专利名称：A、o型口蹄疫病毒双价dna疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA疫苗，特别是一种家畜A、O型口蹄疫病毒双价DNA疫苗及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫是致偶蹄目动物的一种传播迅速、感染性高的发热性传染病，国际兽疫局将其列为A类传染病之首。该病的病原为口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease，FMDV)，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属。多年来，许多国家为了预防和控制口蹄疫，投资了大量的人力、物力、财力，但是该病仍在广大范围内流行。
自1989年发现该病以来，人们已研制出口蹄疫病毒的弱毒疫苗和灭毒疫苗，并广泛运用于生产。这两种疫苗虽然具有较好的免疫原性，但是生产的安全性较差，需要对实验室以及参加实验的工作人员采取保护措施，保证不被致病物质污染；保证病毒不泄漏。在疫苗生产过程中，病毒有可能没有被完全杀死或充分减毒，会导致疫苗中含有高毒性致病物质，进而导致被免疫动物发病而使疾病大规模流行。绝大多数现行疫苗的有效期较短，而且常常需要冷冻保存，这增大了疫苗在农村推广使用的成本。DNA重组技术的发展为制造新一代重组疫苗提供了新思路。
DNA疫苗，又称核酸疫苗，即将外源基因克隆到真核表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体免疫系统，引发免疫反应。1990年Wolff等人首先发现注射DNA能使载体上的基因在局部肌肉细胞内表达，之后DNA疫苗已广泛地用于病毒性、细菌性、寄生虫感染性疾病，并且近年来逐渐应用于肿瘤的治疗研究。与第一、二代疫苗相比，核酸疫苗具有安全可靠、生产简便、成本低廉、稳定性好、运输方便，而且能表达经修饰的天然抗原，诱导机体产生全面的免疫反应等特点。更重要的是DNA疫苗可实现将不同抗原的基因构建在同一个表达载体中，制备多价核酸疫苗。
口蹄疫共包括A、O、C等7种血清型。我国主要以O型为主，A型口蹄疫也时有发生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时有效地预防A、O型口蹄疫病毒的、制备简单、运输储存方便、成本低廉而又安全可靠的DNA疫苗及其制备方法。
本发明所说的A、O型口蹄疫病毒双价DNA疫苗，是将A、O型口蹄疫病毒毒株VP1蛋白的抗原决定簇部分的编码区串联，并与能提高其免疫原性DNA片段连接。核苷酸序列为1 GGATCCATGGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCT61 CGTACTTTGCCAGAGCTCCGATCGCGTCATAAACAGAAAATTGTGGCTCCAGTGAAACAG121 ACTTTGGAATTCGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTGGCTGCTCGTGTGGTG181 AAACAGTTGCCAGGTACCGTCGACGCAGTTCCAAACTTGCGTGGTGATTTGCAGGTTTTG241GCACAGAAAGTTGCTCGTACCTTGCCAGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTG301GCTGCTCGTGTGGTGAAACAGTTGCCATAG其中包含了O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列、A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列和连接片段。
本发明所说的A、O型口蹄疫病毒双价DNA疫苗的制备方法是1、将以上片段经酶切后与含真核启动子的真核表达载体相连接，转化大肠杆菌感受态细胞。
2、经酶切及PCR鉴定得阳性克隆，再经测序鉴定确认。
3、将此阳性克隆置于具相应抗性的培养基中培养，再加氯霉素，继续震荡培养，收集菌体，悬浮于缓冲液中，加裂解液裂解细菌，加入欲冷中和液中和，放置后离心。上清经过滤后加异丙醇，离心，沉淀用乙醇洗涤。
4、沉淀溶于Tris-EDTA(TE)缓冲液中，加入LiCl溶液，离心，上清加入异丙醇，离心后弃上清，用乙醇洗涤，沉淀的DNA用含RNAase的Tris-EDTA溶解，放置。
