六味地黄汤中糖苷类活性部位LWD－b，其制备方法及其医药用途的制作方法

专利名称：六味地黄汤中糖苷类活性部位LWD－b，其制备方法及其医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及六味地黄汤提取物(糖苷类活性部位LWD-b)，其制备方法，以及用于治疗或辅助治疗伴有肾阴虚证及免疫功能失调的各种疾病，包括肿瘤、肿瘤化学或放射治疗的副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染等；自身免疫病如系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力，及老年性疾病等患者所表现的免疫功能紊乱；以及生殖、内分泌系统功能低下或紊乱引起的疾病，包括更年期综合征、卵巢功能低下、不孕症、习惯性流产、植物神经紊乱、黄褐斑、男性乳房发育、老年性性功能衰退、更年期骨质疏松，老年骨质疏松等用途。
背景技术：
六味地黄汤是中医“滋补肾阴”的经典代表名方，由宋朝名医钱乙取《金匮要略》中的肾气丸去桂附，变“温补肾阳”为“滋补肾阴”，在《小儿药证直诀》中首创。该方由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成，主要用于治疗腰膝酸软，头晕目眩，耳鸣耳聋，遗精，消渴，盗汗，骨蒸潮热，牙齿动摇，小便淋沥等肾阴不足之证，在中医临床中广为应用，并在长期的临床实践中得到不断发展，应用范围不断扩大。在现代临床医疗中仍被广泛应用于具有肾阴虚证表现的上百种疾病的治疗或辅助治疗，包括肿瘤、自身免疫病如系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎白细胞减少症支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血血小板减少性紫癜、重症肌无力，更年期综合征，前列腺肥大、不孕症、妊娠中毒症神经衰弱、帕金森氏综合征、高血压、冠心病、心率失常、肾盂肾炎、糖尿病等，获得了良好的治疗效果。但目前该方在实际应用中，无论作为汤剂、丸剂、胶囊剂或其它剂型，都存在明显不足，主要表现在以下几个方面一是剂量大，用药不方便，难以作成现代方便使用的药物剂型；二是有效成分不明确，没有以有效成分作为质量控制指标，难以保证产品质量的稳定和可控；三是当各种原因导致药材中有效成分含量出现大的变化时，没有有效的手段保证产品中有效成分含量的稳定，从而无法保证临床用药的有效性。

发明内容
本发明人经研究，现已发现通过对传统六味地黄汤进行科学地处理，出人意料的发现六味地黄汤的糖苷类活性部位仍具有良好的各种药物活性，其在常温下水中溶解度为≥1.5g/ml。
因此，本发明第一方面涉及六味地黄汤(糖苷类活性部位LWD-b)提取物，其包括，以提取物重量计，12.5-15.3重量％的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)，其中六味地黄汤是由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
本发明另一方面涉及药物组合物，其包括含有12.5-15.3％重量％的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)六味地黄汤提取物及药用载体。
本发明再一方面涉及制备含12.5-15.3重量％总苷的提取物的方法，其包括i)将由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3组成的混合物用沸水蒸煮两次，然后浓缩至浸膏；ii)伴随搅拌往浸膏中加入乙醇至乙醇浓度30％(v/v)放置，离心，冲洗，将上清液与洗液合并为上清液；iii)浓缩上清液，伴随搅拌往浓缩液中加95％乙醇至乙醇浓度60％(v/v)，放置，分离得上清液；iv)将iii)中上清液进行柱层析，用水和极性有机溶剂洗脱，有机溶剂洗脱液浓缩后得部位B。
