专利名称：选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂及其制备方法。该制剂包括纳米级的活性炭载体和抗胃癌药，属于一种用于胃癌治疗的新的靶向制剂。
背景技术：
目前胃癌的根治疗法为手术切除。预防术后复发和转移的主要措施为化疗。但手术疗法不能彻底解决胃癌的转移和复发，术中所造成的癌细胞种植转移也屡见不鲜。化疗是不能手术的晚期胃癌及预防胃癌根治术后复发和转移的主要辅助手段。对于化疗，目前并非是因为抗癌药物不能杀死癌细胞，而是因为化疗药物缺乏对癌细胞的选择性，在杀死癌细胞的同时也杀死正常细胞，尤其是骨髓造血系统对循环中的抗癌药物最为敏感。造成化疗失败的原因，往往是机体不能耐受药物毒性而不得不停药。因此，找到选择性杀灭癌细胞的药物或使药物能选择性地作用于癌组织或癌细胞，减少进入体循环的药物的量，减少其对正常组织和细胞的损伤作用，将能对癌症进行有效的治疗，避免或减少术后复发和转移，提高患者的无瘤生存期或使癌症得到彻底治疗。
用活性炭作为载体吸附抗癌药进行腹腔化疗和淋巴化疗是近些年兴起的针对于胃癌转移和复发而采取的一种高选择性、高浓度、超强化的化疗手段。其基本原理在于活性炭的淋巴组织趋向性及对吸附抗癌药的缓释特性。活性炭吸附抗癌药改变了抗癌药的剂型，与常规抗癌药水溶液相比，具有5个突出的特点(1)高吸附性和功能缓释性；(2)淋巴组织趋向性；(3)局部滞留性；(4)肿瘤表面的附着性；(5)毒副作用小。由于活性炭的高吸附性，因而可以吸附大量的抗癌药。活性炭微粒的粒径较大，可以进入淋巴管而不能被血管吸收。在被注射于腹腔、肿瘤局部区域或其引流淋巴结后，就只能沿淋巴系统移行，并在淋巴结内聚集，因而具有很高的淋巴组织趋向性，并在淋巴系统内长期存留。由于其吸附的抗癌药量大，又具有功能缓释性，因而能够使其周围抗癌药长期维持于高浓度，杀灭淋巴系统内的转移癌灶及游离癌细胞，起到杀灭手术不能清除的微小癌灶及癌细胞(临床称之为化学清除)的作用，因此能有效地防止癌的复发。同时由于其长期存在于癌转移的必经之路上，因此能有效地阻断癌的转移。长期存在于癌区淋巴组织内的吸附抗癌药的活性炭，还可以对癌组织发挥直接的杀伤作用。由于活性炭可附着于癌细胞表面，在癌细胞的表面释放抗癌药，因而更利于抗癌药物作用的发挥。由于活性炭不能通过血管吸收进入血液循环，因而抗癌药也很少或者不能进入血液循环，因此不会或很少对血液系统、骨髓等其它正常或敏感组织造成损害，有效地减少抗癌药的毒、副作用。
在述及活性炭吸附抗癌药对胃癌进行腹腔化疗和淋巴化疗的诸多优越性时，临床实践中还注意到活性炭在用于腹腔化疗时还存在着一些问题，限制腹腔化疗和淋巴化疗的应用。一是目前所用的活性炭的粒径较大，为微米级，如进入血液循环，有造成栓塞的危险；二是目前所用的活性炭微粒形态不规则，容易刺激局部组织，引起炎症，造成腹腔粘连；三是目前没有用于胃癌腹腔化疗和淋巴化疗的专用制剂，往往是临床医生自己在手术时将活性炭与抗癌药混合后使用。因此不仅使用不便，而且制备过程不标准，吸附量不规则，且容易造成感染。以上内容参见Jansen M等，Effects of intraperitonealmitomycin C adsorbed on activated carbon on adhesion formationand mesothelial cells in vitro，Eur.J.Surg.，2000，166，572-6。
发明简述本发明人通过研究发现，将活性炭制成纳米级活性炭颗粒，然后将所得到的纳米级活性炭颗粒与已知的抗癌药组合制成纳米级制剂，可以使抗癌药选择性靶向胃癌组织和淋巴系统，同时不会造成栓塞和腹腔粘连，从而解决了现有技术中的上述缺陷。
