专利名称：和厚朴酚、厚朴酚或其混合物的制剂及其在制备治疗心脑血管疾病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及和厚朴酚、厚朴酚和/或其混合物在制备预防或治疗心脑血管疾病药物中的用途，所述的心脑血管疾病为冠心病，心绞痛，老年心力衰竭，心律失常及脑栓塞、脑梗塞、脑血栓等脑缺血性疾病。
背景技术：
厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils、凹叶厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干皮、根皮及枝皮。厚朴味苦、辛，性温。归脾、胃、肺、大肠经。具有燥湿消痰、下气除满等功能。用于湿滞伤中，腕痞吐泻，食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳。因此厚朴历代以来均用于治疗消化系统疾病。
厚朴的活性成分研究主要侧重于木脂素类化合物和生物碱类化合物。厚朴酚、和厚朴酚为厚朴中的主要有效成分，以往的研究表明其具有肌肉松弛、抗焦虑和中枢抑制、抗菌抗炎活性、抗心率失常、抗氧化、抗肿瘤等多种活性，如厚朴酚、和厚朴酚具有使大鼠脑电波变为高幅慢波；厚朴酚可完全抑制小鸡脊髓反射；厚朴酚、和厚朴酚具有中枢抑制和中枢肌肉松弛作用，较大剂量(100和250mg/kg，腹腔注射)时，可使小鼠肌肉松弛和翻正反射消失达3小时左右；厚朴酚对格兰氏阳性菌、耐酸性菌、类酵母菌和丝状真菌有显著的抗菌活性；厚朴酚与和厚朴酚都能够抗心率失常；实验发现厚朴酚能够通过释放内皮衍生舒张因子而舒张血管平滑肌，通过压力门通(依赖性)-钙通道抑制钙内向通量；能够抑制去甲肾上腺素(NE)诱导的大鼠胸主动脉位相性和强直性收缩；能够抑制高钾诱导的钙依赖性大鼠主动脉收缩，且具有明显的量效关系。厚朴酚与和厚朴酚是有效的抗血小板因子，其机理是抑制了血栓素B2和血小板细胞内钙的移动。
厚朴的毒副作用仅见于对厚朴煎剂及其生物碱类成分木兰箭毒碱的报道。厚朴煎剂给小鼠一次灌胃60g/kg，观察3天，未见死亡。由于厚朴所含毒性成分主要为木兰箭毒碱，其在胃肠道内吸收很慢，吸收后，即由肾脏排泄，在血中浓度较低。厚朴煎剂小鼠腹腔注射的LD50为6.12±0.038g/kg。而木兰箭毒碱腹腔注射的LD50为45.55mg/kg。厚朴煎剂给猫静注的MLD为4.25±1.25g/kg，在一般肌松剂量下，实验动物心电图无影响，大剂量可引起呼吸抑制而死亡。而厚朴酚、和厚朴酚及其混合物未见到毒性报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供式I的厚朴酚，式II的和厚朴酚或其混合物，或其药学可接受的盐或其衍生物用于制备预防或治疗心脑血管疾病的药物中的用途 发明人通过试验发现，和厚朴酚、厚朴酚或它们的混合物可延长电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间，抑制血小板聚集，减少小鼠脑缺血再灌注损伤后脑内丙二醛(MDA)含量，减轻对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)损伤，可有效用于预防或治疗心脑血管疾病，如冠心病，心绞痛，老年心力衰竭，心律失常及脑栓塞、脑梗塞、脑血栓等脑缺血性疾病。因此，本发明提供了厚朴酚、和厚朴酚或其混合物用于制备预防或治疗脑缺血性疾病，尤其是用于制备预防或治疗冠心病、心绞痛、脑血栓形成、脑梗死或脑栓塞的药物中的用途。
本发明的和厚朴酚、厚朴酚或其混合物可用已知的提取方法或采用本发明的新方法从植物厚朴中提取。中国专利CN 85103128A公开了厚朴酚及和厚朴酚的提取方法，包括先用无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾等的溶液直接从原料中提取厚朴酚及和厚朴酚，然后在提取液中加一种无机酸如盐酸、硝酸或硫酸使它们在酸性溶液中游离析出，再用一种有机溶剂精制，得到厚朴酚及和厚朴酚的混合结晶。
中国专利申请01130129.5公开了一种精制有效成分的方法，其特征是以厚朴酚及厚朴酚总含量10.0-50.0％的厚朴提取物为原料，先后在真空度为20-50Pa，温度为80-120℃和真空度为1-5Pa，温度为100-250℃的条件下进行分子蒸馏，得到半结晶或结晶产物。该方法的回收率在90％以上，厚朴酚及和厚朴酚含量在80.0-99.0％。
以上两个专利在本文全面引入作为参考。
在和厚朴酚及厚朴酚的混合物的情况下，厚朴酚与和厚朴酚的比例可以是任意的，优选的比例可为厚朴酚∶和厚朴酚＝1-8∶8-1。
在另一个方面，本发明还提供了一种新的从植物厚朴中提取厚朴酚与和厚朴酚的方法，包括以下步骤取厚朴药材，用乙醇回流提取，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，浓缩液用水稀释后用有机溶剂萃取，萃取液减压回收至干，得油状物，脱脂，再重结晶得到总酚粗晶。用本发明的方法可以简单、快速地提取总酚粗晶，其提取率达90％以上，总酚含量达90％～98％。
在又一个方面，本发明还提供了一种分离和厚朴酚与厚朴酚的方法，包括将上述总酚粗晶，溶于适量乙醇中，以柱色谱用聚酰胺拌样，上柱，0.5％～2％的氢氧化钠梯度洗脱，洗脱液用稀盐酸调至酸性，并用TLC监测活性成分的洗脱，合并相同部分，分别用有机溶剂萃取，减压蒸干溶剂，用有机溶剂重结晶得到的白色针晶为和厚朴酚部分，用混合溶剂反复重结晶所得的白色片状结晶为厚朴酚部分。
