专利名称：10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物及其制法与组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为细胞毒类药物的一种植物生物碱，尤其是一种喜树碱类化合物，更具体的说，本发明涉及10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物，其制备方法，含有它们的药物组合物及其作为药物，特别是作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
1966年美国科学家Wall等首次从中国的喜树中分离到喜树碱后，因其独特的化学结构和显著的抗肿瘤活性，引起人们很大的兴趣。但喜树碱由于水溶性差而不能进入临床研究。在70年代，中国学者将内酯环用氢氧化钠打开，制备成水溶性的钠盐进行临床研究，结果出现严重的骨髓抑制，呕吐，腹泻和严重的出血性膀胱炎等副作用，而且开环形式活性大大降低，使临床研究终止。1985年，JohnHopkins大学的Hsiang等研究结果表明，喜树碱是DNA拓扑异构酶I的特异性抑制剂，而拓扑异构酶I是细胞的一种核酶，与DNA的复制、转录、修复以及重组有关，其在细胞周期的任何阶段都有表达，且已知肿瘤细胞中拓扑异构酶I的含量比正常细胞中的含量高，因而这类抗肿瘤化合物具有一定的选择性。并且拓扑异构酶I在增殖期细胞及静止期细胞中以相当高浓度出现，在缓慢增殖及快速增殖的肿瘤细胞中水平相似，表明其对快速增殖的肿瘤和缓慢生长的肿瘤均有抗癌活性。这一重大发现为喜树碱的重新评价打开大门。药物学家以此为靶点，对喜树碱进行了结构改造，取得了大量的成绩。例如10-羟基喜树碱，从1977年在中国上市以来，被广泛使用，对原发性肝癌、胃癌、头颈部腺源性上皮癌、白血病、直肠癌、膀胱癌等恶性肿瘤均有疗效。其结构式如下所示
近年来，研究喜树碱的文献报道很多，例如美国专利US5,646,159 US4,604,463；US6,111,107；US6,350,756等。从喜树碱出发，应用Manich反应在9位上引入胺甲基，具有较好的水溶性和抗肿瘤活性，其中10-羟基9-二甲胺基甲基喜树碱(Topotecan)于1996年上市，用作卵巢癌病人的二线治疗药物，美国FDA又于1999年批准其作为小细胞肺癌(SCLC)的二线治疗药物。在10-羟基喜树碱的7位上引入乙基得到的化合物SN-38，具有良好的抗肿瘤活性，其水溶性前体药物伊利替康(Irinotecan)于1994年上市，用于结直肠癌的治疗。另外，还有国内的喜树碱类化合物研究报道，例如中国专利200310108532公开的9-烷基10-羟基取代的喜树碱类衍生物，中国专利200410052756公开的10-烷氧基喜树碱衍生物等。尽管如此，仍需要发明疗效高，毒性低，水溶性好的喜树碱类化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种通式(I)的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物，其具有良好的水溶性，较强的肿瘤细胞毒活性。
本发明的另一目的是提供一种通式(I)的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物的制备方法。
本发明一方面涉及药物组合物，其包括作为活性成份的通式(I)的化合物及其异构体及制药领域中常用的载体。
本发明再一方面涉及的是通式(I)化合物或含有它们的药物组合物的抗肿瘤用途。
按照本发明，如通式(I)所示的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物
其特征在于其中A1、A2各自独立地表示含取代的C1-C6直链烷基残基，C3-C20支链烷基残基或H，条件是两者不能同时为H；A1、A2连接成环，包括芳香环、饱和、不饱和杂环基的残基；其中B表示和A1、A2连接的含有1到9个有机羧酸或其羧酸盐的功能基，其羧酸盐包括钠、钾、钙等碱金属盐或碱土金属盐；当A1表示H时，连接A1的B无意义，A2表示含取代的芳香环基残基，含取代的C5-C6环烷基残基，含取代的选自N，O或S的单原子4-6元杂环基残基，含取代的C3-C20支链烷基残基，A2-B选自-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COOH]a}a，-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COO-]a}a，其中a＝1、2或3。
