专利名称：一种子宫颈癌基因工程重组疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于一种生物制剂。具体地说是种用基因方法获取的治疗和预防子宫颈癌的重组疫苗。
背景技术：
子宫颈癌是发病最广泛的恶性肿瘤之一，世界范围内每年新增约500,000病例，且每年有约200,000人死于子宫颈癌。目前，对于子宫颈癌的治疗采用的方法和技术手段主要包括手术治疗；放射治疗；化学药物治疗。这些方法给患者或多或少带来痛苦或者预后不良作用，与此相比，特异性的预防或治疗疫苗可以克服上述缺点。目前子宫颈癌的疫苗研究已经在世界范围内展开，部分国家已经进入临床试验阶段，如美国、英国、日本、澳大利亚、法国以及我国；在美国和英国的临床试验中，经过基因突变的重组疫苗的安全性已得到了证实。但是根据文献报道子宫颈癌的疫苗大多是采用全病毒生产，病毒自身携带的致癌基因存在于产品当中，有潜在的致癌作用；同时部分疫苗的免疫效果有待进一步的确认。
发明内容
本发明的目的是提供一种仅一次注射、长期表达、免疫力高效持久的既具有坚强免疫效果又有良好治疗效果的子宫颈癌基因工程疫苗。为了实现本发明的目的，本发明人仔细研究和比较目前国际上有关类基因工程研究概况，并进行了反复筛选和优化组合，综合了各种类似及相关疫苗的优点，重组优化而成。首先，本发明采用目前致子宫颈癌病毒最流行血清型HPV 16和18型的主要致癌基因E7，将其中的RB结合位点进行了点突变，去除其致癌性，然后将两段基因进行融合，为加强疫苗的免疫效果，在18E7的后边加上了免疫增强因子结核杆菌热休克蛋白并使之与16E718E7相融合，组成完整的疫苗基因。在载体的使用方面，本发明采用两种方式，其一是单一的质粒，即是将上述基因HPV16E7、18E7HSP70克隆到质粒载体PC1质粒中，在提纯质粒后直接用于疫苗注射；其二，采用目前在基因治疗领域国际范围内被广泛使用、公认无毒副作用而且具有免疫促进作用的AAV作为载体，即将HPV16E718E7HSP70基因克隆到AAV载体UF1的NotI和SalI位点上，在辅助基因和包装基因的辅助下，经过磷酸钙法转染将DNA转入293细胞中，完成重组AAV的生产后，再经过HPLC或CsCl方法纯化，再由病毒透析溶液透析，得到高纯度的重组AAV病毒，即作为疫苗使用。
在本发明中我们利用了hsp肽疫苗作为佐剂的安全性和AAV载体作为基因转导载体的优点。因此，我们构建了含有HPV-16 E7和HPV-18 E7 CTL抗原决定簇及hsp的嵌合基因的肿瘤疫苗。通过将AAV载体应用于同基因的肿瘤来验证其保护肿瘤的有效性。结果显示AAV载体介导的这种嵌合基因经肌肉接种(i.m.)能有效地消除肿瘤细胞，表明含HSP-16 E7和HSP-18E7的疫苗对子宫颈癌有治疗效果。
本发明的培养物结核分支杆菌休克蛋白70与人乳头瘤病毒第16抗原表位和18抗原表位融合蛋白基因的重组腺相关病毒HSP70+HPVE16+E18/AAV，已保存中国典型培养物保藏中心。其保藏编号，CCTCCNOV200309。
本发明的优越性和应用前景表明，发明人成功地发展了编码融合到hspDNA的HPV-16和HPV-18 E7 CTL肽的rAAV作为肿瘤疫苗。以hsp作为载体蛋白和以rAAV载体转染是一种有潜力的子宫颈癌治疗的疫苗。它是一种建立在基因工程基础上的，以AAV作载体表达HPV16和18血清型的E7蛋白而诱导机体产生对子宫颈癌的预防和治疗作用。本疫苗对90％以上的子宫颈癌患者有效，并对由乳头瘤状病毒引起的尖锐湿疣有预防和治疗作用。由于本发明已经对目的基因E7做了点突变，而同时将结核杆菌的热敏感蛋白与目的基因融合，加之所使用载体AAV，因而构成了强大的免疫原，且可长期在体内表达而无毒副作用，具有广阔的应用前景。
