可逆性永生化的嗅鞘神经胶质细胞及其促进神经元再生的用途的制作方法

专利名称：可逆性永生化的嗅鞘神经胶质细胞及其促进神经元再生的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经元再生。特别地，本发明提供特定类型的细胞，即，可逆性永生化并且在培养物中生长的嗅鞘神经胶质细胞(olfactoryensheathing glia，OEG)，它是功能性的并且可安全用于移植。本发明在针对神经区域，例如人的脑、脊椎和/或外周神经的移植中具有特别的应用，以帮助外科手术或创伤后急性和慢性神经损伤的恢复。
背景技术：
嗅鞘神经胶质细胞(OEG)由Ramón y Cajal的研究已知成年中枢神经系统(CNS)神经元再生的能力极度有限。相反，来自外周神经系统(PNS)的神经元具有值得注意的再生能力，这可能归因于将PNS轴突置于鞘中的施旺细胞(Schwanncell，SC)的特定特性等因素。这一事实刺激了外周神经和SC移植物的应用以培育CNS中的再生，得到了有希望的结果(在Jones LL等，″Neurotrophic factors，cellular bridges and gene therapy for spinal cordinjury″，J.Physiol 2001；53383-89中进行综述)。尽管如此，用SC实现的不完全CNS再生还是使得有必要寻找更有效的再生介质。
由于它们的特殊特性，近年来使用OEG细胞进行CNS再生已经受到很多注意。嗅觉系统在成年哺乳动物中枢神经系统内具有显著不同的特性。在生物的整个生命期中，嗅觉感觉神经元由存在于嗅觉神经上皮上的祖细胞进行更新。新生的感觉神经元延伸新的轴突，其生长并进入CNS以便在嗅球的小球层生成它们的适当连接。这些嗅觉轴突被一种特殊类型的神经胶质细胞所包围，称作嗅鞘神经胶质细胞(OEG)。
在体内OEG细胞表达几种已经用于在分离和培养后鉴定它们的标记(见Ramon-Cueto A，Avila J.″Olfactory ensheathing gliaproperties andfunction″，Brain Res.Bull.1998；46175-187以及其中的参考文献)。OEG细胞与施旺细胞和星形胶质细胞共有一些特性，尽管它们呈现将它们分类为不同类别的神经胶质细胞的不同模式的标记和特性。
在培养物中已经鉴定出两种OEG细胞变体。在无血清的培养基中Barnett与合作者(Franceschini IA，Barnett SC.″Low-affinity NGF-receptorand E-N-CAM expression define two types of olfactory nerve ensheathingcells that share a common lineage″.Dev.Biol.1996；173327-343)已经于OEG细胞培养物中鉴定了两种极端形态学类型，一种星形胶质细胞样的扁平细胞，其表达GFAP(纤维状染色)和PSA-NCAM，并且对于p75-NGFr是阴性的，以及第二种类型，施旺细胞样的纺锤形细胞，表达p75-NGFr，具有对于GFAP的弥散染色并且对于PSA-NCAM是阴性的。所有的中间表型都是有可能的并且甚至在已建立的克隆细胞系中也观察到这些表型支持了这样的观点，即它们能够源自一种共同的前体细胞。在我们的来自成年大鼠和人供体的OEG细胞培养物中，我们也已检测到两种形态学类型的细胞以及中间表型。
由从我们实验室和其他实验室所获得的数据，显然OEGs显著有别于星形胶质细胞或施旺细胞，与鼠或人供体的年龄无关。
OEG细胞促进神经突增生的能力可以用于在培养物中建立神经突发生和/或再生模型。当使用胚胎性或新生的神经元时，培养物中神经突的增生可以简单地指示神经突发生。不过，来自成年CNS神经元的神经突延伸可以被看作CNS再生的培养模型。因而，Wigley和Berry已经利用成年视网膜神经节细胞(从现在起称为RGC)在单层神经胶质细胞上建立起共培养模型。培养在新生皮质星形胶质细胞汇合单层上的成年RGC能够远距离再生神经突(Wigley CB，Berry M.″Regeneration of adult rat retinalganglion cell processes in monolayer culturecomparisons between cultures ofadult and neonatal neurons″，Brain Res.1988；47085-98)。在最近的研究中，Wigley与合作者利用同一模型将单层的成年大鼠OEG与新生星形胶质细胞和SC相比较。他们证明了成年大鼠OEG细胞是培养物中成年RGC神经突再生的最佳基质，并且这种作用主要依赖于细胞间连接和钙。如Sonigra与合作者(Sonigra RJ，Brighton PC，Jacoby J，Hall S，Wigley CB.″Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adultcentral nervous system neurite outgrowth in coculture″.Glia 1999；25256-269)所证明的，细胞表面分子(进行粘连、轴突引导等的因子)对于成年RGC是重要的，但是必须对它们的确切身份进行定义。