另外，发明人通过对厚朴酚、和厚朴酚及其混合物的体内代谢研究表明，厚朴酚、和厚朴酚及其混合物的口服吸收很差，一般只有4～8％左右，且由于厚朴酚、和厚朴酚及其混合物具有很强的抑菌作用，长期服用将造成人体正常菌群的异常，因此，发明人采用分散技术将厚朴酚、和厚朴酚及其混合物制备成固体分散制剂，使其口服吸收达到50％以上，大大提高了有效成分的生物利用度。同时将厚朴酚、和厚朴酚及其混合物制备成注射剂，采用静脉注射或肌肉注射的方法使药物直接作用于病变部位，具有快速、高效的特点，同时可以大大降低药物的用量，减少其副作用。
另外，发明人通过对厚朴酚、和厚朴酚及其混合物的药代动力学研究表明，厚朴酚、和厚朴酚及其混合物的血浆药一时曲线为三室开放模型或二室开放模型，其体内消除迅速，因此为保持血药浓度，发明人采用缓释或控释技术，使有效血药浓度维持时间长且平稳，使药物的释放接近零级或一级速率，并可以减少药物的用量。
本发明的又一个目的是提供含有厚朴酚、和厚朴酚或其混合物的注射剂，该制剂包括厚朴酚、和厚朴酚或其混合物0.1～10％，表面活性剂0.1～30％，增溶剂1～50％，抗氧化剂0.1～1％，络合剂0.01～0.03％，余量为注射用水。若没有特殊说明，本发明所使用的所有百分比均以所述制剂的重量为基准的重量百分含量表示，即制剂中各种成分的含量为重量百分含量。
本发明注射剂中所述的表面活性剂选自Tween 80，Tween 65，cremophorEL(聚氧乙烯蓖麻油)，pluronic F-68等，或它们的混合物。增溶剂例如包括聚乙二醇，甘油，丙二醇，乙醇，氨基酸盐，乳糖，甘露醇，山梨醇，葡萄糖，右旋糖苷等，或它们的混合物。抗氧化剂例如包括维生素C，亚硫酸钠，焦亚硫酸钠等，或它们的混合物。络合剂例如包括EDTA盐，枸橼酸盐等。
在一个优选的实施方案中，本发明的注射剂包括厚朴酚、和厚朴酚或其混合物0.1～10％，聚乙二醇200(或300，400)1～30％，甘油或丙二醇或乙醇或它们的混合物10～50％，亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、维生素C或它们的混合物0.1～1％，EDTA二钠盐0.01～0.03％。
在另一个优选的实施方案中，本发明的注射剂包括厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物0.1～10％，pluronic F-68 0.2～10％，甘油、丙二醇、乙醇或它们的混合物1～50％，亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、维生素C或它们的混合物0.1～1％，EDTA二钠盐0.01～0.03％。
在又一个优选的实施方案中，本发明的注射剂包括厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物0.1～10％，cremophorEL 1～20％，甘油、丙二醇、乙醇或它们的混合物1～50％，亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、维生素C或它们的混合物0.1～1％，EDTA二钠盐0.01～0.03％。
本发明的另一目的还提供了厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物的固体分散制剂，包括厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物5～50％，水溶性载体(PEG，聚乙烯吡咯烷酮、pluronic F-68，尿素，糖类及其糖类与PEG的联合载体)95～50％制成的固体分散体，然后将该固体分散体按常规的制剂技术制备成滴丸，或与其他辅料，如崩解剂、溶胀辅料和稀释剂等混合制备成片剂，胶囊或颗粒剂。
本发明的另一目的还提供了厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物的缓释制剂，包括厚朴酚、和厚朴酚或二者的混合物5～50％，高分子辅料(PEG，甲基纤维素，羟丙基纤维素，乙基纤维素，PVP，羟丙基甲基纤维素)90～45％，蔗糖，淀粉，硬脂酸镁，滑石粉等1～5％混合后，按制剂技术制得缓释片剂或缓释胶囊。
本发明的厚朴酚、和厚朴酚或二者的混合物以注射剂、输液制剂或分散剂的形式给药，以及以缓释制剂或控释制剂形式给药。
本发明的厚朴酚、和厚朴酚或二者的混合物的给药剂量取决于病人的体重，年龄，病情，具体疾病等因素。作为指导，在注射剂的情况下，本发明的厚朴酚、和厚朴酚或二者的混合物日剂量可以是0.01μg-20mg/kg体重，可以分1-3次进药或连续给药。
图1是固体分散制剂的体外溶出速率。
图2是缓释片剂的体外溶出速率。
具体实施例方式
以下通过实施例来进一步说明本发明，应该指出的是，这些实施例仅用于说明的目的，不构成对本发明范围的任意限制。
一、制备实施例实施例1厚朴提取物的制备取厚朴药材，粉碎成粗粉，用10倍量95％乙醇回流提取3次，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，浓缩液用水稀释后用氯仿萃取，萃取液减压回收至干，得油状物，遂用石油醚脱脂，再用氯仿重结晶得到总酚粗晶，其提取率大于90％，总酚的含量采用HPLC法测定[十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶0.05％磷酸溶液(77∶23)，检测波长294，流速1ml/min]，其厚朴酚、和厚朴酚含量之和在90～98％之间。
