专利名称：兔创伤性肢体深静脉血栓形成动物模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及医疗模型技术领域，是建立具有骨科临床特点创伤性肢体深静脉血栓动物模型的方法，可为研究创伤性肢体深静脉血栓、肺血栓栓塞症的发生、发展、转归，探索更有效的预防、诊疗方法提供一动物模型平台。
背景技术：
血栓病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，见于多个临床科室患者，其发病率、致残率和死亡率都很高，危害性极大。在西方国家，静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)的发病率高达0.1％，其中半数为深静脉血栓(deep venous thrombosis，DVT)。美国每年因DVT及肺血栓栓塞症(pulmonarythromboembolism，PTE)住院人数约650000例，死亡人数约50000～200000例，死亡率占第3位，仅次于肿瘤和心肌梗死。欧洲大宗尸检资料证实，DVT的发生率比动脉血栓高4倍，40％～60％的尸体标本中可发现DVT，其中仅11％～15％的病例在生前确诊。台湾地区的DVT发生率和PTE的死亡率约为欧美的2/3，我国大陆尚无对DVT和PTE发病情况的统计，推测应与台湾地区发病情况相似。
随着人口老龄化，工业、交通的发展，高能量创伤患者增多，骨科创伤病人数呈上升趋势。近年来，DVT已成为骨科常见并发症，发病例数明显增加。DVT往往又是PTE的源头，其诱发PTE的危险度为50％，常引起致命性临床事件发生。Lowxy等研究表明，在股骨骨折、全膝置换和髋关节手术后DVT的发生率分别为50％、76.5％和37％～74％。国外大宗尸检发现胫骨骨折45％～60％，骨盆骨折50％～70％，脊柱脊髓损伤50％～100％的病人发生DVT；创伤病人15％、骨盆骨折25％、脊柱骨折14％病人并发PTE。引起PTE的栓子主要源于下肢DVT，故DVT与PTE密切相关。
动物模型的建立是探索疾病原因、病理生理变化、开展新疗法、预测临床转归不可缺少的方法之一。在医学研究中，理想的动物模型应具备以下特点(1)、应再现所要研究的人类疾病，应该与人类疾病相类似；(3)、动物背景资料完整，实验动物合格，生命周期要满足实验需要；(4)、动物廉价，来源充足，便于运送。
目前在静脉血栓动物模型建立方面国内外有如下方法(1)机械损伤法；(2)结扎法；(3)铜针通电静脉血栓形成法；(4)激光照射法；(5)家兔耳缘静脉血栓法；(6)气球导管漂流阻塞静脉法；(7)电解质损伤血管内皮法；(8)血管内放置异物法；(9)其他静脉血栓形成的方法。
以上造模方法虽各有特点，但更主要是用于研究凝血、纤溶系统的变化及相关药物筛选和疗效评价，与骨科临床DVT自然病程实际不尽相符(1)、骨科临床DVT绝大部分为亚急性或慢性，上述方法所形成的血栓均为急性；(2)、骨科临床DVT几乎都未直接损伤深静脉，上述方法均直接损伤血管。(3)、骨科临床DVT大多发生于创伤或手术后肢体制动、长期卧床者，上述方法并不符合此条件；(4)、骨科临床DVT患者多无使用促凝血药史，部分患者在使用抗凝血药时仍发生DVT。
为深入研究具有骨科特点深静脉血栓及由此并发的肺血栓栓塞症的发生、发展、转归，探索更有效的预防、诊断、治疗方法，就有必要建立新的、更适应其特点的动物模型。
发明内容
本发明提出的兔创伤性肢体深静脉血栓制作方法，是通过应用自制可定量击打装置，模拟与骨科临床相似的创伤过程，造成兔左后肢近端不同程度损伤，导致肢体深静脉血栓形成及肺血栓栓塞症发生，并进行相应指标的检测。
本发明有如下优点(1)、制作过程简单易行，动物死亡率低。
(2)、肢体深静脉血栓、肺血栓栓塞症发生率高。
(3)、能较好模拟临床骨科创伤后，深静脉血栓发生、发展及转归等临床及病理过程，可为研究深静脉血栓、肺血栓栓塞症提供一动物模型，具有推广应用价值。
具体步骤1、动物与分组健康成年新西兰大白兔，体重3.0±0.2kg，雌雄不限。按创伤程度不同及有无石膏固定分为左后肢骨折固定组，左后肢创伤无骨折固定组，左后肢无创伤固定组，无创伤无固定的空白对照组等四组。在造模后第5、7、9天观察血栓形成情况。