通过使用PNS施旺细胞(SC)移植物已经实现了CNS中的初始再生。CNS再生性轴突能够穿入这种允许环境中但问题是在远离损伤的CNS组织中再进入的低效性。以往的实验显示OEG细胞能够在rizhotomy后于脊髓CNS环境中介导外周感觉轴突的再进入。当放置具有SC和OEG细胞的桥管(bridge tube)时，在脊髓的完全横切后也观察到再生性轴突再进入到CNS中。OEG细胞的存在减少了神经胶质创伤(scar)的形成并且在移植物-宿主界面上构成轴突通道。这种方法提供了一种在CNS宿主组织中提高再生性轴突再进入效率的途径。利用大鼠脊髓完全横切模型，也证明了CNS再生影响到脊髓中几种通路的非凡程度，伴随着由行为学试验所测量的功能性恢复(Ramon-Cueto A等，″Functional recovery of paraplegic rats andmotor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia″，Neuron 2000；25425-435)。OEG细胞似乎能够在宿主CNS组织中迁移并且沿着生长的轴突前进，因而为CNS再生提供了有利的微环境。
所有这些数据都支持这样的观点，即OEG细胞在功能上不同于其它的神经细胞，诸如星形胶质细胞或施旺细胞。
使用这些细胞的一个最重要的必要条件是完全了解它们的生长需要。OEG细胞的某些促分裂原最初被鉴定为像存在于星形胶质细胞条件培养基(ACM)中的因子，其并不结合肝素并且能够用抗神经调节蛋白-1(NRG-1)抗体进行抑制。而且，半纯化的牛垂体提取物，其是几种神经胶质促分裂原包括GGF a NRG-1的粗制来源，对于OEG是有活性的。
尽管在啮齿动物中进行的实验提示OEG细胞移植物有利于脊髓伤害后的功能性恢复，这些研究必须延伸到灵长动物，其中运动功能脊椎上的控制对于评估功能性恢复是基础性的。在这一方面最重要的是可以获得移植入患者体内的人OEG细胞的易得的和无限制的来源。我们利用营养因子、生物化学化合物和介质的特定混合物已经明确了延长成年大鼠OEG细胞传代培养的条件。这一组合还允许人OEG细胞的生长。不过，长时期之后OEG细胞丧失它们支持由成年CNS神经元的轴突再生的能力，尽管它们保持支持来自幼神经元(young neuron)的轴突延伸的能力。因而OEG细胞的长期培养似乎并非获得足够移植群的可取方法。
WO 02/088337公开了一种获得大量OEG细胞的方法，其包括用反转录病毒载体感染初级(primary)OEG细胞，所述载体包含端粒末端转移酶催化亚基Tert，以便获得经修饰的OEG细胞。不过，却未提及有关所述细胞支持由成年CNS神经元的轴突再生的能力。
生成保留初级OEG细胞培养物的轴突再生促进特性的永生化非致瘤克隆细胞系是获得无限量的OEGs的可取方法。利用表达自组成型细胞启动子的SV40大T抗原、通过永生化作用已经发展出克隆的大鼠OEG细胞系(Moreno-Flores MT等，″Immortalised olfactory ensheathing glia promoteaxonal regeneration of rat retinal ganglion neurons″，J.Neurochem.2003；85861-871)。在成熟RGN轴突再生的促进中，发现一些这些永生化的大鼠OEGs可与初级的大鼠OEG细胞和SC相比。不过，这些细胞中癌基因(在此种情况下为编码SV40大T抗原的基因)的持续存在令人担心，因为它可以提高移植后恶性转化的危险。
因而仍然需要人OEG细胞的易得的和无限性的来源，所述人OEG细胞保留促进轴突再生的特性并且同时避免肿瘤的生成。
发明概述我们发明的目的是基于OEG细胞在体外和体内促进神经元轴突再生的能力，在此程度上这种能力到目前为止尚未被任何其它初级或遗传修饰的细胞类型所共享。我们已经发现了一种通过可逆转遗传修饰和选择获得无限量的保留其轴突再生能力的OEG细胞的途径。
在我们研究的过程中，我们发现了一种逆转(reverse)永生化初级细胞并由人供体获得OEGs的永生化克隆细胞系的方法。我们已经测试所有这些细胞系在其分子标记上都近似于初级OEGs。值得注目的是，我们已经发现这些细胞系中的一些保留了其促进由成年神经元的轴突再生的能力，即使是在所述永生化过程被逆转时。
根据本发明的一个方面，提供功能性可逆转永生化的或逆转-永生化嗅鞘神经胶质(OEG)细胞系。所述细胞系可以用于治疗方法中，如用于通过将所述细胞移植入中枢和/或外周神经系统损伤区而促进神经元再生的方法中。在一个特定的实施方案中，所述细胞系是人细胞系。
在本发明的另一方面，提供制备用于移植入患者体内的功能性OEG细胞集群(population)的方法。所述方法包括(a)提供初级OEG的样品；(b)通过用一种载体转化所述OEG细胞而使所述OEG细胞永生化，由此产生永生化的OEG细胞，所述载体包括包含癌基因(或癌基因的组合)的可去除的DNA片段；(c)培养所述永生化的OEG细胞；(d)选择保持亲本OEG细胞的功能特性(即，促进由成年CNS神经元的轴突再生的能力)的那些OEG克隆细胞系，和(e)从所述永生化的OEG细胞中去除癌基因(或癌基因的组合)，所述去除导致产生用于移植入患者体内的功能性OEG细胞集群。优选地，由人供体中获得OEG细胞并且所述癌基因是任何能够避免进入衰老的基因，包括编码SV40大T抗原、端粒末端转移酶催化亚基、Bmi-1蛋白的基因或这些基因的任何组合。
本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含所述功能性嗅鞘神经胶质(OEG)细胞以及药用载体。在一个优选的实施方案中所述细胞是逆转-永生化的OEG细胞。
优选通过将所述癌基因(或癌基因的组合)置于重组酶靶位点的侧翼而使它可去除，并且通过将表达来产生重组酶的基因导入所述永性化细胞而实现所述去除，所述重组酶特异性识别重组酶靶位点。优选地，所述重组酶是Cre重组酶并且所述重组酶靶位点是loxP位点。
在优选的实施方案中，可去除的DNA片段还包含自杀基因，其编码能够通过一种外源试剂破坏所述永生化细胞的基因产物，如果所述可去除的DNA片段未从细胞中去除的话。所述自杀基因优选是编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的基因，并且通过暴露于9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(gancyclovir)而破坏所述细胞，如果所述可去除的DNA片段未从细胞中去除的话。
