全部的肽。在另一个例子中，preptin激动剂可以是包含、基本上由或者由少于约87个氨基酸或者超过35个氨基酸组成的，以及在连续序列中含有的SEQ ID NO1、2或3的任何部分或全部，优选全部的肽。
在一个实施方案中，本文描述的方法包括给个体施用有效量的preptin，该preptin包含、基本上由或者由公式(I)或者SEQ ID NO1、2或3的任何之一的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本文描述的方法包括给个体施用有效量的preptin，该preptin是公式(I)的肽的任何之一或者SEQ ID NO1、2或3的等位的或种属的变体。
在另一个实施方案中，本文描述的方法包括给个体施用有效量的preptin类似物，包括，例如，包含、基本上由或者由公式(I)或者SEQ ID NO1、2或3的任何之一的氨基酸序列组成的preptin的类似物。
在另一个实施方案中，该方法包括给个体施用有效量的preptin激动剂。该实施方案包括给个体施用有效量的含有与公式(I)或者SEQID NO1、2或3至少约60％相同的氨基酸序列的preptin激动剂(例如至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％到至少约98％，或者至少约99％)。
在还有另一个实施方案中，该方法包括给个体施用有效量的含有具有多达14个保守氨基酸取代的SEQ ID NO1、2或3的preptin激动剂。
在另一个方面，本发明特征在于用于增加或维持β-细胞质量的方法。该方法包括给需要此的个体施用有效量的在此描述的preptin，preptin类似物preptin激动剂。如在此所用，该个体可能具有实质上正常的β-细胞质量、被增加的β-细胞质量、降低的β-细胞质量或者该个体可能具有β-细胞减少或功能障碍的危险。在还有一个方面，本发明特征在于用于刺激β-细胞生长或者增加β-细胞数量的方法。不期望受到任何特定理论或作用机制的约束，这种刺激或增加可以是例如通过细胞分化或者再生。该方法包括给需要此的个体施用有效量的一种或多种preptin，preptin类似物或preptin激动剂，或者它们的任何一种的一种或多种盐或衍生物。
在另一个方面，本发明涉及在个体中治疗完全或部分地受β-细胞调节的任何疾病、紊乱或症状，完全或部分地涉及β-细胞的任何疾病、紊乱或症状，和特征在于完全或部分地由于β-细胞功能障碍的任何疾病、紊乱或症状，和从增强β-细胞功能获益的任何疾病、紊乱或症状的方法，包括给个体施用有效量的preptin，preptin类似物，或preptin激动剂，或者它们的任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种。Preptin包括公式(I)或者SEQ ID NO1、2或3的任何之一的氨基酸序列。Preptin激动剂包括，例如，SEQID NO1、2或3的任何之一的氨基酸序列的片段或全部。
另一个方面是在个体中提高胰岛素分泌的方法，包括给个体施用有效量的preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种。该个体例如是胰岛素生成或功能下降的个体(例如胰岛素抵抗或β-细胞质量减少，或β-细胞功能降低，或例如被诊断为糖尿病)。在一个方面，该方法包括提高由个体β-细胞分泌胰岛素或者提高个体的β-细胞中的胰岛素分泌，或者增加其β-细胞质量或者增加细胞数量。
在另一个方面，在此描述的方法包括确定个体需要调节(例如增加，维持等)β-细胞质量、β-细胞数量、β-细胞生长或β-细胞功能。通过对细胞量、细胞功能或细胞数量的直接或间接分析或者评价或预测，确定个体状态可以是主观的(例如个体或卫生保健医生的观点，或者基于观察值或其他总体症状或参数)或者客观的(例如可通过检测或诊断标记测定)。
在另一个方面，本发明提供用有效量的preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种来治疗β-细胞质量、数量或功能下降的方法。
在另一个方面，本发明提供用preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种来增加或维持β-细胞质量、数量或功能的方法。
本发明特征还在于一种加工产品，其包括含有preptin，preptin类似物，或preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种的容器，和使用这些内容物来治疗包括，例如，β-细胞质量、数量或功能下降(相对于正常的β-细胞质量、数量或功能，或者指示低于正常的β-细胞质量、数量或功能的其他诊断结果)的疾病的说明书，包括，给个体施用有效量的preptin，preptin类似物，或preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种。
在本发明保护范围内的还有一种加工产品，其包括包装材料；和包装材料内含有preptin，preptin类似物，或preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种。该包装材料包括一个指示被用于在个体内治疗症状的内容物的标签，这些症状例如由β-细胞减少或功能紊乱介导的症状(例如1型或2型糖尿病)。在另一个方面，该标签包括剂量信息。
在另一个方面，本发明涉及有效量的preptin，preptin类似物，或preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种，与或不与其他材料或原料(无论是，例如，其他活性成分、赋形剂、稀释剂等，和/或无论是一个剂量单位的容器)在加工有效用于本发明的方法或者用于在此描述或提供的任何目的的剂量单位的用途。
在还有一个方面，本发明还提供preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种在治疗各种损伤的任何一种中的用途，包括创伤。可以用preptin，preptin类似物，或preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的一种或多种治疗的创伤种类的例子包括，但是不限于化学烧伤或热烧伤；皮肤移植供体和移植部位；皮肤溃疡，包括但是不限于褥疮溃疡、糖尿病溃疡、血管阻塞溃疡和渐进性坏死脂性(lipoidicum)溃疡；手术创伤，创伤性开裂(wound dehiscence)，包括但是不限于腹部、大腿和胸部；角膜损伤与移植；拔牙和口腔手术；粘膜破坏，包括但是不限于胃肠道(例如溃疡性大肠炎和Crohn病)和膀胱；以及大量其他创伤性破坏和皮肤或结缔组织断裂的任何一种，例如擦伤。
被设计用于局部施用的本发明的特定优选制剂，例如，包括药膏、面霜和凝胶。用于本发明的优选局部制剂是药膏。
在另一个方面，本发明提供用于治疗在个体中或上的损伤或创伤的方法，其包括对所述损伤或创伤或者所述个体应用或施用包含有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的化合物的组合物。优选地，所述个体是人。其他个体可以是非人类，包括家养的和经济动物。所述组合物包括，但是不限于，药膏、面霜和凝胶。
可以按照本发明被治疗的创伤的例子包括，但是不限于，(1)其中皮肤或其他外表面被撕裂、刺穿、切割或其他破裂的创伤；(2)其中肌肉被穿破而下面的骨骼或重要器官未被破坏或实质上未被破坏的创伤；(3)皮肤表面损伤。在另一个实施例中，创伤包括内出血。
在另一个方面，本发明提供一种用于增强创伤愈合的方法，其包括例如，将一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的化合物体表或体内应用于这种创伤。
在另一个方面，本发明提供用于在个体内治疗症状的方法，通过应用或施用促进间充质细胞来源的细胞的增殖和/或细胞质量的化合物，其改进包括给所述个体施用有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的一种或多种盐或衍生物的化合物。间充质细胞来源的细胞包括，但是不限于，成纤维细胞。
在另一个方面，本发明提供施用包含有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂的化合物的组合物，来治疗和/或预防外周神经系统损伤、Alzheimer病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、帕金森病等、肌肉萎缩症、糖尿病神经病和心肌病变(myocardiopathies)包括心肌炎和心肌梗塞、心脏病，和急性发作(acute attack)，以及由缺血引起的急性肾功能不全的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供施用包含有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的盐或衍生物的化合物的组合物，来减少运动神经元的细胞死亡、增加肌肉终板、促进受损的坐骨神经的功能恢复、防止化学治疗中出现的外周运动麻痹，以及改善心肌功能。
在另一个方面，本发明提供通过应用或施用促进生长的化合物用于在个体内促进组织生长的方法，其包括给所述个体用于或施用有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的盐或衍生物的化合物。优选组织的例子是结缔组织和/或上皮组装和/或胰腺组织。
在另一个方面，本发明提供通过应用或施用改善免疫功能的化合物来提高个体内的免疫功能的方法，其包括给所述个体应用或施用有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的盐或衍生物的化合物。本发明的这个方面的一个例子包括改善淋巴细胞的增殖。
在另一个方面，本发明还提供多核苷酸或载体(包括克隆载体和表达载体)或者被转化或被转染的细胞，包括被分离的或被纯化的或纯的多核苷酸、载体和被分离的、被转化和被转染的细胞，编码或包含上述或者本文描述的本发明的多肽或肽的任何一种的构建体，例如，包括类似物、片段、激动剂和融合蛋白。因此，在各种实施方案中，本发明提供包含被可操作地连接到启动子的任何这种多核苷酸的重组克隆或表达构建体。
在其他实施方案中，提供用任何这种重组克隆或表达构建体转化或转染的，或者另外含有任何这种重组克隆或表达构建体的宿主细胞。宿主细胞包括进行了离体细胞治疗的个体的细胞，包括，例如，用于β-细胞紊乱或烧伤或其他创伤的离体细胞治疗。
在相关实施方案中，提供制备本发明的多肽或蛋白质或其他构建体的方法，例如包括preptin，preptin类似物和/preptin激动剂蛋白，包括步骤(a)在允许构建体例如preptin类似物或融合蛋白表达的条件下，培养在此描述或提供的宿主细胞；和(b)从宿主细胞和宿主细胞培养物中分离构建体，例如preptin，preptin类似物，和/preptin激动剂蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含例如，被分离的、被纯化的或纯的编码本发明的多肽或蛋白质构建体的任何一种的多核苷酸，例如(包括，例如，preptin类似物，激动剂，和/或融合蛋白)，与生理上可接受的载体组合，或者例如与基因治疗释放媒介物(vehicle)或载体组合或结合在其中。
本发明的其他特征、目的和优点将显而易见地从说明书和附图以及从权利要求书中知晓。
附图简介附

图1显示preptin对NIH-3T3成纤维细胞增殖的剂量依赖作用(通过含氚胸苷摄取来测定)。
附图2比较preptin、GLP-1和IGF-II对INS-1E β-细胞增殖的作用(通过含氚胸苷摄取来测定)。
发明详述本发明涉及preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或它们任何一种的盐或衍生物的一种或多种用于刺激间充质细胞来源细胞例如成纤维细胞的增殖或表达和/或细胞质量或功能，以及用于刺激β-细胞生长增殖或增加β-细胞质量和/或功能的用途。不期望受任何特定理论或作用机制的约束，这种刺激或增加可以是，例如，通过细胞分化或再生来实现。
