专利名称：一种皮肤替代物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料领域，特别涉及一种适用于深II度及III度的烧伤、创伤、冻伤、溃疡等的治疗及整形的皮肤替代物及其制备方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，由表皮、真皮、皮下组织及皮肤附属物所组成。常因物理、化学、生物等原因造成皮肤损伤，当损伤涉及真皮时，一般很难恢复皮肤原有的形态及功能。目前治疗真皮缺损的手段还不多，主要是移植断层自体皮片，突出的问题仍是受皮区的疤痕增生，影响外观和功能。
治疗皮肤缺损的另一手段是用皮肤替代物覆盖。目前市场上出现的皮肤替代物(有时称“创面覆盖物”或“人工皮肤”)有两类。一类是暂时性的，例如再生丝素膜、甲壳胺膜、聚氨酯膜、断层猪皮等；另一类是永久性的，例如脱细胞异体真皮、脱细胞猪皮、胶原蛋白、甲壳胺多孔材料等。暂时性的皮肤替代物一般能在一定程度上防止体液大量流失和细菌侵袭，创面愈合后需揭去或自然脱落，一般仅适用于浅度烧伤或其他原因造成的表皮缺损创面；永久性的皮肤替代物一般能在一定程度上使真皮形态和功能得到修复，可被生物降解，故一般用于深度烧伤或其他原因造成的真皮缺损创面。
在本发明作出前，国内外许多研究者曾致力于永久性皮肤替代物的研究，取得了许多进展。例如，公开号为CN 1266716的中国专利“交联型猪脱细胞真皮片”的技术方案，是选择白猪活杀后洗刷去毛，剥取全厚皮块，去脂肪后反取约0.1-0.4mm厚的皮片，在0.25％胰蛋白酶等复合消化液内4℃、16～24小时，揭去表皮，真皮网状打孔后用戊二醛或甲醛-乙醇混合溶液交联，得到用于烧伤切/削痂创面和整形患者的切疤的创面修复的真皮片。按公开号为CN1416907的中国专利“医用胶原海绵及其制备方法”所采用的技术，将富含胶原蛋白的动物组织去除杂质粉碎，用稀碱溶液和醇类物质洗涤脱脂、溶解、蛋白酶处理、沉淀、乙酸溶解、冷冻干燥后，再固定，得到用于创面修复和止血的医用胶原海绵。
但现有用于深度烧伤或其他原因造成的真皮缺损创面的皮肤替代物，尚需解决的问题是(1)往往在移植此类皮肤替代物的同时需移植自体皮或用异体、异种皮肤覆盖，否则易因缺水而使其干枯，但此时皮肤替代物尚未血管化，移植的自体表皮的成活率受到影响，且大面积烧伤时一次性供皮区不足；(2)脱细胞异体或异种真皮能否完全去除异体(或异种)基质携带的病毒，能否完全避免疾病的传播，尚待观察；(3)特定类型的胶原蛋白才可用于制备永久性的皮肤替代物，但特定类型胶原蛋白的提纯工艺较烦琐，替代物的制造成本尚有降低的必要。
公告号为CN1118518C的发明专利“一种多孔丝素膜及其制备方法”，在技术上采用的是将蚕丝经脱胶、溶解、透析、浓缩后，加入含10～60％的R(OH)n、10～60％的RCH(NH2)COOH，其余为交联剂的添加剂，再经冷冻干燥法加工成多孔丝素膜，可用作创面覆盖及人工皮肤材料、药物控制释放材料、抗凝血材料等。但用于深度烧伤或其他原因造成的真皮缺损创面的修复时，在移植多孔丝素膜的同时仍需用自体皮或用异体、异种皮肤覆盖，否则易因缺水而使多孔丝素膜干枯。
发明内容
本发明的目的就是针对已有技术存在的不足，提供一种具备良好的生物相容性，实现真皮缺损创面修复的复层皮肤替代物及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种皮肤替代物，由厚度0.1～1.0mm的高分子膜为上层、厚度0.05～0.5mm的蚕丝蛋白膜为中层、厚度0.1～1.5mm的蚕丝蛋白多孔材料为下层复合而成。