根据本发明提取物(糖苷类活性部位LWD-b)可按下面工艺流程得到 按经典六味地黄汤各单味药的配比，组成生药。加沸水煎煮，过滤，得提取液。提取液浓缩至适当体积，加醇至终浓度约30％，搅拌，放置过夜。离心处理(2500转/分)，弃去沉淀。合并上清液，浓缩至适量，将醇浓度调节至约为60％，搅拌，放置，离心处理保留上清液。沉淀用适量水复溶后，同法再进行两次醇沉淀处理。三次上清液合并，浓缩除去醇，所得提取液进行大孔吸附树脂柱层析，依次用水和极性有机溶剂洗脱，极性有机溶剂洗脱部位浓缩除去溶剂后冻干，即为六味地黄汤的糖苷类活性部位LWD-b。工艺流程如下所用大孔吸附树脂可为所有型号的弱极性大孔吸附树脂；两步醇沉淀所用醇可为C1-4低级烷基醇，如甲醇、乙醇等，浓度范围分别为10％-40％和50％-95％；大孔吸附树脂层析洗脱所用的极性有机溶剂为所有大孔树脂所能允许使用的极性有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等)浓度范围为10％-95％。
根据本发明，本发明中总苷包括莫诺苷，马钱素和芍药苷。
根据本发明，本发明提取物中12.5-15.3重量％总苷是基于提取物重量计算得到的百分比。
根据本发明，本发明中部位B即为本发明提取物或六味地黄汤中糖苷类活性部位LWD-b或LWD-b。


图1-1为六味地黄汤提取物LWD-b部位的总离子流批纹图谱图1-2为六味地黄汤提取物LWD-b部位的HPLC-DAD指纹图谱图2为莫诺苷对照品色谱图3为马钱素对照品色谱图4为芍药苷对照品图5为样品高效液相色谱图6为样品总离子流色谱图7为样品中莫诺苷负离子质谱8为样品中马铁素负离子质谱9为样品中芍药苷负离子质谱10为口服LWD-b对正常小鼠脾细胞增殖反应的影响图11为LWD-b对荷S180肉瘤小鼠脾细胞增殖反应的影响图12为LWD-b对CJ致敏小鼠脾细胞增殖反应的影响。
根据本发明，本发明的六味地黄汤糖苷类活性部位LWD-b按如下方法定性鉴别(1)α-萘酚反应(Molish反应)LWD-b以适量水溶解，加10％α-萘酚乙醇溶液三滴，然后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，使形成上下两层，稍后在两层界面处可见紫色环，表示有苷类成分存在。
(2)LWD-b中以马钱素为代表的环烯醚萜苷类成分的定性检查六味地黄汤提取物LWD-b以适量95％乙醇浸取，浸出液为待测液。以马钱素和莫诺甙的乙醇溶液作为对照品。待测液和对照液分别点样于硅胶G薄层板和硅胶G-0.3％CMC-Na薄层板上，分别以展开剂A(正丁醇/乙醇/水，15∶3∶3)和展开剂B(氯仿/甲醇，16∶4)展开，分别用10％香草醛溶液(后再喷72％的硫酸)和Godin试剂显色，分别在105℃和80-90℃烘5分钟，待测液和对照液具有相同的显色斑点。
(3)六味地黄汤提取物LWD-b的HPLC指纹图谱液相色谱条件Zorbax Eclipse XDB C-8柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相流速1.00ml/min，检测波长254nm，柱温7℃，CH3CN-H2O二元梯度洗脱(0min2∶98；50min24∶76，60min56∶44)，进样量20μl，所有组分60min内洗脱完毕。
结果见附图1-1和1-2根据本发明，本发明的六味地黄汤糖苷类活性部位LWD-b按如下方法定量鉴别仪器与试剂Agilent 1100高效液相系统，含四元梯度泵、DAD检测器、柱温箱和化学工作站。美国ABI公司API 3000液相色谱-质谱联用仪，配有Turbo Ionspray离子化源以及Analyst 1.1数据处理系统。
莫诺苷、马钱素对照品为本室自制，经光谱确定结构，HPLC面积归一化法测得纯度在98.0％以上。芍药苷对照品购自中国药品生物制品检定所。熟地、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮均购自北京同仁堂药材批发站。甲醇为色谱纯，水为去离子水。
实验方法1.色谱条件Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相为甲醇-水(33∶67)，流速1.0mL.min-1，柱温30℃，DAD检测波长236nm，进样量20μL。理论塔板数按马钱素峰计算大于3000，在此条件下，莫诺苷、马钱素、芍药苷均能与其他组分达到良好的基线分离。
