专利名称：一种参附冻干粉针剂及其制备方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种参附冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术：
参附冻干粉针源于《校注妇人良方》中的参附汤，主要成分为人参、炮附子。按中医理论，主治元气大亏，阳气暴脱。
人参因加工方法不同有白参及红参之分，二者所含的成份不同，白参含Rb1、Rb2、及Rd，红参含特有的Rg3、Rh1及Rh2及人参三醇(Panaxytriol)。
红参为人参的栽培品经两次蒸制加工而成的干燥根，性味甘、微苦、温，归肺、心、脾经。其色泽红润，也有褐黄色者，其气浓香。红参具有良好的大补元气，回阳固脱的功用。用于临床常见的肺虚咳嗽，脾虚久泻久痢，中虚胃冷，血虚眩晕，肾虚喘促、体虚欲脱、肢冷脉微、气不摄血等症候，临床适用于心力衰竭、心源性休克等。
附子，为毛茛科植物乌头的子根加工品，具有回阳救逆、补火助阳、祛风寒湿邪的功效。附子的临床应用广泛，早在《金匮要略》、《伤寒论》中就有收载，但其毒性较强，临床上为了降低其毒性，常采用炮制、久煎等方法，但随着其毒性的降低，其疗效也随之减弱。为确保附子临床用药的安全性，本发明对提取工艺进行优选，以增加药材的利用率，减少其毒副作用。
参附汤能增强机体抵抗力、升高血压，改善体循环，同时还具有抗炎、抗内毒素作用以及抗过敏反应等作用。临床上适用于抗休克治疗。参附冻干粉针是为了进一步提高参附汤的疗效而开发的一种新剂型，具有起效迅速、质量稳定、使用方便等优点。
国内文献对参附针剂及注射剂报道较多，参附注射液可治疗溃疡性结肠炎、充血性心力衰竭，并可对抗体外循环中的炎性反应，在使用中未发现严重副作用。(魏蔚，李羽，魏新川，等，中国胸心血管外科临床杂志2002年11月第9卷第4期第262页；冯青根，参附注射液治疗充血性心力衰竭的疗效观察，上海中医药杂志，1999年第9期第16页；王康达，参附注射液治疗溃疡性结肠炎38例疗效观察，中医药研究2002年第18卷第4期第10页)但是参附注射剂型不便于贮存，稳定性不好，国内已有参附注射液说明书中明确指出，本品是纯中药制剂，保存不当可能影响质量，所以使用前应对光检查，药液出现混浊、沉淀、变色、漏气等现象时不能使用。
中国专利CN1051014是目前国内唯一一份公开的“一种参附注射液及其制备方法”，但该专利制备方法中，弃去了人参中的多糖成分，而人参多糖具有提高人体免疫力，提高NK细胞活性及淋巴细胞转化率，保护髓造血功能，升高白细胞、血小板等诸多作用，对促进休克病人的抵抗力和恢复具有促进作用。因此，多糖的丢弃是很可惜的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种稳定性好，运输和使用均较方便的参附冻干粉针剂。
本发明的参附冻干粉针剂由红参、附子的有效成份和注射用水溶性药用辅料组成，保留人参中人参多糖，使人参的有效成分含量更高。本发明的粉针剂采用冷冻干燥法除去药液中的水分制成粉针，较好的克服了水针剂产品的不稳定性，使贮存期延长，运输方便，可大规模生产，加入注射用等渗溶液后所得注射液各项指标均符合要求。
本发明是通过以下技术方案实现的。
1.将红参按回流法用60％-80％的乙醇回流3次，每次1小时，合并药液，滤过。滤液中加95％乙醇使溶液含醇量为85％，静置12-24小时，滤过，沉淀另用，滤液回收乙醇，浓缩液用非极性溶剂萃取3-4次；水相用有机溶剂萃取4-6次，有机溶剂相回收溶剂，得人参皂甙提取物。
所用非极性溶剂是乙醚、溶剂油、氯仿中的一种。
所用的有机溶剂是正丁醇、乙酸乙酯、丙酮中的一种。