实施例2和厚朴酚与厚朴酚的分离取实施例1的总酚粗晶，溶于适量乙醇中，以柱色谱用聚酰胺拌样，上柱，0.5％～2％的氢氧化钠梯度洗脱，洗脱液用稀盐酸调至酸性，TLC监测活性成分，合并相同部分，分别用氯仿萃取，氯仿液减压蒸干。用环己烷重结晶所得的白色针晶为和厚朴酚部分，用石油醚-乙醚反复重结晶所得的白色片状结晶为厚朴酚部分，所得和厚朴酚的含量采用HPLC法[十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶0.05％磷酸溶液(77∶23)，检测波长294，流速1ml/min]含量测定，含量大于99.0％，收率大于90.0％；所得厚朴酚含量采用HPLC法含量测定，含量大于99.5％，收率大于90.0％。
实施例3注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物0.2％，PEG200 10％，甘油50％，亚硫酸氢钠0.2％，EDTA二钠盐0.03％和水余量。
制备方法精密称取药物，加入聚乙二醇200和甘油，搅拌至药物完全溶解，加入亚硫酸钠和EDTA的水溶液，搅拌均匀，加入注射用水至规定量，搅拌均匀至澄明，用稀盐酸或稀氢氧化钠调节pH值到中性。滤过，灌封，灭菌。
实施例4注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物10％，PEG200 30％，丙二醇50％，焦亚硫酸钠1％，EDTA二钠盐0.01％和水余量。
制备方法同实施例3。
实施例5注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物1.0％，PEG200 2％，乙醇10％，维生素C 0.2％，EDTA二钠盐0.03％和水余量。
制备方法同实施例3。
实施例6注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物1.0％，pluronic F-68 10％，甘油50％，焦亚硫酸钠0.2％，EDTA二钠盐0.03％和水余量。
制备方法同实施例3。
实施例7注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物0.5％，pluronic F-68 10％，乙醇50％，亚硫酸氢钠0.2％，EDTA二钠盐0.03％和水余量。
制备方法同实施例3。
实施例8注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物0.5％，cremophor EL 1％，甘油15％，维生素C 1.0％，EDTA二钠盐0.03％和水余量。
制备方法同实施例3。
实施例9注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物1.0％，cremophor EL 10％，丙二醇20％，亚硫酸钠0.2％，EDTA二钠盐0.03％和水余量。
制备方法同实施例3。
实施例10注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物5.0％，cremophor EL 20％，乙醇50％，焦亚硫酸钠0.2％，EDTA二钠盐0.03％和水余量。
制备方法同实施例3。
实施例11注射剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物10.0％，cremophor EL 20％，丙二醇30％，亚硫酸钠0.2％，EDTA二钠盐0.03％和水余量。
制备方法同实施例3。
实施例12-14滴丸剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物25.0％，聚乙二醇(PEG)-6000或PEG-12000或PEG20000 75％，不同分子量的PEG对应不同的实施例12-14。
制备方法将聚乙二醇加热融化，然后加入精密称定的厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物，搅拌使溶解成透明溶液，滴制成滴丸。
实施例15缓释片剂厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物10.0％，PEG-6000 30％，乙基纤维素(EC)10％，羟丙甲基纤维素(HPC)25％，淀粉20％，滑石粉4％，硬脂酸镁1％制备方法取混合溶剂(95％乙醇∶CH2Cl2＝1∶1)适量，加入厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物，搅拌使其溶解，加入PEG6000搅拌使其溶解，减压回收溶剂，加入EC，HPC，淀粉混合均匀，制成颗粒，加入滑石粉，硬脂酸镁混合均匀，压片，即得。
二、注射剂的光稳定性和热稳定性考察结果1、我们按照如下方法考察了上述制剂的光稳定性，分别取实施例3、6和9的三批注射液各三支，放置于4000lx的条件下照射，分别取0，5，10天的三批样品各一支，进行外观检查和含量测定。三批样品外观检查分别无色澄清，并分别以各时间点的含量对零时含量的百分比计算测定有效成分的含量，结果如下批号 0天 5天 10天实施例3100.00％100.53％101.98％实施例6100.00％100.79％97.79％实施例9100.00％100.78％99.22％可见，上述制剂的在上述光照实验条件下是很稳定的。
综上制剂稳定性符合要求。
2、我们按照如下方法考察了上述制剂的热稳定性，分别取实施例3、6和9的三批注射液各三支，放置于放置于60℃的条件恒温加热，分别取0，30，90天的三批样品，进行外观检查和含量测定。三批样品外观检查分别无色澄清并分别以各时间点的含量对零时含量的百分比计算测定有效成分的含量，结果如下0天 30天90天实施例3100％102.86％102.53％实施例6100％104.25％104.68％实施例9100％101.72％100.02％可见，上述制剂在加速实验条件下同样是很稳定的。