本发明的另一方面提供制备用于移植入患者体内的功能性OEG细胞集群的方法。所述方法包括(a)提供初级OEG的样品；(b)通过用一种载体转化所述OEG细胞而使所述OEG细胞永生化，由此产生永生化的OEG细胞，所述载体包含含有癌基因(或癌基因的组合)、可选择的标记基因和编码单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的可去除的DNA构建体，所述基因一起排列于loxP位点的任何一侧；(c)培养所述永生化的OEG细胞；(d)选择保持亲本OEG细胞的功能特性的那些OEG克隆细胞系，和(e)通过从永生化的OEG细胞中去除所述DNA构建体来逆转OEG细胞的永生化作用，所述去除是通过将编码Cre重组酶的基因导入所述永生化的OEG细胞，以进行DNA构建体在loxP位点上的切除而实现的，所述切除导致产生用于移植入患者体内的功能性OEG细胞集群。
还与治疗患者神经元损害的方法一起提供由前述方法生产的功能性OEG细胞集群，所述方法包括将所述OEG细胞以足够量的那些OEG细胞移植入患者的损害或损伤的神经区，例如，脑、脊柱和/或外周神经，以修复患者中的所述神经元损害或损伤或帮助恢复外科手术或创伤后急性和慢性的神经损害。
根据本发明的另一方面，提供可逆转永生化的OEG细胞，其包含用DNA构建体转化的初级OEG细胞，所述DNA构建体包含在癌基因(或癌基因的组合)侧翼的两个重组酶靶位点，所述癌基因赋予OEG细胞永生化作用，其中当靶位点暴露于特异性识别所述靶位点的重组酶时，所述永生化作用可以由通过在重组酶靶位点上的剪切来切除DNA构建体而成为可逆的。优选地，所述重组酶靶位点是loxP位点并且所述永生化作用可以通过在loxP位点上的Cre重组酶剪切而成为可逆的。所述DNA构建体可以还包括可选择的标记基因，并且可以还包含自杀基因，其编码能够通过一种外源试剂破坏所述永生化OEG细胞的基因产物，如果所述DNA构建体未从细胞中去除的话。优选地，所述自杀基因是编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的基因，并且所述外源试剂是9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤。
在一个实施方案中，初级的OEG细胞获自人供体，并且提供可逆性永生化的细胞系。
按照本发明的另一方面，提供在移植入患者体内后具有功能的逆转-永生化OEG细胞，它是通过将上述永生化OEG细胞中的DNA构建体暴露于重组酶而产生的，所述重组酶在重组酶靶位点通过剪切而切除所述DNA构建体。还提供一种治疗神经元损害患者的方法，包括将足量的所述逆转-永生化的OEG细胞移植入患者的受伤区域以便促进患者体内的神经元再生。
附图简述

图1显示在解离和培养一周后(DIV 1)或在五次连续传代后(DIV 2)人OEG细胞的一般形态。
图2显示用针对神经胶质标记，诸如神经配蛋白(Neuroligin)、APP(22C11)、S100和GFAP的抗体染色的人OEGs的免疫荧光。
图3显示EGF-R家族成员的表达。用针对Erb B2、Erb B3和Erb B4的抗体通过蛋白质印迹分析从不同介质中的人OEGs中获得的细胞提取物。将微管蛋白用作加样对照。该图包含来自用平行培养基进行的类似实验的数据，所述培养基来自己建立的大鼠OEGs细胞系。
图4显示用针对神经元蛋白的抗体染色的大鼠视网膜神经元的轴突再生能力，所述神经元蛋白如神经元特异性微管蛋白(334)、轴突蛋白诸如MAP1B-SMI31(SMI31)或MAP2(305)，或体-树蛋白MAP2(514)。
图5显示包含编码SV40大T抗原的基因作为癌基因的慢病毒(lentiviral)构建体pLOX-Ttag-Ires-TK的图示。
图6显示包含编码端粒末端转移酶催化亚基的基因作为癌基因的慢病毒构建体pLOX-HTERT-Ires-TK的图示。
图7显示包含编码Bmi-1蛋白的基因作为癌基因的慢病毒构建体pLOX-CWBmil的图示。
发明详述本发明的某些方面采用本领域公知的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。见，例如，Sambrook et al.，“Molecular CloningALaboratory Manual”(1989)；“DNA CloningA Practical Approach”，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait ed.1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames & S.Higgins eds.(1985)]；“Transcription and Translation”[B.D.Hames & S.J.Higginseds.(1984)]；“Animal Cell Culture[R.I.Freshney，ed.(1986)]；“ImmobilizedCells And Enzymes”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“A Practical Guide ToMolecular Cloning”(1984)；或“Current Protocols in Molecular Biology“，eds.Frederick M.Ausubel et al.，John Wiley & Sons，1999。
术语“核酸构建体”或“DNA构建体”有时用于指编码序列或可操作性连接于适当调控序列并插入载体用于转化细胞的序列。这一术语可以与术语“转化性DNA”相互交换使用。这种核酸构建体包含目标基因产物的编码序列，以及可选择的标记基因和/或报告基因。
