专利名称：烟草表达口蹄疫植物基因工程疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及动物传染病控制领域，具体地说是应用烟草作生物反应器创制的口蹄疫基因工程疫苗及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫是危害偶蹄兽及人类的重大传染病，国际兽医局及我国农业部列为A类烈性传染病，我国《动物防疫法》规定为第一类危害严重的传染病，疫苗免疫是防治口蹄疫的根本技术措施。目前，口蹄疫预防疫苗各地一般在使用灭活全病毒疫苗，但因口蹄疫不同血清型病毒株变异性甚大(口蹄疫病毒株有7种血清型，70～80种次亚型之多)，一种某地毒株灭活苗难以覆盖预防不同疫区偶蹄动物不同亚型毒株感染。还没有具有实际免疫保护作用的基因工程基因工程苗上市投入使用。在研究开发的口蹄疫基因工程疫苗现主要有合成肽苗及大肠杆菌质粒苗。
植物基因工程疫苗方面，口蹄疫在国内外以烟草表达研究较多，且技术较为成熟，并出现几篇学术论文，但还没有具实用价值的烟草苗出现。目前世界科学家公认能预防口蹄疫强毒株攻击的理想疫苗应形成口蹄疫病毒免疫性立体空间结构，基因工程苗的创制关键在于需要正确设计口蹄疫病毒表面主要抗原决定族的排列组合，使之符合病毒空间免疫结构的原貌，否则，亚单位基因工程苗即使能产生免疫检测反应性，也难产生强毒攻击的保护性，而口蹄疫烟草植物基因工程苗的研发，至今没有实际应用价值的疫苗出现。
发明内容
本发明的目的是提供一种对偶蹄动物猪、牛、羊对各型口蹄疫强毒感染有保护作用的实用基因工程疫苗。
本发明的另一目的是提供上述口蹄疫血清型毒株烟草基因工程疫苗的制备方法。
使用新型烟草花叶病毒载体TMV-30B，烟草作为生物反应器表达外源蛋白免疫活性肽，是分子免疫学、微生物学、人和动物传染病研究方面新的有力工具，本发明使用的新型烟草花叶病毒载体TMV-30B，已发表于1999年国际学术杂志《病毒学》Virology上(Virology，1999，255，312-323，)，由美国佛罗里达大学发明人Dennis J.Lewandowski限制性赠予，该载体比起国内同类TMV旧的载体，插入外源片段可增加长度17倍。在人和动物传染病、免疫学领域，使用该系统可以研制基因工程疫苗等生物医药产品。
本发明人几年来从事O血清型口蹄疫毒株免疫功能抗原蛋白决定簇基因结构研究及筛选，进行了大量的深入研究，实现了O血清型口蹄疫免疫功能抗原决定簇组合在烟草的高效表达，经烟草表达产物免疫的小白鼠，用口蹄疫强毒攻击的不发病保护率可达93～100％，有希望发展出物美价廉的烟草植物基因工程疫苗。
本发明是利用烟草TMV-30B外源蛋白高效表达载体，把O，A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3等亚洲及世界流行的共七个血清型口蹄疫毒株免疫抗原蛋白保持其免疫所需空间结构、克隆表达在烟叶上。
本发明的口蹄疫烟草植物基因工程疫苗的制备方法为(以O血清型口蹄疫疫苗为例，其他六种血清型口蹄疫疫苗工序完全相同)1.取O血清型口蹄疫病毒毒株的总基因组RNA；2.从已发表的O血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA测序信息，设计、合成以下两个DNA核酸探针，使位于并覆盖口蹄疫病毒粒子结构蛋白VP1基因的起始，终止位点引物1GVP-5TCATTAATTAATGACCACCTCTGCGGGTGAGTCTGC引物2GVP-3；GAGGTTTAAACTGACGAAGCTGTTTTGCGGGTGCCA用RT-PCR试剂盒，以抽得的口蹄疫基因组总RNA为底物，用以上探针为引物，进行RT-PCR链式DNA基因片断扩增反应，获得口蹄疫病毒外壳结构蛋白VP1完整基因；3.再以VP1基因为膜板，PCR法制备抗原决定簇氨基酸140-160及200-213片段，在此基础上，进一步制备抗原决定簇三聚合体氨基酸200-213，140-160，200-213作为插入表达免疫原片段；