5、加含PEG 8000的NaCl，离心后收集DNA沉淀，经TE溶解后分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。
6、水相加乙酸铵及乙醇，离心去上清，用乙醇洗，晾干备用。
所说的真核启动子可选用猴空泡病毒SV40早期启动子，劳氏瘤病毒启动子(RSV)，腺病毒主要晚期启动子(ADV)或人巨细胞病毒(CMV)早期启动子等。
提取的质粒DNA应以闭合环状双链DNA为主，可以通过琼脂糖凝胶电泳判断。提取的DNA还需用紫外分光光度计进行浓度测定。通过OD260nm/OD280nm来估计DNA纯度，纯DNA样品该比值应在1.8～2.0之间，如果小于此值，说明有蛋白质等杂质污染；如大于此值，说明有RNA污染。
因为常用的转化菌均为革兰氏阴性细菌，其细胞壁上有一种称内毒素的成份，可使机体产生细菌性休克，在机体注射之前，应用鲎血试剂盒检测其内毒素含量。
将纯化后的DNA疫苗注射4～6龄的小鼠，注射免疫前先在接种部位注射25％蔗糖用于提高质粒转染效率，15分钟后在相同部位注射150μg DNA疫苗。半月后以相同剂量加强免疫一次，一周后眼眶采血，制备血清供ELISA检测用。ELISA板每孔分别包被5～10μg纯化的标准A或O型口蹄疫病毒蛋白，4℃过夜，洗涤液洗涤5～10分钟，用封闭液封闭1～2小时，按系列梯度稀释免疫后待测血清，加阴性、阳性血清作为对照，37℃温育1小时，洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，加200uL/孔TMB显色底物，室温避光30分钟，加终止液终止反应，酶标仪波长450nm，参考波长630nm处测OD值，用空白孔调零点，读取各孔OD值，如OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，被认为是阳性。测得DNA免疫小鼠后抗A和抗O型口蹄疫病毒的效价分别为10240、81920。
本发明具有以下优点1、属A、O型双价疫苗，免疫后动物能同时产生抗A、O型口蹄疫病毒的抗体；2、该疫苗制备安全，无减毒、灭活疫苗可能引起的致病作用；3、疫苗稳定性好、有效期长、运输储存方便、无特殊要求，有利于推广使用；4、诱导机体产生全面的免疫应答；5、能表达经修饰的天然抗原，具有与天然抗原相同的构象和抗原性；6、具有高产性，生产工艺简单，成本低廉。
具体实施例方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明实施例1将包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列、A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列、连接片段的合成序列，经酶切后与猴空泡病毒SV40早期启动子的真核表达载体相连接，转化大肠杆菌感受态细胞。经酶切及PCR鉴定得阳性克隆，再经测序鉴定确认。将此阳性克隆置于具抗性的培养基中培养过夜，次日加氯霉素，继续震荡培养，收集菌体，悬浮于缓冲液中，加新鲜配制的NaOH和SDS裂解细菌，加入欲冷中和液中和，放置后离心；上清经纱布过滤后加异丙醇，离心，沉淀用乙醇洗涤；沉淀溶于Tris-EDTA(TE)缓冲液中，加入等体积的LiCl溶液，离心，上清加入异丙醇，离心后弃上清，用乙醇洗涤，沉淀的DNA用含RNAase的Tris-EDTA溶解，室温放置；加等体积含PEG 8000的NaCl，离心后收集DNA沉淀，经TE溶解后分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次；水相加乙酸铵及乙醇，离心去上清，用乙醇洗，晾干备用。提取的质粒DNA应以闭合环状双链DNA为主，可经琼脂糖凝胶电泳判断。提取的DNA用紫外分光光度计进行浓度测定。通过OD260nm/OD280nm的比值估计DNA纯度，比值为1.8。