按照本发明，优选的是其中A1、A2各自独立地表示含取代的C1-C4直链烷基残基，含取代的C3-C10支链烷基残基或H，条件是两者不能同时为H；其中B表示和A1、A2连接的含有1到9个有机羧酸或其羧酸盐的功能基，其羧酸盐包括钠、钾、钙等碱金属盐或碱土金属盐；当A1表示H时，连接A1的B无意义，A2表示含取代的苯基或苄基残基，含取代的C3-C10支链烷基残基，A2-B选自-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COOH]a}a，-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COO-]a}a，其中a＝1，2或3。
本发明的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物的母体结构可以是10-羟基喜树碱，也可以是在10-羟基喜树碱结构式上，应用本领域公知的技术而合成的7，9，11或20位上含有取代基的类似物。
根据本发明10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物可以异构体的形式存在，而且通常所述的“本发明的化合物”或“本发明的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物”包括该化合物的异构体。
本发明的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物可存在双键的顺反异构体，不对称中心具有S构型或R构型，本发明包括所有可能的立体异构体，以及两种或多种异构体的混合物。如果存在顺/反异构体，本发明涉及顺式形式和反式形式以及这些形式的混合物。如果需要单一异构体，可根据常规方法分离或通过立体选择合成制备。
根据本发明所述的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物优选自天然的10-羟基喜树碱化合物，其光学异构体，或它们的羧酸盐。最优选自天然的10-羟基喜树碱化合物，或它们的羧酸盐。
本发明的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物的制备方法包括下列步骤首先制备相应的含两个或两个以上有机羧酸基团的胺酰氯或异氰酸类化合物，这些化合物的终端含有仲胺基团或伯胺基团，将该含有胺基的化合物与相应的酰化试剂反应，在有机碱催化下得到含有胺酰氯或异氰酸功能基的化合物；再用10-羟基喜树碱或它的类似物和相应的胺酰氯或异氰酸类化合物，通过缩合反应制备10位取代基上含有机羧酸基团的喜树碱化合物的羧酸酯；最后是所述的羧酸酯水解成相应的羧酸化合物，；该羧酸化合物与碱反应制成盐。其特征在于合成反应步骤包括下列试剂，催化剂及反应条件首先制备相应的含两个或两个以上有机羧酸基团的胺酰氯或异氰酸类化合物，将含有胺基的化合物与相应的酰化试剂反应，酰化试剂为光气(COCI2)或双光气(Cl3COCO2CCl3)，催化剂为有机碱，包括三乙胺(Et3N)或吡啶，溶剂为乙醇或四氢呋喃(THF)；再用10-羟基喜树碱或它的类似物和相应的含两个或两个以上有机羧酸基团的胺酰氯或异氰酸类化合物，通过缩合反应制备相应的羧酸酯，反应温度为0-60℃，反应的溶剂为无水有机溶剂，包括二氯甲烷(CH2Cl2)、氯仿(CHCl3)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或四氢呋喃(THF)，反应的催化剂为有机碱，包括三乙胺(Et3N)或吡啶；最后是10位取代基上含有机羧酸基团的喜树碱化合物的羧酸酯水解成相应的羧酸化合物，其取代基终端是叔丁基酯的水解，试剂选用甲酸，如果取代基终端是甲酯或乙酯的羧酸酯水解，采用等当量的无机硷，包括氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钠，反应的温度为0-60℃，优选温度20-30℃，时间为1-24小时，水解反应溶剂是甲醇的硷水溶液或1，4-二氧六环的硷水溶液。
这些10位取代基上含有机羧酸基团的喜树碱化合物的多羧酸化合物可以用通用的常规方法与硷反应制成盐，优选的硷为氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠或碳酸氢钠等。
制备本发明化合物的合成反应一般是在常温或室温(10-30℃)条件下进行。其合成反应通式如下(式中Base代表吡啶或三乙胺) 根据本发明的实施方案，所述的本发明10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物还包括其药效学上可接受的盐、盐的水合物、羧酸酯或前体药物。