因此，本发明的一个方面提供了一种选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂，该制剂包括纳米级活性炭和抗癌药。
本发明的另一个方面提供了一种制备选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂的方法，该方法包括以下步骤将抗癌药制成水溶液；将纳米级活性炭置于抗癌药水溶液中，在一定条件下进行吸附；吸附完毕后，除去水分，得到纳米级活性炭-抗癌药；将纳米级活性炭-抗癌药进行分装、密封、灭菌、避光保存。
发明详述如上所述，本发明的一个方面提供了一种选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂，该制剂包括纳米级活性炭和抗癌药。
在本发明的纳米级制剂中，纳米级活性炭可通过使用球磨机球磨市售活性炭或市售医用活性炭制备。在所得的纳米级活性炭中，优选粒径为10-800nm的活性炭粒子占粒子总数的95％以上，并且优选其平均粒径为299±150nm。
在本发明的纳米级制剂中，抗癌药可以是常用的抗胃癌药，例如丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶等，优选丝裂霉素C。
在本发明的纳米级制剂中，纳米级活性炭与抗癌药，如丝裂霉素C的重量比可以为4∶1-18∶1，优选为8.5∶1。
本发明的纳米级制剂还可以包括其它药学上可接受的分散稳定剂，例如吐温-80、右旋糖苷、豆磷脂、去氧胆酸钠等。
本发明的另一个方面提供了一种制备选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂的方法，该方法包括以下步骤将抗癌药制成水溶液；
将纳米级活性炭置于抗癌药水溶液中，在一定条件下进行吸附；吸附完毕后，除去水分，得到纳米级活性炭-抗癌药；将纳米级活性炭-抗癌药进行分装、密封、灭菌、避光保存。
在上述制备方法的一个优选实施方案中，纳米级活性炭与抗癌药，如丝裂霉素C的重量比可以为4∶1-18∶1，优选为8.5∶1。
在上述制备方法的另一个优选实施方案中，可以使用蒸馏水将抗癌药制成水溶液。其中，蒸馏水与抗癌药，如丝裂霉素C的重量可以为6∶1-25∶1，优选为12.5∶1。
在上述制备方法的另一个优选实施方案中，可以在超声振荡条件下进行吸附操作。其中吸附时间可以为20-60分钟，优选为30分钟。
在上述制备方法的另一个优选实施方案中，可以使用常规的方法除去水分，优选使用冷冻减压干燥法除去水分。
在上述制备方法的另一个优选实施方案中，可以使用玻璃安瓶进行分装。分装后每个玻璃安瓶(10ml)中纳米级活性炭的含量可以为0.85-3.4g，优选为1.7g；而每个玻璃安瓶(10ml)中抗胃癌药的含量可以为0.1-0.4g，优选为0.2g。
本发明的纳米级制剂主要用于胃癌腹腔化疗和淋巴化疗，以防止胃癌的复发和转移；也可用于根治术前或术中标记淋巴结并杀灭其中的微小转移癌灶，同时起到指导手术清除和化学清除的作用，以预防胃癌的复发和转移；还可用于胃癌性腹膜炎及胃癌性腹水的治疗。
使用时，用生理盐水稀释作胃浆膜下、淋巴结、癌区、癌组织注射或腹腔注射，用于胃癌腹腔化疗和淋巴化疗、胃癌引起的癌性腹膜炎和癌性腹水；也可用于癌手术时标记淋巴结，指导手术清除或转移淋巴结的“化学清除”。