4.将烟草花叶病毒TMV-30B载体用内切酶PmeI、PacI切开后，与以上步骤3得到的口蹄疫免疫原基因进行重组连接，得到烟草表达口蹄疫疫苗株pTMV30B-oF3；5.参照国外已发表的口蹄疫O型FMDV国际株O1K的全基因组DNA顺序，设计并合成以下224核苷酸免疫活性肽基因，克隆进质粒pUCM中ATTAATTAATGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGCCACCCGGGCGTCACAAACAGAAAATCGT-AGCTCCAGTAAAACAGACTCTGCAATTCGAGCTCGAATTCATGGTACCCTCGAGGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGCCATGAGTTTAAACT (224核苷酸)与步骤4相同，与TMV-30B载体连接重组得到烟草表达口蹄疫疫苗株pTMV30B-oF4；6.使用Riboprobe Transcription Systems(RNA转录试剂盒)试剂盒，进行以上两株RNA转录，制备烟叶感染用RNA，溶于DEPC处理过的双蒸水中，将pTMV30B-oF3，pTMV30B-oF4两株DNA转录成6.4Kb长度的RNA，感染生长中幼龄烟叶；7.被感染烟叶生长2周后，收获整株烟叶，磨碎，用含有以下成分Tris-HCL，PMSF，SDS，Urea，DTT的缓冲液，4℃浸泡两小时，离心收取上清液，加入司苯、柏油等油性免疫佐剂，就制备成了O血清型口蹄疫亚单位烟草基因工程疫苗，用其免疫小动物，进行口蹄疫强毒攻击保护试验；8.制备烟叶大动物剂型，在猪、牛、羊大动物进行口蹄疫强毒攻击保护试验，经国家兽医生物制品检定所及农业部药证部门质量、安全性等检定、批准后成为正式生产应用疫苗。
免疫效果检测实验室检测分别在免疫原蛋白的质粒表达层次及烟草表达层次用猪、羊的口蹄疫抗体血清，分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳，Western Blotting(印迹杂交)免疫杂交及Dot-ELISA免疫学方法检验的免疫抗原条带，呈强阳性反应。
动物试验这种新型口蹄疫基因工程疫苗，在保山疫苗厂进行了多批次分组，在实验动物小白鼠进行了口蹄疫强病毒攻击保护试验，结果在100多头实验动物中显示了93～100％免疫保护作用。(具体数据见下表)攻毒保护试验结果表
注烟苗TMV30B-oF3稀表达烟叶磨碎浸泡上清液。
烟苗TMV30B-oF3浓表达烟叶磨碎浸泡上清液一倍浓缩。
烟苗参考1TMV30B-oVP1，烟叶表达全长VP1.
烟苗参考2TMV30B-oGH，烟叶表达GH-loop.
阳性对照O血清型口蹄疫全病毒苗。
野生TMV烟草对照未克隆表达的，感染野生型TMV的烟草K326植株。
空白动物对照同龄未免疫小白鼠组。
本发明使用新型烟草花叶病毒TMV-30B高效表达载体，经多年努力，在国内外植物基因工程领域首次克隆表达了口蹄疫病毒外壳抗原决定簇三聚合体的基因工程疫苗，在O血清型口蹄疫病毒强毒攻击保护效果试验中，结果数据显示对小动物有93～100％免疫保护作用。以国家的野外动物强毒攻毒保护效果超过60％即为考虑有效作参考，本发明的烟草基因工程苗，具潜在的大动物免疫保护及实用疫苗开发价值。
本发明与灭活全病毒疫苗相比，既无现在广泛使用的病毒灭活疫苗的万一灭活不彻底、导致疫情扩散的潜在危险性，而且比灭活苗的造价低得多，成本只有目前普遍使用的灭活苗的1/10至1/20，在小动物免疫效果与目前使用的灭活苗相当。
本发经明确认定对偶蹄动物猪、牛、羊有强毒感染保护作用后，可针对亚洲、欧洲及非洲曾流行世界许多地区的口蹄疫血清型O型、A型、Asia-I型、C型、SAT-1、SAT-2、SAT-3共七种亚型口蹄疫主要病毒株构建基因工程疫苗，把创产值数亿元的现行灭活全病毒苗推到另一个更适用、价廉的产品平台，且从基因水平(实验室操作)更容易补偿不同地区口蹄疫病毒基因变异带来的免疫预防效果不足。市场可覆盖中国，亚洲，欧洲，非洲及世界其他国家。
具体实施例方式
实施例1主要流行于亚洲的O血清型口蹄疫烟草基因工程疫苗，由以下制备方法获得(以O血清型口蹄疫疫苗为例，其他六种A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3血清型口蹄疫疫苗工序与O血清型口蹄疫疫苗工序完全相同)1.取得O血清型口蹄疫病毒毒株的总基因组RNA。