本发明因此还涉及含有作为活性成分的本发明化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-95重量％的本发明化合物。
本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等，此外，还包括胸腔注射给药，膀胱、腹腔等的灌注给药以及经动脉对脑、肝、肾、四肢、肠等部位的介入给药等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型，例如片剂、胶囊剂、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、栓剂或冻干粉针剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂，也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇等；粘合剂如淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素、甲基纤维素、紫胶、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、硬脂酸甘油脂、可可脂、氢化植物油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液状石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊剂，将有效成分的本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶或软胶囊中。也可将有效成分的本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，也可装入硬胶囊中，或制成注射剂应用。
例如将有效成分的本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液、乳剂、冻干粉针剂等，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、，如稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。本发明药物成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围从0.1-1000mg/m2尤其是1-100mg/m2。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及包括运用化疗、放疗手段的给药方案。
从体外抗肿瘤活性筛选来看，本发明的化合物表现良好的抗肿瘤活性。可作为抗肿瘤药物用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。
具体实施例方式
下面的实施例用来进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例110-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双醋酸及其二钠盐的合成10-(羧酰胺)羟基喜树碱N-双醋酸的结构式如下
10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双醋酸的合成路线如下 苄胺双乙酸叔丁酯BnN(CH2CO2-tBu)2的合成将苄胺(8.4ml，0.077mol)和碳酸钾(21.5g，0.156mol)溶解在120ml乙醇中，室温下将溴代乙酸叔丁酯(30.0g，0.158mol)滴加入苄胺溶液中。将反应液在室温下搅拌，用硅胶薄层(TLC)层析观察，直到反应物苄胺消失为止。真空下除去乙醇，将油状物用水和乙酸乙酯(EtOAc)萃取。酯层用水和饱和盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥。真空下除去EtOAc溶剂，其残留物用硅胶柱层析纯化得到BnN(CH2CO2-tBu)2(17.9g)，为无色油状物，收率为69.2％，低分辨质谱LRMSM+1＝336.4。