2、自制击打装置以骨科髓内钉打拨器为基础，标上刻度，可运用不同质量的重锤击打。创伤能量按Ep＝mgh计算。击打接触圆面直径为1cm。
3、造模方法兔耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠1ml/kg麻醉，右侧俯卧位，左大腿根部置打击平台上，触清兔左股骨大转子，将击打头平面紧贴股骨大转子至大转子下1.5cm范围内，使用上述击打装置，以不同质量重锤击打大腿近端外侧。石膏外固定方法以宽10cm的无水石膏绷带卷，浸入自来水中至气泡消失后，固定兔左后肢于屈髋屈膝位，石膏绷带层数为7层，石膏位于兔躯体后1/2～1/3，上石膏绷带时检查右髋活动自如后(以防右后肢活动受限，造成进食困难)，俯卧位待石膏定型。
造模后四组动物自由饮水，颗粒饲料饲养，不用抗凝剂及抗生素。
A组击打瞬间能量为12焦耳(Ep＝4kg×10×0.3m)，击打一次，经摄片证实股骨骨折后，石膏固定。
B组击打瞬间能量为7.5焦耳(Ep＝2.5kg×10×0.3m)，击打一次，不造成骨折，石膏固定。
C组未行击打，仅行石膏固定。
D组双后肢无创伤不固定。
4、观察指标于造模后5、7、9d，每时相点用10只兔，作如下检测(1)血细胞分析(2)D-二聚体(D-Dimer，DD)及凝血指标检测(PT-SEC、PT-INF、Fib、TT、APTT)检测
(3)影像学检测1)磁共振血栓直接成像(MRDTI)和磁共振血管成像(MRA)。
2)数字减影血管造影(DSA)检测。
完成上述检查后在麻醉下解剖兔，作大体观察并取股动、静脉及全肺标本后，处死兔。
(4)肉眼观察暴露左侧股动静脉，观察有无血栓。
完整暴露全肺，观察肺叶情况，有无肺出血、肺水肿等。
(5)光镜观察切取后的股动、静脉，标记近远端，用10％中性甲醛溶液固定，于血栓发生明显处取材行石蜡切片包埋，HE染色；血栓发生不确定时，取近端、中间及远端共三点作切片，以其中一点纳入统计。
取出的全肺，用10％中性甲醛液固定，石蜡切片包埋，HE染色，光镜观察是否有肺动脉栓塞。
(6)透射电镜观察(7)免疫组织化学检测(8)血液流动状态观测5、数据处理使用SPSS10.0版统计软件，对所得结果进行统计学处理。
具体实施例方式
一、造模过程及观察指标1、动物与分组健康成年新西兰大白兔，体重3.0±0.2kg，雌雄不限。单笼饲养，适应性喂养两周，饲养期间给兔颗粒饲料，自由饮水，兔舍室温20℃，相对湿度60％RH，通风良好。120只新西兰大白兔，随机分为A、B、C、D四大组A组为左后肢骨折固定组，B组为左后肢创伤无骨折固定组，C组为左后肢无创伤固定组，D组为无创伤无固定的空白对照组。每大组30只，按造模后观察时间位点不同再随机分为3小组，每组10只，第1小组为造模后5天观察组，第2小组为造模后7天观察组，第3小组为造模后9天观察组。
2、自制击打装置以骨科髓内钉打拨器为基础，标上刻度，可运用不同质量的重锤击打。创伤能量按Ep＝mgh计算。击打接触圆面直径为1cm。
3、指标检测所用实验设备和试剂(1)全自动血凝仪法国STAGO公司的STA-R型。按其操作规程进行操作。试剂由广州倍肯公司提供。
(2)大型双C形臂X光数字减影机德国SIEMENS公司的BICORPLUS/TOP型，按其操作规程进行操作。
(3)核磁共振设备美国GE公司的1.5T磁共振设备，2003年SiguaImfinity Excite II MR/I V.11.0版软件。
(4)全自动血球计数仪，型号BECKMAN COULTER。
(5)透射电子显微镜，型号JEM-100CX。
(6)免疫组织化学检测设备和试剂。
设备1)CM2000C型北航医学病理图像分析仪；2)市售红双喜18cm压力锅；3)塑料切片架；4)家庭用National微波炉(23L、900W)；5)PHS-25数字酸度计；6)经多聚赖氨酸液浸泡处理后的载玻片；7)PAP Pen免疫组化划圈笔；8)免疫组化染色孵育盒；9)便携式电子定时器；10)恒温箱100L、冰箱(-18C～4℃)。
试剂1)基质金属蛋白酶2(MMP-2)、CD34和FVIII-RAg抗体，S-P即用型试剂盒(购自福州迈新生物技术开发公司)；2)抗原修复缓冲液∶柠檬酸盐缓冲液(0.01mmol，pH＝6.0)、EDTA缓冲液(1mmol，pH＝8.0)按1∶50的比例稀释；3)二甲苯、10％福尔马林液、3％双氧水甲醇液、PBS液(pH＝7.2～7.4)、DAB显色液等。