上述技术方案中，所述上层高分子膜可以是家蚕丝素、柞蚕丝素、聚氨酯、硅橡胶、聚乙烯醇等天然或合成高分子的致密膜；所述中层蚕丝蛋白膜为致密膜，其中含0～90％的家蚕丝素、0～90％的柞蚕丝素、以及0～90％的蚕丝丝胶，其余为添加剂，中层的物质组成和比例可以与下层相同或不同；所述下层蚕丝蛋白多孔材料中含0～90％的家蚕丝素、0～90％的柞蚕丝素、以及0～90％的蚕丝丝胶，其余为添加剂。添加剂的种类及加入方式为现有技术，例如，中国发明专利CN1118518C“一种多孔丝素膜及其制备方法”中即公开了一种加入添加剂的技术方案。
本发明所述的皮肤替代物的制备方法，它以家蚕丝胶、家蚕丝素、柞蚕丝素溶液中的一种或几种为原料，加入添加剂后采用冷冻干燥的方法制备成蚕丝蛋白多孔材料，其特征在于再进行如下步骤的加工(1)用高分子膜在工作气体为He、Ar、CO、NH3、O2、H2中的一种的条件下进行低温等离子体处理，处理时间为0.5～10分钟；(2)制备总浓度为0.1～20％的复合水溶液，其中各种溶质的相对比例为0～90％的家蚕丝素、0～90％的柞蚕丝素、0～90％的蚕丝丝胶，其余为添加剂；(3)将低温等离子体处理后的高分子膜立即浸渍于上述复合水溶液中，溶液温度为10～90℃，浸渍时间为0.5分钟以上，然后再将其浸渍于温度为10～90℃的水中，振荡处理0.5小时以上，在温度为20～100℃的条件下干燥，在高分子膜上复合形成蚕丝蛋白膜；(4)将复合水溶液均匀涂抹于蚕丝蛋白膜的表面，把蚕丝蛋白多孔材料覆盖其上，在20～100℃的温度条件下干燥处理10～60分钟，得到由上层高分子膜、中层蚕丝蛋白膜、下层蚕丝蛋白多孔材料复合而成的皮肤替代物。
上述技术方案中，为保证中层的厚度和致密性，可以在进行步骤(4)之前，将步骤(1)至(3)重复进行1～3次，在高分子膜上复合形成蚕丝蛋白膜。
与现有技术相比，本发明所述的皮肤替代物具有以下显著优点1、由于本发明所提供的皮肤替代物其主体材料是蚕丝蛋白，蚕丝蛋白是由18种氨基酸所组成的天然蛋白质，具有良好的生物相容性，因此，制得的皮肤替代物避免了来自脊椎类动物材料可能携带的病毒、抗原的影响和疾病的传播。
2、本发明所述的皮肤替代物采用不同材料的复层结构技术，将其覆盖到创面后，下层能诱导新生血管长入，引导真皮细胞、组织的再生，是真皮再生的支架，在真皮形态和功能修复过程中蚕丝蛋白多孔材料逐步被降解；上层防止细菌侵入和体液流失，为真皮形态和功能的修复营造良好的环境，同时由于上层具备良好的力学性能，可防止术前、术中、术后皮肤替代物破损；待血管长入皮肤替代物的下层后揭去上层和中层，只需在其表面移植、覆盖自体刃厚皮(较薄的皮)，即可达到深度烧伤创面修复的目的，不需在移植皮肤替代物的同时就用自体皮或用异体、异种皮肤覆盖；中层是致密的蚕丝蛋白膜，具备良好的细胞相容性，它配合下层使创面愈合后的形态良好，有利于恢复皮肤原有的形态及功能。
3、由于采用了等离子反复处理法，使皮肤替代物的中层家蚕丝素、柞蚕丝素、丝胶等蚕丝蛋白质能与上层丝素、聚氨酯、硅橡胶、聚乙烯醇等高分子膜紧密结合，有利于中层的蛋白质致密膜的形成，从而实现替代皮肤的功能。