本发明的选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂具有如下新的特点1、由于载体粒子粒径为纳米级，远小于毛细血管直径，因此即使本发明的纳米级制剂进入循环，也不会造成栓塞；2、由于在制备本发明的纳米级活性炭时，球磨机对活性炭进行长时间的研磨，使其在形态成为近球形，且表面变得平滑，因此本发明的纳米级制剂在腹腔注射后对腹膜的刺激性减小，因此较少引起炎症，因而也很少或不引起腹膜粘连；3、由于本发明的纳米级制剂的制备过程统一，吸附时间恒定，活性炭与抗癌药的比例规则，因此使剂量的使用更为规则，因而可收到更好的疗效；4、特殊制备的本发明的纳米级制剂，可经常规灭菌处理，避免了临床应用时临时配制，由于未经灭菌过程而很容易造成感染的弊病；5、制备出本发明的纳米级制剂，省去了临时吸附制备的麻烦，方便应用。这种纳米级制剂不仅可在具有手术条件的高级医院使用，也可以在没有手术条件的乡村使用；6、所用的纳米级活性炭比目前所用的微米级活性炭具有更强的吸附抗癌药的能力，经腹腔或淋巴结注射后可以使腹腔内或注射局部组织内的有效药物浓度保持更长时间；7、纳米级活性炭本身的毒性较微米级活性炭降低，使用时具有更好的安全系数；8、在实验性腹腔化疗中，纳米级活性炭较微米级活性炭具有更好的疗效，抑癌率可达85％以上；9、本发明的纳米级制剂中的抗癌药优选采用丝裂霉素C。丝裂霉素C的杀灭胃癌细胞的量效关系呈指数性，因此用此纳米级制剂提高其在癌组织、腹腔及淋巴系统中的浓度后，明显提高对胃癌的治疗效果且能有效地减少复发和转移。
具体实施例方式
以下结合实际应用，对本发明的选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂的制备方法及应用作进一步的说明。这些实例仅用于说明本发明，而不起限定作用。
实施例1纳米级活性炭的制备取市售医用活性炭(北京大力精细化工厂)约40g，装入行星牌球磨机球磨60小时。然后取球磨后的活性炭3g加三次蒸馏后的水3000ml充分混匀，静置72小时，待在容器底部可见明显沉淀，其上层液体透明，沉淀与上清界限分明时，取上清置1000ml不锈钢滤器中，通过0.22μm的微孔滤膜加压滤去水分，在烘箱中于120℃烘烤2小时。最后再用三次蒸馏后的水稀释，用原子力显微镜进行检测并进行粒度分析。原料40g医用活性炭可重复利用，除去损耗，最后所得纳米级活性炭的产量为38g。
实施例2本发明纳米级制剂的制备取按照实施例1的方法制备的纳米级活性炭102g和日本协和制药株式会社生产的抗癌药丝裂霉素C12g；将丝裂霉素C溶于150ml无菌、无热原蒸馏水中；将纳米级活性炭置于丝裂霉素C溶液中，在超声振荡条件下吸附30分钟；用冷冻减压干燥法除去水分，得固体干燥物114g；将114g的纳米级活性炭-丝裂霉素C分装于60个10ml玻璃安瓶中，每瓶含纳米级活性炭和丝裂霉素C各为1.7g和0.2g；也可以将114g纳米级活性炭-丝裂霉素C分装于120个10ml的玻璃安瓶中，每瓶含纳米级活性炭0.85g，丝裂霉素C 0.1g；也可以将114g的纳米级活性炭-丝裂霉素C分装于30个10ml的玻璃安瓶中，每瓶含纳米级活性炭-丝裂霉素C 3.8g，其中纳米级活性炭和丝裂霉素C的含量各为3.4g和0.4g；将玻璃安瓶密封；高温高压灭菌120分钟，避光保存。
通过以上制备方法，得到以下不同规格的纳米级制剂1)纳米级活性炭1.7g+丝裂霉素C 0.2g/10mL玻璃安瓶；2)纳米级活性炭0.85g+丝裂霉素C 0.1g/10mL玻璃安瓶；3)纳米级活性炭3.4g+丝裂霉素C 0.4g/10mL玻璃安瓶。
实施例3本发明纳米级制剂的生物活性测试除了给药时间不同之外，测试方法的其余部分参见梁寒等，活性炭吸附丝裂霉素C腹腔化疗的临床实验研究，中国肿瘤临床，2000，27，897-901；李义生等，淋巴化疗对胃癌淋巴转移灶的临床治疗研究，中国肿瘤临床，2001，28，771-774。
取实施例2制备的纳米级制剂对裸鼠人胃癌腹腔种植转移模型进行了实验性腹腔化疗。结果表明这种纳米级制剂对种植转移的癌灶具有明显的杀灭作用，疗效明显优于游离丝裂霉素C腹腔化疗和用微米级活性炭吸附丝裂霉素C腹腔化疗，结果见表1。
表1.本发明纳米级制剂对人胃癌裸鼠腹腔种植膜型的腹腔化疗作用