图1.HPV 16 18E7基因在293细胞上的体外表达。
质粒pC1-1618E7hsp70转染293细胞48时小时，AAV11618E7hsp70感染293细胞24小时后，用抗16E7(B and C)或18 E7(E and F)多克隆抗体组化染色293细胞，视野中红色细胞为阳性反应，该照片放大200倍。
图2.AAV LacZ载体在动物体内的表达。
肌肉注射2×1011病毒粒子的AAV1LacZ(A and B)or AAV2LacZ(C andD)与C57BL/6小鼠的腓肠肌，在注射后的5周后16月后取注射部位肌肉组织样品，进行染色和H.E复染。蓝色细胞为LacZ阳性表达细胞。
图3.病毒载体免疫后动物无瘤率的对比试验。
选择不同的病毒载体分别为AAV1LacZ、AAV1-1618E7hsp70、AAV2-1618E7hsp70以及200ul PBS作为对照，肌肉注射同龄重量相近实验小鼠。5周后给每只实验鼠接种肿瘤细胞1×105TC-1，分别再接种肿瘤细胞后的12和24周，再次和第三次给没有发生肿瘤的小鼠接种2×105TC-1，每三天一次观察实验鼠并测量肿瘤大小。
图4.AAV1-1618E7hsp70诱导针对E7的特异免疫反应。
20只C57BL/6(6-8周龄)小鼠用于该实验。其中10只注射2×1011AAV1-1618E7hsp70免疫，另10只注射200ul PBS，5周后5只免疫AAV1-1618E7hsp70和5只注射PBS的小鼠接种1×105TC-1细胞，而另外10只接种2×101B16-1细胞，每三天观察成瘤情况并记录。
图5.免疫AAV-1618E7hsp70激发动物强烈的CTL反应。
小鼠免疫病毒载体后5周，取得脾细胞经处理后，检测CTL反应指标。AAV1-1618E7hsp70和AAV2-1618E7hsp70均诱导了较强的CTL反应，而PBS和AAV1LacZ组均未显示阳性反应结果。
具体实施例方式
下面结合附图及本发明的相关概念和方法进行具体地阐述。
一.重组腺相关病毒的相关特性腺相关病毒(AAV)是一种单链病毒，它已被作为基因治疗的载体广泛研究。作为一种缺陷性的人类细小病毒，AAV拥有许多使其能成为人类基因治疗载体的天然属性，例如，非致病性、定点整合能力及广泛的宿主范围(人、类人猿、鼠、犬和鸟)等。同其他已在疫苗中应用的病毒载体(如痘苗病毒或腺病毒等)不同的是，AAV载体并不表达任何病毒基因。AAV载体中必须包含的唯一的病毒DNA是其145bp的反向末端重复序列。由AAV载体携带的表达基因仅表达克隆基因本身。
先前已有报道证实AAV载体能够将基因有效地转入肌肉中，并可实现长期的基因转导。在本发明中，我们通过AAV载体将设计的肿瘤疫苗导入肌肉中。因此，我们测试了编码lacZ报告基因的AAV载体在巨细胞启动子的调控下将载体转入肌肉的有效性，lacZ报告基因具有核定位信号区。以2.5％的阿弗丁皮下注射麻醉C57BL/6(H-2h)小鼠。30微升rAAV lacZ(3×1010病毒颗粒)经皮注入小鼠后腿的胫骨前肌。两周后，处死该鼠，肌肉组织进行冷冻切片和染色，以X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)为底物进行β-半乳糖苷酶活性的测定。图2A示β-半乳糖苷酶在大部分的肌管中核染(箭头所示)，显示AAV载体有效的基因转导，同时显示AAV1表达效率明显高于AAV2。