2.质谱条件负离子检测，喷射电压为-4000V，DP电压-70V，FP电压-290V，TEM 300℃，NEB为8，CUR为11。
3.对照品溶液的制备精密称取莫诺苷、马钱素、芍药苷对照品各10mg，置于10mL容量瓶内，用甲醇定容至刻度，摇匀。分别从中吸取75，100，150，300，600μL，加水稀释成10mL，制备成5份对照品溶液。
4.样品溶液的制备取该提取物适量加加水配成浓度为40mg/mL，共3份，过滤(0.45μm的滤膜)后按上述色谱条件进样，计算莫诺苷、马钱素、芍药苷的含量。
结果在上述色谱条件下，分别对3个对照品进行HPLC-DAD和HPLC-MS分析。莫诺苷、马钱素、芍药苷保留时间分别为6.0，11.0，12.0min，电喷雾质谱检测确证质量数与计算值相符；再对样品进行HPLC-DAD和HPLC-MS分析，主要成分的色谱保留时间和质谱数据均与对照品相符，结果见图2-9。
结果莫落苷的标准曲线方程为A＝2772.8C-13.28，r＝0.9998，线性范围7.4～60mg.L-1；马钱素的标准曲线方程为A＝2676.3C-4.14，r＝0.9996，线性范围7.7～62mg.L-1；芍药苷的标准曲线方程为A＝2541.3C-42.49，r＝0.9991，线性范围8.5～68mg.L-1。
表1六味地黄水煎液中莫诺苷、马钱素、芍药苷加样回收率试验结果

RP-HPLC分析结果表明，提取物中主要成分莫诺苷(a)、马钱素(b)、芍药苷(c)的相对保留时间分别为1.0，1.75～1.85，1.90～2.10。HPLC-MS分析表明，样品中的主要成分a、b和c在(-)ESI-MS二级质谱中分别具有[M-H]的准分子离子和[M-glc]碎片峰(a为405和243；b为389和227；c为479和317)，见图6～图9。
样品含量测定结果表明，样品中莫诺苷、马钱素、芍药苷含量范围分别为6.2-7.6％、3.3-4.1％、3.0-3.6％，三部分加和，在六味地黄汤糖苷类活性部位LWD-b中的含量范围在12.5-15.3％。
根据本发明，本发明第一方面涉及六味地黄汤糖苷类活性部位LWD-b，该活性部位具有明显改善或调节免疫功能的活性，对伴有肾阴虚证并具有免疫功能失调的各种疾病以及生殖内分泌功能低下或紊乱的各种疾病，特别是肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中的副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱等疾病具有治疗或辅助治疗作用。
根据本发明，本发明的六味地黄汤糖苷类活性部位LWD-b中的主要活性成分为莫诺苷、马钱素和芍药苷，三部分加和，在LWD-b中的含量范围在12.5-15.3％之间。
根据本发明，本发明还涉及含有LWD-b的药物组合物，包括作为活性成分的本发明LWD-b及一种或多种药用载体或赋形剂。
根据本发明，本发明还涉及LWD-b用于制备治疗伴有肾阴虚证并具有免疫功能低下的各种疾病以及生殖内分泌功能低下或紊乱的各种疾病，如肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱等病的药物的用途。
根据本发明，本发明LWD-b可单独或以药物组合物形式使用，其给药方式可根据具体情况而定，可通过口服、非肠道或局部给药，给药剂型可以是例如片剂，胶囊，冲剂、丸剂、膏剂等。
具体实施例方式
实施例下面的实施例和生物活性实验，是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1六味地黄汤提取物糖苷类活性部位LWD-b的制备六味地黄汤各单味药按常用配比，如熟地黄∶山茱萸∶山药∶泽泻∶丹皮∶茯苓(8∶4∶4∶3∶3∶3)或对部分药味加、减量后，组成生药1500克，加六倍生药重量的沸水煎煮两次，每次两小时，用纱布(六层)加脱脂棉过滤，减压浓缩至生药(重量)与浸膏(体积)比1∶1。