Preptin可以按照Buchanan等(2001)Biochem.J.360431-439的方式从胰岛β-细胞中分离。Preptin和preptin类似物和激动剂以及它们的盐和衍生物也可以采用合成方法来制备。肽及其盐和衍生物的合成，包括固相和液相肽合成，在本领域已经完整地建立。参见，例如Stewart等(1984)固相肽合成(第二版)；和Chan(2000)“Fmoc固相肽合成，实用方法”，牛津大学出版社。可以采用自动肽合成仪(例如PioneerTM肽合成仪，Applied Biosystems，Foster City，CA)来合成肽。例如，在甲基苯氢胺(methylbenzyhydrylamine)树脂上制备肽，接着通过氟化氢去保护，并从树脂上裂解。
用于本发明的蛋白质和肽还可以通过重组方法来制备。本发明提供能够引导可用于本发明的蛋白质和肽的表达的重组表达构建体。存在于在此提及的各种氨基酸序列中的氨基酸根据其熟知的三字母或单字母缩写被鉴定。存在于在此提及的各种DNA序列或其片段中的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母命名来命名。特定的氨基酸序列还可以包含类似、但被改变的氨基酸序列，例如仅具有较少变化的那些，例如用于说明而不是限制，共价化学修饰、插入、删除和取代，其可能还包括保守性取代或非天然氨基酸的取代。相互类似的氨基酸序列可能共有实质上的序列相同的区域。同样地，核苷酸序列可能包含具有较小变化的实质上相似的核苷酸序列，例如用于说明而不是限制，共价化学修饰、插入、删除和取代，其可能还包括由于遗传密码的简并性产生的沉默突变。相互类似的核苷酸序列可能共有实质上的序列相同的区域。
如在此所用，“氨基酸”是具有中心碳原子(alpha(α)碳原子)被连接到氢原子、羧酸基团(其碳原子在此被称作“羧基碳原子”)、氨基基团(其氮原子在此被称作“氨基氮原子”)和侧链基团R上的分子。当被结合到肽、多肽或蛋白质中时，在将氨基酸连接到另一个氨基酸上的脱水反应中，氨基酸失去其氨基和羧基基团的一个或多个原子。结果，当被结合到蛋白质时，氨基酸被称作“氨基酸残基”。在为天然蛋白质的情况下，氨基酸残基的R基团将20种氨基酸与它们通常形成的蛋白质区别，虽然在被结合到蛋白质后，一个或多个氨基酸残基在生物系统中被衍生化或修饰(例如通过糖基化和/或通过氧化两个非邻近的半胱氨酸氨基酸残基的硫醇侧链来形成胱氨酸，生成在稳定蛋白质的折叠构型中起重要作用的二硫化物共价键，等)。本领域技术人员可以预期，非天然氨基酸也可以被结合到蛋白质中，特别是那些通过合成方法，包括固相和其他自动合成方法制备的蛋白质。这种氨基酸的例子包括，不限于，α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、L-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、citralline、磺基丙氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基精氨酸、苯基甘氨酸、环己基精氨酸、β--精氨酸、氟-氨基酸、designer氨基酸(例如，β--甲基氨基酸、α-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸)和氨基酸类似物。此外，当α-碳原子具有四种不同基团(情况是除了甘氨酸外，20种氨基酸被生物系统利用来合成蛋白质，甘氨酸具有被结合到α-碳原子上的两个氢原子)时，各种氨基酸存在两种不同异构形式，称作D和L。在哺乳动物中，仅L氨基酸被结合到天然多肽中。本发明包括结合一种或多种D-和L-氨基酸的蛋白质，以及由仅D-或L-氨基酸残基的蛋白质。
在此，如下的缩写被用于如下氨基酸(及其残基)丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和缬氨酸(Val，V)。非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、esparagine和谷氨酰胺。正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
“蛋白质”或“肽”是指通过肽键连接的两种或多种单个氨基酸(无论是否是天然的)的任何聚合物，当被结合到氨基酸(氨基酸残基)的α碳原子上的羧酸基团的羧基碳原子被共价结合到结合在邻近氨基酸的α碳原子上的氨基基团的氨基氮原子上时发生连接。术语“蛋白质”在其含义中被理解为包括术语“多肽”和“肽”(有时，它们在此被交换使用)，反之亦然。此外，包含多个多肽亚基或其他组分的蛋白质也被解释为被包括在在此所用的“蛋白质”的含义中。类似地，蛋白质、肽和多肽的片段也在本发明的保护范围内，并且在此称作“蛋白质”。
在生物系统中(可以是体内或体外系统，包括无细胞系统)，特定蛋白质的特定氨基酸序列(即按照从氨基末端到羧基末端来书写的多肽的“一级结构”)通过mRNA的编码部分的核苷酸序列来确定，核苷酸序列是通过遗传信息通常为基因组DNA来划分(用于本发明的目的，基因组DNA被理解为包括细胞器DNA，例如线粒体DNA和叶绿体DNA)。当然，组成特定生物体的基因组的任何类型的核酸(例如在大多数动物和植物中的双链DNA，一些病毒中的单链或双链RNA等)被理解为编码特定生物体的基因产物。信使RNA在核糖体中被翻译，核糖体催化游离氨基酸聚合，氨基酸的特定身份通过被翻译为初始多肽的mRNA的特定密码子来划分(对于mRNA来说，是mRNA编码区中的三个邻近的A，G，C，或U核苷酸)。DNA重组技术使得可以大规模合成具有与在活生物体中天然生成相同的一级序列的蛋白质和多肽(例如人胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素、粒细胞菌落刺激因子等)。此外，这种技术可以合成这些或其他蛋白质的类似物，这些类似物与天然蛋白质相比含有一个或多个氨基酸删除、插入和/或取代。DNA重组技术还可以合成全新的蛋白质。
在非生物系统中(例如，采用固相合成的系统)，蛋白质的一级结构(还包括二硫化物(胱氨酸)键定位)可以由用户确定。结果，获得具有与生物制备的蛋白质相同的一级结构的多肽，还可以获得这种蛋白质的类似物。此外，还可以合成全新的多肽，蛋白质中可以结合非天然的氨基酸。
术语“基因”是指涉及制备多肽链的DNA的区段；其可能还包括多肽编码区域前后的区域，例如，“先导和尾部”以及在相关的各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
如在此所描述，本发明提供完全地或部分地通过具有preptin编码序列的核酸编码的肽，preptin编码序列被融合或者另外地在读框内被连接到其他天然的或工程化的序列上，来表达被融合或者另外地被连接到其他功能性多肽序列上的多肽序列，例如，用于说明而不是限制，使得可以删除、功能性改变、分离和/或纯化融合蛋白。
多肽修饰可以通过本领域技术人员知晓的任何方法来实现。在此优选方法依赖于修饰编码例如preptin蛋白，类似物或激动剂的DNA，以及被修饰的DNA的表达。编码本发明的肽构建物之一的DNA可以采用标准方法来改变或诱变，包括在下文描述的那些方法。
氨基酸的保守取代是熟知的，并且可以不改变生成的蛋白质分子的生物活性来进行。例如，这种取代通常可以通过极性残基、带电荷残基、疏水残基、小残基等之间进行交换来进行。如果需要，这种取代可以通过在体外生物分析中仅仅检测生成的被修饰蛋白质结合适当细胞表面受体，或者结合适当抗体或期望的目标分子的能力来经验性地确定。
本发明还涉及杂交到本发明的构建体上的核酸，构建体包括例如，在此提供的编码preptin，preptin类似物和/preptin激动剂的多核苷酸序列或者其互补物，如果这些序列之间具有至少约70％，或至少约80-85％，或至少约90％，或至少约95％，96％，97％，98％或99％的同一性，这对于熟悉本领域的人员来说是显而易见的。
本发明特别涉及在严紧条件下杂交到，例如在此提及的preptin，preptin类似物和/preptin激动剂的编码核酸上的核酸。如在此所用，特定严紧条件下的“杂交”被用于描述两条单链核酸分子之间形成的杂合体的稳定性。杂交的严紧性通常表示为杂合物被退火和洗涤的离子强度和温度的条件。术语“严紧条件”是指多核苷酸之间能够杂交的条件。严紧条件可以用盐浓度、有机溶剂(例如甲酰胺)浓度、温度定义，并且其他条件在本领域是熟知的。特别地，可以通过降低盐浓度，提高有机溶剂(例如甲酰胺)的浓度，或者提高杂交温度来提高严紧性。例如，严紧性盐浓度通常小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，和最优选小于约250mM NaCl和25mM檬酸三钠。低严紧性杂交可以在缺乏有机溶剂，例如甲酰胺下实现，而高严紧性杂交可以在存在有机溶剂(例如，至少约35％甲酰胺，最优选至少约50％甲酰胺)下实现。严紧的温度条件通常包括至少约30℃的温度，更加优选至少约37℃，和最优选至少约42℃。各种其他参数，例如，杂交时间、去垢剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度，和包含或去除载体DNA，对于本领域技术人员来说是熟知的。根据需要通过组合这些各种条件来达到不同程度的严紧性，这是本领域的常规技术。其他典型的“高度”、“中度”和“低度”严紧性包括如下条件或者等同的条件高度严紧性0.1 x SSPE或SSC，0.1％SDS，65℃；中度严紧性0.2 x SSPE或SSC，0.1％SDS，50℃；和低度严紧性1.0 x SSPE或SSC，0.1％SDS，50℃。如本领域技术人员所知晓，可以通过改变时间，温度，用于预杂交、杂交的溶液的浓度和洗涤步骤，来达到改变杂交条件的严紧性，而且合适的条件可能还部分地取决于所用探针的和被印迹的先验者(proband)的核酸样本的特定核酸序列。因此，可以预期，可以容易地选择合适的严紧条件，而无需过度的试验，其中可以根据探针杂交一种或多种特定先验者序列而不杂交到特定的其他先验者序列的能力来确定该探针的期望选择性。
如在此所用，优选的“严紧条件”通常是指仅当序列之间具有至少约90-95％，或至少约97％同一性时发生的杂交。在优选实施方案中，杂交到例如在此提及的preptin，preptin类似物，和/或preptin激动剂的编码核酸的核酸构建体，编码实质上保留与例如由cDNA编码的preptin，preptin类似物，和/或preptin激动剂相同生物学功能或活性的多肽。
本发明的核酸，在此也被称作多核苷酸，可以是RNA形式，例如mRNA，或DNA形式，该DNA包括cDNA(也称作“互补DNA”，是与特定信使RNA互补的DNA分子)、基因组DNA和合成的DNA。DNA可以是双链的或者单链的，如果为单链DNA，则可以是编码链或者非编码(反义)链。编码用于本发明的preptin的编码序列，例如，可以含有与本领域已知的或者在此描述其中部分的编码序列相同的部分，或者可以是不同的编码序列，其由于遗传密码的冗余(redundancy)和简并性，编码相同的构建体或其部分，包括preptin，preptin类似物，和/或preptin激动剂蛋白质的全部或部分。
编码按照本发明使用的用于本发明的构建体的核酸包括，但是不限于只有编码preptin的序列。术语编码preptin的“核酸”或者“多核苷酸”，例如，包括仅包括例如preptin多肽的编码序列的核酸，以及包括其他编码和/或非编码序列的核酸。
如在此描述使用的核酸和寡核苷酸可以通过本领域技术人员知晓的任何方法来合成(参见，例如WO 93/01286，美国专利申请07/723,454；美国专利5,218,088；美国专利5,175,269；美国专利5,109,124)。各种寡核苷酸和核酸序列的鉴定还涉及本领域知晓的方法。例如，可用于克隆的寡核苷酸的期望特性、长度和其他特征是熟知的。在某些实施方案中，合成的寡核苷酸和核酸序列可以被设计成含有如下连接来抵抗内源性的宿主细胞核酸酶的降解硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、砜、硫酸盐、羰基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯和被证明可以用于反义应用中的其他连接。参见，例如Agrwal等，Tetrehedron Lett.283539-3542(1987)；Miller等，J.An.Chem.Soc.936657-6665(1971)；Stec等，Tetrehedron Lett.262191-2194(1985)；Moody等，Nucl.Acids Res.124769-4782(1989)；Uznanski等，Nucl.Acids Res.(1989)；Letsinger等，Tetrahedron40137-143(1984)；Eckstein，Anml.Rev.Biochem.54367-402(1985)；Eckstein，Trends Biol.Sci.1497-100(1989)；Stein寡核苷酸.基因表达的反义抑制剂，Cohen编辑，MacmillanPress，伦敦，97-117(1989)；Jager等，Biochemistry 277237-7246(1988)。