(7)显影剂MRA用磁显葡胺注射液。DSA用37.1％的Injection Dimeglumine Gadopentetate(钆喷酸葡胺注射液Gd-DTPA，先灵药业有限公司生产)。
(8)无水石膏绷带。
(9)彩色超声检查设备Logic 9型高频彩色超声机。
4、造模方法兔耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠1ml/kg麻醉，右侧俯卧位，左大腿根部置打击平台上，触清兔左股骨大转子，将击打头平面紧贴股骨大转子至大转子下1.5cm范围内，使用上述击打装置，以不同质量重锤击打大腿近端外侧。石膏外固定方法以宽10cm的无水石膏绷带卷，浸入自来水中至气泡消失后，固定兔左后肢于屈髋屈膝位，石膏绷带层数为7层，石膏位于兔躯体后1/2～1/3，上石膏绷带时检查右髋活动自如后(以防右后肢活动受限，造成进食困难)，俯卧位待石膏定型。
造模后四组动物自由饮水，颗粒饲料饲养，不用抗凝剂及抗生素。
A组击打瞬间能量为12焦耳(Ep＝4kg×10×0.3m)，击打一次，经摄片证实股骨骨折后，石膏固定。
B组击打瞬间能量为7.5焦耳(Ep＝2.5kg×10×0.3m)，击打一次，不造成骨折，石膏固定。
C组未行击打，仅行石膏固定。
D组双后肢无创伤不固定。
5、观察指标于造模后5、7、9d，每时相点用10只兔，作如下检测(1)血细胞分析从兔耳缘静脉抽血0.5ml，注入含0.1ml抗凝剂的全自动血球计数仪专用试管内，立即充分摇匀，1h内用全自动血球计数仪作红细胞、白细胞、血小板计数，血红蛋白定量检测，白细胞分类。由同一专业人员按规程操作。
(2)D-二聚体(D-Dimer，DD)及凝血指标检测(PT-SEC、PT-INF、Fib、TT、APTT)检测从兔耳缘静脉抽血2ml，注入全自动血凝仪专用试管内，立即充分摇匀，1h内用STA-R型全自动血凝仪检测。由同一专业人员按规程操作。
(3)影像学检测造模后从A2、B2、C2组中以简单随机方法各抽取2只兔，按上述方法麻醉后，用电动石膏锯拆除固定石膏。按下述顺序进行检查。
1)磁共振血栓直接成像(MRDTI)和磁共振血管成像(MRA)MRDTI按文献报告的方法，由专业人员按核磁共振设备操作规程进行。完成MRDTI检测后，从兔耳缘静脉注入造影剂磁显葡胺10ml作MRA检查，速率0.3ml/s，扫描延迟时间50～60s，FSPGR(快速梯度回波)序列，冠状位无间隔扫描，TR10.2ms，TE1.9ms，连续3～4回合，经工作站对原始图像进行重建。
2)数字减影血管造影(DSA)检测从兔的下腔静脉注入37.1％的Gd-DTPA，在大型双C臂X光数字减影机上检测，由专业人员按规程操作。
完成上述检查后在麻醉下解剖兔，作大体观察并取股动、静脉及全肺标本后，处死兔。
(4)肉眼观察暴露左侧股动静脉，观察有无血栓。血栓的分级标准为0级为无血栓；1级为血管外观颜色变暗，静脉近端通血试验通血减慢，可疑血栓；2级为血管外观增粗，颜色变深，静脉近端通血试验通血减慢，有血栓；3级为血管外观明显增粗，属支也增粗颜色变深，静脉近端通血试验通血极慢或无通血，有明显的血栓。由两位不详本实验内容的专业人员分别评定并记录血栓发生情况。
完整暴露全肺，观察肺叶情况。观察有无肺出血、肺水肿。分级0级双肺无肺出血、肺水肿；1级双肺有少许散在出血点；2级双肺下极点片状出血或双肺点状出血；3级双肺大片状出血、水肿，大于两叶者。
(5)光镜观察切取后的股动、静脉，标记近远端，用10％中性甲醛溶液固定，于血栓发生明显处取材行石蜡切片包埋，HF染色；血栓发生不确定时，取近端、中间及远端共三点作切片，以其中一点纳入统计。光镜镜检观察静脉和动脉是否有血栓及血管壁的变化。根据血栓对血管的阻塞程度分为4个等级0级 无血栓；1级 血管阻塞＜50％；2级 血管阻塞＞50％，但未完全阻塞；3级 血管完全阻塞。
取出的全肺，用10％中性甲醛液固定，石蜡切片包埋，HE染色，光镜观察是否有肺动脉栓塞。
(6)透射电镜观察造模后第7天从A2、B2组各随机抽取肉眼观察发生血栓的2只兔，从C2组随机抽取肉眼观察无血栓发生的2只兔，在击打平面取左股动静脉，长度2cm，戊二醛前固定，锇酸后固定，常规包埋，制成超薄切片，醋酸钠和柠檬酸铝双染色，透射电子显微镜观察。
