专利名称：具有抗肿瘤活性的新型嘧啶磺酰胺类化合物及其盐类的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的新型嘧啶磺酰胺类化合物及其盐类。
背景技术：
癌症是当前危害人类健康和正常生活的最主要的疾病之一，抗癌药物的研究开发一直是科学家选择的热点课题。由于癌症发生机制的复杂性和特殊性，寻找高选择性、高效及低毒副作用的抗癌药物并非易事。
在实体瘤的恶性生长和转移中，肿瘤组织中的新生血管起着重要作用，它为肿瘤的生长提供了必需的营养和氧气。血管生成抑制剂能抑制血管内皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的活性，从而抑制肿瘤新生血管的生长，使肿瘤细胞得不到养分而死亡。血管生成抑制剂特异性地作用于肿瘤赖以生存的血管，而非直接针对肿瘤细胞，因而抗肿瘤的选择性高、疗效好，毒性低。它不是细胞毒药物，不会引起骨髓抑制、胃肠道反应及脱发等副作用。
嘧啶胺类化合物能抑制某些生长因子，如血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生因子(EGF)受体蛋白酪氨酸激酶(PTK)，从而抑制某些细胞类型(如肿瘤细胞、血管内皮细胞和表皮细胞等)的异常生长。
已有嘧啶胺类化合物用于肿瘤治疗的报道如诺华制药公司的美国专利US5521184(申请日1993年4月2日，授权日1996年5月28日；在中国已于1999年6月2日授予专利权)。该专利的嘧啶胺类化合物格列卫[Gleevec(imatinib mesylate，STI-571)]的结构式为 化学名为4[4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯甲酰胺甲烷磺酸盐。这类化合物抑制癌细胞赖以生长的酶(受体蛋白酪氨酸激酶)而发挥抗肿瘤作用。
美国食品和药品管理局(FDA)2001年5月10日批准用于肿瘤治疗。然而嘧啶胺类化合物水溶性较差，而且其胺基易氧化，有吸湿性，不易结晶，从而对在体内的崩解和溶出造成一定的影响。降低了生物利用度。
发明内容
本发明提供一类具有抗肿瘤活性、生物利用度高的新型嘧啶磺酰胺类化合物及其盐类。针对嘧啶胺类化合物不易结晶，水溶性差而影响其生物利用度的缺陷，根据磺酰官能团具有抗菌和降血糖等广泛生物活性的特点，本发明在嘧啶氨基上引入磺酰基团，制备成嘧啶磺酰胺类化合物。活性实验表明，本发明化合物由于磺酰基的引入，不仅解决了化合物结晶和水溶性的问题，而且使化合物更稳定。从而提高生物利用度。
本发明化合物由嘧啶胺类化合物经磺酰化反应所得，分子结构式通式(I)如下 其中，L表示氮杂环烷基。
所说的氮杂环烷基，为下列三类六元杂环(1)六元杂环为取代哌嗪，结构式如通式(II) R1为1～5个碳原子的直链或支链烷基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基，优选甲基、乙基，特别优选乙基。
(2)六元杂环为2位或3位取代哌啶，结构式为 或 R2或R3为1～4个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，优选甲基、乙基，特别优选甲基。
(3)六元杂环为吗啉基，结构式如下 本发明还包括上述化合物药学上可接受的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、甲烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。本发明化合物的制备方法是将嘧啶胺类化合物和取代芳基磺酰氯反应形成嘧啶磺酰胺类化合物，通常用无机碱(氢氧化钠或氢氧化钾)或有机碱(三乙胺)催化，可以方便制备嘧啶磺酰胺化合物。反应流程如下
上述化合物嘧啶胺(VI)按欧洲专利EP0233461的方法制备，对-溴甲基苯磺酰氯(VII)由市售的对甲苯磺酰氯(上海市试剂公司)和溴代丁二酰亚胺(NBS)反应而得。
具体步骤如下1.制备中间体化合物VIII将4-溴甲基苯磺酰氯(VII)溶于适量CH2Cl2中，搅拌下滴加含嘧啶胺(VI)和催化剂三乙胺(或NaOH或KOH)的CH2Cl2溶液，加热回流12小时反应完毕，冷却至室温，有黄色固体析出，减压蒸去溶剂，残留物用甲醇溶解，拌硅胶，经石油醚-乙醚(5∶1)硅胶柱层析得产物，用乙醇重结晶得化合物VIII4-溴甲基-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺。
2.制备目标化合物-嘧啶磺酰胺类化合物将中间体(VIII)和带有相应L基团的氮杂环烷烃进行氮的烷基化反应即得目标化合物，所说的氮杂环烷基，为如前所述的三类取代六元杂环。
具体操作如下将中间体(VIII)溶于适量绝对无水乙醇溶液中后，滴加到含有相应氮杂环烷烃的绝对无水乙醇溶液中，加热回流，用薄层层析(TLC)来跟踪、判断反应终点，约20小时反应完全。反应液减压浓缩并回收溶剂，残留物用甲醇溶解拌硅胶，石油醚-乙酸乙酯(5∶1)柱层析得粗品，乙醇重结晶得带有相应L基团氮杂环烷基的嘧啶磺酰胺类化合物。