2.从已发表的O血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA测序信息，设计、合成以下两个DNA核酸探针，使位于并覆盖口蹄疫病毒粒子VP1结构蛋白基因的起始，终止位点引物1GVP-5TCATTAATTAATGACCACCTCTGCGGGTGAGTCTGC引物2GVP-3GAGGTTTAAACTGACGAAGCTGTTTTGCGGGTGCCA用RT-PCR试剂盒，以抽得的口蹄疫基因组总RNA为底物，用以上探针为引物，进行RT-PCR链式DNA基因片断扩增反应，获得口蹄疫病毒外壳结构蛋白VP1完整基因；3.再以VP1基因为膜板PCR法制备抗原决定簇氨基酸140-160及200-213片段，在此基础上，进一步制备抗原决定簇三聚合体氨基酸200-213，140-160，200-213作为插入表达免疫原片段。
4.将烟草花叶病毒TMV-30B载体用内切酶PmeI、PacI切开后，与以上步骤3得到的口蹄疫免疫原基因进行重组连接，得到烟草表达口蹄疫疫苗株pTMV30B-oF3；
5.参照国外已发表的口蹄疫O型FMDV国际株O1K的全基因组DNA顺序，设计并合成以下224核苷酸免疫活性肽基因，克隆进质粒pUCM中ATTAATTAATGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGCCACCCGGGCGTCACAAACAGAAAATCGT-AGCTCCAGTAAAACAGACTCTGCAATTCGAGCTCGAATTCATGGTACCCTCGAGGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGCCATGAGTTTAAACT (224核苷酸)与步骤4相同，与TMV-30B载体连接重组，得到烟草表达口蹄疫疫苗株pTMV30B-oF4；6.使用Riboprobe Transcription Systems(RNA转录试剂合)试剂盒，进行以上两株RNA转录，制备烟叶感染用RNA，溶于DEPC处理过的双蒸水中，将pTMV30B-F3，pTMV30B-F4两株DNA转录成6.4Kb长度的RNA，感染生长中幼龄烟叶。
7.被感染烟叶生长2周后，收获整株烟叶，磨碎，用含有以下成分Tris-HCL，PMSF，SDS，Urea，DTT的缓冲液，4℃浸泡两小时，离心收取上清液，加入司苯、柏油等油性免疫佐剂，就制备成了O血清型口蹄疫亚单位烟草基因工程疫苗。用其免疫小动物，进行口蹄疫强毒攻击保护试验。
实施例2烟草表达口蹄疫基因工程疫苗株小动物试验该口蹄疫植物基因工程苗，在使用实验室免疫反应检测阳性的基础上(PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，Western Blotting(印迹杂交)免疫杂交，用猪及羊口蹄疫血清抗体，进行了免疫原生物活性检测，均取得阳性结果)，在云南省保山疫苗厂进行了猪源、牛源口蹄疫强毒在实验小动物的攻击保护效果试验。试验使用上述的烟草口蹄疫植物基因工程疫苗的粗制品1.T4噬菌体口蹄疫O型血清型全病毒表达疫苗株TMV-30B-oF32.口蹄疫O型FMDV国际株O1K亚单位基因工程疫苗表达株T4-30B-oF4试验动物小白鼠考核标准用烟草口蹄设基因工程疫苗注射实验动物事，1)猪及牛源口蹄疫病毒对实验动物的攻击保护性百分比测定；2)进行动物内脏剖检，观察病变。
实验方法1.先进行牛源口蹄疫强毒的小白鼠适应性传代，传代6代后用于本试验；2.猪、牛源口蹄疫强毒对小白鼠半数致死量SM50LD测定；3.对免疫成年小白鼠口蹄疫强毒进行接种攻毒，取2～3月龄小白鼠(公鼠)，每组5只，以烟疫苗株免疫动物，每次间隔时间半月，设全病毒灭活疫苗阳性对照组及阴性空白对照组，末次免疫后10天，用O血清型口蹄疫病毒猪/牛强毒株接种每只受试动物及对照动物，给予强毒攻毒。
4、接种乳鼠进行毒血症检测，攻毒后36小时取每受试动物外周血，稀释20倍后，每头成年鼠的外周血再注射接种5只乳鼠，从死亡或存活以判定是否产生毒血症viremia，及判定烟草疫苗株是否产生了免疫保护作用.