胺基双乙酸叔丁酯HN(CH2CO2-tBu)2的合成将BnN(CH2CO2-tBu)2(28.0g，83.5mmol)溶解在200ml甲醇中，在N2保护下加入钯碳(Pd/C)(8.74g)和甲酸铵(26.5g，420mmol)。将该混合液体加热回流12小时，过滤除去Pd/C，再将滤液的甲醇溶剂除去，其残留固体用硅胶柱层析纯化(石油谜Pet/EtOAc 2∶1)得到固体NH(CH2CO2-tBu)2(15.45g，75.1％)，低分辨质谱LRMSM+1＝246.4。
胺酰氯双乙酸叔丁酯ClCON(CH2CO2-tBu)2的合成将以上中间体NH(CH2CO2-tBu)2(12.87g，52.46mmol)，Et3N(10.42mL)溶解在50mL THF中。冰水浴下，将其加入溶有Cl3COCO2CCl3(5.70g，19.24mmol)的THF(250mL)中。将该混合液在室温下搅拌3h。真空下除去THF溶剂，得到粗品。将该粗品悬浮在EtOAc中，过滤除去固体，再将滤液的EtOAc溶剂除去，其残留固体用硅胶柱层析纯化(Pet/EtOAc 10∶1)得到无色固体ClCON(CH2CO2-tBu)2(11g，68.1％).RF0.31over 101Pet/EtOAc，低分辨质谱LRMSM+1＝330.3。
10-(t-BuO2CCH2)2NCO2-喜树碱的合成将10-羟基喜树碱(0.311g，0.856mmol)和ClCON(CH2CO2-tBu)2(1.712mmol)溶解在21mL吡啶中，室温下搅拌12小时。真空下除去吡啶溶剂。用CHCl3(100mL)萃取，用7％的NaHCO3溶液100ml和饱和盐水洗涤CHCl3层，用无水硫酸钠干燥。用硅胶柱层析纯化(CHCl3/EtOAc1∶1)得到黄色固体10-(t-BuO2CCH2)2NCO2-喜树碱0.51g，收率93.8％。RF0.49(CHCl3∶EA∶EtOH 1∶1∶0.1).低分辨质谱LRMSM+1＝636.7。
10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双醋酸的合成将10-(t-BuO2CCH2)2NCO2-喜树碱(0.44g，0.6922mmol)溶解在8.0mL甲酸中，室温下搅拌12小时。真空下除去甲酸溶剂，得到黄色固体。用EtOAc和CHCl3洗涤得到黄色固体10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双醋酸0.31g，收率85.6％。核磁共振氢谱1HNMR(DMSO-d6)δ0.89(3H，t，J＝7.2Hz)，1.87(2H，m)，4.12(2H，s)，4.28(2H，s)，5.30(2H，s)，5.43(2H，s)，6.54(1H，s)，7.34(1H，s)，7.58(1H，dd，J1＝9.2Hz，J2＝2.8Hz)，7.88(1H，d，J＝2.8Hz)，8.20(1H，d，J＝9.2Hz)，8.70(1H，s)，12.99(2H，s)，低分辨质谱LRMSM+1＝524.3。
10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双醋酸二钠的合成将10-(t-BuO2CCH2)2NCO2-喜树碱(0.340g，0.6499mmol)溶解在1.0mLDMF中，然后定量加入52.0mg氢氧化钠水溶液，冷冻真空干燥下除去DMF溶剂，得到淡黄色固体，用EtOAc洗涤得到水溶性固体10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双醋酸二钠盐0.340g，收率92.3％，LRMSM-2Na+1＝524.3。
实施例210-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双丙酸及其二钠盐的合成10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双丙酸结构式如下
合成路线参见实施例1，合成方法相似。
苄胺双丙酸叔丁酯BnN(CH2CH2CO2-tBu)2的合成将苄胺(5.46mL，0.05mol)和碳酸钾(21.5g，0.156mol)溶解在100ml乙醇中，室温下将溴代丙酸叔丁酯(15.38mL，0.105mol)滴加入苄胺溶液中。将反应液加热回流48小时，用TLC层析观察，直到反应物苄胺消失为止。真空下除去乙醇溶剂，将油状物用水和乙酸乙酯萃取。酯层用水和饱和盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥。真空下除去EtOAc溶剂，其残留物用硅胶柱层析纯化得到BnN(CH2CH2CO2-tBu)2(14g)，为无色油状物，RF0.74(Pet/AcOEt5∶1)，收率为77％，低分辨质谱LRMSM+1＝364.1。