浸膏伴随搅拌加乙醇至乙醇终浓度30％(v/v)，搅拌，放置过夜。离心处理(2500转/分，25min)。沉淀用30％乙醇冲洗4次，离心，沉淀弃。上清液合并浓缩至1000毫升，用95％乙醇将乙醇终浓度调节为60％，搅拌，放置过夜，同法离心处理。沉淀用60％乙醇再进行二次醇沉淀处理。三次上清液合并，旋转薄膜蒸发，除去乙醇，进行HP-20大孔吸附树脂柱层析，树脂柱床体积(毫升)与上样量(克)比为10∶1，然后用水和30％乙醇依次洗脱，30％乙醇洗脱部位浓缩除醇后冻干，得到棕黄色粉末为LWD-b(38.6克)。其具有前述的定性反应特征。
按前述所给方法测定本实施例所得提取物中总苷含量为13.9％。
实施例2实施例1六味地黄汤提取物LWD-b的生物活性实验一、LWD-b对免疫功能的作用1.口服LWD-b对正常小鼠脾细胞增殖反应的影响雌性Balb/c小鼠，灌胃给予LWD-b，1次/日，连续7天。第8日断头处死小鼠，无菌取脾脏，制备脾细胞悬液，用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度为5×106细胞/ml，取100μl Con A(终浓度为0.5ug/ml)和100μl细胞悬液依次加入96孔板内，对照组用1640培养液代替Con A，置37℃、5％CO2孵温箱孵育56小时，每孔加入20μl3H-TdR(10μCi/ml)，继续培养至72小时，以多道细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，80℃烘干后，将玻璃纤维滤纸置于闪烁液内，用液体闪烁计数仪测cpm值。每样品设5个平行孔，结果用平均cpm值表示。结果表明，口服给予LWD-b(0.07、0.14g/kg)对脾细胞自发增殖反应和ConA诱导的增殖反应均具有明显的促进作用(结果见图10)。
2.口服LWD-b对环磷酰胺所致小鼠脾细胞抗体生成反应的影响Balb/c小鼠，雌性，灌胃给药9天，1次/日。于给药第5天时每只小鼠腹腔注射绵羊红细胞(SRBC)悬液0.2ml(5×107个红细胞)/只，免疫当天，除正常对照组外，各组小鼠腹腔注射环磷酰胺(Cy)，15mg/kg，次日以同剂量重复注射一次。以SRBC免疫后第4天进行实验，实验时小鼠断头处死，取脾脏，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×106/ml。取脾细胞悬液400μl与50％SRBC(50μl)及50％补体(按1∶1稀释的新鲜豚鼠血清50μl)混合，取100μl加入Cunningham氏小室中，石蜡封口后置于37℃孵箱中孵育1小时，记数小室内溶血空斑(PFC)形成数，结果以PFC/106个脾细胞表示。结果表明，Cy处理小鼠脾细胞抗体生成反应能力较对照组明显下降，口服给予LWD-b具有明显改善作用(表2)。
表2.LWD-b对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠抗体生成反应的影响

注LW六味地黄汤；**P＜0.01，与正常对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与Cy模型组比较。
3.LWD-b对荷瘤小鼠脾细胞增殖反应的影响移植瘤小鼠模型的制备按下述方法进行取S180腹水传代小鼠，无菌取腹水，以生理盐水稀释，调整细胞浓度为2×105/ml。给Balb/c小鼠右前腋皮下注射S180细胞悬液，0.2ml/只小鼠。小鼠于移植肿瘤细胞后24小时口服给予LWD-b，连续10天，进行实验，小鼠脾细胞增殖反应按前述方法进行。结果表明，与对照组比较，荷瘤小鼠由ConA诱导的脾细胞增殖反应明显低下，口服LWD-b(0.07、0.14g/kg)，对荷瘤小鼠低下的脾淋巴细胞增殖反应具有明显地改善作用(结果见图11)。