本发明化合物可制备成药学上可接受的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、甲烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。制备方法为将上述嘧啶磺酰胺类化合物与相应的酸回流反应，经分步浓缩结晶而得。
本发明用ELISA法测定了本发明化合物抑制血小板衍生生长因子受体-β蛋白酪氨酸激酶的活性。结果显示，本发明嘧啶磺酰胺类化合物具有显著的抑制血小板衍生生长因子受体蛋白酪氨酸激酶活性的作用，从而显示其具有抗肿瘤活性。
本发明具有下列有益的结果1.本发明化合物具有很好的结晶，便于在制备过程中分离纯化，便于产品的质量控制。
2.由于引入磺酰基团，增加了产品的水溶性，并提高了在体内的生物利用度，使其给药途径多样，既可制成口服剂型，又可制成注射剂型。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明作进一步详细阐述，但不对本发明作限制。
在具体的实施例中，嘧啶胺母环的化学名为4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基苯胺(简称RNH2)，化学结构如下
实施例1.制备原料化合物4-溴甲基苯磺酰氯(VII)对甲基苯磺酰氯19.1g(0.1mol)溶于四氯化碳(CCl4)，加热，当反应液开始回流时，分批加入溴代丁二酰亚胺(NBS，上海市化学试剂公司)18.69g(0.105mol)和催化量自由基引发剂2，2′-二偶氮异丁腈(AIBN，上海市化学试剂公司)2g。加料完毕，反应回流加剧，液体呈红色，有红色气体产生，待无气体生成再回流1小时，停止加热。冷却至室温，过滤。滤液减压蒸去大部分溶剂后，加入100ml石油醚，搅拌，析出淡黄色固体，过滤，真空干燥，得24g化合物VII，熔点53-55℃。
实施例2.制备中间体化合物4-溴甲基-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺(VIII)将上述4-溴甲基苯磺酰氯(VII)13.5g(0.05mol)溶于100mlCH2Cl2中。搅拌下滴加含4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基苯胺(VII)6.1g(0.025mol)和三乙胺(5ml)的50ml CH2Cl2溶液。滴加完毕，加热回流12小时。反应完毕，冷却至室温，有黄色固体析出，减压蒸去溶剂，残留物用甲醇溶解拌硅胶，经石油醚-乙醚(5∶1)硅胶柱层析，洗脱物乙醇重结晶得中间体4-溴甲基-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺(VIII)15g，熔点158-160℃。
实施例3.制备本发明化合物之一4-[4-甲基-1-哌嗪基]甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺(化合物代号100504，L基为N-甲基哌嗪基)将实施例2制备的中间体化合物(VIII)0.51g(0.001mol)溶于15ml绝对无水乙醇后，滴加到含有氮甲基哌嗪0.4g(0.004mol，上海市试剂公司)的45ml绝对无水乙醇溶液中，加热回流，用薄层层析(TLC)来跟踪、判断反应终点，约20小时反应完全。浓缩反应液，残留物用甲醇溶解拌硅胶，石油醚-乙酸乙酯(5∶1)柱层析得粗品，乙醇重结晶得产品0.45g，熔点162-164℃。MS(质谱分子峰)529，HRMS(高分辨质谱)HNMR 529.2256(理论值529.66897)实施例4.制备本发明化合物之二4-[4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺(化合物代号100515，L基为N-乙基哌嗪基)方法同实施例3，但用N-乙基哌嗪代替N-甲基哌嗪，得产品0.47g，熔点138-140℃。MS543，HRMS543.4581(理论值543.69641)实施例5.制备本发明化合物之三4-[4-甲基-1-哌啶基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺(化合物代号100605，L基为4-甲基哌啶基)将中间体化合物(VIII)0.51g(0.001mol)溶于15ml绝对无水乙醇溶液中后，滴加到含4-甲基哌啶0.4g(0.004mol，上海市试剂公司)的45ml绝对无水乙醇溶液中，加热回流18小时(TLC跟踪)。反应完毕，用石油醚-乙酸乙酯(5∶1)柱层析得洗脱物浓缩，乙醇重结晶得产品0.42g，熔点182-184℃。MS528，HRMS528.4756(理论值528.68174)。