术语“可操作性连接的”或“可操作性插入的”在此意为对编码序列的表达必需的调控序列在相对于编码序列适当的位置被置于核酸分子中以便能够表达所述编码序列。这一相同定义有时被用来在表达载体中排列其它转录控制元件(例如增强子)。
术语“可选择的标记基因”指一种基因，当它表达时赋予一种可选择的表型如在转化细胞上的抗生素抗性。
“载体”是另一种核酸片段可以可操作地插入其中以便引起片段的复制或表达的复制子，诸如质粒、噬菌体、粘粒或病毒。更具体地，术语“病毒性载体”指能够向宿主细胞传递外源或异源遗传信息的病毒。这种外源遗传信息可以翻译成蛋白质产物，但这并非外源信号的必要要求。
术语“永生化作用”或“永生化的”意指一种细胞或一种产生细胞的过程，所述细胞将在培养中无限地增殖由此避免进入衰老。在本发明中，永生化作用指以这样一种方式转化初级细胞培养物的过程，即引发细胞在某些方面表现像肿瘤细胞一样；具体地，在肿瘤细胞的增殖特性上。
术语“选择”指对永生化的OEG克隆细胞系各个测定其支持神经元存活和促进轴突由成年CNS神经元再生的能力以便排除性地选择那些保留这一功能特性的克隆细胞系的过程。
术语“逆转-永生化作用”指通过一种方式对细胞进行永生化使得它们能够在以后恢复非永生化状态的过程。
“可逆性永生化的”细胞是目前处于永生化状态，但以后能够利用本文所述的逆转-永生化作用恢复为非永生化状态的细胞。
“逆转-永生化的”细胞是已经进行过完整过程的逆转-永生化作用，并且现在以非永生化状态存在的细胞。
本文所用的术语“功能性的”，意即逆转-永生化的OEG细胞能够在共培养系统中于体外促进由成年CNS神经元的轴突再生，并且因此在移植入患者的神经受损区域后仍然具有体内促进轴突再生的能力。
术语“自杀基因”指赋予可逆性永生化细胞致死性表型的基因。用更常用的术语，“自杀基因”可以被认为阴性可选择标记基因。其基因产物的表达能够使细胞被杀死，即，通过外源试剂如抗生素或抗病毒剂处理细胞。
术语“重组酶/重组酶靶”指相互作用的分子的配对，一个是重组酶而另一个则是被该重组酶特异性识别和剪切的DNA位点。所述重组酶/重组酶靶由于二者之间的特异性相互作用而进行配对，即重组酶结合其关联DNA结合序列并于该位点剪切所述DNA。
本文所用的术语“神经元损害”指由任何急性或慢性外伤性损害或任何退行性疾病状况产生的任何损伤，其导致任何功能性神经学失能作为神经元细胞死亡、神经通道结构破坏、轴突退化或突触消除的结果。因而促进神经元轴突再生可以有助于在多种情况下存活的神经元回路的修复，所述多种情况包括脑和脊髓的外伤性损害，轴突退行性疾病包括多发性硬化和神经元退行性疾病包括特别是阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨延顿病、运动神经元疾病和脊髓小脑共济失调。
按照本发明，已有一种方法最小化或消除移植的OEG细胞恶性转化的危险，所述OEG细胞是通过初级OEG细胞的永生化和在细胞培养中增殖而产生的。发明人利用重组病毒可逆性地使得OEG细胞永生化，所述重组病毒如包含癌基因或癌基因组合的慢病毒，所述癌基因或癌基因组合能够诱导致瘤性生长，侧翼为重组酶靶位点。通过将编码重组酶的基因导入细胞中接着进行位点特异性重组而实现将癌基因或癌基因组合从永生化的细胞中切除，所述重组酶特异性识别所述重组酶靶位点。在位点特异性重组和癌基因切除后，细胞增殖停止并且细胞形成初级OEG细胞的特性。而且，所述细胞具有最小的致癌可能性。
上述的逆转-永生化OEG细胞的显著特征是它们在移植患者中恶性转化的危险大大减小了。通过将“自杀”基因添加到用于永生化细胞的起始病毒构建体中，按照本发明甚至进一步增强了这些细胞进行OEG移植的安全应用。在一个示范性的实施方案中，所述自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，在两个loxP位点之间并入慢病毒载体中。如果通过上述机制由Cre重组酶将癌基因(或癌基因的组合)成功地切除，也切除了HSV-tk基因。如果它未被切除，则能够通过用9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤处理来破坏细胞，所述9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤是一种靶向HSV-tk基因产物的抗病毒剂。
因而，本发明的可逆转性永生化的OEG细胞是包含含有可选择性标记基因和癌基因或癌基因的组合的异源性DNA构建体的OEG细胞，所述癌基因或癌基因的组合能够使细胞在培养物中增殖，所述可选择性标记基因和癌基因(癌基因的组合)一起排列于重组酶DNA结合位点的侧翼。任选地，所述DNA片段还包含“自杀”基因，也排列于重组酶结合位点内。通过用所述DNA构建体转化初级OEG细胞，在适于扩殖转化的OEG细胞集群的标准条件下培养转化的OEG细胞，随后将转化的OEG细胞暴露于识别所述DNA构建体上结合位点的重组酶(例如通过用包含编码重组酶基因的病毒载体感染转化的OEG细胞)来实施本发明。如果所述DNA构建体还包含“自杀”基因，将所述OEG细胞进一步置于会杀死任何仍包含所述DNA构建体的细胞的条件下，随后用重组酶进行处理。
初级OEG细胞可以获自任何供体或来源。优选地，所述供体或来源是哺乳动物，诸如小鼠或大鼠，最优选地，所述供体或来源是人。获得初级OEG细胞并起始初级OEG细胞的培养的方法是本领域所公知的。例如，初级OEG可以获自形成嗅球的患者或供体，这承担了显而易见的困难和危险，或获自嗅粘膜固有层(Lamina Propria)。我们用本发明解决了完全从有限供应的嗅粘膜固有层中获得足够OEG细胞进行移植的问题。人嗅粘膜相对易于通过简单内镜操作或局部麻醉进行活检(Feron等.″newtechniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons，Arch.Otorlaryngol.Head Neck Surg.1998；124861-866)。