4.口服LWD-b对空肠弯曲菌致敏小鼠脾细胞增殖反应的影响CJ致敏自身免疫病小鼠模型制备按下述方法进行用生理盐水洗涤甲醛化的空肠弯曲菌(CJ)两次(4000rpm×30min)，调540nm OD值为1.25，相当于空肠弯曲菌3×109CFU/ml，与福氏完全佐剂1∶1混匀乳化，小鼠足垫注射0.05ml。免疫后15天，尾静脉注射上述菌悬液0.2ml，同时口服给药，并设立空白对照及佐剂对照组。30天后(给药15天)进行免疫功能检测。小鼠脾细胞增殖反应按前述方法进行。结果表明，与对照组比较，CJ致敏小鼠脾细胞增殖反应明显增强。口服LWD-b(0.07、0.14g/kg)对CJ致敏小鼠异常增高的脾细胞自发增殖反应和Con A诱导的脾细胞增殖反应均具有明显的恢复作用(结果见图12)。
5.口服LWD-b对CJ致敏小鼠血清抗核抗体水平的影响CJ致敏自身免疫病小鼠模型制备及给药方法同上，给药15天后处死小鼠，分离血清，测定血清抗核抗体水平。血清抗核抗体采用如下方法测定用100μg/ml的大鼠肝细胞核蛋白包被液包被96孔酶联板(37℃1小时、4℃过夜)。1％FBS封闭酶联板1小时后，PBS-T液洗板3次，甩干。每孔加入50μl 1∶100稀释的待测血清样品，置37℃温育1小时。PBS-T液洗板3次，甩干。每孔加入100ul 1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG抗体，调零孔加100μl抗体稀释液，37℃作用30分钟。PBS-T液洗板3次，甩干。每孔加100ul0.1mg/ml的TMB溶液，37℃显色10-20分钟。每孔加50ul H2SO4(2mol/L)终止显色，在酶联检测仪上测定光密度值(450nm)。结果表明，CJ致敏小鼠血清中抗核抗体水平较对照组明显升高，口服(0.07、0.14g/kg，连续15天)对CJ致敏小鼠血清中增高的抗核抗体水平具有明显的降低作用。
上述实验结果表明，口服给予六味地黄汤提取物LWD-b对正常小鼠脾细胞自发增殖反应和ConA诱导的增殖反应均具有明显促进作用，提示LWD-b对正常机体免疫功能具有增强作用。同时，口服给予LWD-b对化疗药环磷酰胺处理小鼠、荷瘤小鼠所表现的免疫功能低下均具有明显的改善作用，表明LWD-b对化疗药及荷瘤所引起的免疫功能低下具有明显改善作用。此外，口服给予LWD-b对CJ致敏自身免疫病模型小鼠异常增高的脾细胞增殖反应具有明显抑制作用，并能明显降低血清中抗核抗体的水平，表明LWD-b对CJ诱导的免疫功能紊乱具有明显纠正作用。上述研究结果提示LWD-b临床可用于多种具有免疫功能低下或平衡紊乱表现之疾病的治疗或辅助治疗，如肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染等；自身免疫病如系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力，及老年性疾病等患者所表现的免疫功能紊乱等。
二、LWD-b对生殖内分泌系统的作用1.LWD-b对雌性“肾阴虚”小鼠下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱的作用(1)LWD-b对“肾阴虚”小鼠卵巢重量的影响“肾阴虚”小鼠模型的制备及给药方法同前。断头处死小鼠，取卵巢称重。结果表明，用皮质酮处理5天后小鼠卵巢重量较对照组明显降低。口服给予LW对皮质酮所致小鼠卵巢重量降低具有明显改善作用，口服给予LWD-b亦能明显提高模型小鼠的卵巢重量(表3)。
表3.LW-AFC对皮质酮处理(肾阴虚)小鼠卵巢重量的影响

注**P＜0.01，与正常对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组比较；Mean±SD，n＝12-17(2)LWD-b对“肾阴虚”小鼠血清E2水平的影响应用放射免疫分析检测试剂盒(天津协和生物技术研究所产品)检测小鼠血清E2水平。具体操作过程按试剂盒说明进行，操作程序及加样量(μl)如表4所示，标准品、NSB、T均为双管。
表4小鼠血清E2检测操作程序

结果表明，“肾阴虚”小鼠血清E2水平较对照组明显下降。口服给予六味地黄汤对模型小鼠血清E2水平的下降具有明显改善作用，口服给予LWD-b对模型小鼠血清E2水平降低也具有明显改善作用(表5)。
表5.LWD-b对“肾阴虚”小鼠血清E2水平的影响