Mean±SD，n＝8。*p＜0.05，与生理盐水组比较；#p＜0.05，与游离丝裂霉素C组比较。BALB/C-nu裸鼠，4周龄，体重12-15g，人胃癌裸鼠移植模型细胞悬液(1.3×10-6)腹腔接种后第十二天开始给药，于给药后第二十二天处死，解剖观察肿瘤生长情况，取瘤在万分之一天平上称重，用SPSS11.0统计软件进行数据处理，单因素方差分析检测组间差异。
这种制剂及早给药明显减少腹腔种植胃癌的转移范围和转移癌灶的数目，在部分裸鼠胃癌腹腔种植模型上，可完全避免胃癌的发生和转移，结果见表2、表3。
表2.本发明纳米级制剂对种植胃癌的抗转移和抗复发作用
Mean±SD，n＝8。*p＜0.05，**p＜0.01与生理盐水组比较；#p＜0.05，##p＜0.01与丝裂霉素C 6mg/kg组比较。BALB/C-nu裸鼠56只，6周龄，体重16g-20g，随机分7组，每组8只，雌雄各半。腹腔接种人胃癌裸鼠移植模型细胞悬液(1.6×106)，接种1小时后给药，给药后第28天解剖观察，取肿瘤称重。
表3.本发明纳米级制剂对肿瘤播散及生长情况的影响
应用SPSS10.0统计软件包，列联表资料分析(Crosstabs)，分层资料的χ2检验表明2、3、4、5、6、7组与1组(生理盐水对照组)比，P均＜0.01，表明在瘤细胞腹腔接种后立即腹腔注射药物，单纯MMC、活性炭与MMC混匀后注射与本制剂均有明显抑制肿瘤播散的效果。4、5、6组与2组比，P均＜0.01；6组与3组比，P＜0.05，表明由于吸附MMC活性炭具有功能性缓释性，因此其抑瘤效果优于单纯MMC。6组与4组比，P＞0.05，表明MMC剂量相同情况下，本制剂具有与文献报道活性炭吸附MMC同样优良的抑制肿瘤播散及肿瘤生长的效果。5组与4组相比p＜0.05，表明活性炭纳米化后，可以进一步加大剂量，取得更为明显的抗复发转移效果。6组与5组比，P＞0.05；7组与5组比，P＜0.01；7组与6组比，P＞0.05，表明制剂的抗癌活性具有一定的量效关系。从表中还可以看到，第5组8只动物有四只没有肿瘤发生，所有8只小鼠均没有肠壁外部位的转移癌灶，表现出良好的抗转移效果。第一组生理盐水对照；第二组丝裂霉素C6mg/kg ip；第三组丝裂霉素C0.36mg/kg ip；第四组丝裂霉素C-活性炭51mg(含丝裂霉素C6mg，纳米级活性炭45mg)/kg ip；第五组丝裂霉素C-纳米级活性炭153.9mg(含丝裂霉素C18mg，纳米级活性炭135.9mg)/kg ip；第六组丝裂霉素C-纳米级活性炭51.3mg(含丝裂霉素C 6mg，纳米级活性炭45.3mg)/kgip；第八组丝裂霉素C-纳米级活性炭17.1mg(含丝裂霉素C2mg，纳米级活性炭15.1mg)/kg ip。BALB/C-nu裸鼠56只，6周龄，体重16g-20g，随机分7组，每组8只，雌雄各半。腹腔接种人胃癌裸鼠移植模型细胞悬液(1.6×106)，接种1小时后给药，给药后第28天解剖观察，取肿瘤称重。
这种纳米级制剂在发挥良好的抗胃癌转移和复发的同时，可有效地减轻丝裂霉素C的毒副作用。在剂量为游离丝裂霉素C致死剂量的2.8倍的情况下，对裸鼠的骨髓造血功能仍无明显影响，而只有此剂量的1/3的游离丝裂霉素C却已明显抑制了裸鼠骨髓的造血功能，结果见表4。
表4.本发明纳米级制剂对骨髓造血功能的影响(血液学检查)各组血红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)测定值
数据表示为x±s，行t检验。与1组(生理盐水组)比较，*P＜0.05MMC的毒副作用主要是骨髓抑制，以血小板下降最显著。给药后4周血液学检查，可见MMC高剂量组与对照组相比血小板显著减少，提示有骨髓抑制。其他组与对照组相比无显著区别。血液学检查表明，活性炭的应用显著降低了MMC的毒副作用，本制剂在大量应用(MMC效价18mg/kg，相当于单纯MMC半数致死量的2倍)的情况下仍未见明显毒副作用。肿瘤种植及分组同表3。