2.将滤渣用水煎煮提2-3次，每次1.5-3小时，过滤，滤液加1％的鞣酸煮沸，过滤，或经离子交换树脂吸附，水洗脱，滤液或洗脱液减压浓缩至相对密度1.10-1.20(50℃)；浓缩液加入乙醇，使含醇量达到60％，静置12-24小时，过滤，收集沉淀；滤液继续加入乙醇使含醇量达到80％，静置12-24小时，过滤，收集沉淀，滤液回收乙醇。合并沉淀，用注射用水溶解，使溶液中糖含量为0.1％～1％，溶液经过滤后，过中空纤维柱超滤，截留分子量大于1000部分，超滤液减压浓缩至相对密度1.10-1.20(50℃)，得多糖溶液。
3.取黑附片洗净置煎煮器中，加水20倍量煎煮3次，每次2-6小时。合并煎液，滤过。滤液加95％乙醇使溶液中含醇量为60％，静置12-24小时，滤过，滤液中继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12-24小时，过滤，回收滤液中乙醇至尽，得附片提取液。
4.合并多糖溶液和附片提取液，将人参皂甙提取物加入混合液中，充分溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH值为5.5-7.0，加入0.1％～0.4％的吐温80和适量冻干赋形剂，按溶液量加入0.05％-0.3％的活性炭，煮沸10-15分钟，放冷、过滤至澄明，分装、冷冻干燥，即得本发明的参附冻干粉针剂。
下面通过正交实验对本发明的一种参附冻干粉针剂及其制备方法作进一步的说明。
1.红参提取工艺的优选为确定红参的最佳提取工艺，我们进行了正交试验研究，根据预试验结果表明，影响提取液人参总皂苷含量的主要因素有醇提浓度、提取次数、回流时间等，因此采用正交实验考查上述三因素不同水平对提取液人参总皂苷含量的影响。
表1因素水平表因素水平醇提浓度提取次数回流时间A(％) B(次) C(小时)1 60 1 12 70 2 23 80 3 3表2L9(34)人参提取工艺正交试验结果因素 结果试验号A B C E 人参总皂苷％1 1 1 1 1 2.102 1 2 2 2 4.123 1 3 3 3 4.964 2 1 2 3 2.865 2 2 3 1 4.016 2 3 1 2 4.787 3 1 3 2 2.868 3 2 1 3 4.109 3 3 2 1 4.45I 11.18 7.8210.98 10.56
II 11.65 12.23 11.43 11.76III11.41 14.19 11.83 11.92R 0.476.370.851.36方差分析Tests of Between-Subjects EffectsDependent VariableX
a.R Squared＝0.952(Adjusted R Squared＝0.807)经直接观察与方差分析，对人参总皂苷提取率影响的主要因素为提取次数。正交实验中最优组合为A2B3C3。因此确定红参的优选提取工艺为A2B3C3，即人参加70％乙醇提取3次，回流3h。而回流时间不是影响提取率的显著因素，故采取回流1小时工艺以节约时间。
2.附子提取工艺优选参照临床实践选用水煎工艺，主要考查提取时的加水量、提取时间和提取次数对乌头碱提取率的影响。
表1因素水平表因素水平提取次数提取时间加水量A(次) B(小时) C(倍)1 1 3 10
2 2 4.5 153 3 6 20表2 附子提取工艺正交试验设计及结果因素 结果试验号A B C E 乌头碱含量mg1 1 1 1 1 0.15292 1 2 2 2 0.16323 1 3 3 3 0.12084 2 1 2 3 0.27085 2 2 3 1 0.22166 2 3 1 2 0.18357 3 1 3 2 0.29118 3 2 1 3 0.21959 3 3 2 1 0.1964I 0.4369 0.7148 0.5559 0.5709 T＝1.8198II0.6759 0.6043 0.6304 0.6378 CT＝T2/9＝0.3680III 0.707 0.5007 0.6335 0.6111R 0.2701 0.2141 0.0745 0.0669方差分析Tests of Between-Subjects EffectsDependent VariableX