(7)免疫组织化学检测检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、CD34、FVIII-PAg。将10％中性甲醛溶液固定完全的静脉组织标本制成常规石蜡切片(厚4～5μm)。1)行常规脱蜡水洗后，用3％双氧水甲醇液处理10分钟，2)用蒸馏水冲洗切片3次，3)切片置于装有已沸腾的柠檬酸盐缓冲液(0.01mmol，pH＝6.0)和EDTA缓冲液(1mmol，Ph＝8.0)的高压锅中，加热至喷汽，开始计时，1-2分钟后，离开热源，自然冷却至室温，4)蒸馏水冲洗2次，PBS液冲洗2次，每次约3分钟。检测均采用免疫组织化学SP法。用多克隆抗体及SP试剂盒(购自福州迈新公司)对组织抗原进行相应的修复后，按S-P试剂盒说明书操作步骤进行。
在显微镜下观察，免疫组化阳性染色为细胞质内棕黄色颗粒，有阳性结果后再用CM2000C型北航医学病理图像分析仪进行定量检测。
(8)血液流动状态观测造模前从实验动物中随机抽取12只兔，麻醉后用高频彩色多普勒血流显像观测兔仰卧、左后肢伸直位和屈髋(120°)屈膝位(110°)时，腹股沟部股静脉血流速度(V)、血管内径(D)的变化并计算血流量，血流量cm3/s＝π×(D/2)2×V。
6、数据处理使用SPSS10.0版统计软件，对所得结果进行统计学处理。各组计量资料数据用均数±标准差(X±S)表示，多组数据间比较、组间两两比较用随机区组(无重复数)设计的双因素方差分析或R×C表卡方检验或四格表资料的Fisher确切概率法，对资料相关性的分析用Superman法，以P＜0.05为差别有统计学意义，P＜0.01为差别有显著的统计学意义。
二、结果1、实验动物情况A组30只兔中死亡5只，其中，第5天观察组1d、5d各死亡一只，第7天观察组1d、5d各死亡一只，第9天观察组6d死亡一只。经解剖2只死于失血性休克，2只死于肺血栓栓塞症，1只原因不明。B、C、D组兔无死亡。
2、血细胞分析(1)红细胞计数各组红细胞计数结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B、C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与C、D组比较，C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点RBC计数(X±S)(单位×1012/L)
(2)白细胞计数各组白细胞计数结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B、C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与C、D组比较，C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点WBC计数(X±S)(单位×109/L)
(3)血小板计数各组血小板计数结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B、C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与C、D组比较，C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点PLT计数(X±S)(单位×109/L)
(4)血红蛋白测定各组血红蛋白检测结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B、C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与C、D组比较，C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点HGB计量(X±S)(单位g/L)
(5)MID检测各组MID结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点MID比例(X±S)(单位×100％)