胺基双丙酸叔丁酯NH(CH2CH2CO2-tBu)2的合成在N2下，将BnN(CH2CH2CO2-tBu)2(1.09g，3.0mmol)溶解在20ml甲醇中，在N2保护下加入Pd/C(0.32g)和甲酸铵(0.946g，15mmol)。将该混合液体加热回流12小时，过滤除去固体Pd/C，再将滤液的甲醇溶剂除去，其残留固体用硅胶柱层析纯化(Pet/EtOAc 2∶1)得到固体HN(CH2CH2CO2-tBu)2(0.61g，74.4％)，RF0.29(Pet/EtOAc 1∶1)，低分辨质谱LRMSM+1＝274.0胺酰氯双丙酸叔丁酯ClCON(CH2CH2CO2-tBu)2的合成冰水浴下，将NH(CH2CH2CO2-tBu)20.16g，0.5395mmol)，Et3N(0.29mL，2.10mmol)溶解在10mLTHF中。将其加入溶有Cl3COCO2CCl3(0.16g，0.5395mmol)的THF(10ml)中。将该混合液在室温下搅拌3小时。真空下除去THF溶剂，得到ClCON(CH2CH2CO2-tBu)2粗品。直接进行下一步反应。
10-(t-BuO2C CH2CH2)2NCO2-喜树碱的合成将10-羟基喜树碱(0.311g，0.856mmol)和ClCON(CH2CH2CO2Bu-t)2(1.712mmol)溶解在20mL吡啶中，室温下搅拌12小时。真空下除去吡啶溶剂。用CHCl3(100mLX2)萃取，用7％的NaHCO3溶液和饱和盐水洗涤CHCl3层，用无水硫酸钠干燥。真空下除去CHCl3溶剂后得固体粗品，用硅胶柱层析纯化(CHCl3/EtOAc1∶1)得到黄色固体10-(t-BuO2CCH2CH2)2NCO2-喜树碱0.51g，收率93.8％。RF0.49(CHCl3∶EA∶EtOH 1∶1∶0.1)，低分辨质谱LRMSM+1＝662.7。
10-(羧酰胺)羟基喜树碱N-双丙酸的合成将10-(t-BuO2C CH2CH2)2NCO2-喜树碱(0.4g，0.60mmol)溶解在8.0mL甲酸中，室温下搅拌12小时。真空下除去甲酸溶剂，得到黄色固体。用EtOAc和乙醚洗涤得黄色固体10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双丙酸0.216g，收率65.0％。低分辨质谱LRMSM+1＝552.3.核磁共振氢谱1HNMR(DMSO-d6)δ0.89(3H，t，J＝7.2Hz)，1.87(2H，m)，4.12(2H，s)，2.57(2H，t，J＝6.8 Hz)，2.67(2H，t，J＝6.8Hz)，3.55(2H，t，J＝6.8Hz)，3.71(2H，t，J＝6.8Hz)，5.30(2H，s)，5.43(2H，s)，6.53(1H，s)，7.68(1H，dd，J1＝9.2Hz，J2＝2.8Hz)，7.91(1H，d，J＝2.8Hz)，8.18(1H，d，J＝9.6Hz)，8.32(1H，s)，8.65(1H，s)。
10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-双丙酸二钠盐的合成将10-(t-BuO2C CH2CH2)2NCO2-喜树碱(0.212g，0.3844mmol)溶解在1.0mL DMF中，然后定量加入30mg氢氧化钠水溶液。冷冻真空干燥下除去DMF溶剂，得到淡黄色固体，用EtOAc洗涤得到水溶性固体10-(羧酰胺)羟基喜树碱N-双丙酸二钠盐0.21g，收率92％，低分辨质谱LRMSM+1＝596.5。
实施例310-[N-(4，4’-二丙酸)丁酸)羧酰胺]羟基喜树碱的合成10-[N-(4，4’-二丙酸)丁酸)羧酰胺]-羟基喜树碱结构式如下
下例反应式的三羧酸叔丁酯衍生物中间体通过以下方法获得。用硝基甲烷和叔丁基丙烯酸酯，通过MICHEAL加成得到硝基三羧酸叔丁酯衍生物。将该化合物50g(0.11mol)置于1000ml的圆底烧瓶中，加入400ml无水乙醇使其溶解，然后加入由30g镍铝合金制备得到的Raney Ni(0.26mol)。常温常压氢反应。反应物反应完全后过滤除去Raney Ni，旋转减压蒸去乙醇溶剂，得到46.6g白色固体，胺基三羧酸叔丁酯衍生物化合物[1，5-双叔丁氧基酰基-3-[(2-叔丁氧基酰基)乙基]3-氨基戊烷]。产率100％。Rf＝0.806(乙酸乙酯)；Mp60～62℃。LRMSM+1＝416.1；M+钠＝438.3。
用实施例1描述的胺酰氯制备法得到以下异氰酸三羧酸叔丁酯衍生物(MW＝441)，没有纯化的粗品用于下一步和10-羟基喜树碱的偶合反应(反应式中Phosgen为光气)。