综上制剂稳定性符合要求。
三、体内分布实验结果我们对实施例3、6、9的注射剂进行了大鼠体内分布实验，结果表明，上述注射液能够迅速分布到各组织器官中，其中以大脑分布量最高，其次为肾、心脏和肝脏。说明药物可以有效的分布在肌体的病变部位。结果见表1。
表1静脉注射20mg/kg上述注射液后在各组织中的分布时间(分钟)大脑 肝脏 心脏 肾脏2 26.01±2.8456.27±58.52±5.81 53.91±20.5120.225 26.98±3.0838.43±28.48±0.47 33.25±5.2712.3910 20.86±1.516.32±3.02 15.30±1.97 16.35±1.4215 16.41±1.519.55±1.34 10.86±1.33 13.45±0.8230 9.41±1.02 3.08±1.07 6.28±1.00 5.51±0.9260 4.95±0.32 2.89±0.60 4.86±0.82 2.54±0.831201.19±0.16 0.75±0.46 2.08±0.37 1.03±0.21四、厚朴酚、和厚朴酚和二者混合物固体分散制剂的体外溶出速率测定和在大鼠体内的生物利用度测定。
按《中国药典》2000版一部附录XC“溶出度测定法”进行，转速100r/min，水浴温度37±0.5℃，溶出介质为pH1.2的人工胃液900ml，投药量为含药量30mg的固体分散制剂和普通片剂，所述的固体分散制剂为实施例12的滴丸，其溶出速率结果见表2和图1。
表2固体分散制剂与普通片剂的体外溶出速率(％)(n＝6)时间固体分散制剂溶出速率普通片溶出速率1 8.04 0.42 25.811.355 39.9 2.311055.588.692064.9818.963073.3122.014585.6426.916092.8830.1五、缓释片剂的溶出速率测定按《中国药典》2000版一部附录XC“溶出度测定法“进行，转速50r/min，水浴温度37±0.5℃，溶出介质为蒸馏水900ml，投药量为含药量30mg的固体分散制剂，所用的缓释片剂为实施例15所制得，其溶出速率结果见图2。
六、厚朴酚、和厚朴酚和二者混合物的药效学试验1、和厚朴酚对电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间的影响实验方法体重为300±20g的SD雄性大鼠50只随机分为5组大剂量组(和厚朴酚5×10-5g/kg)、中剂量组(和厚朴酚5×10-6g/kg)、小剂量组(和厚朴酚5×10-7g/kg)、阳性药对照组(阿司匹林5×10-3g/kg)和空白对照组(0.9％生理盐水)。15％乌拉坦麻醉大鼠。将大鼠仰卧固定，颈部行2cm切口，分离右侧颈总动脉，穿塑料条备用。舌静脉注射给药，记时，并将备用分离好的右颈动脉与血栓测定仪连接。给药后10min给予2mA电流刺激血管3min，记录血栓形成时间。空白对照组给予同等体积的0.9％生理盐水。实验结果参见表3。
表3和厚朴酚对电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间的影响(n＝10)组别 剂量(g/kg)血栓形成时间min空白对照组 / 8.9±1.1阳性药对照组5×10-313.4±5.3*和厚朴酚大剂量组5×10-515.9±4.7**和厚朴酚中剂量组5×10-611.4±3.1*和厚朴酚小剂量组5×10-710.9±3.4*代表P＜0.05，**代表P＜0.01
2、和厚朴酚对兔体内血小板聚集的影响实验方法体重为3.0～4.0kg的雄性兔30只随机分为大剂量组(和厚朴酚1.2×10-5g/kg)、中剂量组(和厚朴酚1.2×10-6g/kg)、小剂量组(和厚朴酚1.2×10-7g/kg)、阳性药对照组(阿司匹林1.2×10-3g/kg)和空白对照组(0.9％生理盐水)，每组测定6只兔，间隔72h后测定下一组剂量。兔称重，耳中动脉取血4ml(3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝)。耳缘静脉给药，给药15min后再次耳中动脉取血2ml(3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝)于试管中。将抗凝血离心得到PRP(富血小板血浆)；下层再离心得到PPP(贫血小板血浆)。分别取PPP和PRP置于血小板聚集仪中，以自身动物的PPP调PRP浊度，使各PRP浊度相同，PRP在37℃温育1min，加胶原(终浓度空mg/ml)引起血小板聚集，记录最大聚集率。实验结果参见表4。
表4和厚朴酚对兔体内血小板聚集的影响(n＝6)组别 剂量(g/kg) 血小板聚集的抑制率(％)空白对照组 6.1±33.5阳性药对照组5×10-395.1±7.6**和厚朴酚大剂量组5×10-577.4±29.4**和厚朴酚中剂量组5×10-670.8±27.3**和厚朴酚小剂量组5×10-760.6±24.9**代表P＜0.05，**代表P＜0.013、和厚朴酚对小鼠脑缺血再灌注损伤后脑内MDA的影响实验方法选取体重为25～35g的ICR雄性小鼠60只，随机分为6组大剂量组(和厚朴酚7×10-5g/kg)、中剂量组(和厚朴酚7×10-6g/kg)、小剂量组(和厚朴酚7×10-7g/kg)、空白对照组(0.9％生理盐水)、阳性药对照组(维生素E0.5g/kg)和假手术组。小鼠称重，水合氯醛麻醉，仰卧固定，颈部3cm切口，分离双侧颈总动脉30min，松开动脉夹松开动脉夹30分钟后，小鼠立即于冰浴下断头取脑，脑组织-40℃冻存，以待进行MDA测定；空白对照组给予相同体积的生理盐水；阳性药对照组为连续灌胃给药5天，每天一次，剂量0.5g/kg，于最后一次给药1小时进行缺血再灌注手术。假手术组仅分离出颈总动脉，不夹闭不给药，1h后取脑组织冻存。