4、丝素蛋白来源丰富、提纯简便，可避免复杂、烦琐的加工工艺，容易实现规模化生产，制造成本低，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述实施例一1、家蚕茧经剥茧、切剖、去蛹得到茧层，将1公斤清洁的家蚕茧层用自来水充分洗涤后，再用去离子水洗涤3次，放入20升去离子水中，于98～100℃处理40分钟使丝胶溶解，过滤后得到丝胶水溶液，丝胶水溶液经冷冻干燥后得到固体丝胶。称取10g固体丝胶溶解于去离子水中配制成1000ml，得到浓度为1％的家蚕丝胶蛋白溶液。
2、将1公斤家蚕丝放入10升浓度为0.025％的碳酸钠水溶液中，煮沸0.5小时，重复处理三次，脱尽蚕丝外围的丝胶，得到家蚕丝素纤维；将晾干后的丝素纤维，用10升摩尔比为1∶8∶2的氯化钙、水、乙醇溶液，在70±2℃下加热溶解成丝素蛋白混合溶液；用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用水进行透析，以去除氯化钙，乙醇等杂质，再用多层脱脂纱布过滤，得到家蚕丝素蛋白溶液，调节溶液浓度至5％。
3、用浓度为9M的硫氰酸锂，于温度40℃，浴比1∶20溶解已经脱胶的柞蚕丝素纤维，得到混合溶液，将上述溶液对水透析，过滤后得到柞蚕丝素蛋白溶液，将柞蚕丝素溶液的浓度调节至5％。
4、将家蚕丝素蛋白溶液与家蚕丝胶蛋白溶液按10∶90的体积比混合，按公告号为CN1118518C的发明专利“一种多孔丝素膜及其制备方法”中所述的技术方案加入添加剂，采用冷冻干燥工艺制得厚度为0.4mm的蚕丝蛋白多孔材料。
5、将家蚕丝素蛋白溶液与柞蚕丝素蛋白溶液按照70∶30的体积比混合，加入添加剂，制得浓度为5％的复合水溶液。
6、制备厚度为0.5mm的聚氨酯膜，同样，还可采用其它的合成高分子材料膜，也可采用按公开号为CN1121836A的中国专利“一种创面保护膜及其制备方法”中的技术方案得到的丝素蛋白膜或其它的天然高分子膜等。
7、将聚氨酯膜进行低温等离子体处理，工作气体为Ar气，处理时间为0.5分钟。
8、立即将经步骤7处理后的聚氨酯膜浸渍于步骤5制得的复合水溶液中，溶液温度为20℃，浸渍时间为20分钟。
9、将经步骤8处理后的膜浸渍于温度为25℃的去离子水中，振荡处理3小时，每隔1小时更换一次水。
10、于35℃干燥。
11、步骤7～10重复进行3次，在聚氨酯膜表面复合形成蚕丝蛋白膜。
12、将步骤5制得的复合水溶液均匀涂抹上述聚氨酯膜与蚕丝蛋白膜复合而成的膜表面，将步骤4制得的蚕丝蛋白多孔材料覆盖于膜上。
13、于35℃干燥，得到上层为聚氨酯膜、中层为蚕丝蛋白膜、下层为蚕丝蛋白多孔材料复合而成的皮肤替代物，经切割、密封包装后，用Co60辐照，辐照剂量为25kGry。
实施例二1、家蚕茧经剥茧、切剖、去蛹得到茧层，将1公斤清洁的家蚕茧层用自来水充分洗涤后，再用去离子水洗涤3次，放入20升去离子水中，于98～100℃处理40分钟使丝胶溶解，过滤后得到丝胶水溶液，丝胶水溶液经冷冻干燥后得到固体丝胶。称取10g固体丝胶溶解于去离子水中配制成1000ml，得到浓度为1％的家蚕丝胶蛋白溶液。
2、将0.5公斤家蚕茧层放入20升浓度为0.4％的中性皂溶液中，于98～100℃温度条件下处理2小时，脱尽蚕丝外围的丝胶，充分洗涤、晾干后得到丝素纤维；用28升8.5摩尔/升的溴化锂溶液，于60±2℃搅拌溶解丝素纤维，得到丝素蛋白混合溶液；用水透析去除溴化锂等杂质，再用多层脱脂纱布过滤，得到家蚕丝素蛋白溶液，调节溶液浓度至5％。