将以上异氰酸三羧酸叔丁酯衍生物(1.5g，3.2mmol)和10-羟基喜树碱(0.364g，1.0mmol)，置于吡啶(81mL)中。室温搅拌24小时。减压下除去吡啶溶剂。浓缩物用CH2Cl2(200mL)和水萃取，再用NaHCO3(7％，100mL)和饱合盐水洗有机相，用无水Na2SO4干燥有机层。旋转减压蒸去CH2Cl2溶剂得到粗品。硅胶柱层析(CHCl3/EtOAc1∶1)后得到浅黄色固体10-羟基喜树碱三羧酸叔丁酯衍生物(0.51g，60％)RF0.3(CHCl3∶EA∶EtOH 1∶1∶0.1)。
将以上的10-羟基喜树碱三羧酸叔丁酯衍生物(0.51g)溶解在甲酸(10mL)中，室温搅拌12小时，旋转减压除去甲酸溶剂，得到黄色固体。将该固体在乙腈中重结晶得10-[N-(4，4’-二丙酸)丁酸)羧酰胺]-羟基喜树碱(0.3g)，低分辨质谱(LRMS)M-1＝636。
实施例410-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-九羧酸的合成10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-九羧酸结构式如下 取代基部分的制备
将实施例3中[1，5-双叔丁氧基酰基-3-[(2-叔丁氧基酰基)乙基]3-氨基戊烷]50g(0.12mol)与化合物三取代丙酸硝基甲烷10g(0.036mol)(见上图)，置于一个1000ml的圆底烧瓶中，加入350mLDMF，待化合物溶解后，再加入1-羟基苯并三唑(HOBt)17.9g(0.13mol)。然后取1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)27.3g(0.13mol)置于一个100ml的烧杯中，加入50mLDMF使其溶解，将其滴加入反应瓶中，室温搅拌反应48h，过滤除去固体，向反应液中加入400mL EtOAc，用水(100×4mL)洗，无水硫酸钠干燥有机层。减压旋转蒸去DMF和EtOAc等溶剂，将所得残留物用柱层析分离得到反应式(上图)的硝基化合物(II)白色固体36g，产率为67.5％。Rf＝0.375(EtOAc∶己烷＝1∶2)；Mp 151～153℃；低分辨质谱LRMSM+1 1470.4M+水＝1487.4。
以上化合物(II)28g(0.019mol)，置于一个1000ml的圆底烧瓶中，加入400mL无水乙醇，再加入由30g镍铝合金制备得到的RaneyNi(0.26mol)。常温常压下氢化反应。反应完全后过滤除去Raney Ni，旋转减压除去乙醇溶剂，得到白色固体化合物(III)27g。产率100％。Rf＝0.51(D∶M＝10∶1)；Mp＝180～181℃；LRMSM+1 1440.3。用实施例1描述的胺酰氯制备法得到异氰酸九羧酸叔丁酯衍生物(IV)，得到的没有进一步纯化的粗品(IV)低分辨质谱LRMSM+1-1726直接用于下一步和10-羟基喜树碱的偶合反应。
将以上异氰酸九羧酸叔丁酯衍生物(IV)(15g)和10-羟基喜树碱(0.364g，1.0mmol)，置于吡啶(150mL)中。室温搅拌74小时。减压下除去吡啶溶剂。浓缩物用CH2Cl2(500mL)和水萃取，再用NaHCO37％，100mL)和饱和盐水洗有机相，用无水硫酸钠干燥有机层。旋转减压除去CH2Cl2溶剂，得到粗品，将该粗品经硅胶柱层析(CHCl3/EtOAc1∶1)后得到白色固体10-羟基喜树碱九羧酸叔丁酯衍生物(0.7g)。
将以上的10-羟基喜树碱九羧酸叔丁酯衍生物(0.7g)溶解在甲酸(10mL)，室温搅拌74小时，旋转减压除去甲酸溶剂，得到10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-九羧酸产品(0.1g)，低分辨质谱(LRMS)M-1＝1324。
实施例510-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-5-苯间二甲酸的合成10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-5-苯间二甲酸结构式如下 合成方法在冰浴条件下，将Cl3COCO2CCl3(0.15g，0.5mmol)和三乙胺(0.3mL)置于含10mL THF的圆底烧瓶中，缓慢加入1，3-(5-胺基)苯二甲酸(0.135g，1.5mmol)。反应液体在搅拌下经过2小时升到室温。旋转减压除去THF溶剂，得到的粗品异氰酸化合物(0.2g)直接用于下一步和10-羟基喜树碱的反应。