将纯化后DNA疫苗注射4龄小鼠，注射免疫前先在接种部位注射25％蔗糖用于提高质粒转染效率，15min后在相同部位注射150μg DNA疫苗。半月后相同剂量加强免疫一次，一周后眼眶采血，制备血清供ELISA检测用。ELISA板每孔分别包被5μg纯化的标准A或O型蛋白质，4℃过夜，洗涤液洗涤10min，用封闭液封闭2h，按系列梯度稀释免疫后的待测血清，加阴性、阳性血清作为对照，37℃温育1h，洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，加200μL/孔TMB显色底物，室温避光30min，加终止液终止反应，酶标仪波长450nm处测OD值，用空白孔调零点，如OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，认为是阳性。测得DNA免疫后抗A和抗O型口蹄疫病毒的效价分别为10240、81920。
实施例2将包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列，A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列、连接片段的合成序列，经酶切后与劳氏瘤病毒启动子(RSV)的真核表达载体相连接，转化大肠杆菌感受态细胞。经酶切及PCR鉴定得阳性克隆，再经测序鉴定确认。将此阳性克隆置于具抗性的培养基中培养过夜，次日加氯霉素，继续震荡培养，收集菌体，悬浮于缓冲液中，加新鲜配制的NaOH和SDS裂解细菌，加入欲冷的中和液中和，放置后离心。其余步骤与实施例1相同。
实施例3将包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列，A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列、连接片段的合成序列，酶切后与腺病毒主要晚期启动子(ADV)的真核表达载体相连接，次日转化大肠杆菌感受态细胞。经酶切及PCR鉴定得阳性克隆，再经测序鉴定确认。将此阳性克隆置于具抗性的培养基中培养过夜，次日加氯霉素，继续震荡培养，收集菌体，悬浮于缓冲液中，加新鲜配制的NaOH和SDS裂解细菌，加入欲冷的中和液中和，放置后离心。其余步骤与实施例1相同。
实施例4将包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列，A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列、连接片段的合成序列，经酶切后与人巨细胞病毒(CMV)早期启动子的真核表达载体相连接，转化大肠杆菌感受态细胞。经酶切、PCR鉴定和测序鉴定得阳性克隆。将此阳性克隆置于具抗性的培养基中培养，加入氯霉素后震荡培养，收集菌体，悬浮于缓冲液中，加新鲜配制的NaOH和SDS裂解细菌，加入欲冷的中和液中和，放置后离心。其余步骤与实施例1相同。
实施例5
化学方法合成的DNA片段与经BamHI和NotI双酶切的真核表达载体pCDNA3产物用T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM101。经酶切、PCR鉴定得阳性克隆pCDNA3-T8-3S，经测序鉴定确认。将此阳性克隆置于具有Ampr的LB培养基中，37℃下培养过夜，次日加氯霉素使其终浓度为150μg/mL，于37℃摇菌15h，再按以下方法进行质粒的大量提取及纯化菌液于4℃以4,000转/min离心15min，弃上清；将菌体悬浮于预冷的STE(0.1MNaCl，10mM Tris(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0))中，以4,000转/min离心15min，弃上清；收集的菌体用溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))悬浮；加新鲜配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，颠倒混匀6次，室温放置3min；加入预冷的溶液III(5M乙酸钾)，上下颠倒混匀，冰浴放置10min；12,000g 4℃离心15min；将上清经四层纱布过滤入离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min；12,000g室温离心15min弃上清，用70％乙醇洗涤，然后经100％乙醇洗涤；DNA沉淀溶于TE中；加入等体积的5M LiCl，4℃下以10,000转/min离心10min；上清转移至另一干净的离心管中，加入等量的异丙醇，充分混匀，室温10,000转/min离心10min；弃上清，用70％乙醇洗涤，蒸发乙醇；沉淀的DNA用含RNAase的TE(pH8.0)溶解，室温放置30min；加等体积含13％(W/V)PEG 8000的1.6M NaCl，充分混匀，用4℃12,000g离心5min，收集DNA沉淀，用pH8.0的TE溶解，用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次；将水相转至新的离心管中，加10M乙酸铵，充分混匀，加2倍体积乙醇，室温静置10min，于4℃，12,000g离心5min；去上清，用70％乙醇洗DNA，12,000g 4℃离心2min；去上清，晾干备用。