3、D-二聚体(D-Dimer，DD)检测D-二聚体检测结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点DD计量(X±S)(单位μg/ml)
4、凝血指标检测(1)PT-SEC检测PT-SEC检测结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点PT-SEC比较(X±S)(单位s)
(2)INR检测INR检测结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点INR比较(X±S)
(3)Fib检测Fib检测结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点Fib比较(X±S)(单位g/L)
(4)TT检测TT检测结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点TT比较(X±S)(单位s)
(5)APTT检测APTT检测结果见下表。经双因素方差分析，A、B、C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；进一步作q检验A组与B、C、D组比较，差别均有统计学意义(P＜0.05)；B组与C、D组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
A、B、C、D四组各时相点APTT比较(X±S)(单位s)
5、磁共振血栓直接成像(MRDTI)、磁共振血管成像(MRA)与数字减影血管造影(DSA)检查股静脉血栓MRDTI、MRA与DSA检测结果见下表。
造模第7天MRDTI、MRA、DSA血栓检测结果
6、肉眼观察(1)、肉眼观察左股静脉血栓发生A组不同时相点均见兔腹股沟区有不同程度的出血及血肿，血肿较大且弥散，可见部分股静脉血栓，以2、3级为多，股动脉搏动可见，大部分股静脉、股动脉受损较重。
B组第5天见部分兔腹股沟区血肿较小且弥散，大部分兔腹股沟区无血肿，部分股静脉可见血栓；第7天见大部分股静脉可见血栓，以2、3级为多，1级较少；第9天部分股静脉仍可见静脉血栓存在，以1级和2级为主，3级少。从第5天到第9天均可见股动脉搏动。
C组均未见腹股沟区血肿，少见静脉血栓，为1、2级，未见3级，股动脉搏动正常。
肉眼观察各组左股静脉血栓发生见下表。经x2检验，A、B、C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；进一步作x2分割，A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)。C组与D组经Fisher确切概率法比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
肉眼观察各组左股静脉血栓发生结果
(2)肉眼观察肺血栓栓塞症发生A、B组部分出现肺充血、肺水肿，表面有点片状出血灶，病变呈双侧性分布，主要为1级和2级，少数为3级。C组少见肺出血、肺水肿，主要为1级。D组肺表面光滑均一，呈淡粉红色，未见充血、水肿、坏死及出血等情况。A、B、C各组以(1级+2级+3级)/n×100％计算发生率，显示A、B组肉眼观察肺出血、肺水肿发生率较C组高。
肉眼观察各组肺血栓栓塞症发生结果见下表。经四格表x2检验或者Fisher确切概率法比较A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；A组与D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与C组比较，差别有统计学意义(P＜0.05)；B组与D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.05)；C组与D组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
肉眼观察各组肺血栓栓塞症发生结果
7、光镜观察