实施例6.制备本发明化合物之四4-(N-吗啉基甲基)-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺(化合物代号100609，L基为吗啉基)将中间体化合物(VIII)0.51g(0.001mol)溶于15ml绝对无水乙醇后，滴加到含吗啉0.348g(0.004mol，上海市试剂公司)的45ml绝对无水乙醇溶液中，加热回流22小时(TLC跟踪)。反应完毕，浓缩得残留物，甲醇溶解残留物拌硅胶，经石油醚-乙酸乙酯(5∶1)柱层析得产品0.40g，熔点175-177℃。MS516，HRMS516.7532(理论值516.62696)。
实施例7.制备本发明化合物之五4-(N-哌啶基甲基)-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺(化合物代号100610，L基为哌啶基)将中间体化合物(VIII)0.51g(0.001mol)溶于15ml绝对无水乙醇溶液中后，滴加到含哌啶0.34g(0.004mol，上海市试剂公司)的45ml绝对无水乙醇溶液中，加热回流20小时(FLC跟踪)。反应完毕，用石油醚-乙醚(3∶1)硅胶柱层析浓缩并用乙醇重结晶，得产品0.38g，熔点180-182℃。MS514，HRMS514.3351(理论值514.665465)。
实施例8.制备本发明化合物之六4-[3-甲基-1-哌啶基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺(化合物代号100610，L基为3-甲基哌啶基)方法同实施例5，但用3-甲基哌啶代替4-甲基哌啶，得产品0.42g，熔点180-182℃。MS528，HRMS514.3875(理论值528.68174)。
本发明其它化合物的制备方法与上述实施例类同。
实施例9.制备本发明化合物之盐实施例5发明化合物的甲烷磺酸盐的制备4-[4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺甲烷磺酸盐将5.29克(0.01mol)实施例5制备的化合物(4-[4-甲基-1-哌嗪基]甲基)-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺)加到70ml乙醇中。在该淡黄色悬浮液中，加入0.96克(0.01mol)甲烷磺酸，20分钟加完，然后加热回流20分钟，在65℃过滤，将滤液浓缩到原来体积的50％，浓缩液在25℃下过滤，得固体A。将母液浓缩至干，得残留物B。将A和B悬浮在110ml乙醇和1.5ml蒸馏水组成的混合溶剂中，回流溶解，放冷25℃过夜，过滤得晶体并在65℃干燥直至恒重。得到4-[4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺甲烷磺酸盐结晶3.2克。
本发明其它化合物及其盐盐的制备方法与上述实施例类同。
本发明化合物酪氨酸激酶活性测定实验一、试验材料与试剂酶反应底物Poly(Glu，Tyr)4∶1(Sigma公司)；钒酸钠(Sigma公司)；ATP-Na2(Amresco公司)；抗磷酸化酪氨酸单抗PY99(Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(Calbiochem公司)；HRP底物OPD(Amresco公司)；96孔酶标板(Corning公司)；N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)(Amresco公司)。待测化合物为本发明制备的化合物，编号为100504、100515、100605、100609、100610和100611，配制成10-4M浓度。
反应缓冲液按下表配制试剂 母液浓度 终浓度HEPES1.04M 50mM(pH7.4)MgCL2100mM 20mMMnCL2100mM 0.2mMNa3VO450mM 0.2mMDTT 1M 1mMH2O 补足体积二、实验步骤1.酶反应底物Poly(Glu，Tyr)4∶1用PBS(pH7.2-7.4)稀释成20μg/ml，125μl/孔包被96孔酶标板，置37℃反应12-16小时，弃去孔中液体。
2.洗板，用200μl/孔的T-PBS(含0.1％Tween-20的PBS)洗板三次，每次5分钟。
3.于37℃烘箱中干燥96孔酶标板1-2小时。
4.每孔加入浓度为10μM的ATP80μl，待测化合物10μl(终浓度为10-5M)，最后加入用反应缓冲液稀释的血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)酪氨酸激酶酶液10μl(0.5μg酶蛋白)，
启动反应，置37℃摇床反应1小时。(在实验中，ATP的中浓度为8μM，PDGFR-β为每孔1ul。实验为复孔。实验中设无底物，无酶，无ATP，相应浓度的DMSO对照。T-PBS洗板三次。