二.构建和生产编码整合到hsp DNA的E7 CTL抗原决定簇的重组腺相关病毒(rAAV)人乳头瘤状病毒(HPV)感染是引起子宫颈癌的原因之一，它携带三个转化癌基因E5、E6和E7。它们的产物都是独特的肿瘤抗原，因此可用于肿瘤疫苗。因为癌蛋白E6和E7始终存在和表达，E6和E7癌基因也就成为子宫颈癌的以T细胞为基础的免疫治疗的受瞩目的靶基因。HPV抗原介导的子宫颈癌的免疫治疗已被证实是有效的，因为不论是实验性的还是自然的乳头状瘤病毒相关的肿瘤均可被E7抗原的免疫所控制。先前的研究已使用了多种不同的免疫法，如重组E7痘苗病毒或以E7进行的同基因的细胞转染等，这些研究都显示了CTLs可能是最有效的免疫效应机制。本发明采用人乳头瘤状病毒的HPV16和18型E7全序列基因，并将此二基因通过分子克隆手段融合，此融合蛋白表达一融合蛋白兼含HPV16和HPV18 E7蛋白。目前报道中相似的研究则使用该基因的部分序列，或者单独使用E6和E7基因。
HPV-16 E7是一种转化癌蛋白，所以蛋白疫苗就可能出现像转化这样的不可预见的危险性的副作用，所以我们对E7的结合位点进行了点突变从而去除了其致癌性。以细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原决定簇的多肽接种来防止肿瘤的生长是一种安全有效的免疫治疗的方法。然而，多肽疫苗与有毒的佐剂结合，如不完全的Freund佐剂，有时也可因特异性的T细胞耐受而导致肿瘤的快速生长。最近，结核分枝杆菌热休克蛋白70(hsp70)已被应用于无佐剂的刺激对人全长的免疫缺陷病毒p24蛋白或与hsp共价相连的卵清蛋白产生体液和细胞应答的载体。已有报道，分枝杆菌hsp作为一种佐剂也可通过卵清蛋白肽疫苗增强诱导细胞免疫。
含HPV-16 E7的44～62aa编码序列的DNA片断通过PCR来合成，其模板为HPV-16 E7/pCEP4质粒，它包含有HPV-16的540～885位核苷酸序列。PCR中应用的上游引物是5’-GATGGTgaattcATGCAAGCAGAACCG-3’，它不仅覆盖了启动子区域(黑体字)和HPV-16 E7的44～47aa编码序列，在其5’末端还含有一个EcoRI的位点(小写字母)。下游引物是5’-AAACCGAAGggatccGTCACACTTGCA-3’，在HPV-16 E7的62aa编码序列之后含一个BamHI的位点(小写字母)。
PKS70载体质粒通过将结核杆菌hsp70基因亚克隆入pT7-7表达载体的BamHI和HindIII位点构建而成，本质粒由Richard A.Young馈赠。如上所述的E7抗原决定簇PCR产物被转入pGEM-T载体(Promega，Madison，Wis.)以产生pGEM-T/E7CTL，然后再被亚克隆入pKS70的EcoRI和BamHI位点以产生pKS70/E7CTL-hsp。pKS70/E7CTL-hsp通过双脱氧链终止法测序，HPV-16 E7的44～62aa编码序列被证实在hsp70基因的框架内。然后用EcoRI和HindIII消化pKS70/E7CTL-hsp质粒以释放E7CTL-hsp，再将它亚克隆入SK(+)载体(Stratagene)，并命名为pSK/E7CTL-hsp。从pSK/E7CTL-hsp上以SmaI和XhoI切下的DNA片断被转入pXX-UF1，后者含有绿色荧光蛋白基因，由人巨细胞病毒早期启动子调控，其两端是AAV145bp的反向末端重复序列。用PvuII和SalI消化pXX-UF1质粒以去除绿色荧光蛋白基因，然后将E7CTL-hsp DNA片断置于人巨细胞病毒早期启动子转录调控的下游，并命名为pXX/E7CTL-hsp。