权利要求
1.A、O型口蹄疫病毒双价DNA疫苗，其特征在于将A、O型口蹄疫病毒毒株的VP1蛋白抗原决定簇部分的编码区串联，并与能提高其免疫原性的DNA片段连接。
2.如权利要求1所述的A、O型口蹄疫病毒双价DNA疫苗，其特征在于该疫苗的核苷酸序列为1 GGATCCATGGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCT61 CGTACTTTGCCAGAGCTCCGATCGCGTCATAAACAGAAAATTGTGGCTCCAGTGAAACAG121 ACTTTGGAATTCGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTGGCTGCTCGTGTGGTG181 AAACAGTTGCCAGGTACCGTCGACGCAGTTCCAAACTTGCGTGGTGATTTGCAGGTTTTG241GCACAGAAAGTTGCTCGTACCTTGCCAGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTG301GCTGCTCGTGTGGTGAAACAGTTGCCATAG其中包含了O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列；A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原决定簇基因编码序列和连接片段。
3.A、O型口蹄疫病毒双价DNA疫苗的制备方法，其特征在于其步骤为1)、将连接片段经酶切后与含真核启动子的真核表达载体相连接，转化大肠杆菌感受态细胞；2)、经酶切及PCR鉴定得阳性克隆，再经测序鉴定确认；3)、将此阳性克隆置于具抗性的培养基中培养，再加氯霉素继续震荡培养，收集菌体，悬浮于缓冲液，加NaOH和SDS裂解细菌，加入预冷的中和液中和，放置后离心；4)、上清经过滤后加异丙醇，离心，沉淀用乙醇洗涤；5)、沉淀溶于Tris-EDTA(TE)缓冲液中，加入LiCl，离心，上清加入异丙醇，离心后弃上清，用乙醇洗涤，沉淀的DNA用含RNAase的Tris-EDTA溶解，放置；6)、加含PEG 8000的NaCl，离心后收集DNA沉淀，经TE溶解后分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次；7)、水相加乙酸铵及乙醇，离心去上清，用乙醇洗，晾干备用。
4.如权利要求3所述的A、O型口蹄疫病毒双价DNA疫苗的制备方法，其特征在于所说的真核启动子可选用猴空泡病毒SV40早期启动子，劳氏瘤病毒启动子，腺病毒主要晚期启动子或人巨细胞病毒早期启动子等真核启动子。
全文摘要
涉及一种家畜A、O型口蹄疫病毒双价DNA疫苗。将A、O型口蹄疫病毒毒株的VP1蛋白抗原决定簇部分的编码区串联，与能提高其免疫原性的DNA片段连接。将片段酶切后与真核表达载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞；PCR鉴定得阳性克隆；经培养，收集菌体，裂解细菌，离心；上清经过滤，离心，洗涤；沉淀溶于缓冲液，加入LiCl，离心，弃上清，用乙醇洗涤，沉淀的DNA用含RNAase的Tris－EDTA溶解；加NaCl，离心后收集DNA沉淀，经TE溶解后抽提；水相加乙酸铵及乙醇，离心去上清，用乙醇洗。属A、O型双价疫苗，免疫后动物能同时产生抗A、O型口蹄疫病毒的抗体；无减毒、灭活疫苗可能引起的致病作用；高产、稳定、长效、储运方便；诱导机体产生全面免疫应答；能表达经修饰的天然抗原。
文档编号A61P31/00GK1557486SQ20041000215
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月13日 优先权日2004年1月13日
发明者陈亮, 邵寒娟, 苏勇波, 林涛, 陈 亮 申请人:厦门大学