任何癌基因或癌基因的组合都可以用来使初级OEG细胞可逆地永生化，并且其中许多是本领域已知的。编码SV40大T抗原的基因(SV40Tag)，一种用来使得初级细胞永生化的已知癌基因，是其中一种，但是可以使用其它的。这些特别包括，但不限于，如本领域已知的病毒癌基因，以及细胞癌基因如Bmi-1，端粒末端转移酶催化亚基，c-myc，或编码生长因子受体的基因。在一个特定的实施方案中，所述DNA片段只包含一个癌基因。在另一个特定的实施方案中，所述DNA片段包含两个或更多癌基因的组合；在这种情况下，所述癌基因可以是串联的或在任何其它的合适的位置上。
可以通过多种方法递送所述癌基因，例如，在任何适于向细胞递送遗传物质的载体中。在此示范慢病毒载体。其它的合适载体包括反转录病毒载体，具体地为致癌反转录病毒，以及腺伴随病毒和腺病毒。慢病毒载体的实例包括人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)，从其中已经发展了许多合适的载体。其它适于用作载体的慢病毒包括灵长类慢病毒组，包括人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、人免疫缺陷病毒3型(HIV-3)、猿免疫缺陷病毒(SIV)，猿AIDS反转录病毒(SRV-1)，人T-细胞嗜淋巴细胞病毒4型(HTLV4)，以及牛慢病毒，马慢病毒，猫慢病毒，和绵羊/山羊慢病毒组。除了通过以上指出的方法递送癌基因之外，还可以通过其它本领域已知的方法递送癌基因，例如，通过以与EP 235113中所教导的相似方式电穿孔入细胞中。
类似地，任何可选择的标记基因都可以用在携带癌基因的DNA构建体中，并且其中许多是本领域已知的。在″Current Protocols in MolecularBiology″，编辑.Frederick M.Ausubel等，John Wiley & Sons，2001中描述了几种可选择的标记系统以及将癌基因送入细胞中的载体和其它方法。
此外，许多合适的“自杀”基因的实例是本领域已知的。优选使用HSV-tk基因，但是可以使用其它的。Ausubel等，2001，同上给出了许多实例。
除了永生性的癌基因或癌基因的组合、可选择的标记基因以及自杀基因之外，DNA构建体还可以包含一种或多种诸如促进生长的所需的基因。
如本领域已知的，可以将前述基因可操作性地连接于一个或多个5′和/或3′表达控制区。关于启动子，也如本领域已知的，可以使用组成型的或诱导型的启动子。
适用于本发明的DNA重组酶系统也是本领域已知的。优选使用cre/lox系统(Cre重组酶，LoxP结合位点)，但还可以使用其它系统，包括，但不限于来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP/FRT系统。将理解如果DNA构建体包含特定重组酶的靶结合位点，则在逆转OEG细胞的永生化作用中使用该重组酶。
US 5,629,159描述了多种DNA构建体，其被示范用于胰岛细胞和神经细胞的永生化和去永生化。可以全部或部分地采用这些变体的一种或多种，以便利用本文所述的方法逆转按照本发明的OEG细胞的永生化作用。
本发明的一个优选的实施方案包括(1)用包含侧翼为loxP位点的SV40Tag基因，HSV-tk基因和适合的可选择标记基因(例如，编码热稳定抗原的neo或HSA)的慢病毒载体使得初级OEG细胞永生化；(2)选择转化子并使它们在培养物中生长；(3)通过用适合的载体，如腺病毒载体感染细胞而逆转永生化作用，所述载体携带可表达的Cre重组酶基因以便切除癌基因；和，任选地，(4)用9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤处理破坏细胞，在所述细胞中没有成功地删去癌基因。已经发展出这种类型的载体和系统用于各种初级细胞的可逆性永生化作用(Westerman & Leboulch，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938971-8976，1996)，但是尚未用于逆转初级OEG细胞的永生化作用。更重要的是，在本发明之前，这种系统是否能够用于生产OEG细胞是未知的，所述OEG细胞在移植后于体内发挥作用，保持其轴突再生特性，并且致癌可能性足够低从而可以安全用于这种用途。
如实施例中所详细描述的，已经对优选的实施方案进行了试验。简言之，按照Dr.Trono实验室所描述的方案，利用包含侧翼为loxP重组靶位点的编码SV40Tag的基因的重组慢病毒将来自人嗅球的OEG细胞永生化(实施例1)。随后可以用Cre重组酶进行点特异性重组而完成从永生化细胞上切除SV40Tag。用这种重组病毒永生化的细胞表达癌基因[(在此情况下为SV40Tag)或任何其它癌基因或其组合]，并且它们不会停止分裂。用Cre重组酶切除编码SV40Tag的基因后，细胞停止生长并且DNA合成下降而且细胞在有限的时期后衰老。
总之，这些结果表明通过上述方法生产的逆转-永生化的OEG细胞在移植后于体内作为OEG细胞而起作用。而且，所述细胞的致癌可能性足够低从而可以安全用于移植入需要这种治疗的患者体内。尽管对于其它的细胞类型已经采用过类似的反永生化作用方案，但是成功逆转永生化作用而在体内产生功能性OEG细胞是意想不到的结果。事实上，反永生化作用后获得的OEG细胞能够促进神经元再生(实施例2)。
因而，本发明表明，通过用整合了癌基因(或癌基因的组合)、自杀基因和重组酶/重组酶靶系统的重组病毒转导初级OEG细胞，生成了一种充分分化的可逆性永生化非肿瘤原性OEG细胞系。在按照本发明所描述的结果之前，成功生成这种细胞系将会是不可预测的。