将脑组织0-4℃解冻，硫代巴比妥酸法测定脑组织中MDA水平，以532nm吸光度表示。实验结果参见表5。
表5和厚朴酚对小鼠脑缺血再灌注损伤后脑内MDA的影响(n＝10)组别 剂量(g/kg)OD(A532)值空白对照组 0.302±0.03假手术组0.223±0.03**阳性药对照组0.5 0.247±0.03**和厚朴酚大剂量组7×10-50.243±0.03**和厚朴酚中剂量组7×10-60.257±0.05*和厚朴酚小剂量组7×10-70.279±0.04*代表P＜0.05，**代表P＜0.014、和厚朴酚对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)损伤的影响实验方法将体重为300-350g雄性SD大鼠随机分成6组，每组10只，分别为大剂量组(和厚朴酚5×10-5g/kg)、中剂量组(和厚朴酚5×10-6g/kg)、小剂量组(0.9％生理盐水)和假手术组。给药方式为舌静脉注射给药，分三次给药，缺血前15min、缺血后3h和缺血后24h。
具体操作如下手术组大鼠称重，7％水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉，舌静脉给药。颈部正中行2cm手术切口，分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，穿线并结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，将已标记好长度的尼龙线插入颈内动脉约22mm处，并用手术线结扎、固定，逐层缝合皮肤。术后3h再次舌静脉给药，术后24h麻醉后舌静脉第三次给药，给药后15min断头处死，冰浴下取脑切片，2％TTC染色，切片，拍照，最后将照片缺血区域和非缺血区域剪下称重，计算缺血比例。假手术组仅行切口，分离颈动脉，不插线，不给药，缝合后24h取脑。生理盐水组与手术组操作一致，只是给药时给予同等体积的生理盐水。实验结果参见表6。
表6.和厚朴酚对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)损伤的影响(n＝10)
*P＜0.05，**P＜0.01
5、厚朴酚对电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间的影响实验方法体重为300±20g的SD雄性大鼠50只随机分为5组大剂量组(厚朴酚2.5×10-5g/kg)、中剂量组(厚朴酚2.5×10-6g/kg)、小剂量组(厚朴酚2.5×10-7g/kg)、阳性药对照组(阿司匹林5×10-3g/kg)和空白对照组(0.9％生理盐水)。15％乌拉坦麻醉大鼠。将大鼠仰卧固定，颈部行3cm切口，分离右侧颈总动脉，穿塑料条备用。舌静脉注射给药，记时，并将备用分离好的右颈动脉与血栓测定仪连接。给药后10min给予2mA电流刺激血管3min，记录血栓形成时间。空白对照组给予同等体积的0.9％生理盐水。实验结果参见表7。
表7.厚朴酚对电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间的影响(n＝10)组别 剂量(g/kg) 血栓形成时间min空白对照组/8.3±1.8阳性药对照组 5×10-312.9±4.4*厚朴酚大剂量组2.5×10-517.3±5.1**厚朴酚中剂量组2.5×10-612.4±4.3*厚朴酚小剂量组2.5×10-710.9±4.1*P＜0.05，**P＜0.016、厚朴酚对兔体内血小板聚集的影响实验方法雄性兔30只，体重3.0～4.0kg，随机分组，实验分为大剂量组(厚朴酚2.5×10-5g/kg)、中剂量组(厚朴酚2.5×10-6g/kg)、小剂量组(厚朴酚2.5×10-7g/kg)、阳性药对照组(阿司匹林1.2×10-3g/kg)和空白对照组(0.9％生理盐水)，每组测定6只兔，间隔72h后测定下一组剂量。兔称重，耳中动脉取血4ml(3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝)。耳缘静脉给药，给药15min后再次耳中动脉取血2ml(3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝)于试管中。将抗凝血离心得到PRP(富血小板血浆)；下层再离心得到PPP(贫血小板血浆)。分别取PPP和PRP置于血小板聚集仪中，以自身动物的PPP调PRP浊度，使各PRP浊度相同，PRP在37℃温育1min，加胶原(终浓度3mg/ml)引起血小板聚集，记录最大聚集率。实验结果参见表8。
表8.厚朴酚对兔体内血小板聚集的影响(n＝6)组别 剂量(g/kg) 血小板聚集的抑制率(％)空白对照组 6.1±33.5阳性药对照组 1.2×10-395.1±7.6**厚朴酚大剂量组2.5×10-593.4±12.3**厚朴酚中剂量组2.5×10-678.9±9.0**厚朴酚小剂量组2.5×10-770.3±8.9**代表P＜0.05，**代表P＜0.017、厚朴酚对小鼠脑缺血再灌注损伤后脑内MDA的影响实验方法选取体重为25～35g ICR雄性小鼠60只，随机分为6组大剂量组(厚朴酚5×10-5g/kg)、中剂量组(厚朴酚5×10-6g/kg)、小剂量组(厚朴酚5×10-7g/kg)、空白对照组(0.9％生理盐水)、阳性药对照组(维生素E 0.5g/kg)和假手术组。小鼠称重，水合氯醛麻醉，仰卧固定，颈部3cm切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。厚朴酚给药组用无创小动脉夹夹闭双侧颈总动脉30min，松开动脉夹30min形成再灌注损伤，于缺血和再通时分别尾静脉注射给药一次，松开动脉夹30分钟后，小鼠立即于冰浴下断头取脑，脑组织-40℃冻存，以待进行MDA测定；空白对照组给予相同体积的生理盐水；阳性药对照组为连续灌胃给药5天，每天一次，剂量为0.5g/kg，于最后一次给药1小时进行缺血再灌注手术。假手术组仅分离出颈总动脉，不夹闭不给药，1h后取脑组织冻存。