(1)光镜观察左股动静脉血栓发生A组左股静脉第5天少见股静脉内血栓，多为不完全血栓，可见静脉内膜损伤严重，血管内皮细胞剥脱，内皮下层裸露，少数有动脉内膜损伤和不全血栓；第7天可见大部分股静脉发生血栓，以2、3级为主，静脉内膜损伤严重，血栓与血管壁粘连，血管壁及组织间隙炎性浸润明显，少数有动脉内膜损伤和不全血栓；第9天可见大部分股静脉有血栓，多为不完全血栓；部分血栓纤维化，可见部分新生内皮细胞形成迷路状相互沟通的管道，血管部分再通，动脉内仍可见不全血栓。各组以(1级+2级+3级)/n×100％计算血栓发生率。
B组第5天部分股静脉内血栓发生，多为不完全血栓，仅见1例完全性血栓，静脉内膜损伤，内皮细胞剥脱，内皮下层裸露，部分内皮细胞变性，细胞浆内大量空泡形成，细胞水肿呈球形，细胞间隙增大，偶见动脉内膜损伤，部分动脉内有血栓栓塞但程度轻，均为1级；第7天大部分股静脉发生血栓，多为2、3级，静脉内膜损伤，部分内皮细胞变性，细胞浆内大量空泡形成，细胞水肿呈球形，细胞间隙增大，血管壁炎性细胞浸润，偶见动脉内膜损伤，少部分动脉内有程度较轻的不完全性血栓；第9天可见部分股静脉血栓发生，多为不完全血栓；静脉内膜损伤，有静脉内皮细胞覆盖至血栓周边表面，血管壁炎性细胞浸润仍存在，部分血栓纤维化，可见部分新生内皮细胞形成迷路状可相互沟通的管道，血管部分再通。
C组第5天可见少部分股静脉1级血栓，动脉内未见血栓，未见动、静脉内膜损伤；第7天可见部分股静脉1、2级血栓，少见静脉内膜损伤；第9天可见少部分股静脉1、2级血栓，少见静脉内膜损伤，动脉内未见血栓。
光镜观察各组左股静脉血栓发生结果见下表。经x2检验，A、B、C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；进一步作x2分割，A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；A组与D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与C组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)。C组与D组经Fisher确切概率法比较，差别有统计学意义(P＜0.05)。
光镜观察各组左股静脉血栓发生结果
(2)光镜观察肺血栓栓塞症发生D组肺组织病理切片在光镜下可见肺泡壁完整、肺泡膨胀良好、肺泡和间质未见炎性细胞浸润及出血，肺血管结构完整未见异常变化；有栓塞的肺组织镜下可见肺泡周围有大量炎性细胞浸润、肺泡和间质内有局灶出血、肺动脉血管内可见血栓存在；A、B组大部分血栓堵塞于肺小动脉远端，呈散在分布，未波及大血管(图31、32)；C组少见肺动脉血栓；D组未见肺动脉血栓存在。
光镜观察各组肺血栓栓塞症发生结果见下表。经x2检验，A、B、C、D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；进一步作x2分割A组与B组比较，差别无统计学意义(P＞0.05)；A组与C组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；A组与D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与C组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)；B组与D组比较，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)。C组与D组经Fisher确切概率法比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。
光镜观察各组肺血栓栓塞症发生结果
8、光镜观察股静脉血栓发生率与肺血栓栓塞症发生率的相关性分析各组光镜观察股静脉血栓发生率与肺血栓栓塞症发生率结果见下两表。Superman相关系数为0.901，差别有显著的统计学意义(P＜0.01)。
A、B、C、D四组各时相点股静脉血栓发生率(％)
A、B、C、D四组各时相点肺血栓栓塞症发生率(％)
9、透射电镜观察左股动静脉内膜和内皮细胞A组第7天动静脉内皮细胞均有损伤，以静脉内皮细胞损伤明显。可见静脉内皮下基底膜裸露，内皮下基质大片暴露，附壁血栓发生，血栓与静脉内膜接触部位的内皮细胞几乎完全脱落，内皮细胞核溶解，细胞膜破裂，有多核粒细胞粘附。动脉内膜脱落，弹力层断裂，单核粒细胞侵入中膜。血栓边缘有残存内皮细胞，大小不一。