OEG细胞移植具有作为备选方法的很大潜力以促进神经系统修复、神经元再生和对受到所述损害、损伤或病损的患者治疗神经元损害，损伤或SNC病损包括脑和脊髓的创伤性损害，轴突退行性疾病包括多发性硬化和神经退行性疾病包括特别是阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨延顿病、运动神经元疾病和脊髓小脑共济失调。发展这种疗法的一种显著限制已被本发明所克服，所述限制与用于移植的OEG细胞的受限的可获得性有关。
所以，在一个方面本发明还涉及通过用有效量的包含以上定义的逆转-永生化OEG细胞的组合物处理而进行的对患神经元损害的人患者的治疗方法。应用的细胞数将依赖于病灶的大小和被治疗患者的状况。所述应用一般通过外科手术暴露病损位点，从而能够直接应用本发明的细胞。
所述治疗可以是自体的，因而利用由来自患者的OEG细胞产生的逆转-永生化OEG细胞。这减小了不利的免疫反应的危险，尽管它具有缺陷，即从患者体内取样品之时直到生成足够的逆转-永生化细胞用于治疗为止需要一些时间。或者，所述治疗可以是异源的，使用易于获得的可逆性永生化或逆转-永生化的OEG细胞库。这种细胞库包含根据本文所述的本发明的方法制备的可逆性永生化或逆转-永生化OEG细胞的集合，并且选择那些特征为在促进轴突再生中具有大的组织相容性和有效性的细胞。这种细胞集合的可获得性将显著减少治疗所需的时间，例如在CNS损伤之后，尽管可能需要使用免疫抑制性化合物。
包含可逆性永生化或逆转-永生化OEG细胞的用于移植的细胞库也是本发明的目的。
在一个实施方案中，本发明的细胞库包含人可逆性永生化或逆转-永生化OEG细胞系的文库或多种人可逆性永生化或逆转-永生化OEG细胞系，其中每种都对至少一种或多种关键抗原基因，即，编码组织相容性抗原的基因是纯合的优选每个细胞系对于至少一种存在于人群中的MHC(主要组织相容性复合物)等位基因是纯合的，其中相对于多种OEG细胞系的剩余成员所述多种细胞系的每个成员对于不同组的MHC等位基因都是纯合的。优选地，所述文库的每个成员对于组织相容性的不同组合或者MHC抗原等位基因都是纯合的。可以将保留所述集合并冷冻分布到应用位点上。利用本发明的方法，可逆性永生化的或逆转-永生化的OEG细胞系可以选自这些细胞的库，对于与需要移植的患者的MHC等位基因匹配的MHC等位基因而言，所述细胞对于一种或多种组织相容性抗原等位基因是纯合的。
本发明的治疗方法可以组合以其它疗法，诸如神经营养因子或生长因子、模拟神经递质作用的药剂、抗凋亡剂、干扰生长轴突的抑制剂的试剂的应用，以及身体复原和训练。可以使用聚合物支架以便允许再生性轴突的定向生长。
还要求包含本发明细胞的药物组合物。所述细胞优选包含于生理上合适的载体中，如生理上相容的媒介物，包括但不限于，培养基，诸如Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，RPMI 1640，Fisher′s，Iscove′s，或McCoy′s培养基；或者优选地，固体、半固体、凝胶状或粘性支持介质，诸如胶原蛋白、胶原糖胺聚糖、血纤蛋白、聚氯乙烯、聚氨基酸诸如聚赖氨酸或聚鸟氨酸、水凝胶、琼脂糖、硫酸葡聚糖或硅氧烷。在特定的实施方案中，所述支持介质可以包含生长因子或其它如上所述的试剂。
如果将固体、半固体或胶质的支持物用作媒介物，可以将细胞导入媒介物的液相，随后对其进行处理，从而使它变得更加坚固。在所述媒介物具有固体结构的本发明的实施方案中，可以将所述媒介物塑造成这样的形状，其可以与病损的形状一致。
提供下列实施例以便更加详细地描述本发明。它们意在说明，但并非限定本发明。
实施例1利用Cre/Lox系统的人初级OEG细胞的逆转永生化作用在本实施例中所述的方案中，利用重组慢病毒将人OEG细胞永生化，所述慢病毒包含编码SV40Tag的基因，侧翼为Loxp位点。在用能够传递编码Cre重组酶的基因的重组腺病毒处理之前和之后对细胞进行特征鉴定，以便确定这种方法是否能够产生对于移植在临床上有用的OEG细胞系。
从来自死后(post-mortem)的成年供体人组织中获得人细胞。所述组织属于男性和女性供体，来自溴球；用0.1％胰蛋白酶解离并消化外层。供体的年龄似乎对于培养的成功没有限制。用含有抗生素(青霉素/链霉素)和抗真菌素(Primocin)的无菌磷酸缓冲盐(PBS)溶液洗涤组织。随后用胰蛋白酶溶液于37℃将所述组织进行控制性蛋白质水解20分钟。此后，通过将消化物质经过减小直径的Pasteur移液管进行机械破坏并培养于对这种细胞类型特别设计的培养基中。这种成分半确定的培养基包含来自牛垂体的提取物、弗司扣林、小量热灭活的胎牛血清，组合以如在Moreno-Flores MT，Lim F，Martin-Bermejo MJ，Diaz-Nido J，Avila J，Wandosell F.″Immortalised olfactory ensheathing glia promote axonalregeneration of rat retinal ganglion neurons″J.Neurochem.2003；85861-871中所述的Dulbeco′s改良培养基(DMEM)。
将人细胞于37℃在7％CO2中维持于所述培养基中，并且随后遵照Ramon-CuetoA，Avila J.″Olfactory ensheathing gliaproperties and function″.Brain Res.Bull.1998；46175-187中所示的通用标准将其鉴定为OEG细胞。结果显示于图1-3中。表1总结了由鼠OEG细胞、星形胶质细胞、施旺细胞和oligodendocite O2星形胶质细胞系和人OEG细胞所分析的不同细胞标记。
表1分析的细胞标记