在此所用，“缺失”具有如熟悉本领域的人员所理解的通常含义，并且例如为在此提供的截断分子的情况下，可以指相对于相应的全长分子缺少来自末端或者非末端区域的序列的一个或多个部分。截断分子为线性的生物聚合物，例如核酸分子或者多肽，可能在分子的任意异端具有一个或多个缺失和/或在分子的非末端区域具有一个或多个缺失。
本发明还涉及在此提及的核酸的变体，这些核酸编码本发明的构建体的片段、类似物和/或衍生物，例如preptin多肽。编码本发明的构建体的核酸的变体可以是其中包括的核酸序列的一个或多个部分的天然等位变体，或者这种序列或部分的非天然变体，包括采用例如本领域已知的用于改变序列的方法通过分子工程化改变的序列。如本领域所知晓，等位变体是核酸序列的可替代形式，其具有至少一个或多个核苷酸的取代、删除或添加的一种，任何一种变化不会实质上或不期望地改变被编码的pretin、preptin类似物和/或preptin激动剂的功能。
本发明的构建体的变体和衍生物，例如preptin蛋白质，可以通过突变编码例如pretin、preptin类似物和/或preptin激动剂多肽或其任何部分的核苷酸来获得。改变天然氨基酸序列可以通过大量常规方法的任何一种来实现。可以在特定基因座上导入突变，例如通过合成含有突变序列的寡核苷酸，突变序列与确保连接到天然序列片段上的限制性位点侧面连接。连接后，生成的重组序列编码具有期望氨基酸插入、取代或删除的类似物。
可选择地，可以使用例如寡核苷酸定点特异性诱变方法产生被改变的基因，其中预先确定的密码子可以通过取代、删除或插入来改变。进行这种改变的示例性方法被公开在Walder等，1986 Gene 42133；Bauer等，1985 Gene 3773；Craik，1985年1月BioTechniques12-19；Smith等，1985年1月遗传工程原理和方法BioTechniques12-19；Costa GL，等，“利用快速PCR方法的定点诱变”1996 MethodsMol Biol.57239-48；Rashtchian A.，“采用聚合酶链式反应的克隆和遗传加工基因的新方法，”1995 Curr Opin Biotechnol.6(1)30-6；Sharon J，等，“抗体结合位点的寡核苷酸引导诱变，”1993 Int RevImmunol.10(2-3)113-27；Kunkel，1985 Proc.Natl.Acad Sci.USA82488；Dunkel等，1987 Methods in Enzymol.154367；和美国专利4,518,584和4,737,462。
作为例子，可以通过定点诱变编码蛋白质的DNA结合使用DNA扩增方法来进行DNA修饰，DNA扩增方法采用引物在DNA模板中导入和扩增改变，例如通过重叠延伸的PCR剪切(SOE)。定点诱变通常使用具有单链和双链形式的噬菌体载体来实现，例如M13噬菌体载体，其是熟知的并且可以购买得到。也可以使用含有单链噬菌体复制起点的其他合适载体。参见例如Veira等，1987 Meth.Enzymol.153。一般地，定点诱变是通过制备编码目标蛋白(例如特定结合preptin，preptin类似物，和/preptin激动剂蛋白质的全部或组成部分)的单链载体来进行。在与单链载体中的DNA同源的区域中含有期望突变的寡核苷酸引物被退火到载体上，接着结合上DNA聚合酶，例如E.coliDNA聚合酶I(Klenow片段)，该酶利用双链区域作为引物来生成异源双链核酸分子，其中一条链编码被改变的序列，另一条为原始序列。异源双链核酸分子被导入适当的细菌细胞中，选择包括期望突变的克隆。获得的改变的DNA分子可以在合适的宿主细胞中重组表达以产生修饰的蛋白质。
本发明还包括包含编码添加或取代氨基酸残基或序列，或者删除生物活性所不需或不期望有的末端或中间残基或序列的的等价DNA构建体。
“宿主细胞”或“重组宿主细胞”是含有载体例如表达载体的细胞，或者通过重组技术被另外地加工来表达目标蛋白的细胞。宿主生物体包括那些其中可能进行重组生产本发明的构建体，例如由本发明的重组构建体编码preptins，preptin类似物和/preptin激动剂的生物体，例如细菌(例如E.coli)、酵母(如酿酒酵母和毕氏酵母(Pichiapastoris))、昆虫细胞，和哺乳动物细胞，包括体外和体内表达。因此，宿主生物体可能包括在制备本文提供的组合物中用于构建、繁殖、表达或其他步骤的生物体。宿主包括发生如在此所描述的免疫反应的个体。当前，用于制备本发明的用于生产糖基化蛋白质的构建体的优选宿主生物体是哺乳动物细胞或者可以进行糖基化蛋白质表达和回收的其他细胞系统。其他细胞系包括近交鼠品系和鼠细胞系，人细胞和细胞系。
将编码被用于本发明的期望构建物的DNA构建体导入载体中，例如质粒，用于在适当的宿主细胞中表达。在优选实施方案中，宿主是哺乳动物宿主，例如哺乳动物细胞系。序列优选被密码子优化来在特定宿主中表达。因此，例如，如果构建物是人preptin或preptin类似物或衍生物或激动剂，并且在细菌中被表达，密码子被优化为细菌利用。对于小编码区，基因可以作为单个寡核苷酸被合成。对于大的蛋白质，可以采用多重寡核苷酸剪切、诱变或者本领域技术人员知晓的其他技术。质粒或其他载体中的核苷酸序列是调控区，例如启动子和操纵子，被可操作地相互连接用于转录。编码期望蛋白质的核苷酸的序列还可以包括编码分泌信号的DNA，其中生成的肽是前体蛋白。从周质间隙或者发酵液中回收生成的被加工的蛋白质。
在优选实施方案中，DNA质粒可能还包括转录终止序列。如在此所用，“转录终止区”是发出信号使转录终止的序列。完整的转录终止子可以从蛋白质编码基因中获得，编码基因可能与插入基因或者启动子来源相同或不同。转录终止子是在此的表达系统的可选择组分，但是在优选实施方案中被使用。
在此使用的质粒或者其他载体包括与编码目标蛋白质或者多肽的DNA可操作连接的启动子，被设计来在上述的合适宿主(例如，细菌、鼠或人)中表达蛋白质，取决于质粒的预期用途(例如，基因治疗)。在此用于表达蛋白质和多肽的合适启动子是可以广泛获得的，并且在本领域是已知的。被连接到调控区的诱导型启动子或者组成型启动子是优选的。这种启动子包括，例如，但是不限于，T7噬菌体启动子和其他的T7样噬菌体启动子，例如T3，T5和SP6启动子，来自E.coli的trp，lpp，和lac启动子，例如lacUV5；杆状表达/昆虫表达系统的P10或多角体蛋白基因启动子(参见，例如，美国专利5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784)和来自其他真核表达系统的诱导型启动子。为了表达蛋白质，启动子被插入到质粒中，可操作地连接控制区，例如lac操作子。
优选的启动子区域是那些在哺乳动物细胞中是可诱导和具有功能的。细菌表达的合适诱导型启动子和启动子区的例子包括，但是不限于对异丙基β--D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG；参见Nakamura等，1979 Cell 181109-1117)响应的E.coli lac启动子；对重金属(例如锌)诱导响应的金属硫蛋白启动子金属调控元件(参见，例如，美国专利4,870,009)；对IPTG响应的噬菌体T7 lac启动子(参见，例如，美国专利4,952,496；和Studier等，1990 Meth.Enzymol.18560-89)和TAC启动子。根据所用的表达宿主系统，质粒可选择地包括一种可选择的标记基因或在宿主中具有功能的基因。因此，例如，可选择基因包括赋予细菌表型的任何基因，使得被转化的细菌细胞可以被鉴定并在未被转化细胞的大群体中可选择地生长。细菌宿主的合适可选择标记基因，例如，包括氨卡青霉素抗性基因(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。目前卡那霉素抗性基因优选被用于细菌表达。
在各种表达系统中，质粒或其他载体还可以包括编码分泌被可操作地连接的蛋白质的信号的DNA。适合使用的分泌信号可以广泛地获得，并且在本领域是已知的。可以采用在E.coli中起作用的原核和真核的分泌信号。根据表达系统，目前优选的分泌信号可以包括，但是不限于，由如下的E.coli基因编码的那些信号ompA、ompT、ompF、ompC、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶等(von Heijne，J.Mol.Biol.18499-105，1985)。此外，可以采用细菌的pelB基因分泌信号(Lei等，J Bacteriol.1694379，1987)、phoA分泌信号和在昆虫细胞中起作用的cek2。用于某些表达系统的最优选的分泌信号是E.coli ompA分泌信号。还可以采用本领域技术人员知晓的其他原核和真核分泌信号(参见，例如，von Heijne，J.Mol.Viol.18499-105，1985)。采用在此描述的方法，本领域技术人员能够替换为在酵母、昆虫或哺乳动物细胞中起作用的分泌信号，以从这些细胞分泌蛋白。
用于E.coli细胞转化的优选质粒包括pET表达载体(例如pET-11a、pET-12a-c、pET-15b；参见美国专利4,952,496；可购自Novagen，Madison，WI.)。其他优选质粒包括pKK质粒，特别是含有tac启动子的pKK 223-3(Brosius等，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.816929；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology；美国专利5,122,463、5,173,403、5,187,153、5,204,254、5,212,058、5,212,286、5,215,907、5,220,013、5,223,483和5,229,279)。已经通过用卡那霉素抗性基因替换氨卡青霉素抗性基因来改进质粒pKK。(购自Pharmacia；从pUC4K获得，参见，例如，Vieira等(1982)Gene 19259-268；和美国专利4,719,179)。杆状细菌载体，例如pBlueBac(又称作pJVETL及其衍生物)，尤其是pBlueBacIII(参见，例如，美国专利5,278,050、5,244,805、5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784；购自Invitrogen，San Diego)，可被用在昆虫细胞中表达多肽。其他质粒包括pIN-IIIompA质粒(参见美国专利4,575,013；还参见Duffaud等，Meth.Enz.153492-507，1987)，例如pIN-IIIompA2。
在其他实施方案中，如果在细菌细胞中一个或多个DNA被复制，一个宿主的例子是E.coli。优选的DNA分子是还包括细菌复制起点的系统，以确保细菌的DNA分子代代相传。这样，通过在细菌中复制，生成了大量DNA分子。在该表达系统中，优选的细菌复制起点包括，但是不限于，fl-ori和col E1复制起点。用于这种系统的优选宿主含有编码T7 RNA聚合酶的DNA的染色体拷贝，被可操作地连接到诱导型启动子上，例如lacUV启动子(参见美国专利4,952,496)。这种宿主包括，但是不限于，溶原性细菌E.coli菌株HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)和BL21(DE3)。菌株BL21(DE3)是优选的。PLys菌株生成低含量的T7溶菌酶，T7溶菌酶是T7 RNA聚合酶的天然抑制剂。
所提供的DNA分子还可包括编码阻抑蛋白的基因。阻抑蛋白能够抑制含有阻抑蛋白结合的核苷酸序列的启动子的转录。通过改变细胞的生理条件，启动子可以被去抑制。例如，通过往生长培养液中加入抑制与操作子或调节蛋白或者DNA的其他区域相互作用的能力的分子，或者通过改变生长培养液的温度来实现这种改变。优选的阻抑蛋白包括，但不限于对IPTG诱导响应的E.coli lac I阻抑蛋白、对温度敏感的λcI857阻抑蛋白等。E.coli lacI阻抑蛋白是优选的。