注**P＜0.01，与正常对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组比较；Mean±SD，n＝12-17(3)LWD-b对“肾阴虚”小鼠垂体LH水平的影响应用时间分辨免疫荧光分析法检测小鼠垂体LH含量。断头处死小鼠，取处垂体，迅速置于液氮中，检测时从液氮中取出垂体，待液氮挥发至稳定后称重，然后移至盛有400μl裂解液(Na3PO4 10mM、NaCl 0.14M、BSA 1％的水溶液)的离心管中，将离心管置于冰浴中，用超声法制备匀浆，4℃离心分离上清，用于LH水平的测定。测定前垂体样品按1∶29比例稀释。应用96孔测定板进行测定，加样前用洗涤液洗涤测试孔，然后依次加入50μl hLH标准品或血清样品和200μl示踪剂工作液。于振荡器上快速震荡2分钟，4-10℃静置过夜，然后于室温下缓震1小时，用洗涤液洗涤测定孔6次，每孔加入200μl增强液，于震荡器上缓慢震动5分钟，10-15分钟后用时间分辨荧光仪测定荧光。根据标准曲线，计算样品中LH的含量。结果表明，模型小鼠垂体LH的含量较正常对照组明显下降，口服六味地黄汤及LWD-b均能明显提高模型小鼠垂体LH的含量(表6)。
表6.LWD-b对“肾阴虚”小鼠血清E2、垂体LH、下丘脑GnRH水平的影响

注**P＜0.01，与正常对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组比较；Mean±SD，n＝12-17(4)LWD-b对“肾阴虚”小鼠下丘脑GnRH含量的影响小鼠下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的检测采用海军放射免疫技术研究所生产的放射免疫分析试剂盒进行检测。小鼠断头处死，分离取出下丘脑，置于液氮中保存备用。测定时从液氮中取出下丘脑，待液氮挥发至稳定后，称重，置于盛有300μl煮沸生理盐水的离心管中，继续煮沸3min，然后加入150μl冰醋酸，置于冰浴中，超声法制备匀浆，加入150μl NaOH中和冰醋酸，然后加入25μl抑肽酶，混匀，4℃离心分离上清，分装后置于-70℃保存备用。测试时按试剂盒说明进行，T、NSB、标准品均为双管，操作程序及加样量(μl)如表7所示。
表7小鼠下丘脑GnRH含量测定操作程序

结果表明，模型小鼠下丘脑GnRH含量较正常对照组明显下降，口服六味地黄汤及LWD-b能明显提高模型小鼠下丘脑GnRH含量(表8)。
表8.LWD-b对“肾阴虚”小鼠血清E2、垂体LH、下丘脑GnRH水平的影响

注**P＜0.01，与正常对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组比较；Mean±SD，n＝12-173.LWD-b对雄性“肾阴虚”小鼠睾丸重量及血清睾酮水平的影响“肾阴虚”模型小鼠制备方法同前述。小鼠称体重后断头处死，取睾丸称重，计算睾丸指数。血清睾酮应用贝克曼库尔特Access全自动微粒体化学发光免疫分析仪及配套试剂盒测定，该仪器的检测灵敏度为0.5ng/ml。测定时将待测血清分别置于0.2ml测定管中，放入仪器测试架中，设定仪器测定程序，由仪器自动进行测定，并计算血清睾酮含量。结果表明，模型小鼠血清睾酮水平较对照组明显降低，口服给予六味地黄汤对模型小鼠血清睾酮水平的下降无明显改善作用，口服给予LWD-b对模型小鼠血清睾酮水平的下降具有明显改善作用(表9)。
表9.LW-AFC对“肾阴虚”小鼠睾丸重量及血清皮质酮水平的影响

注*p＜0.05，**p＜0.01与对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01与肾阴虚组比较；Mean±SD，n＝10。
以动物肾上腺皮质功能改变模拟肾虚证的主要依据是临床肾阳虚患者表现为肾上腺皮质功能低下，肾阴虚患者临床表现有肾上腺皮质功能亢进的现象，肾上腺皮质激素在衰老过程中也明显增高。此外，临床因治疗需要长期大量使用肾上腺皮质激素病人表现为肾阴虚，激素停用后表现为肾阳虚。根据以上结果，设计了应用肾上腺皮质激素制备“肾虚证”动物模型的方法。动物给予肾上腺糖皮质激素制备肾虚证的造模方法是目前广泛使用的动物肾虚证的造模方法。在大量研究中，动物应用皮质激素期为“肾阴虚”，停用后为“肾阳虚”。本研究所采用的外源性皮质酮处理小鼠7天造“肾阴虚”模型的方法，已基本得到学者认可，并已被大量文献应用。