3、用熔融的硝酸钙溶液，于温度105℃，浴比1∶20溶解已经脱胶的柞蚕丝素纤维，得到混合溶液，将上述溶液对水透析，过滤后得到柞蚕丝素蛋白溶液，调节溶液浓度至5％。
4、将家蚕丝素蛋白溶液、家蚕丝胶蛋白溶液和柞蚕丝素蛋白溶液按80∶10∶10的体积比混合，加入添加剂后，采用冷冻干燥法制得厚度为0.9mm的蚕丝蛋白多孔材料。
5、将家蚕丝素蛋白溶液、家蚕丝胶蛋白溶液和柞蚕丝素蛋白溶液按80∶10∶10的体积比混合，加入添加剂后，制得复合水溶液。
6、制备厚度为0.8mm的聚乙烯醇膜。
7、将聚乙烯醇膜进行低温等离子体处理，工作气体为O2气，处理时间为1分钟。
8、立即将经步骤7处理后的聚乙烯醇膜浸渍于步骤5制得的复合水溶液中，溶液温度为60℃，浸渍时间为60分钟。
9、将经步骤8处理后的膜浸渍于温度为60℃的去离子水中，振荡处理24小时，每隔4小时更换一次水。
10、在60℃的温度下干燥，在聚乙烯醇膜上复合形成蚕丝蛋白膜。
11、将步骤5制得的复合水溶液均匀涂抹于上述聚乙烯醇膜与蚕丝蛋白膜复合而成的膜表面，将步骤4制得的蚕丝蛋白多孔材料覆盖其上。
12、在60℃的温度下干燥，得到上层为聚乙烯醇膜、中层为蚕丝蛋白膜、下层为蚕丝蛋白多孔材料复合而成的皮肤替代物，经切割、密封包装后，用Co60辐照，辐照剂量为15kGry。
权利要求
1.一种皮肤替代物，其特征在于它是由厚度0.1～1.0mm的高分子膜为上层、厚度0.05～0.5mm的蚕丝蛋白膜为中层、厚度0.1～1.5mm的蚕丝蛋白多孔材料为下层复合而成。
2.一种皮肤替代物的制备方法，它以家蚕丝胶、家蚕丝素、柞蚕丝素溶液中的一种或几种为原料，加入添加剂后采用冷冻干燥的方法制备成蚕丝蛋白多孔材料，其特征在于再进行如下步骤的加工(1)用高分子膜在工作气体为He、Ar、CO、NH3、O2、H2中的一种的条件下进行低温等离子体处理，处理时间为0.5～10分钟；(2)制备总浓度为0.1～20％的复合水溶液，其中各种溶质的相对比例为0～90％的家蚕丝素、0～90％的柞蚕丝素、0～90％的蚕丝丝胶，其余为添加剂；(3)将低温等离子体处理后的高分子膜立即浸渍于上述复合水溶液中，溶液温度为10～90℃，浸渍时间为0.5分钟以上，然后再将其浸渍于温度为10～90℃的水中，振荡处理0.5小时以上，在温度为20～100℃的条件下干燥，在高分子膜上复合形成蚕丝蛋白膜；(4)将复合水溶液均匀涂抹于蚕丝蛋白膜的表面，把蚕丝蛋白多孔材料覆盖其上，在20～100℃的温度条件下干燥处理10～60分钟，得到由上层高分子膜、中层蚕丝蛋白膜、下层蚕丝蛋白多孔材料复合而成的皮肤替代物。
3.根据权利要求2所述的皮肤替代物的制备方法，其特征在于在进行步骤(4)之前，将步骤(1)至(3)重复进行1～3次，在高分子膜上复合形成蚕丝蛋白膜。
全文摘要
本发明属于生物医学材料领域，特别涉及一种适用于治疗烧伤、创伤及整形等的皮肤替代物及其制备方法。它由下层是蚕丝蛋白多孔材料，中层是蚕丝蛋白膜，上层是高分子膜复合而成，高分子膜在经低温等离子体处理后与蚕丝蛋白膜紧密结合，与蚕丝蛋白多孔材料形成良好的复合。它既能诱导毛细血管和真皮细胞长入，实现真皮组织的再生修复，具备良好的生物相容性，又不需在移植皮肤替代物的同时就用自体皮或用异体、异种皮肤覆盖。
文档编号A61L27/60GK1628864SQ200410064988
公开日2005年6月22日 申请日期2004年10月13日 优先权日2004年10月13日
发明者李明忠, 吴徵宇, 卢神州, 孙东豪, 廖镇江, 张剑 申请人:苏州大学