总之，主题发明的重组构建体将还含有转录和翻译所需的元件。特别地，当含有编码preptin，preptin类似物和/或preptin激动剂蛋白核酸序列的重组表达载体用于在宿主细胞或生物体中表达时，该元件是优选的。在本发明的某些实施方案中，通过将基因置于启动子的调控下来实现细胞类型优选或者细胞类型特异的表达。启动子的选择将取决于被转化的细胞和期望的控制程度或类型。启动子可以是组成型的或具有活性的，还可以是细胞类型特异的、组织特异的、个别细胞特异的、事件特异的、时序(temporally)特异的或者诱导型的。组成型的或非特异的启动子的例子包括SV40早期启动子(美国专利5,118,627)、SV40晚期启动子(美国专利5,118,627)、CMV早期基因启动子(美国专利5,168,062和腺病毒启动子。除了病毒启动子外，细胞启动子也在本发明的范围内。特别地，所谓看家基因的细胞启动子也是有用的。病毒启动子一般比细胞启动子更强大，是优选的。在许多真核细胞基因中，包括高等真核细胞，启动子区已经被确定，因而本领域技术人员能够很容易地选择用于特定宿主的合适启动子。
还可以使用诱导型启动子。这些启动子包括MMTV LTR(PCT WO91/13160)，被地塞米松诱导；可被重金属诱导的金属硫蛋白启动子和具有cAMP响应元件的被cAMP诱导的启动子。使用诱导型启动子，编码preptin，preptin类似物和/preptin激动剂蛋白质的核酸序列可以通过主题发明的表达构建体被释放到细胞中，并且将保持静止，直到加入诱导剂。这使得可以对基因产物的生成时机进行控制。
事件类型特异的启动子仅在发生某一事件，例如肿瘤发生或病毒感染时，具有活性的或者被上调。HIV LTR是已知的事件特异启动子的例子。除非存在tat基因产物，否则启动子是无活性的，tat基因产物在病毒感染时出现。一些事件特异的启动子也是组织特异性的。
此外，可以采用由特定的细胞基因同时调控的启动子。例如，当期望本发明的特定构建体，例如preptin，preptin类似物和/或preptin激动剂的编码基因的表达，与一种或多种其他内源的或外源导入的基因的表达相呼应时，使用被同时的基因的启动子。当已知与免疫系统的特定组织中的免疫反应的诱导相关的特定基因表达模式时，这种类型的启动子特别有用，使得该组织中的特定免疫活性细胞可以被激活或者募集来参与免疫反应。
除了启动子，可以插入阻抑序列、负调控物或者组织特异性沉默子来降低preptin，preptin类似物和/preptin激动剂的编码基因在某些情形下的非特异性表达，例如作为治疗方案的一部分，宿主为瞬时无免疫应答的情形。可以将多个抑制元件插入到启动子区域。转录抑制不依赖于抑制元件的方向或者与启动子的距离。一种类型的抑制序列是绝缘体序列(insulator sequence)。这种序列抑制转录(Dunaway等，1997 Mol Cell Biol 17182-9；Gdula等，1996 Proc Natl AcadSci USA 939378-83，Chan等，1996 J Virol 705312-28；Scott和Geyer，1995 EMBO J 146258-67；Kalos和Fournier，1995 MolCell Biol 15198-207；Chung等，1993 Cell 74505-14)，并且将会抑制不期望的背景转录。
在II型(软骨)胶原蛋白、胆碱乙酰转移酶、白蛋白(Hu等，1992J.Cell Growtla Differ.3(9)577-588)、磷酸甘油酸激酶(PGK-2)(Misuno等，1992 Gene 119(2)293-297)基因的启动子区域中以及在6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶基因(Lemaigre等，Mol.Cell Biol.11(2)1099-1106)中也确定了抑制元件。此外，已经在大量肝特异性基因中确定了负调控元件Tse-1，并且已经证明，在肝细胞中Tse-1阻断cAMP响应元件(CRE)介导的诱导基因活化。(Boshart等，1990 Cell 61(5)905-916)。
在优选实施方案中，提高期望产物的表达的元件可以被插入到构建体中。这种元件包括内部核糖体结合位点(IRES；Wang和Siddiqui，1995 Curr.Top.Microbiol.Immunol 20399；Ehrenfeld和Semler，1995 Curr.Top.Microbiol.Immunol.20365；Rees等，1996Biotechniques 20102；Sugimoto等，1994 Biotechnology 12694)。IRES提高翻译效率。此外，其他序列可能增强表达。对于某些基因，特别是在5’断的序列抑制转录和/或翻译。这些序列通常是能够形成发夹结构的回文序列。将被释放的核酸中的任何这种序列通常被删除掉。分析转录或翻译产物的表达水平来确认或确定哪些序列影响表达。通过任何已知方法来分析转录水平，包括Northern印迹杂交、Rnase探针保护等。蛋白质水平可以通常任何已知方法来分析，包括ELISA、western印迹、免疫细胞化学或者其他已知技术。
其他元件可以被插入到本发明的构建体中，例如插入到本发明的preptin或preptin类似物或激动剂蛋白编码构建体中。在优选实施方案中，构建体包括转录终止子序列，包括多聚腺苷酸序列、剪切供体受体位点和增强子。还可以插入用于哺乳动物细胞或者其他真核细胞中表达和维持构建体的其他元件(例如复制起点)。由于在细菌细胞中制备构建体比较便利，细菌繁殖所需或者增强细菌繁殖的元件被插入。这种元件包括复制起点、选择性标记等。
如在此指出，用于本发明的构建体的制备或表达的宿主细胞，例如，可以是高等真核细胞，例如哺乳动物细胞或者低等真核细胞，例如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。按照本发明，恰当的宿主细胞的代表性例子包括，但是不必限于，细菌细胞，例如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，例如酵母细胞；昆虫细胞，例如果蝇S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9；动物细胞，例如CHO、COS或293细胞；腺病毒；植物细胞或者任何已经适合于体外繁殖或者由此重新建立的合适细胞。一般认为，根据本文的教导，本领域技术人员能够选择适当的宿主细胞。各种哺乳动物细胞培养系统也可以被用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman，1981 Cell23175描述的猴肾脏成纤维细胞的COS-7细胞系，和其他能够表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点、多聚腺苷酸位点、剪切供体受体位点、转录终止序列，和5’侧翼非转录序列。来源于SV40剪切的DNA序列和多聚腺苷酸位点可以被用于提供所需的非转录遗传元件。可以通过本领域技术人员熟悉的各种方法将构建体导入宿主细胞中，包括但是不现有，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或者电穿孔(Davis等，1986Basic Methods in Molecular Biology)。
本发明还涉及载体，涉及从包括本发明的核酸的已知载体制备的构建体，并且特别涉及“重组表达构建体”，其包括各种已知构建体的任何一种，包括用于基因治疗的释放构建体，其包括任何编码例如在此提供的按照本发明的preptins、preptin类似物和preptin激动剂的核酸；涉及通过重组方法，用本发明的载体和/或其他构建体细胞遗传工程化的宿主细胞，和施用包含编码按照本发明的preptins、preptin类似物和preptin激动剂或其片段或衍生物的核酸序列表达或其他构建体的方法。
本发明的各种构建体实际上可以在任何宿主细胞中被表达，包括在用于基因治疗的情况下的体内宿主细胞，在适当的启动子的控制下，取决于构建体的性质(例如启动子类型，如上所述)和期望宿主细胞的性质(例如，无论是否有丝分裂后期末期分化或者活性分裂；例如，无论表达构建体是否作为附加体存在于宿主细胞中或者被整合到宿主细胞基因组中)。用于原核和真核宿主的适当克隆和表达载体被描述在例如Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，第二版，冷泉巷，纽约(1989)；如在此指出，在本发明的特别优选实施方案中，在用主题发明的重组表达构建体转染或转化的哺乳动物细胞中进行重组表达。还参见，例如Machida，CA.，“用于基因治疗的病毒载体方法和操作”(″Viral Vectors for GeneTherapyMethods and Protocols″)；Wolff，JA，“基因治疗定向基因转移的方法和应用”(″Gene TherapeuticsMethods andApplications of Direct Gene Transfer″)(Birkhauser 1994)；Stein，U和Walther，W(eds.P，“癌症的基因治疗方法与操作”(″GeneTherapy of CancerMethods and Protocols″)(Humana Press 2000)；Robbins，PD(编辑)，“基因治疗操作”(″Gene Therapy Protocols″)(Humana Press 1997)；Morgan，JR(编辑)，“基因治疗操作”(″GeneTherapy Protocols″)(Humana Press 2002)；Meager，A(编辑)，“基因治疗技术、应用与原理从实验室到临床”(″Gene TherapyTechnologies，Applications and RegulationsFrom Laboratory toClinic″)(John Wiley & Sons Inc.1999)；MacHida，CA和Constant，JG，“用于基因治疗的病毒载体方法和操作”(″ViralVectors for Gene TherapyMethods and Protocols″)(Humana Press2002)；“作为遗传代谢疾病NIH指南的基因治疗新方法”(”NewMethods of Gene Therapy For Geneic Metabolic Diseases NIHGuide”)22(35)，1993年10月1日。还参见与基因治疗相关，包括疫苗的最新美国专利，包括美国专利6,384,210(“用于生物多聚物合成的溶剂、溶剂微粒化及其所用方法”(”Solvent by biopolymersynthesis，solvent microdroplets and methods of use”)；6,384,202(“受细胞周期调节的细胞特异性活性化合物”(”Cell-specific active compounds regulated by the cellcycle”))；6,384,018(“多核苷酸肺结核疫苗”(“Polynucleotidetuberculosis vaccine”))；6,383,814(“用于治疗性分子的细胞内释放的阳离子两性分子”(“Catinonic amphiphiles forintracellular delivery of therapeutic molecules”))；6,383,811(“用于将聚离子释放到细胞内的多聚两性电解质”(“Polyampholutes by delivering polyions to cell”))；6,383,794(“制备高滴度重组腺伴随病毒的方法”(“Methods ofproducing high titer recombinant adeno-associated virus”))；6,383,785(“自增强的药学上可控制的表达系统”(”Self-enhancing，pharmacologically controllable expressionsystem”))；6,383,753(“细胞增殖的酵母哺乳动物调控蛋白(“Yeast mammalian regulators of cell proliferation”))；6,383,746(CCR5的功能性启动子”(“Functional promoter forCCR5”))；6,383,743(“顺序分析基因表达的方法”(“Method forserial analysis of gene expression”))；6,383,738(“单纯疱疹病毒ORF P是病毒蛋白合成的抑制蛋白”(“Herpes simples virus ORFP