本实验结果表明，口服给予LWD-b对肾上腺皮质激素所致雌性“肾阴虚”模型小鼠卵巢重量降低、血清E2和垂体LH水平的降低亦具有明显改善作用；对雄性“肾阴虚”小鼠血清睾酮水平的下降亦具有明显改善作用，表明LWD-b对“肾阴虚”小鼠所表现的HPG轴功能低下或平衡失调具有明显改善或调节作用。上述结果提示，LWD-b对肾阴虚所致HPG轴功能低下或平衡紊乱均具有改善或调节作用，临床可用于衰老和伴有肾阴虚证的HPG轴功能低下疾病如更年期综合症、卵巢功能低下、不孕症、习惯性流产、植物神经紊乱、黄褐斑、男性乳房发育、老年性功能衰退、更年期骨质疏松，老年骨质疏松等预防和治疗。
权利要求
1.六味地黄汤(糖苷类活性部位LWD-b)提取物，其包括，以提取物重量计，12.5-15.3重量％的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)，其中六味地黄汤是由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
2.药物组合物，其包括含有12.5-15.3％重量％的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)六味地黄汤提取物及药用载体。
3.六味地黄汤提取物的制备方法，其包括i)将由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3组成的混合物用沸水蒸煮两次，然后浓缩至浸膏；ii)伴随搅拌往浸膏中加入乙醇至乙醇浓度30％(v/v)放置，离心，冲洗，将上清液与洗液合并为上清液；iii)浓缩上清液，伴随搅拌往浓缩液中加95％乙醇至乙醇浓度60％(v/v)，放置，分离得上清液；iv)将iii)中上清液进行柱层析，用水和极性有机溶剂洗脱，有机溶剂洗脱液浓缩后得部位B。
4.权利要求3所述方法，其中所用大孔吸附树脂为所有型号的弱极性大孔吸附树脂；两次醇沉淀所用醇为C1-4低级烷基醇，浓度范围分别为10％-40％和50％-95％；大孔吸附树脂层析洗脱所用的极性有机溶剂为所有大孔树脂所能允许使用的极性有机溶剂，浓度范围为10％-95％。活性炭层析洗脱所用醇为甲醇和乙醇，醇浓度为20％-95％。
5.根据权利要求1的提取物，其中所述提取物是用于治疗肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱的提取物。
6.权利要求2的药物组合物，其中所述药物组合物是用于治疗肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱的药物组合物。
7.权利要求1的提取物在制备用于治疗肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱的产品中用途。
8.权利要求1的提取物，以提取物重量计，其含有6.2-7.6重量％莫诺苷。
9.权利要求1的提取物，以提取物重量计，其含有3.3-4.1重量％马钱素。
10.权利要求1的提取物，以提取物重量计，其含有3.0-3.6重量％芍药苷。
全文摘要
六味地黄汤(糖苷类活性部位LWD－b)提取物，其包括，以提取物重量计，12.5－15.3重量％的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)，其中六味地黄汤是由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
文档编号A61P31/00GK1663593SQ200410058598
公开日2005年9月7日 申请日期2004年8月19日 优先权日2003年8月19日
发明者赵毅民, 乔善义, 张永祥, 周文霞, 程军平, 赵修南, 董剑英, 孙磊, 杨胜, 马渊, 齐春会, 任凤霞, 熊善丽, 郭继芬 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所