B组第7天；可见静脉内皮细胞损伤明显，而动脉内皮细胞损伤不明显。可见血栓与静脉内膜接触部位的静脉内皮细胞部分脱落，裸露出中膜平滑肌，静脉血管内皮细胞线粒体肿胀，嵴溶解，邻近部位内皮细胞增生，静脉内膜面单核粒细胞粘附。静脉内膜有增生的内皮细胞存在。动脉弹力层和中膜结构仍保持完整，未见中性粒细胞侵入中膜，内皮细胞基本完整，细胞间存在明显间隙。
C组第7天静脉内皮细胞和动脉内皮细胞均无损伤。部分静脉内皮细胞水肿失去正常形态，但无明显内皮下基质暴露，动脉内皮细胞均正常。
10、免疫组织化学检测MMP-2、CD34、FVIII-RAg检测结果均为阴性。
11、血液流动状态观测造模前从120只兔中随机抽取12只，用高频彩色多普勒血流显像仪观测左后肢伸直位和屈髋屈膝位时股静脉的血流速度和血管内径，结果显示屈髋屈膝位较伸直位时血流速度减慢，血管内径变小，两样本配对t检验t＝8.106p＜0.01，差别有显著的统计学意义，结果见下表。
两种体位股静脉血流量结果(n＝12)
权利要求
1.一种建立兔创伤性肢体深静脉血栓动物模型的方法。其特征在于应用骨科髓内钉打拨器改装自制的可定量击打装置，模拟与骨科临床相似的创伤过程，造成兔单侧下肢近端不同程度的损伤，创建一种具有骨科临床特点的肢体深静脉血栓动物模型制作方法，并进行相应指标检测，观察深静脉血栓、肺血栓栓塞症发生情况，局部及全身相应变化，具体步骤如下(1)、自制击打装置以骨科髓内钉打拨器为基础，标上刻度，可测出不同质量击打锤自30cm高度自由落下的不同击打能量。击打头平面直径为1cm，瞬间打击能量按Ep＝mgh计算。(2)、造模方法健康成年新西兰大白兔，体重3.0±0.2kg，雌雄不限。适应性喂养两周，耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠1ml/kg麻醉，右侧俯卧位，左大腿根部置打击平台上，触清兔左股骨大转子，将击打头平面紧贴股骨大转子至大转子下1.5cm范围内，使用上述击打装置，以不同质量重锤击打大腿近端外侧后，7层石膏绷带屈髋屈膝位固定，瞬间打击能量按Ep＝mgh计算，并据创伤能量不同及有无石膏固定分为左后肢骨折固定组(12焦耳)，左后肢创伤无骨折固定组(7.5焦耳)，左后肢无创伤固定组，无创伤无固定的空白对照组等四组。(3)、观察指标于造模后5、7、9d，每时相点用10只兔，作如下检测1)、血细胞分析2)、D-二聚体(D-Dimer，DD)及凝血指标检测(PT-SEC、PT-INF、Fib、TT、APTT)检测3)、影像学检测①、磁共振血栓直接成像(MRDTI)和磁共振血管成像(MRA)。②、数字减影血管造影(DSA)检测。完成上述检查后在麻醉下解剖兔，作大体观察并取股动、静脉及全肺标本后，处死兔。4)、肉眼观察暴露左侧股动静脉，观察有无血栓。完整暴露全肺，观察肺叶情况。观察有无肺出血、肺水肿。5)、光镜观察切取后的股动、静脉，标记近远端，用10％中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，观察血栓发生情况。取出的全肺，用10％中性甲醛液固定，石蜡切片包埋，HE染色，光镜观察是否有肺动脉栓塞。6)、透射电镜观察7)、免疫组织化学检测8)、血液流动状态观测(4)、数据处理使用SPSS10.0版统计软件，对所得结果进行统计学处理。
全文摘要
本发明是一种兔创伤性肢体深静脉血栓模型的建立方法。其特征在于应用骨科髓内钉打拨器改装自制的可定量击打装置，模拟与骨科临床相似的创伤过程，造成兔单侧下肢近端不同程度的损伤，创建出一种具有骨科临床特点的肢体深静脉血栓动物模型，深静脉血栓、肺血栓栓塞症发生率高，并可进行不同指标的检测。该发明制作过程简单易行，动物死亡率低；能较好模拟临床骨科创伤后，深静脉血栓发生、发展及转归过程，具有推广应用价值。
文档编号A61K49/00GK1751742SQ20051001079
公开日2006年3月29日 申请日期2005年5月10日 优先权日2005年5月10日
发明者赵学凌, 李文, 黄河, 王兵, 赵宏斌, 何飞, 王建伟, 吴雪梅, 张春强, 贾代良, 赵 智, 唐锡章, 周兆文, 李世和 申请人:昆明医学院第一附属医院