is a repressor of virus protein synthesis”))；6,383,737(“人乙二酰辅酶A脱羧酶”(“Human oxalyl-CoA Decarboxylase”))；6,383,733(“筛选用于治疗肿瘤疾病的药学活性化合物的方法”(“Methods of screening for pharmacologically active compoundsfor the treatment of tumour diseases”))；6,383,522(“含有抗肿瘤转移剂和鲨鱼软骨提取物的毒性降低的组合物”(“Toxicityreduced composition containing an anti-neoplastic agent and ashark carti lage extract”))；6,383,512(“囊泡复合物及其制备和使用方法”(″Vesicular complexes and methods of making and usingthe same″))；6,383,481(“造血干细胞移植的方法”(″Method fortransplantation of hemopoietic stem cells″))；6,383,478(“促进血管生成的聚合物包囊系统”(″Polymeric encapsulation systempromoting angiogenesis″))；6,383,138(“分析物的脑内取样方法”(″Method for transdermal sampling of analytes″))；6,380,382(“编码具有诊断、预防、治疗等用途的蛋白质的基因”(″Gene encoding aprotein having diagnostic，preventive，therapeutic，and otheruses″))；6,380,3719(“内多糖一种具有选择蛋白配基和趋化因子释放活性的新蛋白”(″Endoglycana novel protein havingselectin ligand and chemokine presentation activity″))；6,380,369(“人DNA错配修复蛋白”(″Human DNA mi smatch repairproteins″))；6,380,362(“多核苷酸，多核苷酸编码的多肽以及使用它们的方法”(″Polynucleotides，polypeptides expressed by thepolynucleotides and methods for their use″))；6,380,170(“细胞周期调控结构基因表达的核酸构建体”(″Nucleic acid constructfor the cell cycle regulated expression of structural genes″))；6,380,169(“含有寡核苷酸裂解化合物的金属复合物以及治疗方法”(″Metal complex containing oligonucleoside cleavage compounds和therapies″))；6,379,967(“作为病毒载体的疱疹病毒”(″Herpesvirus saimiri as viral vector″))；6,379,966(“血管内释放非病毒核酸蛋白酶蛋白及其用途(″Intravascular delivery ofnon-viral nucleic acid protease proteins，and uses thereof″))。
典型地，例如，表达构建体来源于质粒载体。一种优选构建体是改良的pNASS载体(Clontech，Palo Alto，CA)，其具有编码氨卡青霉素抗性基因的核酸序列、多聚腺苷酸信号和T7启动子位点。其他合适的哺乳动物表达载体是已知的(参见，例如，Ausubel等，1995；Sambrook等，同上文；还可以参见，例如，Invitrogen，San Diego，CA；Novagen，Madison，WI；Pharmacia，Piscataway，NJ和其他公司的产品目录)。目前，优选构建体被制备来包括在合适的调节控制下的二氢叶酸还原酶(DHFR)的编码序列，来促进preptins、preptin类似物和preptin激动剂生成水平的升高，其水平在使用适当选择剂(例如methetrexate)后由基因扩增产生。
一般地，如上所述，重组表达载体将包括复制起点和允许宿主细胞转化的可选择标记，来源于高度被表达基因来引导下游结构基因转录的启动子。异源结构序列在适当阶段与翻译起始和终止序列一起被组装。因此，例如，按照在此提供的编码核酸的preptin，preptin类似物和preptin激动剂可以被包括在各种作为在宿主细胞中表达preptin，preptin类似物和preptin激动剂多肽的重组表达构建体的表达载体构建体的任何一种之中。在某些优选实施方案中，构建体被包括在用于体内施用的制剂中。这种载体和构建体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；由质粒和噬菌体DNA组合得到载体，病毒DNA，例如痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒或者下文描述的复制缺陷逆转录病毒。但是任何其他载体可以被用于制备重组表达构建体，在优选实施方案中，这种载体在宿主中是可复制的和可存活的。
例如通过各种操作，可以将适当的DNA序列插入到载体中。总之，通过本领域知晓的操作将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点上。用于克隆，DNA分离，扩增和纯化，包含DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的标准技术，以及各种分离技术是本领域技术人员知晓和通常使用的。大量标准方法被描述在，例如，Ausubel等，(1993 Current Protocols in Molecular Biology，GreenePubl.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook等，(1989分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉巷实验室，Plainview，纽约)；Maniatis等(1982分子克隆(Molecular Cloning)，冷泉巷实验室，Plainview，纽约)；Glover(编辑)(1985 DNA Cloning第I和II卷，IRL Press，Oxford，UK)；Hames和Higgins(编辑)，(1985Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK)；和别处。
表达载体中的DNA序列被可操作地连接到至少一种适当的表达控制序列上(例如组成型启动子或被调控的启动子)，来引导mRNA合成。这种表达控制序列的代表性例子包括上文描述的真核细胞或者其他病毒的启动子。启动子区可以采用CAT(氯霉素转移酶)载体或者具有选择标记其他载体从任何期望基因中选择。真核启动子包括CMV立早启动子、HSV胸苷激酶和晚期SV40、逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-1。选择适当的载体和启动子完全在本领域普通技术人员的能力范围内，在此描述了某些特别优选的重组表达构建体的制备，该构建体包含至少一个被可操作地连接到编码preptin，preptin类似物和preptin激动剂多肽的核酸上的启动子或被调节的启动子。
可以在载体中插入增强子序列来增强通过高等真核细胞转录本发明包括的编码蛋白质和多肽的DNA。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约在10-300bp，其作用于启动子来提高其转录水平。例子包括位于复制起始后的100-270bp位置上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起始后的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
基因治疗是用遗传物质来治疗疾病，其包括替换有缺陷的基因或往细胞和/或组织中增加新基因的策略，正被开发来应用于治疗癌症、修正代谢紊乱和用于免疫治疗领域。本发明的基因治疗包括使用各种本发明的构建体，与或不与单独的载体或释放载体或构建物一起，用于治疗在此指出的疾病、紊乱和/或症状。体内基因治疗包括将遗传物质直接注射到患者或者人类患者的动物模型中。对于组织特异性的体内治疗，例如那些旨在治疗糖尿病的治疗，定位基因释放和/或表达/靶向系统是优选的。各种基因治疗载体已经被设计来靶向特定组织，各种操作也被开发来从物理上靶向特定组织，例如采用导管技术，所有这些方法被包括在本文中。基因治疗的离体方法被包括在本文中，包括取出、遗传修饰、扩增和重新施用患者自身的细胞。例子包括用于糖尿病治疗的B细胞移植或者祖细胞的遗传修饰。有用的基因治疗载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(Hsv)载体和逆转录病毒载体。基因治疗还可以采用“裸DNA”、脂质体释放、脂质释放(包括DNA附着到正电荷的脂质上)和电穿孔来实施。如在此所提供，在某些实施方案中，包括但是不限于基因治疗方案，载体可以是病毒载体，例如，逆转录病毒载体。Miller等，1989BioTechniques 7980；Coffin和Varmus，1996 Retroviruses，冷泉巷实验室出版社，纽约。例如，产生逆转录质粒载体的逆转录病毒可以来源于包括，但是不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒，逆转录病毒例如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺癌病毒。用于病毒载体中的合适启动子通常包括，但是不限于，逆转录LTR；SV40启动子和Miller等，1989 Biotechniques 7980-990中描述的人巨细胞病毒(CMV)启动子，或者任何其他启动子(例如，细胞启动子如真核细胞启动子，包括，但不限于组蛋白、polIII和β-肌动蛋白启动子)。其他可以被使用的病毒启动子包括，但不限于，腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。根据本文含有的教导，选择合适的启动子对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以从上面描述的被调控启动子或启动子中选择。
本发明的包含一种或多种在此描述的编码构建体的多核苷酸的构建体或组合物(例如，其中在一定条件下被体内或体外施用一段时间，以足以在宿主细胞中表达preptin，preptin类似物和/preptin激动剂蛋白，来用于基因治疗)，可以被配制成用于按照熟知方法施用的药物组合物。药物组合物通常包括一种或多种重组表达构建体，和/或这种构建体的表达产物，结合了药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在所用的剂量和浓度下，该载体对于受体来说是无毒性的。对于核酸制剂，或者包含本主题发明的重组构建体的表达产物的制剂来说，将以约0.01μg/kg到约100mg/kg体重被施用，例如，典型地通过皮内、皮下、肌肉内或静脉内的路径或者通过其他路径被施用。优选剂量为，例如约1μg/kg到约1mg/kg，而约5μg/kg到约200μg/kg是特别优选的。施用的次数和频率将取决于宿主的反应，这对本领域技术人员来说是显然的。用于治疗用途的“药学上可接受的载体”在药学领域是熟知的，被描述在例如雷明顿药物科学(RenaingtoyasPharmaceutical Science)，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑1985)中。例如，生理pH下的无菌生理盐水和磷酸缓冲生理盐水可以被使用。防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂可以被添加到药物组合物中。例如，苯甲酸钠、山梨酸和p-羟基苯甲酸酯可以被加入作为防腐剂。Id.at 1449。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。Id.