rAAV E7CTL-hsp病毒载体依据先前所出版的共转染的方法制备。简要地说，每一个直径15cm的细胞培养盘加入共49μg质粒DNA(16μgpXX/E7CTL-hsp质粒加上8μg编码Rep和Cap蛋白的pXX2，以及25μg编码腺病毒基因产物的pXX6)以磷酸钙沉淀法转染293细胞。转染后48小时收获80盘细胞，细胞混合物经组织匀浆，CsCl加至终浓度为1.37g/ml。病毒颗粒再按照先前所出版的方法进行CsCl密度梯度离心纯化。rAAV E7CTL-hsp病毒颗粒的相对浓度由slot blot确定。该质粒的滴度在1×1012～5×1012病毒颗粒/ml的范围内。
三.相关结果的分析1、AV载体介导的E7嵌合基因在293细胞中表达的免疫组化分析为了确定我们所设计构建的16E718E7HSP 7 0基因能否通过AAV载体在细胞内表达，我们分别用质粒转染293细胞和用病毒感染293细胞，分别在试验后的48小时或24小时，用特异性抗体染色293细胞，从而检测基因表达效果。图1示16E718E7HSP7基因的表达结果。
2、以编码16E718E7HSP70的rAAV进行接种可预防肿瘤TC-1是E7表达的肿瘤细胞系。它来源于C57BL/6小鼠初级肺上皮细胞，由HPV-16 E6和E7实现其永生化，由激活的ras癌基因转化。为了评估对已建立的肿瘤的预防效果，我们将每10只C57BL/6小鼠分为一组，我们先对小鼠接种rAAV病毒载体和磷酸盐缓冲液对照肌肉注射，5周后，在其左侧胁腹部皮下注射1×105TC-1细胞。观察肿瘤形成情况并记录肿瘤大小。图3显示，AAV 1-16E718E7HSP70和AAV 2-16E718E7HSP70均可以预防肿瘤的形成，同时AAV 1-16E718E7HSP70还可以100％抵抗TC-1细胞的第三次攻击，而AAV 2-16E718E7HSP70则表现了较低的效率(70％)。
3、AAV16E718E7HSP70诱导针对E7的特异性免疫反应B161是一种来自C57BL/6小鼠的黑色素瘤细胞系，被视为无E7表达的同基因的细胞。实验小鼠接种AAV16E718E7HSP70或磷酸盐缓冲液5周后，5周后5只免疫AAV1-1618E7hsp70和5只注射PBS的小鼠接种1×105TC-1细胞，而另外10只(5只免疫AAV1-1618E7hsp70和5只注射PBS)接种2×104B16-1细胞，每三天观察成瘤情况并记录肿瘤。结果如图4所示。rAAV1618E7hsp70接种能预防E7表达细胞(TC-1)的肿瘤生长，但在非E7表达的细胞则无此效应。
4、AAV16E718E7HSP70免疫小鼠的细胞免疫应答为了阐明针对TC-1肿瘤的保护机制，我们需判断在以编码16E718E7HSP70的rAAV免疫的小鼠中是否诱导了CTL应答。将用编码16E718E7HSP70的rAAV1、rAAV2、rAAV lacZ和PBS免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞分离，并在体外以合成的E7 49～57aa肽刺激，该短肽被认为是CTL抗原决定簇。这些被刺激的脾细胞再进一步经测试，以识别和溶解51Cr标记的靶细胞包括TC-1。图5显示从接种rAAV16E718E7HSP70的小鼠分离的脾细胞能被E7 44～62肽刺激，但从接种rAAV lacZ的小鼠分离的脾细胞则不能。
以前，结核杆菌hsp70已被用作分子佐剂来刺激对人全长的免疫缺陷病毒p24蛋白或与hsp共价相连的卵清蛋白产生体液和细胞应答的载体。hsp70能够与共价相连的多肽融合进入MHC I类和II类抗原呈递途径和引起CD8 CTLs的机制被认为是(i)hsp70帮助蛋白质折叠和促进蛋白质进入到亚细胞结构的能力，(ii)hsp促进细胞内的蛋白质裂开的能力，(iii)较高的T细胞针对分支杆菌hsp70的频率。我们的研究进一步证实了hsp能够充当促进E7肽抗原诱导针对含E7的肿瘤的CD4-和CD8-依赖的CTL反应的佐剂。