将脑组织0～4℃解冻，硫代巴比妥酸法测定脑组织中MDA水平，以532nm吸光度表示。实验结果参见表9。
表9.厚朴酚对小鼠脑缺血再灌注损伤后脑内MDA的影响(n＝10)组别 剂量(g/kg)OD(A532)值空白对照组 0.302±0.03假手术组0.223±0.03**阳性药对照组 0.5 0.247±0.03**厚朴酚大剂量组5×10-50.246±0.02**厚朴酚中剂量组5×10-60.251±0.03*厚朴酚小剂量组5×10-70.269±0.06*P＜0.05，**P＜0.018、厚朴酚对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)损伤的影响实验方法将体重为300～350g的雄性SD大鼠随机分成6组，每组10只，分别为大剂量组(厚朴酚5×10-5g/kg)、中剂量组(厚朴酚5×10-6g/kg)、小剂量组(厚朴酚5×10-7g/kg)、阳性药对照组(丹参注射液1.2g/kg)、空白对照组(0.9％生理盐水)和假手术组。给药方式为舌静脉注射给药，分三次给药，缺血前15min、缺血后3h和缺血后24h.。
具体操作如下手术组大鼠称重，7％水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉，舌静脉给药。颈部正中行2cm手术切口，分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，穿线并结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，将已标记好长度的尼龙线插入颈内动脉约22mm处，并用手术线结扎、固定，逐层缝合皮肤。术后3h再次舌静脉给药，术后24h麻醉后舌静脉第三次给药，给药后15min断头处死，冰浴下取脑切片，2％TTC染色，切片，拍照，最后将照片缺血区域和非缺血区域剪下称重，计算缺血比例。假手术组仅行切口，分离颈动脉，不插线，不给药，缝合后24h取脑。生理盐水组与手术组操作一致，只是给药时给予同等体积的生理盐水。实验结果参见表11。
表11.厚朴酚对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)损伤的影响(n＝10)组别 剂量(g/kg) 脑梗塞面积(％)空白对照组 42.92±14.08假手术组 0三九丹参注射液对照组 1.29.94±11.70**厚朴酚大剂量组5×10-510.05±12.63**厚朴酚中剂量组5×10-612.72±13.24**厚朴酚小剂量组5×10-721.29±15.31**代表P＜0.05，**代表P＜0.019、厚朴提取物(厚朴酚与和厚朴酚的混合物)对电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间的影响实验方法体重为300±20g SD的雄性大鼠50只随机分为5组大剂量组[(含量为95％，厚朴提取物含量按厚朴酚计)](厚朴提取物1×10-4g/kg)、中剂量组(厚朴提取物1×10-5g/kg)、小剂量组(厚朴提取物1×10-6g/kg)、阳性药对照组(阿司匹林5×10-3g/kg)和空白对照组(0.9％生理盐水)。15％乌拉坦麻醉大鼠。将大鼠仰卧固定，颈部行3cm切口，分离右侧颈总动脉，穿塑料条备用。舌静脉注射给药，记时，并将备用分离好的右颈动脉与血栓测定仪连接。给药后10min给予2mA电流刺激血管3min，记录血栓形成时间。空白对照组给予同等体积的0.9％生理盐水。实验结果参见表12。
表12.厚朴提取物对电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间的影响(n＝10)组别 剂量(g/kg) 栓形成时间min空白对照组/ 8.9±1.1阳性药对照组 5×10-313.4±5.3*厚朴提取物大剂量组1×10-419.3±5.9**厚朴提取物中剂量组1×10-516.2±4.6**厚朴提取物小剂量组1×10-615.4±3.1**代表P＜0.05，**代表P＜0.0110、厚朴提取物对兔体内血小板聚集的影响实验方法雄性兔30只，体重3.0～4.0kg，随机分组，实验分为大剂量组(厚朴提取物4×10-5g/kg)、中剂量组(厚朴提取物4×10-6g/kg)、小剂量组(厚朴提取物4×10-7g/kg)、阳性药对照组(阿司匹林1.2×10-3g/kg)和空白对照组(0.9％生理盐水)，每组测定6只兔，间隔72h后测定下一组剂量。兔称重，耳中动脉取4ml(3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝)。耳缘静脉给药，给药15min后再次耳中动脉取血2ml(3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝)于试管中。将抗凝血离心得到PRP(富血小板血浆)；下层再离心得到PPP(贫血小板血浆)。分别取PPP和PRP置于血小板聚集仪中，以自身动物的PPP调PRP浊度，使各PRP浊度相同，PRP在37℃温育1min，加胶原(终浓度3mg/ml)引起血小板聚集，记录最大聚集率。实验结果参见表13。