合成肽可以通过方法例如亲合柱层析或者高压液相层析的方法进一步纯化。标准的理化表征方法在本领域是已知的，包括NMR(13C，1H，19F，或31P)和IR，其给合成产物的鉴定和纯度提供确定的证据。氨基酸分析可以被用于确定肽的氨基酸组成。质谱分析可以被用于确定合成产物的分子量。
可以通过例如脂肪酸衍生化、糖基化或偶联到单甲氧基聚乙二醇(PEG)和/或磷脂(包括PEG-脂质偶联物)上来制备衍生物。示例性PEG的分子量为2,000和5,000，虽然也可以使用其他的PEG，包括但是不限于范围在如600-12,000的PEG。衍生物的脂质部分，举例来说，可以包括饱和或不饱和PEG、胆固醇、具有短链(C8)、中等长度链(C14)和长链(C20)脂肪胺等的神经酰胺。
Preptins以及preptin类似物和激动剂，及其盐和衍生物还可以作为二聚体或更大的聚集体来被制备，以提高其功能和/或延长半衰期。
可以在体外检测Preptin激动剂刺激NIH-3T3细胞或者其他类似细胞或者β-细胞包括INS-IE β-细胞增殖的能力。参见下文的特定实施例。可以通过本领域的操作来进行体内筛选。参见，例如，Burks和White(2001)Diabetes 50副刊1S140-5；Flier等，(2001)ProcNatl Acad Sci USA 98(13)7475-80；Guiot等，(2001)Diabetes50副刊1S188；Kjems等，(2001)Diabetes 50(9)2001-2012；Moore等，(2001)Diabetes 50(10)2231-6。
采用本发明提供的序列信息，使用各种方法获得任何物种的preptin的变体，这种方法包括但是不限于，例如，筛选cDNA文库、RT-PCR、筛选基因组文库和计算机辅助检索EST、cDNA和基因组数据库。这些方法对于本领域技术人员来说是熟知的(参见，例如，www.MolecularCloning.com；Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Inc)。例如，通常采用寡核苷酸探针和/或引物在基因组文库或cDNA文库中进行筛选。基于来源于在此描述的种类的任何之一的preptin的序列的寡核苷酸探针和/或引物可以被合成并被用于通过杂交或PCR技术在来自其他生物体的cDNA或基因组DNA文库鉴定阳性克隆。阳性克隆是与preptin的序列具有足以在期望严紧性的杂交条件下与寡核苷酸探针或引物杂交的相似性的克隆。探针和/或引物的长度至少约10个、优选至少约15个和最优选至少约20个核苷酸。适合使用这种寡核苷酸探针和/或引物的杂交和PCR技术在本领域是熟知的。可以通过限制性酶消化、DNA测序等来分析阳性克隆。被确定或怀疑包含preptin编码核酸序列的克隆可以采用本领域熟知的技术来表达。来自任何物种的preptin可以通过使用本领域知晓的技术在合适宿主细胞中表达核酸编码序列来获得。合适的宿主细胞包括原核或真核生物体或者细胞系，例如，酵母、E.coli、昆虫细胞和COS1细胞。优选地，利用真核系统来表达preptin。本发明的重组表达载体可以被用在宿主细胞中表达preptin，来分离preptin蛋白。被纯化的本发明的preptin蛋白可以通过本领域熟知的方法来制备，通常包括往宿主细胞中导入编码preptin的重组核酸，允许在宿主细胞中表达蛋白质，并分离和纯化该蛋白。优选地，重组核酸是重组表达载体。可以从表达蛋白的宿主细胞中分离蛋白质，并按照本领域的标准方法来纯化，包括硫酸胺沉淀、柱层析(例如离子交换、凝胶过滤、亲合层析等)电泳和最后结晶(一般参见“酶纯化及相关技术”(″Enzyme Purification and Related Techniques″)，(1971)Methods in Enzymology，22233-577，在此引入作为参考)。
术语“β-细胞生长”被定义为β-细胞数量的增加和/或β-细胞质量的提高。
术语“β-细胞质量”是指β-细胞的质量和/或重量。
术语“β-细胞增殖”是指β-细胞数量的增加。
β-细胞或β-细胞质量被降低或被危及的症状包括完全或部分地在于β-细胞和/或β-细胞质量对于正常或期望的机体功能来说是低常的或不足的。
如在此所用，术语“个体”是指但是不限于哺乳动物，包括人、家养动物(或其他可能被兽医治疗的动物)，以及经济动物，包括但是不限于马、牛、猪、绵羊、家禽等。
术语“治疗”被定义为给个体应用或施用包括有效量或者其他期望量的一种或多种preptin，preptin类似物、preptin激动剂、和它们的任何一种的盐和/或衍生物的组合物。
所述个体可能已经或者被确定为，例如，β-细胞质量、数量或功能下降，具有β-细胞质量、数量或功能下降的症状，具有β-细胞质量、数量或功能损失继发的疾病或紊乱，或者β-细胞质量、数量或功能下降的倾向，目的在于治愈、减轻、缓解、补救或改善β-细胞质量、数量或功能下降，β-细胞质量、数量或功能下降的症状，具有β-细胞质量、数量或功能下降继发的疾病或紊乱，或者β-细胞质量、数量或功能下降倾向。
“有效量”是指给被治疗的个体赋予治疗的或其他期望作用的preptin，preptin类似物preptin激动剂的含量，例如对β-细胞质量、数量或功能产生作用。治疗的或其他的期望作用可以是客观的(即可以通过一些检测或标记测定)或是主观的(即个体产生一种迹象或者感觉到作用)。上述preptin类似物preptin激动剂或者它们的任何一种的盐或衍生物的有效量，范围在从约10-约40μg/Kg体重到约200-约500μg/Kg体重到约600-约1000μg/Kg体重。根据施用路线以及与其他试剂共同施用的可能性，有效剂量是变化的，其他试剂例如那些可用于，仅作为例子，刺激β-细胞增殖或提高β-细胞质量的那些试剂，通过例如使用化合物如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、生长激素(GH)、葡萄糖依赖的促胰岛多肽(GIP)、肝细胞生长因子(HGF)、PTH相关蛋白(PTHrP)、β-动物纤维素、胎盘催乳素(PL)和胰岛再生相关蛋白(INGAP)。
两条氨基酸序列的“百分同一性”可以使用Karlin和Altschul(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268的算法来确定，该算法在Karlin和Altschul(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中被改进。这种算法被结合到Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序中(2.0版本)。可以用XBLAST程序，分值＝50，字长(wordlength)＝3来进行BLAST蛋白质检索，以获得与在此描述的肽分子同源的氨基酸序列。当两条序列之间存在缺口时，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中所描述采用缺口BLAST。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以采用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有化学相似或衍生化的侧链的另一个残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域被定义。这些家族包括，例如，具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、死氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。本发明还包括氨基酸类似物(例如，磷酸化的氨基酸)，以及用非天然的氨基酸取代的肽，包括但是不限于D-氨基酸、β-氨基酸和？氨基酸。
如在此所用“被分离的”是指，在为天然物质的情况下，该物质被或已经从其天然或原始环境中取出，或者不再与该环境发生联系。例如，存在于活动物中的天然的蛋白质或者多肽未被分离，但是从天然系统中的一些或所有共同存在的物质中分开的相同核酸或多肽是被分离的。这种蛋白质或者多肽可以是组合物的一部分，在该组合物中还可以被分离的不是该蛋白质或多肽的天然环境中的一部分。在为天然物质的情况下，例如本发明的重组制备的蛋白质或多肽，术语“被分离的”包括实质上或者基本上不含在加工过程中通常伴随的组分的物质，例如，蛋白质和多肽被纯化到期望程度，优选，例如使得它们用本领域知晓的技术测定为至少约80％纯度，更加优选至少约90％，和更加优选至少约95％。
术语“实质上被纯化的”是指至少约60％不含、优选至少约75％不含，和最优选至少约90％或更高不含天然的或者在加工过程中与之结合的其他组分的肽。
如在此所用“纯化的”不要求绝对纯度；相反，是作为相对术语，其中目标蛋白或者其他底物比其在天然环境下、在细胞中或其他环境下更纯，例如加工环境下。实际上，该物质通常，例如被分馏来去除各种其他组分，而且得到的物质实质上保留其期望的生物学活性。
术语“糖尿病”是指包括β-细胞或β-细胞功能损失的任何疾病或综合症，并且包括在此描述的疾病或症状的任何之一。
β-细胞介导的疾病是任何其中在疾病病理学中完全或在任何部分中涉及β-细胞的疾病。β-细胞介导的疾病包括，例如，1型或2型糖尿病。
如在此所用，“preptin”、“preptin类似物”和“preptin激动剂”被定义为包括药学上可接受的盐或衍生物，并且不排除合适的preptin，preptin类似物或preptin激动剂的混合物。
药学上可接受的盐包括那些来源于药学上可接受的无机和有机酸和碱的盐。合适的酸性盐的例子包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯基硫酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑胺酸盐、樟脑硫酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷硫酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷硫酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷硫酸盐、2-萘硫酸盐、烟酸盐(nicotinate)、硝酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、persulfate、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、枯味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酰酸盐和十一烷酸盐。其他酸，例如草酸，虽然其本身不是药学上可接受的，但是可以用在可作为获得本发明的组合物及其药学上可接受的加酸盐的中间体的盐的制备中。来源于适当的碱的盐包括碱金属(例如钠)、碱土金属(例如镁)、铵和N-(烷基)4+盐、本发明还包括在此公开的化合物的碱性含氮基团的季铵化。可以通过这种季铵化作用来获得可溶于水或油的或者分散的产物。盐酸盐和乙酸盐是优选的。
本发明的保护范围内还包括含有有效量的preptin，preptin类似物或preptin激动剂或它们中任何一种的盐和/或衍生物的一种或多种，以及药学上可接受的载体的药物组合物。
术语“药学上可接受的载体”是指与有效量的preptin，preptin类似物或preptin激动剂，或者它们的任何一种的盐和/或衍生物的一种或多种一起被施用给个体的载体(佐剂或媒介物)，并且当以足够释放所述preptin，preptin类似物和/或preptin激动剂的剂量被施用时，不会破坏它们的药学活性，而且是无毒的。
可被用于上述药物组合物中的药学上可接受的载体包括，但是不限于，离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物释放系统(SEDDS)，例如d-α-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸盐，以药剂形式使用的表面活性剂，例如Tweens或者其他类似聚合体释放基质，血清蛋白，例如人血清白蛋白，缓冲物质，例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸、水、盐或电介质的部分甘油酯混合物，例如硫酸钾，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钠，锌盐，硅胶，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羟甲基纤维素钠，聚丙烯酸盐，石蜡，聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。环式糊精例如α-、β--和γ-环式糊精，或者化学修饰的衍生物，例如羟基烷基环式糊精，包括2-和3-羟基丙基-β--环式糊精，或者其他被溶解的衍生物也可以被有利地使用来增强在此描述的公式的化合物的释放。油脂溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或者羟甲基纤维素或类似的分散剂，其通常以药学上可接受的制剂形式的配方被使用，例如乳化剂和/或悬浮剂。
为了实施治疗损伤包括内部和外部创伤的方法，或者用于治疗β-细胞损失或功能损失的方法，或者用于提高或维持β-细胞质、数量或功能的方法，一种或多种preptins、preptin类似物和/preptin激动剂或者它们的任何一种的盐或衍生物可以被施用给个体。Preptin，preptin类似物preptin激动剂，盐或衍生物，可以例如在药学上可接受的载体例如生理盐水中，结合其他药物和/或与适当的赋形剂一起被施用。其可以例如通过注射(例如静脉内、动脉内、皮内、腹膜内、肌肉内或者皮下)、口服、口腔、鼻内、经粘膜、体表、作为眼科制药、通过吸入、通过颅内注射或者灌注技术来施用。本文的方法包括施用有效量的化合物或者化合物的组合物来达到期望或特定的效果。低于或高于上述那些剂量的剂量是期望或必需的。在本领域，一般认为，用于任何特定个体的特定剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄频率、药物组合、疾病的严重性和进展、症状或综合症、个体对疾病、症状或综合症的倾向等，以及主治医生的判断。
被口服施用的药物组合物可以是任何口服可接受的剂量形式，包括，但是不限于，胶囊、片剂、乳剂和液体悬浮液、分散剂和溶液。在为用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当口服施用水溶液悬浮剂和/或乳剂时，活性成分被悬浮或溶解在油相中，与乳化剂和/或悬浮剂组合。如果需要，可以加入某些甜味剂和/或甜味剂和/或着色剂。