5、AAV在疫苗中的应用中的优势我们的研究表明AAV载体，所有的病毒编码序列(96％的基因组)去除后，在肿瘤疫苗的应用中表现出很好的应用前景。表达HPV-16和-18的E6和E7蛋白的活重组病毒疫苗一期临床实验已在实施中。对基因治疗来说，由于AAV载体不表达病毒基因，故其优于其他用于疫苗的病毒载体，如痘苗病毒和腺病毒等。像裸DNA一样，由AAV载体携带的表达基因仅表达克隆基因本身。用痘苗病毒或腺病毒做疫苗的载体在刺激免疫系统方面具有一些优点，但与之相关的病毒感染的危险，特别是在免疫缺陷的病人，或许远远胜于这些优点。另外，先前也有报道AAV载体并不会诱导针对被转染细胞的较强的细胞免疫应答，因而可以实现基因的持续表达。AAV载体介导的基因在骨骼肌中的表达已显示可持续1.5年以上。虽然AAV载体能够引起体液免疫反应，从而导致在第二次给药后出现活性的中和，但重复的给药并不认为是必然导致原来的被转染细胞能逃过CTL反应并持续较长时间。因此AAV在人的病毒免疫方面是很有用的。最近，有关单纯疱疹病毒作为疫苗发展的研究显示AAV介导的免疫能引起特异性的CTL和抗体应答。因此，我们的研究提供了一种针对HPV诱导的肿瘤的有潜力的疫苗。
权利要求
1.一种子宫颈癌基因工程重组疫苗，采用目前致子宫颈癌病毒最流行血清型HPV 16和18型的主要致癌基因E7，将其中的RB结合位点进行了点突变，去除其致癌性，然后将两段基因进行融合，在18E7的后边加上了免疫增强因子结核杆菌热休克蛋白并使之与16E718E7相融合，组成完整的疫苗基因。
2.根据权利要求1所说的一种子宫颈癌基因工程重组疫苗，在载体的使用方面，(1)单一的质粒，即是将上述基因HPV16E7、18E7HSP70克隆到质粒载体PCl质粒中，在提纯质粒后直接用于疫苗注射；(2)采用AAV作为载体，即将HPV16E718E7HSP70基因克隆到AAV载体UF1的NotI和SalI位点上，在辅助基因和包装基因的辅助下，经过磷酸钙法转染将DNA转入293细胞中，完成重组AAV的生产后，再经过HPLC或CsCl方法纯化，再由病毒透析溶液透析，得到高纯度的重组AAV病毒，即作为疫苗使用。
3.根据权利要求1所说的一种子宫颈癌基因工程重组疫苗，利用了hsp肽疫苗作为佐剂的安全性和AAV载体作为基因转导载体，构建了含有HPV-16 E7和HPV-18 E7 CTL抗原决定簇及hsp的嵌合基因的肿瘤疫苗。
4.根据权利要求1所说的一种子宫颈癌基因工程重组疫苗，培养物结核分支杆菌休克蛋白70与人乳头瘤病毒第16抗原表位和18抗原表位融合蛋白基因的重组腺相关病毒HSP70+HPVE16+E18/AAV，已保存中国典型培养物保藏中心。其保藏编号，CCTCCNOV200309。
全文摘要
一种子宫颈癌基因工程重组疫苗，本发明涉及生物工程技术。它是一种建立在基因工程基础上的，以AAV作为载体表达HPV16和18血清型的E7蛋白而诱导机体产生针对HPV的特异免疫反应，从而产生对子宫颈癌的预防和治疗作用。由于本发明已经对目的基因E7做了点突变，而同时将结核杆菌的热敏感融合与目的基因相融合，加之所使用载体AAV，因此构成了良好的免疫原，且可长期在体内表达而无毒副作用。
文档编号A61K48/00GK1616107SQ20041006078
公开日2005年5月18日 申请日期2004年8月31日 优先权日2004年8月31日
发明者肖啸, 周立桥 申请人:肖啸, 周立桥