表13.厚朴提取物对兔体内血小板聚集的影响(n＝6)组别剂量(g/kg) 血小板聚集的抑制率(％)空白对照组 6.1±33.5阳性药对照组 1.2×10-395.1±7.6**厚朴提取物大剂量组4×10-587.8±9.7**厚朴提取物中剂量组4×10-682.8±7.9**厚朴提取物小剂量组4×10-776.1±4.5***P＜0.05，**P＜0.0111、厚朴提取物对小鼠脑缺血再灌注损伤后脑内MDA的影响实验方法选取ICR雄性小鼠60只，体重25～35g，随机分为6组大剂量组(厚朴提取物1×10-4g/kg)、中剂量组(厚朴提取物1×10-5g/kg)、小剂量组(厚朴提取物1×10-6g/kg)、空白对照组(0.9％生理盐水)、阳性药对照组(维生素E 0.5g/kg)和假手术组。小鼠称重，水合氯醛麻醉，仰卧固定，颈部3cm切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。厚朴提取物给药组用无创小动脉夹夹闭双侧颈总动脉30min，松开动脉夹30min形成再灌注损伤，于缺血和再通时分别尾静脉注射给药一次，松开动脉夹30分钟后，小鼠立即于冰浴下断头取脑，脑组织-40℃冻存，以待进行MDA测定；空白对照组给予相同体积的生理盐水；阳性药对照组为连续灌胃给药5天，每天一次，剂量为0.5g/kg，于最后一次给药1小时进行缺血再灌注手术。假手术组仅分离出颈总动脉，不夹闭不给药，1h后取脑组织冻存。
将脑组织0～4℃解冻，硫代巴比妥酸法测定脑组织中MDA水平，以532nm吸光度表示。实验结果参见表14。
表14.厚朴提取物对小鼠脑缺血再灌注损伤后脑内MDA的影响(n＝10)组别 剂量(g/kg) OD(A532)值空白对照组0.302±0.03假手术组 0.223±0.03**阳性药对照组 0.5 0.247±0.03**厚朴提取物大剂量组1×10-40.227±0.05**厚朴提取物中剂量组1×10-50.231±0.04**厚朴提取物小剂量组1×10-60.243±0.06***P＜0.05，**P＜0.0112、厚朴提取物对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)损伤的影响实验方法将体重为300～350g的雄性SD大鼠随机分成6组，每组10只，分别为大剂量组(厚朴提取物1×10-4g/kg)、中剂量组(厚朴提取物1×10-5g/kg)、小剂量组(厚朴提取物1×10-6g/kg)、阳性药对照组(丹参注射液1.2g/kg)、空白对照组(0.9％生理盐水)和假手术组。给药方式为舌静脉注射给药，分三次给药，缺血前15min、缺血后3h和缺血后24h.。
具体操作如下手术组大鼠称重，7％水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉，舌静脉给药。颈部正中行2cm手术切口，分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，穿线并结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，将已标记好长度的尼龙线插入颈内动脉约22mm处，并用手术线结扎、固定，逐层缝合皮肤。术后3h再次舌静脉给药，术后24h麻醉后舌静脉第三次给药，给药后15min断头处死，冰浴下取脑切片，2％TTC染色，切片，拍照，最后将照片缺血区域和非缺血区域剪下称重，计算缺血比例。假手术组仅行切口，分离颈动脉，不插线，不给药，缝合后24h取脑。生理盐水组与手术组操作一致，只是给药时给予同等体积的生理盐水。实验结果参见表15。
表15.厚朴提取物对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)损伤的影响(n＝10)组别 剂量(g/kg) 脑梗塞面积(％)空白对照组 42.92±14.08假手术组 0丹参注射液对照组 1.29.94±11.70**厚朴提取物大剂量组1×10-410.53±10.60**厚朴提取物中剂量组1×10-511.15±12.03**提取物厚朴酚小剂量组 1×10-612.25±11.05***P＜0.05，**P＜0.0113、上述和厚朴酚、厚朴酚及其混合物的药效学指标的临床意义1)和厚朴酚、厚朴酚及其混合物对血小板聚集和血栓形成的作用血小板聚集和动脉血栓形成在冠心病和脑缺血性中风的发病和再发作中起重要作用，血小板聚集抑制剂是临床上治疗和预防这两大类疾病的必不可少的药物，和溶栓药合用可增强溶栓效果，并防止或延缓再梗塞的发生。和厚朴酚、厚朴酚及其混合物具有很强的抑制血小板聚集和血栓形成的作用，可成为新的防治心脑血管疾病的药物，尤其是对冠心病，心绞痛，脑栓塞、脑梗塞、脑血栓等心脑缺血性疾病有着非常有效的治疗与预防效果。
2)和厚朴酚、厚朴酚及其混合物对脑缺血再灌注损伤的影响脑缺血和脑栓塞后需要进行溶栓治疗使堵塞的血管再通，恢复脑组织的供血、供氧，此过程可诱发氧自由基的产生，使脂质过氧化，从而加重脑细胞的损伤。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的代谢产物，和厚朴酚、厚朴酚及其混合物可降低缺血再灌注小鼠脑组织的MDA的水平，表明它可作为脑缺血再灌注损伤的保护剂，防止或减轻血管再通时对脑组织的损伤，尤其是对所述的冠心病，心绞痛，老年心力衰竭，心律失常及脑栓塞、脑梗塞、脑血栓等心脑缺血性疾病有着显著的治疗效果。