a.R Squared＝0.969(Adjusted R Squared＝0.875)经直接观察与方差分析，对乌头碱含量影响的主要因素为提取次数，正交实验中最优组合为A3B1C3。由于在A3B1C3提取条件下乌头碱的含量超过乌头碱0.2mg的中毒剂量，为了降低其毒性，选用提取时间为4.5小时，以A3B2C3条件进行提取，即加水20倍量提取3次，每次4.5小时。实验结果显示在此条件下的乌头碱含量为0.1973mg，符合要求。
以下通过药效实验对本发明作进一步说明实验一、参附冻干粉针剂的体外溶血实验(因其含人参皂苷)1实验材料 参附冻干粉针剂，北京乾露春科技有限公司实验室提供；家兔，8只，由第一军医大学实验动物中心提供，体重1.7～2.2kg。
2实验方法与结果家兔颈动脉取血，去纤维蛋白原，加约10倍于血液的生理盐水洗涤离心，去上清液，反复数次，至上清液不现红色为止，以生理盐水稀释成2％的红细胞悬液。取洁净试管12支，分为2组，依次编号，按表2所列先在各管加入2％兔红细胞悬液及生理盐水混匀，置37℃恒温箱中30分钟后，各管加入不同量的参附冻干粉针剂(第1、7号管为对照不含参附冻干粉针)，摇匀后再置37℃恒温箱中，于15、30、60、120、180、240分钟各观察一次，若溶血则溶液呈透明红色，如有棕色沉淀，表示有红细胞凝聚作用，摇动数次后消失为假凝聚，否则为真凝聚。
实验结果见表1。结果显示参附冻干粉针剂在高剂量和低剂量情况下均未有溶血和引起红细胞凝聚的作用。
表1参附冻干粉针剂溶血实验试管号试剂类别与剂量1234567891011122％红细胞悬液(ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5生理盐水(ml) 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0参附粉针剂5mg/20ml 00.1 0.2 0.3 0.4 0.5参附粉针剂10mg/20ml 00.1 0.2 0.3 0.4 0.5
溶血 - - - - - - - - - - - -红细胞凝聚- - - - - - - - - - - --表示无溶血或红细胞凝聚实验二、参附冻干粉针剂对小白鼠烫伤性休克的影响观察1.实验材料 参附冻干粉针剂，北京乾露春科技有限公司实验室提供；雄性小白鼠，由第一军医大学实验动物中心提供，体重16～25g。
2.方法 采用雄性小白鼠100只分2组，实验组动物50只，实验前3天，每天腹腔注射参附冻干粉针剂1次，对照组小白鼠50只注射蒸馏水，给药方法同实验组。在烫伤前1小时，各组动物均再腹腔注射1次。烫伤性休克按Rosenthal方法，在烫伤前小白鼠饥饿17小时，烫伤时将小白鼠齐颈部浸入65℃水浴中10秒钟，然后取出，观察5h、8h、12h、24h的死亡数，计算死亡率。
实验结果见表2。
表2参附冻干粉针剂对小鼠烫伤性休克的影响分组动物数烫伤后不同时间内小白鼠的死亡只数和死亡率(％)5小时 8小时 12小时 24小时对照组 5026(52％) 33(66％) 37(74％)41(82％)参附粉针剂组5016(32％)*20(40％) 28(56％)31(62％)*(8mg/kg) ***P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较。