胃肠外施用的药物组合物可以是任何可接受的剂量形式，例如可以通过如下施用路径之一被施用，不限于皮下、动脉内、肌肉内、皮内、intrastemal注射或者灌注技术。例如，可注射的无菌组合物(例如水溶液的或油质的悬浮液或者其他制剂)可以按照本领域己知的技术来配制，使用合适的分散剂或湿润剂(例如Tween 80)和悬浮剂。
当预期的治疗涉及容易通过局部应用来达到的区域或器官时，药物组合物的局部施用是有用的。对于局部应用于皮肤，药物组合物应当与合适的含有悬浮或者溶解在载体中的活性组分的药膏一起配制。用于局部施用本发明的化合物的载体包括，但是不限于，矿物油、液体石油(liquid petroleum)、白石油(white petroleum)、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化腊和水。可选择地，药物组合物可以与合适的含有用合适的乳化剂悬浮或溶解在载体中的活性化合物的洗剂或面霜一起配制。合适的载体包括，但是不限于，矿物油、山梨聚糖单硬脂酸盐、聚山梨醇酯60、十六烷基酯腊、十六碳烯醇(cetearylalcohol)、2-辛基十二烷醇、苯甲基醇和水。本发明的药物组合物还可以通过直肠栓剂或者以合适的灌肠剂被局部应用于肠道后端。本发明还包括局部经皮应用的或者其他的膜片(patch)。
药物组合物可以通过鼻内气雾剂或吸入剂被施用。这种组合物按照药物配制领域熟知方法来制备，可以制备成溶解在生理盐水中的溶液，使用苯甲醇或其他合适防腐剂、增强生物利用度的稀释促进剂、碳氟化合物和/或其他本领域已知的溶解剂或分散剂。
制备面霜可以采用，例如，(1)油质性基底，例如由不挥发性油或者烃组成的基底，例如白石油或矿物油，或者(2)可吸收基底，例如由无水物质或吸水物质组成的基底，包括例如无水羊毛脂。通常，在基底形成后，无论是油质的或可吸收的，活性成分如一种或多种preptins、preptin类似物和/或preptin激动剂以产生期望浓度的含量被添加。
霜剂可以是，例如，油/水乳剂。可以包含，例如油相(分散相)，通常例如不挥发性油、烃等，例如石蜡、石油冻、矿物油等，和包含水和任何水溶性物质的水相(连续相)，例如加入的盐。这两种相可以使用乳化剂来稳定，例如表面活性剂，如十二烷醇硫酸钠；吸水性胶体，例如阿拉伯树胶胶质粘土、veegum等。在乳剂形成后，活性成分(一种或多种preptins、preptin类似物和/或preptin激动剂)通常以产生期望浓度的含量被添加。
凝胶可包含选自如在此描述的油质基底、水或乳化-悬浮基底的基底。凝胶化剂被加入基底中，在基底中形成基质，增加其粘性。凝胶化剂的例子包括，例如，羟基丙基纤维素、丙烯酸聚合物等。通常，活性成分(一种或多种preptins、preptin类似物和/preptin激动剂)在某一时间点以产生期望浓度的含量被添加，例如在加入凝胶化剂之前。
本发明将在如下实施例中被进一步描述。应当理解，这些实施例仅用于说明目的，不被解释为以任何方式限制本发明。
实施例1刺激NIH-3T3细胞增殖NIH-3T3细胞被用于各种目的，包括关于促有丝分裂的研究。参见，例如Buergisser等(1990).BiochemBiophys Res Comm 169(3)832-839；Burgisser等(1991).J Biol Chem 266(2)1029-33；Yang等(1996).Endocrinol 137(7)2766-2773；Geddes等(2001).ProtEngin 14(1)61-65。NIH-3T3细胞以3×104细胞/孔的密度被植入24孔平板。在37℃下，细胞在高浓度葡萄糖的DMEM(添加30mM碳酸氢钠、2mM L-谷氨酸、105IU/l青霉素、0.01％链霉素硫酸盐)和10％胎牛血清中生长24h，随后在高浓度DMEM和0.2％BSA中血清饥饿24h。往孔中加入preptin，达到10、50、100和500nM preptin/孔的最终浓度，在往各个孔中加入1μCi3H-胸苷之前，再培养细胞15h。在培养1h后，吸掉培养液，细胞用冰冷PBS洗涤两次，用5％TCA洗涤两次和用100％乙醇洗涤两次。然后在用200μl的0.2M NaOH溶解细胞之前，空气干燥平板30min。然后用200μl 0.2M HCl中和这种碱性细胞溶解液，接着将300μl等分试样与2ml Starscint闪烁液混合，在闪烁计数器上进行计数。
一种测定细胞增殖的方法是通过将被标记的核苷酸(例如[3H]-胸苷)结合到在细胞分化过程中新合成的DNA上。例如，最熟悉和被广泛使用的用于量化细胞增殖的方法之一是测定含氚胸苷([3H]-胸苷)的结合。细胞将被标记的DNA前体结合到新合成的DNA上，使得由液体闪烁计数测定的结合量是细胞增殖的相对测定值。类似地，在该实施例中，闪烁计数器中的每分钟的数量(cpm)增加表示3H-胸苷摄取的增加，因而细胞增殖增加。细胞增殖结果被显示在附图1中。
实施例2刺激INS-1E β--细胞增殖INS-LE细胞以2×105细胞/孔的密度被植入24孔平板。在37℃下，细胞在改进的RPMI-1640(GIBCO R-1383 Lot108H83032；添加了23.8mM碳酸氢钠、2mM L-谷氨酸、10mM HEPES、50μM β--巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、105IU/l青霉素、0.01％链霉素硫酸盐)和10％胎牛血清中生长24h，随后在改进的RPMI-1640中血清饥饿24h。然后将无血清培养液替换为500μl含有如下物质的RPMI-16400％胎牛血清(阴性对照)，10％胎牛血清(阳性对照)，10nM大鼠preptin(rPreptin 10nM)，10nM人GLP-1(hGLP-1 10nM)，10nM人IGF-II(hIGF-II 10nM)，在各个孔中加入5μCi3H-胸苷之前，再培养细胞18h。在培养细胞6h后，吸掉培养液，细胞用冰冷PBS洗涤两次，用5％TCA洗涤两次和用冰冷的100％乙醇洗涤两次。然后在用400μl的0.5M NaOH溶解细胞之前，空气干燥平板30min。然后用400μl 0.5MHCl中和这种碱性细胞溶解液，接着将500μl等分试样与2mlStarscint闪烁液混合，在闪烁计数器上进行计数。闪烁计数器中的每分钟的数量(cpm)的增加表示3H-胸苷摄取的增加，因而细胞增殖增加。细胞增殖结果被显示在附图2中。
在此参考或提及的所有专利、出版物、科技文献、网站、以及其他文件和材料指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且每份这些被参考的文件和材料在此引入作为参考，如同分别地以其全部被引入作为参考或者在此以其全部被列举。申请人保留将来自任何这些专利、出版物、科技文献、网站、电子信息和其他被参考的材料或文件的材料和信息机械结合到本说明书的权力。
所撰写的本专利的描述部分包括所有权利要求。此外，所有权利要求，包括所有原始权利要求以及所有来自任何和全部优先权文件的权利要求在此都全部被引入所撰写的说明书的描述部分作为参考，申请人保留将任何和所有这些权利要求机械结合到所撰写的本申请的描述或任何其他部分中的权力。因此，例如，在任何情况下，本专利都不被解释为根据其描述没有给权利要求提供书面说明，断言权利要求的准确措词没有明确地(in haec verba)在本专利的书面描述部分中被阐明。
权利要求将按照法律来解释。但是，无论声称或认识到解释任何权利要求或其部分的难易，在任何情况下，在本申请的审查过程中，导致该专利被解释为已经丧失其任何和所有等同物的任何权利的对权利要求或其任何部分的任何调整或修改，不构成现有技术的一部分。
本说明书所公开的所用特征可以以任何组合被结合。因此，除非另外明确地指出，每一个公开的特征仅仅是一类等价的或类似的特征的一个例子。
应当理解，虽然本发明与其详细说明一起被描述，前面的说明是用于阐明，而不是限制本发明的保护范围，保护范围由附随的权利要求书来定义。因此，从前述内容可以预期，虽然本发明的特定实施方案在此被描述用于阐明目的，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，可以进行各种改进。其他方面、优点和改进属于如下权利要求的范围内，除非被附随的权利要求限定，本发明是不被限制的。
在此描述的特定方法和组合物是优选实施方案的代表，是示例性的，不被理解为对本发明的保护范围的限制。在考虑本说明书的情况下，其他目标、方面和实施方案对本领域技术人员来说是可行的，包含在由权利要求的保护范围定义的本发明的精神内。对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的保护范围和精神的前题下，对在此公开的发明变化替代和改进是显然的。在此被说明性地描述的本发明在缺乏任何在此未作为重要部分被特别地公开的元件或限制时可以被实施。因此，例如，在本文的各种情况下，在本发明的实施方案或实施例中，术语“包含”、“包括”、“含有”等被开放式地解释，不被限制。在此被说明性地描述的方法和处理合适地以不同步骤顺序被实施，不必被限制于在此或在权利要求中指出的步骤顺序。
所用的术语和表述被用作说明的术语，不是限制，目的不在于使用这些术语和表述来排除被显示和描述的特征或其部分的任何等价物，但是，一般认为，各种改进可能在要求保护的本发明的保护范围之内。因此，应当理解，虽然本发明通过各种实施方案和/或优选实施方案和可选择的特征被特别地公开，本领域技术人员可能进行的对在此公开的内容的任何以及所有改进和变化，属于由附随的权利要求定义的本发明的保护范围内。
在此宽泛和一般性地描述了本发明。落入一般公开的较窄的种类和亚组的每一个也构成本发明的部分。包括用限制性或否定性限制从类别中排除任何主题的本发明的类别描述，无论被排除的物质是否在此被特别地引用。
还应当理解，术语“包含”还指术语“包括”。还应当理解，如在此和在附随权利要求中所用的，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数形式，除非上下文中另外清楚地指出，术语“X和/或Y”是指“X”或“Y”或者“X”和“Y”，名词后的字母“s”表示该名词的复数和单数形式。此外，当本发明的特征或方面以马库氏群体被描述时，本领域技术人员将会认识到本发明还以马库式群体中的任何单个成员或成员亚组被描述。
其他实施方案在如下权利要求内。在任何情况下，该专利都不被解释为限定于在此特别地和/或清楚地公开的特定实施例或实施方案或者方法。在任何情况下，该专利都不被解释为受审查员或者其他官员或专利商标局的职员作出的陈述限定，除非该陈述被申请人以相应的书面形式特别地和毫无限制或保留地清楚的接受。
权利要求
1.用于治疗特征在于或涉及，或在任何测定中通过改善个体中降低的β-细胞质量和/或减少的β-细胞数量来缓解症状的方法，包括给所述个体施用有效量一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述preptin选自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro ArgTyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln SerThr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin，包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro ArgTyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln SerAla Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro ArgTyr ProVal Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln SerAla Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preptin。
3.根据权利要求1所述的方法，其中preptin激动剂包含SEQ ID NO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的片段包含SEQ ID NO1，2或3的残基17-34。
5.根据权利要求1所述的方法，其中preptin激动剂包含与SEQ IDNO1，2或3至少约60％相同的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中preptin激动剂包含与SEQ IDNO1，2或3至少约80％相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的方法，其中preptin激动剂包含与SEQ IDNO1，2或3至少约90％相同的氨基酸序列。
8.根据权利要求5所述的方法，其中preptin激动剂包含与SEQ IDNO1，2或3至少约95％相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中preptin激动剂包含具有多达约14个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
10.根据权利要求9所述的方法，其中preptin激动剂包含具有多达约10-13个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
11.根据权利要求9所述的方法，其中preptin激动剂包含具有多达约6-9个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
12.根据权利要求9所述的方法，其中preptin激动剂包含具有多达约2-5个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
13.用于增加或维持β-细胞质量和/或β-细胞数量所述的方法，包括给需要此的个体施用有效量一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述preptin选自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys GlnSer Thr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin，包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preptin。