5.加入抗磷酸化酪氨酸抗体PY99 100μl/孔，(用含BSA 5mg/ml的T-PBS稀释，稀释度1∶500)，25℃摇床反应1小时或者37℃30分钟。T-PBS洗板三次。
6.加入二抗羊抗小鼠IgG-HRP 100μl/孔(用含BSA5mg/ml的T-PBS稀释，稀释度1∶2000)，25℃摇床反应1小时或者37℃30分钟。T-PBS洗板三次。
7.加显色液(含2mg/ml OPD，0.03％H2O2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH＝5.4)100μl/孔，25℃避光反应，反应时间视颜色而定(约4分钟)。
8. 2M H2SO450μl/孔终止反应，OD490nm测定。
三、抑制率的计算公式 其中化合物孔OD值本发明化合物所测的各个OD值减去空白孔所得到的OD值；阴性对照孔OD值不加酶实验孔的OD值；无药物作用的对照孔OD值含相应浓度DMSO实验孔的OD值。
四、PDGFR-β酪氨酸激酶活性抑制体外筛选试验测定结果本发明化合物在浓度为10-5M条件下，作用1小时，对PDGFR-β酪氨酸激酶活性有不同程度的抑制作用，其中100611的抑制作用最强，达到85.9％。
对PDGFR-β酪氨酸激酶活性的抑制率(％)样品编号浓度(10-5M)100504 26.4100515 25.0100605 20.4100609 41.0100610 57.9100611 85.9上述结果表明，本发明化合物对酪氨酸激酶活性具有明显的抑制作用，因而可用于制备抗肿瘤药物。
权利要求
1.一种嘧啶磺酰胺类化合物，分子结构通式如下 L表示氮杂环烷基，所说的杂环烷基，为下列三类各种取代六元杂环(1)六元杂环为取代哌嗪，结构式如通式(II) R1为1～5个碳原子的直链或支链烷基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基；(2)六元杂环为2位或3位取代哌啶，结构式为 或 R2或R3为1～4个碳原子的直链或支链烷基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基；(3)六元杂环为吗啉基，结构式为
2.按权利要求1所述的嘧啶磺酰胺类化合物，其特征在于结构通式(I)中的L基为取代哌嗪基，其通式(II)中的R1基选自甲基或乙基。
3.按权利要求1所述的嘧啶磺酰胺类化合物，其特征在于结构通式(I)中的L基为取代哌啶基，其通式(III)或(IV)中的R2或R3基选自甲基或乙基。
4.按权利要求1所述的嘧啶磺酰胺类化合物，其特征在于结构通式(I)中的L基为吗啉基。
5.按权利要求2所述的嘧啶磺酰胺类化合物，其特征在于取代哌嗪基通式(II)中R1为乙基，该化合物为4-[4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺。
6.按权利要求3所述的嘧啶磺酰胺类化合物，其特征在于取代哌啶基通式(III)的R2为甲基，该化合物为4-[4-甲基-1-哌啶基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺。
7.按权利要求3所述的嘧啶磺酰胺类化合物，其特征在于取代哌啶基通式(IV)的R3为甲基，该化合物为4-[3-甲基-1-哌啶基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯磺酰胺。
8.权利要求1至7所述的任何一种化合物的药学上可接受的盐。
9.权利要求8所述化合物的盐，选自盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、甲烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
10.权利要求1至7和9所述的任何一种化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
11.权利要求8所述的任何一种化合物的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的新型嘧啶磺酰胺类化合物及其药学上可接受的盐类。本发明针对现有抗肿瘤化合物嘧啶胺类化合物不易结晶、水溶性差而影响其生物利用度的缺陷，在其嘧啶氨基上引入磺酰基团，制备成嘧啶磺酰胺类化合物。经活性实验表明，本发明化合物易结晶，水溶性好，从而提高了抗肿瘤活性。因此可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号C07D401/00GK1587263SQ20041005322
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月29日 优先权日2004年7月29日
发明者庄明强, 赵京浦, 章雄文 申请人:上海新兴医药股份有限公司