游离丝裂霉素C组裸鼠用药1周后，毛无光泽，活动明显减少，体重不增且有所降低。而纳米级活性炭-丝裂霉素C组，在丝裂霉素C剂量达2.8倍致死量的情况下，动物仍无明显异常表现，仅在用药1周后，体重的增加稍有减缓，但4周后与对照组相比已无明显差异，结果见表5。
表5.本发明纳米级制剂对动物体重增长的影响
n＝8。与1组(生理盐水组)比较，*P＜0.05，**P＜0.01应用SPSS10.0统计软件包，根据数据分布特点，采用非参数检验Mann-Whitney方法分析，体重增长值用中位数(最小值，最大值)表示。2组(MMC高剂量组)动物给药后明显消瘦，给药后1周称量体重除1只体重增长外，其余7只体重低于用药前，同时活动减少，毛无光泽；3组(MMC低剂量组)及5组(MMC-nCH高剂量组，MMC剂量18mg/kg)动物1周体重增长值低于1组(生理盐水对照组)(P＜0.05)。给药后4周，2组动物体重增长值虽低于对照组，但无统计学意义。其他组与对照组相比也无显著差别。BALB/C-nu裸鼠56只，6周龄，体重16g-20g，随机分7组，每组8只，雌雄各半。腹腔接种人胃癌裸鼠移植模型细胞悬液(1.6×106)，接种1小时后给药。分组见表3。
结论这些结果表明，本发明的纳米级制剂在发挥良好的抗胃癌转移和复发作用的同时，还明显降低了抗癌药的毒副作用。
通过上述描述，已经全面公开了本发明，本领域熟练技术人员应该理解的是在不偏离本发明的实质和范围的条件下，可以在所要求的宽参数范围内实施本发明。
权利要求
1.一种选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂，包括纳米级活性炭和抗癌药。
2.权利要求1的纳米级制剂，其中抗癌药是丝裂霉素C。
3.权利要求1的纳米级制剂，其中纳米级活性炭粒径为10-800nm的粒子占粒子总数的95％以上，平均粒径为299±150nm。
4.权利要求1的纳米级制剂，其中抗癌药是5-氟尿嘧啶。
5.权利要求1的纳米级制剂的制备方法，该方法包括以下步骤将抗癌药制成水溶液；将纳米级活性炭置于抗癌药溶液中，在一定条件下进行吸附；吸附完毕后，除去水分，得到纳米级活性炭-抗癌药；和将纳米级活性炭-抗癌药进行分装、密封、灭菌、避光保存。
6.权利要求5的方法，其中的抗癌药是丝裂霉素C。
7.权利要求5或6的方法，其中纳米级活性炭与抗癌药的重量比是4-18∶1，优选8.5∶1。
8.权利要求5或6的方法，其中水与抗癌药的重量比为6-25∶1，优选12.5∶1。
9.权利要求5或6的方法，其中进行吸附的时间为20-60分钟，优选30分钟。
10.权利要求5或6的方法，其中分装后每10ml玻璃安瓶中含纳米级活性炭0.85-3.4g，优选1.7g，而每10ml玻璃安瓶中含抗癌药0.1-0.4g，优选0.2g。
全文摘要
本发明公开了一种选择性靶向胃癌和淋巴系统的纳米级制剂。该纳米级制剂由纳米级的活性炭和对胃癌有效的抗癌药组成。这种纳米级制剂用生理盐水稀释后注射于腹腔进行腹腔化疗，注射于癌区浆膜下或直接注射于癌区的引流淋巴结进行淋巴化疗。经内镜注射于癌瘤内则对癌灶发挥直接的杀伤作用，同时可收到淋巴化疗的效果。注射于癌区的这种纳米级制剂，对转移淋巴结也有直接杀伤作用，起到化学清扫转移灶的作用。通过上述这些原理，这种纳米级制剂是一种具有高度组织选择性的高效的抗胃癌转移和复发的新抗癌药制剂。
文档编号A61P35/00GK1657100SQ20041000548
公开日2005年8月24日 申请日期2004年2月19日 优先权日2004年2月19日
发明者张英鸽, 曲秋莲, 孙岚 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所