3)和厚朴酚、厚朴酚及其混合物对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)脑缺血模型的影响临床上常见的脑缺性中风是由于中脑动脉阻塞引起的，该模型类似于人的脑缺血性中风，和厚朴酚、厚朴酚及其混合物可明显减小MCAO大鼠的脑梗塞面积，可在临床上作为防治脑缺血性中风的新药，尤其是对脑缺血性中风有着非常有效的治疗效果，同样对于冠心病、心绞痛也有着显著的治疗效果。
权利要求
1.厚朴酚、和厚朴酚或其混合物或其药学上可接受的盐用于制备预防或治疗心脑血管疾病药物中的用途，所述的心脑血管疾病尤其为冠心病，心绞痛，老年心力衰竭，心律失常，以及脑栓塞、脑梗塞、脑血栓等脑缺血性疾病。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述心脑血管疾病为心脑缺血性疾病，尤其是脑血栓形成、脑梗死或脑栓塞的脑缺血性疾病。
3.一种提取分离厚朴酚与和厚朴酚的方法，包括以下步骤取厚朴药材，用乙醇回流提取，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，浓缩液用水稀释后用氯仿萃取，萃取液减压回收至干，得油状物，脱脂，再重结晶得到总酚粗晶，然后将总酚粗晶溶于适量乙醇中，以柱色谱用聚酰胺拌样，上柱，0.5％～2％的氢氧化钠梯度洗脱，洗脱液用稀盐酸调至酸性，TLC监测活性成分，合并相同部分，分别用氯仿萃取，氯仿液减压蒸干，用环己烷重结晶所得的白色针晶为和厚朴酚部分，用石油醚-乙醚反复重结晶所得的白色片状结晶为厚朴酚部分。
4.一种含有厚朴酚、和厚朴酚或其混合物的注射剂，其特征在于制剂中各组分的重量百分比为，厚朴酚、和厚朴酚或其混合物0.1～10％，表面活性剂0.1～30％，增溶剂1～50％，抗氧化剂0.1～1％，络合剂0.01～0.03％，注射用水余量。
5.根据权利要求4所述的注射剂，所述的表面活性剂选自Tween 80，Tween 65，cremophor EL(聚氧乙烯蓖麻油)，pluronic F-68，或它们的混合物。
6.根据权利要求4-5任一所述的注射剂，所述的增溶剂选自聚7二醇，甘油，丙二醇，乙醇，氨基酸盐，乳糖，甘露醇，山梨醇，葡萄糖，右旋糖苷，或它们的混合物。
7.根据权利要求4-6任一所述的注射剂，所述的抗氧化剂选自维生素C，亚硫酸钠，焦亚硫酸钠，或它们的混合物。
8.根据权利要求4-7任一所述的注射剂，所述的络合剂选自EDTA盐或枸橼酸盐。
9.根据权利要求4-8任一所述的注射剂，包括厚朴酚、和厚朴酚或其混合物0.1～10％，聚乙二醇200～400 1～30％，甘油或丙二醇或乙醇或它们的混合物10～50％，亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、维生素C或它们的混合物0.1～1％，EDTA二钠盐0.01～0.03％。
10.根据权利要求4-9任一所述的注射剂，包括厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物0.1～10％，pluronic F-68 0.2～10％，甘油、丙二醇、乙醇或它们的混合物1～50％，亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、维生素C或它们的混合物0.1～1％，EDTA二钠盐0.01～0.03％。
11.根据权利要求4-10任一所述的注射剂，包括厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物0.1～10％，cremophor EL 1～20％，甘油、丙二醇、乙醇或它们的混合物1～50％，亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、维生素C或它们的混合物0.1～1％，EDTA二钠盐0.01～0.03％。
12.一种含有厚朴酚、和厚朴酚或其混合物的的固体分散制剂，其特征在于制剂中各组分的重量百分比为，厚朴酚、和厚朴酚或二者混合物5～50％，水溶性载体50～95％。
13.根据权利要求12所述的固体分散制剂，所述的水溶性载体选自PEG、聚乙烯吡咯烷酮、pluronic F-68，尿素，糖类及其糖类与PEG的联合载体。
14.根据权利要求12-13任一所述的固体分散制剂，可将固体分散制剂按常规的制剂技术制备成滴丸，或与崩解剂、溶胀辅料和稀释剂混合制备成片剂、胶囊或颗粒剂。
15.一种含有厚朴酚、和厚朴酚或其混合物的缓释制剂，其特征在于制剂中各组分的重量百分比为，包括厚朴酚、和厚朴酚或二者的混合物5～50％，高分子辅料95～50％。
16.根据权利要求15所述的缓释制剂，所述的高分子辅料选自PEG，甲基纤维素，羟丙基纤维素，乙基纤维素，PVP，羟丙基甲基纤维素，尤其是可与蔗糖，淀粉，硬脂酸镁，滑石粉混合后，按常规制剂技术制得缓释片剂或缓释胶囊。
全文摘要
本发明涉及厚朴酚，和厚朴酚或其混合物的制剂及其用于制备预防或治疗心脑血管疾病的药物中的用途，所述心脑血管疾病为冠心病，心绞痛，心律失常，老年心力衰竭和脑缺血性疾病，尤其是用于预防或治疗脑血栓形成，脑梗死或脑栓塞的用途。本发明还涉及厚朴酚与和厚朴酚的提取方法，以及含有厚朴酚、和厚朴酚或其混合物的制剂，所述的制剂为注射剂、固体分散剂、缓释制剂和控释制剂。
文档编号A61P9/10GK1626067SQ20031012130
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月11日 优先权日2003年12月11日
发明者陈世忠, 王弘, 王银叶, 乌耀华 申请人:陈世忠