结果1.攻毒保护试验结果见前表；2.内脏剖检，观察受试动物未见脏器明显病理改变。
权利要求
1.一种烟草表达口蹄疫植物基因工程疫苗，其特征在于利用烟草TMV-30B外源蛋白高效表达载体，把O，A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3亚洲及世界流行的共七个血清型口蹄疫毒株免疫抗原蛋白保持其免疫所需空间结构、克隆表达在烟叶上，疫苗株为pTMV30B-oF3和pTMV30B-oF4。
2.权利要求1所述的烟草表达口蹄疫植物基因工程疫苗的制备方法，其特征在于按以下步骤制备1)取得O或A或C或Asia-I或SAT-1或SAT-2或SAT-3血清型口蹄疫病毒毒株的总基因组RNA；2)从已发表的O或A或C或Asia-I或SAT-1或SAT-2或SAT-3血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA测序信息，设计、合成以下两个DNA核酸探针，使位于并覆盖口蹄疫病毒粒子结构蛋白VP1基因的起始，终止位点引物1GVP-5TCATTAATTAATGACCACCTCTGCGGGTGAGTCTGC引物2GVP-3；GAGGTTTAAACTGACGAAGCTGTTTTGCGGGTGCCA用RT-PCR试剂盒，以抽得的口蹄疫基因组总RNA为底物，用以上探针为引物，进行RT-PCR链式DNA基因片断扩增反应，获得口蹄疫病毒外壳结构蛋白VP1完整基因；3)再以VP1基因为膜板，PCR法制备抗原决定簇氨基酸140-160及200-213片段，在此基础上，进一步制备抗原决定簇三聚合体200-213氨基酸140-160氨基酸-200-213氨基酸作为插入表达免疫原片段；4)将烟草花叶病毒TMV-30B载体用内切酶PmeI、PacI切开后，与以上步骤3得到的口蹄疫免疫原基因进行重组连接，得到烟草表达口蹄疫疫苗株pTMV30B-oF3；5)参照国外已发表的口蹄疫O型FMDV国际株O1K的全基因组DNA顺序，设计并合成以下224核苷酸免疫活性肽基因，克隆进质粒pUCM中ATTAATTAATGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGCCACCCGGGCGTCACAAACAGAAAATCGT-AGCTCCAGTAAAACAGACTCTGCAATTCGAGCTCGAATTCATGGTACCCTCGAGGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGCCATGAGTTTAAACT (224核苷酸)与步骤4相同，与TMV-30B载体连接重组得到烟草表达口蹄疫疫苗株pTMV30B-oF4；6)使用Riboprobe Transcription Systems试剂盒，进行以上两株RNA转录，制备烟叶感染用RNA，溶于DEPC处理过的双蒸水中，将pTMV30B-oF3，pTMV30B-oF4两株DNA转录成6.4Kb长度的RNA，感染生长中幼龄烟叶；7)被感染烟叶生长2周后，收获整株烟叶，磨碎，用含有以下成分Tris-HCL，PMSF，SDS，Urea，DTT，的缓冲液，4℃浸泡两小时，离心收取上清液，加入油性免疫佐剂，就制备成了O或A或C或Asia-I或SAT-1或SAT-2或SAT-3血清型口蹄疫亚单位烟草基因工程疫苗。
全文摘要
本发明是一种烟草表达口蹄疫植物基因工程疫苗及其制备方法。其特征在于利用烟草TMV－30B外源蛋白高效表达载体，把O，A，C，Asia－I，SAT－1，SAT－2，SAT－3亚洲及世界流行的共七个血清型口蹄疫毒株免疫抗原蛋白保持其免疫所需空间结构、克隆表达在烟叶上，疫苗株为pTMV30B－oF3和pTMV30B－oF4。本发明基因工程疫苗对小动物有93～100％免疫保护作用。并对偶蹄动物猪、牛、羊有强毒感染保护作用。本发明与灭活全病毒疫苗相比，既无现在广泛使用的病毒灭活疫苗的万一灭活不彻底、导致疫情扩散的潜在危险性，而且比灭活苗的造价低得多，成本只有目前普遍使用的灭活苗的1/10至1/20，将现行灭活全病毒苗推到另一个更适用、价廉的产品平台，市场可覆盖中国，亚洲，欧洲，非洲及世界其他国家。
文档编号A61P31/14GK1820784SQ200510010728
公开日2006年8月23日 申请日期2005年4月6日 优先权日2005年4月6日
发明者任兆钧, 刘勇, 郭云生, 赵敏仪 申请人:云南省烟草科学研究所, 任兆钧