15.根据权利要求13所述的方法，其中preptin激动剂包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的片段包含SEQ IDNO1，2或3的残基17-34。
17.根据权利要求13所述的方法，其中preptin激动剂包含一条肽，该肽选自(1)与SEQ ID NO1，2或3至少约60％相同的氨基酸序列，(2)与SEQ ID NO1，2或3至少约80％相同的氨基酸序列，(3)与SEQ ID NO1，2或3至少约90％相同的氨基酸序列，(4)与SEQ ID NO1，2或3至少约95％相同的氨基酸序列。
18.根据权利要求13所述的方法，其中preptin激动剂选自一条肽，该肽包含(1)具有多达约14个保守性或其他氨酸取代的SEQ IDNO1，2或3，(2)具有多达约10-13个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(3)具有多达约6-9个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(4)具有多达约2-5个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
19.一种用于刺激β-细胞增殖的生长和/或β-细胞质量增加所述的方法，包括给需要此的个体施用有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述preptin选自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys GlnSer Thr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin，包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preptin。
21.根据权利要求19所述的方法，其中preptin激动剂包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的片段包含SEQ IDNO1，2或3的残基17-34。
23.根据权利要求19所述的方法，其中preptin激动剂包含一条肽，该肽选自(1)与SEQ ID NO1，2或3至少约60％相同的氨基酸序列，(2)与SEQ ID NO1，2或3至少约80％相同的氨基酸序列，(3)与SEQ ID NO1，2或3至少约90％相同的氨基酸序列，(4)与SEQ ID NO1，2或3至少约95％相同的氨基酸序列。
24.根据权利要求19所述的方法，其中preptin激动剂选自一条肽，该肽包含(1)具有多达约14个保守性或其他氨酸取代的SEQ IDNOI，2或3，(2)具有多达约10-13个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(3)具有多达约6-9个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(4)具有多达约2-5个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
25.在个体中治疗完全或部分地由β-细胞或β-细胞功能障碍介导的调节性疾病、紊乱或症状所述的方法，包括给个体施用有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述preptin选自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys GlnSer Thr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin、包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preptin。
27.根据权利要求25所述的方法，其中preptin激动剂包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述的疾病是1型糖尿病或2型糖尿病。
29.一种提高个体中的胰岛素分泌所述的方法，包括给个体施用有效量的preptin，preptin类似物和/preptin激动剂
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述preptin选自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys GlnSer Thr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin，包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preption。
31.根据权利要求29所述的方法，其中preptin激动剂包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
32.一种加工产品，包括以足以治疗或改善疾病、症状或紊乱或其更多一种综合症的含量含有一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物的容器；和用于使用容器中的内容物来治疗或改善涉及损伤、创伤、β-细胞质量降低、β-细胞数量减少、β-细胞功能下降的疾病、症状或紊乱，或其更多一种综合症的说明书，包括给药给个体。
33.一种加工产品，包括包装材料；和在包装材料中，以足以治疗或改善疾病、症状或紊乱或其更多一种综合症的含量，含有的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物；其中所述的包装材料描述或指示使用一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物治疗个体内的完全或部分地由β-细胞损失或β-细胞功能下降介导的损伤、创伤或症状。
34.一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物在制备用于治疗具有如下的任何一种或多种的个体的药剂中的用途i)内部损伤；ii)外部损伤；iii)内部创伤；iv)外部创伤；v)完全或部分以β-细胞质量降低为特征的症状，vi)完全或部分以β-细胞数量降低为特征的症状，vii)提高或维持β-细胞质量；viii)升高或维持β-细胞数量，ix)通过细胞分化或再生刺激β-细胞增殖，x)通过细胞分化或再生提高β-细胞质量，xi)β-细胞介导的疾病；xii)完全或部分以不期望的低胰岛素分泌为特征的症状；和xiii)完全或部分以胰岛素抗性为特征的症状；xiv)完全或部分以高血糖症为特征的症状；和，xv)完全或部分以餐后高血糖症为特征的症状。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述preptin是人的、大鼠的或小鼠的preptin。
36.根据权利要求34所述的用途，其中preptin激动剂包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述的片段包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸残基17-34。
38.根据权利要求34所述的用途，其中preptin激动剂包含一条肽，该肽选自(1)与SEQ ID NO1，2或3至少约60％相同的氨基酸序列，(2)与SEQ ID NO1，2或3至少约80％相同的氨基酸序列，(3)与SEQ ID NO1，2或3至少约90％相同的氨基酸序列，(4)与SEQ ID NO1，2或3至少约95％相同的氨基酸序列。
39.根据权利要求34所述的用途，其中preptin激动剂选自一条肽，该肽包含(1)具有多达约14个保守性或其他氨酸取代的SEQ IDNO1，2或3，(2)具有多达约10-13个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(3)具有多达约6-9个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(4)具有多达约2-5个保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
40.根据权利要求34所述的用途，其中β-细介导的疾病是1型糖尿病或2型糖尿病。
41.可用于或适合用于根据权利要求1-40的任何一项的方法的剂量单位，包含一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物，与药学上可接受的封装或基质、药学上可接受的载体、药学上可接受的合适辅助激活剂(co-active)、药学上可接受的缓冲液、药学上可接受的盐、药学上可接受的张力剂和/或药学上可接受的稀释剂的任何一种或多种配制来被施用或自体施用。
42.根据权利要求41的剂量单位，其中所述一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物的含量范围为10-40μg/Kg个体体重到约200-500μg/Kg个体体重到约600-1000μg/Kg个体体重。
43.一种用于治疗个体内或上的损伤或创伤所述的方法，其包括将包含有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐以及其衍生物的化合物的组合物应用于所述损伤或创伤。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述个体是人。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述个体不是人。
46.根据权利要求43、44或45的任何一项所述的方法，其中所述创伤是皮肤或其他外部表面被撕裂、被刺穿、被切割或另外的破坏的一种。
47.根据权利要求43、44或45的任何一项所述的方法，其中所述创伤是其中肌肉被穿破而下面的骨骼或重要器官实质上未受损的创伤。
48.根据权利要求43、44或45的任何一项所述的方法，其中所述创伤是皮肤表面损伤。
49.根据权利要求43、44或45的任何一项所述的方法，其中所述创伤是内出血。
50.根据权利要求43、44或45的任何一项所述的方法，其中所述组合物是药膏、面霜或凝胶。
51.根据权利要求43、44或45的任何一项所述的方法，其中所述创伤选自化学烧伤、热烧伤、皮肤移植物供体部位、皮肤移植物移植部位、皮肤溃疡、手术创伤、创伤性开裂、角膜损伤、角膜移植部位、拔牙部位、口腔手术部位、粘膜破坏、皮肤破坏和或结缔组织破坏。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述皮肤溃疡选自褥疮溃疡、糖尿病溃疡、血管阻塞溃疡和脂性渐进性坏死性溃疡。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述粘膜破坏选自胃肠道内的粘膜破坏和膀胱内的粘膜破坏。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述胃肠道内的粘膜破坏包括溃疡性大肠炎。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述胃肠道内的粘膜破坏包括Crohn病。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述皮肤破坏包括擦伤。
57.根据权利要求51所述的方法，其中所述结缔组织的破坏包括擦伤。
58.一种用于增加创伤愈合所述的方法，其包括将有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐，或其衍生物的化合物局部应用于该创伤上。
59.一种通过应用或施用促进间充质细胞来源的细胞增殖和/或细胞量的化合物在个体内治疗症状所述的方法，其改进包括给该个体施用有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐，或其衍生物的化合物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中间充质细胞包含成纤维细胞。
61.施用包含有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂、其盐和其衍生物的化合物的组合物，来治疗和/或预防外周神经系统损伤，减少运动神经元死亡、增加肌肉终板、促进受损的坐骨神经的功能恢复、防止化学治疗中出现的外周运动麻痹，治疗和/或预防Alzheimer病，治疗和/或预防中风，治疗和/或预防肌萎缩性(脊髓)侧索硬化，治疗和/或预防帕金森病，治疗和/或预防肌肉萎缩症，治疗和/或预防糖尿病神经病，改善心肌功能，治疗和/或预防心肌病变(myocardiopathies)，包括心肌炎和心肌梗塞，治疗和/或预防心脏病和急性发作(acute attack)，以及治疗和/或预防由缺血引起的急性肾功能不全。
62.一种用于在个体内通过应用或施用促进生长的化合物来促进组织生长的方法，其包括给所述个体应用于或施用有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，或其盐，或其衍生物的化合物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中组织选自结缔组织和上皮组织。
64.用于通过应用或施用化合物来提高免疫功能来在个体内改善免疫功能所述的方法，其包括给所述个体应用或施用有效量的一种或多种选自preptin，preptin类似物，preptin激动剂，其盐，或其衍生物的化合物。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述免疫功能的提高包括淋巴细胞增殖的提高。
全文摘要
本发明的特征在于用于治疗个体包括人和非人类动物中的各种疾病、紊乱和/或症状的方法，包括损伤和创伤，以及疾病、紊乱和/或症状，例如完全地或部分地涉及或特征在于细胞质量降低、细胞数量减少和/或细胞功能下降。该方法包括给个体施用有效量的一种或多种化合物，包括preptin，preptin类似物、preptin激动剂、其盐以及其衍生物。
文档编号A61P5/50GK1684705SQ03823520
公开日2005年10月19日 申请日期2003年8月1日 优先权日2002年8月1日
发明者G·J·S·库珀, C·M·比沙南, G·C·詹姆斯 申请人:普罗特米克斯公司