实验三、参附冻干粉针剂对内毒素所致小鼠休克的影响1.实验材料 参附冻干粉针剂，北京乾露春科技有限公司实验室提供；大肠杆菌内毒素，Sigma公司出品，雄性小白鼠，由第一军医大学实验动物中心提供，体重16～25g。
2.方法小鼠100只随机分为5组，静脉给药每天1次，连续5天。停药24小时后用大肠杆菌内毒素(25mg/kg)静脉给药，观察小鼠的休克死亡数，计算死亡率，阳性对照药选用市售参附注射液(10mg/kg)，结果见表3。
表3参附冻干粉针剂对内毒素所致小鼠休克的影响药物 动物数 死亡数 死亡率生理盐水 20 18 90％市售参附注射液20 945％*(10mg/kg)参附冻干粉针剂20 11 55％*(4mg/kg)参附冻干粉针剂20 840％**(8mg/kg)参附冻干粉针剂20 525％**(12mg/kg)*P＜0.05，**P＜0.01，与生理盐水组比较。
实验四、参附冻干粉针剂的抗缺血性休克作用1.实验材料 参附冻干粉针剂，北京乾露春科技有限公司实验室提供；动物健康成年杂种犬，体重12～18kg，雌雄兼用，由第一军医大学实验动物中心提供。
2.方法杂种犬30只分为5组，每组6只。对照组给予等容量生理盐水，阳性对照药组给予市售参附注射液0.6ml/kg，实验组分为参附冻干粉针剂3mg/kg、6mg/kg、9mg/kg 3个剂量组，均采用缓慢股静脉给药。将犬以戊巴比妥钠麻醉，背位固定，分离气管，插管进行人工呼吸。分离右侧颈总动脉，插管连接AP-6001放大器，测定血压。分离左侧颈总动脉，打开左腹腔分离左侧肾动脉，分别放置电子流量计探头测定脑血流量及肾血流量。分离右侧股动脉，连接AP-6001放大器，进行心室内插管，测定左室内压、左室舒末压。分离右侧股静脉，插管以备给药和采血。分离左侧股动脉，插管以备放血。手术完毕后15分钟，左侧股动脉慢慢放血至平均动脉压为40mmHg时，停止放血，持续观察10分钟，如血压无明显波动，开始给药观察。记录给药前及给药后5、15、30、45、60、90分钟的各项指标。(李仪奎.中药药理实验方法学(第一版).上海科学技术出版社，1991.)结果参附冻干粉针剂(3mg/kg、6mg/kg、9mg/kg)和市售参附注射液均可使失血性休克犬的收缩压、舒张压、平均动脉血压均有所升高(P＜0.05，P＜0.01)，同时能增加脑血流量、肾血流量(P＜0.05)，而对心率无明显影响(P＞0.05)。但参附冻干粉针剂优于市售参附注射液的效果。
综上所述参附冻干粉针剂能有效对抗因烫伤、中毒、失血所致的休克。
具体实施例方式
实施例一1按重量比为1∶2选取红参1kg、黑附片2kg。
将红参用70％的乙醇10倍量回流3次，每次1小时，合并药液，滤过。滤液中加95％乙醇使溶液含醇量为85％，静置24小时，滤过，沉淀另用，回收滤液中的乙醇至尽；浓缩液用乙醚萃取3-4次；水相用正丁醇萃取4-6次，正丁醇相回收正丁醇，得人参皂甙提取物。滤渣用沸水煮提2次，每次2小时，过滤，滤液加1％的鞣酸煮沸，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.10-1.20(50℃)，浓缩液加入乙醇，使含醇量达到60％，静置24小时，过滤，收集沉淀；滤液继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置24小时，过滤，收集沉淀；滤液回收乙醇。合并沉淀，用注射用水溶解，使溶液中糖浓度为0.1％，溶液经过滤后，过中空纤维柱超滤，截留分子量大于3000，超滤液减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50℃)，备用。取黑附片，洗净置煎煮器中，加水20倍量煎煮3次，每次4.5小时。合并煎液，滤过。浓缩滤液，加95％乙醇使溶液中含醇量为60％左右，静置24小时，滤过，滤液中继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置24小时，过滤，回收滤液中的乙醇至尽。得黑附片提取液。合并多糖溶液和附片提取液，将人参皂甙提取物加入上述混合溶液中，充分溶解后，调PH至6.0-6.5，加0.2％的吐温80和适量冻干赋形剂，按溶液量加入0.1％的活性炭，煮沸10-15分钟、放冷、过滤、分装，冷冻干燥，即得本发明的参附冻干粉针剂。实测每支冻干粉针剂含人参皂甙＞10mg、乌头碱≤0.5mg。