(f)纤维染色；(d)弥漫性染色；n.d.未测为了将这些人OEG细胞永生化，利用包含编码SV40大T抗原的基因作为癌基因的表示为pLOX-Ttag-Ires-TK(图5)的慢病毒构建体，我们使用了由Dr.D.Trono′的实验室所描述的一种可逆性系统(Naldini L，Blomer U，Gage FH，Trono D，Verma IM.“Efficient transfer，integration，and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injectedwith a lentiviral vector”.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1996；9311382-11388；Salmon P，Oberholzer J，Occhiodoro T，Morel P，Lou J，Trono D.″Reversibleimmortalization of human primary cells by lentivector-mediated transfer ofspecific genes″.Mol.Ther.2000；2404-414)。或者，也可以利用包含编码端粒末端转移酶催化亚基的基因作为癌基因的表示为pLOX-HTERT-Ires-TK(图6)或包含编码Bmi-1蛋白的基因作为癌基因的表示为pLOX-CWBmil(图7)的慢病毒构建体。
由这些感染，在那些具有最高生长速率的人细胞之后获得了建立的克隆；并且最初，获得了一些克隆并且鉴定为OEG细胞。例如用pLOX-Ttag-Ires-TK永生化的细胞，表达T抗原(＞85％)，S100和3-PDGH。
实施例2成年视网膜轴突再生分析将由成年大鼠视网膜节神经元(RGN)的轴突再生的促进作用用作测定细胞培养物中再生能力的标准方法。这种方法比其它神经突发生(neuritogenic)分析更接近地反映OEG细胞的体内修复性能。
简言之，所用的方法如下将视网膜从P60大鼠眼中解剖出来，用0.1％胰蛋白酶解离并进行消化。用2mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂停止消化，并通过将消化物质经过减小直径的Pasteur移液管而获得细胞的精细悬浮液。将细胞离心并重悬于成分确定的培养基中(Moreno-Flores等，2003)。将RGN铺于单层神经胶质细胞初级OEG上或在建立的细胞系中。
为了进行免疫组化分析，培养七天后，将神经元-人OEG细胞混合培养物用4％的低聚甲醛进行固定。图4显示用针对神经元蛋白诸如神经元特异性微管蛋白(334)、轴突蛋白诸如MAP1B-SMI31或MAP2(305)，或体-树蛋白MAP2(514)的抗体染色的大鼠视网膜神经元的轴突再生能力。
我们的数据显示可逆性永生化的人OEG细胞在与初级OEG或来自大鼠OEG细胞的克隆细胞系相似的程度上促进由成年RGN的轴突再生。
考虑到最近的几个研究已经证明了OEG细胞促进体内CNS轴突再生的能力(Li Y，Field PM，Raisman G.“Repair of adult rat corticospinal tractby transplants of olfactory ensheathing cells”.Science 1997；2772000-2002；Li Y，Field PM，Raisman G.″Regeneration of adult rat corticospinal axonsinduced by transplanted olfactory ensheathing cells″.J.Neurosci.1998；1810514-10524；Ramon-Cueto A，Plant GW，Avila J，Bunge MB.“Long-distance axonal regeneration in the transected adult rat spinal cord ispromoted by olfactory ensheathing glia transplants”.J.Neurosci.1998；183803-3815；and Ramon-Cueto A，Cordero MI，Santos-Benito FF，Avila J.“Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in theirspinal cords by olfactory ensheathing glia”.Neuron 2000；25425-435)，即使在完全横切脊髓之后仍具有给人深刻印象的运动和感觉功能恢复[Ramon-Cueto等，2000，在前引用的]，并且我们最近的初步实验显示大鼠来源的建立的细胞系在培养物和体内保持这种神经元再生性能力，我们推断人OEG细胞的可逆永生化作用并不产生再生能力的显著减弱，即使到目前为止并不知道潜在的分子机制。
据我们所知，这是第一次证明可逆性永生化的人OEG细胞能够促进培养的来自的成熟哺乳动物CNS的神经元的轴突再生。我们的人OEG细胞系代表有用的工具，来促进OEG细胞在研究和应用中的用途。这些细胞系和类似物单独或在包含其的药物组合物中，可以用来治疗CNS病损。
权利要求
1.一种可逆性-或逆转-永生化的嗅鞘神经胶质(OEG)细胞系。
2.一种按照权利要求1的细胞系，其用于治疗方法中。
3.一种按照权利要求2的细胞系，其用于促进神经元再生。
4.一种按照前述权利要求任一项的细胞系，其是人细胞系。
5.一种包含前述权利要求的任一项的细胞系和药用载体的药物组合物。
6.一种制备用于移植入患者体内的功能性OEG细胞集群的方法，其包括a)提供初级OEG细胞的样品；b)通过用一种DNA构建体转化OEG细胞而使所述OEG细胞永生化，由此产生永生化的OEG细胞，所述DNA构建体包含含有癌基因或癌基因组合的可去除DNA片段；c)培养所述永生化的OEG细胞；d)选择保持它们的功能特性的那些永生化的OEG克隆细胞系；和e)从所述永生化的OEG细胞中去除癌基因或癌基因的组合，所述去除导致产生用于移植入患者体内的功能性OEG细胞集群。