实施例二按重量比为1∶2选取为红参2kg与黑附片4kg。将红参用80％的乙醇回流3次，每次1小时，合并药液，滤过。滤液中加95％乙醇使溶液含醇量为85％左右，静置12小时，滤过，沉淀另用，回收滤液中的乙醇，得浓缩液。浓缩液用乙醚萃取3-4次；萃取液回收溶剂油；水相用乙酸乙酯萃取6次，乙酸乙酯相回收溶剂，得人参皂甙提取物。将提取人参皂甙后的人参滤渣用沸水煮提2次，每次1小时，过滤，滤液过离子交换柱，用去离子水洗脱，洗脱液减压浓缩至相对密度1.10-1.20(50℃)，浓缩液加入乙醇，使含醇量达到60％，静置12小时，过滤，收集沉淀；滤液继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12小时，过滤，收集沉淀；滤液回收乙醇。合并沉淀，用注射用水溶解，使溶液中糖浓度为0.5％，溶液经过滤后，过中空纤维柱超滤，截留分子量大于1000，超滤液减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50℃)，备用。取黑附片，洗净置煎煮器中，加水20倍量煎煮3次，每次4.5小时。合并煎液，滤过。浓缩滤液，加95％乙醇使溶液中含醇量为60％左右，静置12小时，滤过，滤液中继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12小时，过滤，回收滤液中的乙醇至尽。得附片提取液。合并多糖溶液和附片提取液，将人参皂甙提取物加入上述混合液中，充分溶解后，调PH至6.5-7.0，加0.2％的吐温80和适量甘露醇，按溶液量加入0.8％的活性炭，煮沸10-15分钟、放冷、过滤、分装，冷冻干燥，即得本发明的参附冻干粉针剂。实测每瓶含人参皂甙＞10mg、乌头碱≤0.5mg。
实施例三按重量比为1∶2选取为红参2kg与黑附片4kg。将红参用80％的乙醇回流3次，每次1小时，合并药液，滤过。滤液中加95％乙醇使溶液含醇量为85％左右，静置12小时，滤过，沉淀另用，回收滤液中的乙醇，得浓缩液。浓缩液用氯仿萃取3-4次；萃取液回收溶剂油；水相用正丁醇萃取6次，正丁醇相回收溶剂，得人参皂甙提取物。将提取人参皂甙后的人参滤渣用沸水煮提2次，每次1小时，过滤，滤液过离子交换柱，用去离子水洗脱，洗脱液减压浓缩至相对密度1.10-1.20(50℃)，浓缩液加入乙醇，使含醇量达到60％，静置12小时，过滤，收集沉淀；滤液继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12小时，过滤，收集沉淀；滤液回收乙醇。合并沉淀，用注射用水溶解，使溶液中糖浓度为0.8％，溶液经过滤后，过中空纤维柱超滤，截留分子量大于1000，超滤液减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50℃)，备用。取黑附片，洗净置煎煮器中，加水20倍量煎煮3次，每次4.5小时。合并煎液，滤过。浓缩滤液，加95％乙醇使溶液中含醇量为60％左右，静置12小时，滤过，滤液中继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12小时，过滤，回收滤液中的乙醇至尽。得附片提取液。合并多糖溶液和附片提取液，将人参皂甙提取物加入上述混合液中，充分溶解后，调PH至6.5-7.0，加0.2％的吐温80和适量甘露醇，按溶液量加入0.8％的活性炭，煮沸10-15分钟、放冷、过滤、分装，冷冻干燥，即得本发明的参附冻干粉针剂。实测每瓶含人参皂甙＞10mg、乌头碱≤0.5mg。
权利要求
1一种参附冻干粉针剂，其特征在于它是由红参、附子的有效部位提取物注射液用水溶性药用辅料和冻干赋形剂组成。
2一种参附冻干粉针剂的制备方法，其特征在于它包括以下步骤(1)按重量比为1∶2选取为红参与黑附片原料药。(2)将红参用60％-85％的乙醇回流3次，每次1小时，合并药液，滤过。滤液中加95％乙醇使溶液含醇量为80％左右，静置12-24小时，滤过，沉淀另用，回收滤液中的乙醇，得浓缩液。浓缩液用非极性溶液萃取3-4次；萃取液回收溶剂；水相用有机溶剂萃取4-6次，有机溶剂相回收溶剂，得人参皂甙提取物。(3)将提取人参皂甙后的得人参滤渣用沸水煮提2～3次，每次1.5-3小时，过滤，滤液加1％的鞣酸煮沸，过滤，或经离子交换树脂吸附后水洗脱，滤液或洗脱液减压浓缩至相对密度1.10-1.20(50℃)，浓缩液加入乙醇，使含醇量达到60％，静置12-24小时，过滤，收集沉淀；滤液继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12-24小时，过滤，收集沉淀；滤液回收乙醇。合并沉淀，用注射用水溶解，使溶液中糖浓度为0.1％～1％，溶液经过滤后，过中空纤维柱超滤，截留分子量大于1000，超滤液减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50℃)，备用。(4)取黑附片，洗净置煎煮器中，加水20倍量煎煮3次，每次2-6小时。合并煎液，滤过。浓缩滤液，加95％乙醇使溶液中含醇量为60％左右，静置12-24小时，滤过，滤液中继续加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12-24小时，过滤，回收滤液中的乙醇至尽。得附片提取液。(5)合并多糖溶液和附片提取液，将人参皂甙提取物加入上述混合液中，充分溶解后，调PH至5.0-7.0，加0.2％-0.4％的吐温80和适量冻干赋形剂，按溶液量加入0.05％～0.3％的活性炭，煮沸10-15分钟、放冷、过滤、分装，冷冻干燥，即得本发明的参附冻干粉针剂。
3根据权利要求2，所述的红参提取工艺为乙醇浓度为70％(v/v)，提取时间为每次1小时，提取次数为3次。
4根据权利要求2，所述黑附片提取工艺为提取用水量为20倍，提取次数为3次，每次提取时间为4.5小时。
5根据权利要求2，所述非极性溶剂是乙醚、溶剂油、氯仿中的一种。
6根据权利要求2，所述的有机溶剂是乙酸乙酯、正丁醇、丙酮中的一种。
7根据权利要求2所述的冻干赋形剂可以是任意常用的冻干赋形剂。
8根据权利要求7所述的冻干赋形剂也可以是甘露醇、乳糖、蔗糖、或葡萄糖中的一种或两种的复合赋形剂。
全文摘要
本发明涉及一种主要用于抗休克治疗的一种参附冻干粉针剂及其制备方法，该参附冻干粉针剂是由人参、附子的有效部位和注射用水溶性药用辅料组成，采用冷冻干燥法除去药液中的水分制成粉针剂。本发明所述冻干粉针剂，较水针剂产品的稳定性好，便于贮存，运输方便，可大规模生产，加入注射用水后所得注射液各项指标均符合要求。该产品可增强机体抵抗力、升高血压，改善循环，同时还具有抗炎作用以及抗过敏反应等作用。
文档编号A61P9/00GK1557361SQ20041000216
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月16日 优先权日2004年1月16日
发明者张正生 申请人:张正生