7.权利要求6的方法，其中OEG细胞获自人供体。
8.权利要求6的方法，其中通过将所述癌基因或癌基因的组合置于重组酶靶位点的侧翼而将它制成可去除的，并且通过将一种基因导入永生化的细胞中而完成去除，所述基因被表达来产生一种特异性识别重组酶靶位点的重组酶。
9.权利要求8的方法，其中所述重组酶是Cre重组酶并且所述重组酶靶位点是loxP位点。
10.权利要求6的方法，其中所述癌基因是编码SV40大T抗原的基因，编码端粒末端转移酶催化亚基的基因、编码Bmi-1蛋白的基因或所述癌基因的任何组合。
11.权利要求6的方法，其中所述可去除的DNA片段还包含自杀基因，其编码能够通过一种外源试剂破坏所述永生化细胞的基因产物，如果所述可去除的DNA片段未从所述细胞中去除的话。
12.权利要求11的方法，其中所述自杀基因是编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的基因，并且通过暴露于9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤而破坏所述细胞，如果所述可去除的DNA片段未从所述细胞中去除的话。
13.由权利要求6的方法生产的功能性OEG细胞集群。
14.一种对患者治疗神经损害的方法，所述方法包括将足量的权利要求13的OEG细胞移植入患者体内以促进患者神经元损伤区域的神经元再生。
15.一种制备用于移植入患者体内的功能性OEG细胞集群的方法，其包括a)提供初级OEG细胞的样品；b)通过用一种DNA构建体转化OEG细胞而使所述OEG细胞永生化，所述DNA构建体包含含有癌基因或癌基因组合、可选择的标记基因以及编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的基因的可去除DNA片段，这些基因一起排列于loxP位点的任一侧侧翼上；c)培养所述永生化的OEG细胞；d)选择保持其功能特性的那些永生化的OEG克隆细胞系；和e)通过从永生化的OEG细胞中去除所述DNA片段来逆转OEG细胞的永生化作用，所述去除是通过将编码Cre重组酶的基因导入所述永生化的OEG细胞，以进行DNA片段在loxP位点上的切除而实现的，所述切除导致产生用于移植入患者体内的功能性OEG细胞集群。
16.权利要求15的方法，其中所述OEG细胞获得自人供体。
17.权利要求15的方法，其中所述癌基因是编码SV40大T抗原的基因，编码端粒末端转移酶催化亚基的基因、编码Bmi-1蛋白的基因或所述癌基因的任何组合。
18.一种由权利要求10的方法生产的功能性OEG细胞集群。
19.一种对患者治疗神经损害的方法，包括将足量的权利要求18的OEG细胞移植入患者体内以促进患者神经元损伤区域的神经元再生。
20.一种永生化的OEG细胞，其包含用DNA构建体转化的初级OEG细胞，所述DNA构建体包含在癌基因或癌基因的组合侧翼的两个重组酶靶位点，所述癌基因或癌基因的组合赋予OEG细胞永生化作用，其中当靶位点暴露于特异性识别所述靶位点的重组酶时，所述永生化作用可以由通过在重组酶靶位点上的剪切来切除癌基因而成为可逆的。
21.权利要求20的永生化OEG细胞，其中所述重组酶靶位点是loxP位点并且所述永生化作用可以通过在loxP位点上的Cre重组酶剪切而成为可逆的。
22.权利要求20的永生化OEG细胞，其中所述DNA构建体还包含可选择的标记基因。
23.权利要求20的永生化OEG细胞，其中所述DNA构建体还包含自杀基因，其编码能够通过一种外源试剂破坏所述永生化细胞的基因产物，如果所述癌基因未从细胞中去除的话。
24.权利要求23的永生化OEG细胞，其中所述自杀基因是编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的基因，并且所述外源试剂是9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤。
25.权利要求20的永生化OEG细胞，其中所述OEG细胞获自人供体。
26.一种包含权利要求25的永生化OEG细胞集群的细胞系。
27.一种在移植到患者中后有功能的逆转-永生化OEG细胞，其是通过将权利要求20的永生化OEG细胞中的DNA构建体暴露于重组酶而产生的，所述重组酶在重组酶靶位点通过剪切而切除所述癌基因或癌基因的组合。
28.一种对患者治疗神经损害的方法，包括将足量的权利要求27的逆转-永生化OEG细胞移植入患者体内以促进患者神经元损伤区域的神经元再生。
29.一种细胞文库，其包含按照权利要求6-12或15-17任一项的方法制备的可逆性永生化或逆转-永生化的OEG细胞的集合。
30.可逆性永生化或逆转-永生化的嗅鞘神经胶质细胞在制备治疗神经元损害的药物中的用途。
全文摘要
本发明是基于嗅鞘神经胶质(OEG)细胞促进成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)中轴突再生的能力。这种特定的能力可以归因于几种因素的组合，诸如细胞膜的分子组成和/或分泌某些分子的能力；以及减小神经胶质创伤和在受损的CNS中伴随着新生长轴突的能力。我们从初级的人OEGs发展出永生化的细胞系。由来自供体的死后人组织培养所述细胞并利用可逆的系统进行永生化。通过其以与初级OEGs相似的方式促进由成年大鼠视网膜节神经元的轴突再生能力而选择这些OEG人克隆细胞系中的一些。这些细胞系，单独或在包含这些细胞的药物组合物中，可以用来修复CNS中的神经元损害。
文档编号A61P25/00GK1823161SQ200480020663
公开日2006年8月23日 申请日期2004年7月19日 优先权日2003年7月18日
发明者M·T·莫雷诺·弗洛雷斯, M·T·马丁·贝尔梅霍, J·阿维拉·德·格拉多, F·万多谢尔·胡拉多, J·迪亚斯·尼多, F·利姆, E·帕斯特拉纳·伊斯基耶多 申请人:科学研究高等机关