将以上的异氰酸(0.2g)溶解于DMF(5mL)再将10-羟基喜树碱(0.15g)溶解于DMF(10mL)中。在0℃下将前者加入后者之中，室温搅拌74小时.减压下除去DMF溶剂.浓缩物用CH2Cl2(50mL)和水萃取，再用水和饱和盐水洗有机相，用无水硫酸钠干燥有机层。旋转减压除去CH2Cl2溶剂，得到粗品10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-5-苯间二甲酸叔丁酯衍生物。将该粗品经硅胶柱层析(CHCl3/EtOAc 1∶1)纯化后得到白色固体10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-5-苯间二甲酸叔丁酯(0.07g)，低分辨质谱(LRMS)M+1＝684。
将以上10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-5-苯间二甲酸叔丁酯(0.07g)溶解在甲酸(10mL)中，室温搅拌24小时，旋转减压除去甲酸溶剂，将固体在乙醚中进行重结晶得到10-(羧酰胺)羟基喜树碱-N-5-苯间二甲酸(0.02g)，低分辨质谱(LRMS)M-1＝570。
药理实验样品制备10-羟基喜树碱(HCPT)加几滴二甲基亚砜(DMSO)然后用蒸馏水溶解得供试样品，其他样品用蒸馏水溶解供实验用。
实验方法六种人体肿瘤细胞(SGC-7901，BEL-7404，BEL-7402，Bcap-37，HL-60和K562)，一种老鼠肿瘤细胞P388，分别悬浮于RPMI-1640(Gibco)培养基中，提供以10％牛血清，在温度37℃，含5％CO2空气环境下培养。每种肿瘤细胞浓度为(1-5)×108/L，不同浓度的10-羟基喜树碱和供试的实施例化合物与肿瘤细胞作用3-5d；HL-60作用12h；P388作用48h。采用MTT和台盼蓝排染法测定。体外细胞毒性实验测定结果见表1表1。10-羟基喜树碱及实施例化合物对不同肿瘤细胞作用比较
BEL-7402和BEL-7404人恶性肝肿瘤细胞株；SGC-7901人胃癌细胞株；Bcap-37人乳腺癌细胞株；HL-60和K562人白血病癌细胞株；P338鼠白血病癌细胞株。
实验结果表明实施例1，2，5三个化合物都呈现出类似于10-羟基喜树碱的肿瘤细胞毒性。实施例1化合物的抑制肿瘤细胞的效果最好，也好于10-羟基喜树碱。
权利要求
1.一种如通式(I)所示的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物 其特征在于其中A1、A2各自独立地表示含取代的C1-C6直链烷基残基，C3-C20支链烷基残基或H，条件是两者不能同时为H，A1、A2连接成环，包括芳香环、饱和、不饱和杂环基的残基，其中B表示和A1、A2连接的含有1到9个有机羧酸或其羧酸盐的功能基，当A1表示H时，连接A1的B无意义，A2表示含取代的芳香环基的残基，含取代的C5-C6环烷基残基，含取代的选自N，O或S的单原子4-6元杂环基残基，含取代的C3-C20支链烷基残基，A2-B选自-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COOH]a}a，-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COO-]a}a，其中a＝1、2或3。
2.根据权利要求1所述的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物，其特征在于其中A1、A2各自独立地表示含取代的C1-C4直链烷基残基，含取代的C3-C10支链烷基残基或H，条件是两者不能同时为H，其中B表示和A1、A2连接的含有1到9个有机羧酸或其羧酸盐的功能基，当A1表示H时，连接A1的B无意义，A2表示含取代的苯基或苄基残基，含取代的C3-C10支链烷基残基，A2-B选自-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COOH]a}a，-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COO-]a}a，其中a＝1，2或3。
3.根据权利要求1或2所述的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物，其特征在于所述化合物选自天然的10-羟基喜树碱化合物，其光学异构体，或它们的羧酸盐。
4.制备如权利要求1或2所述的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物的方法，首先制备相应的含两个或两个以上有机羧酸基团的胺酰氯或异氰酸类化合物，这些化合物的终端含有仲胺基团或伯胺基团，将该含有胺基的化合物与相应的酰化试剂反应，在有机碱催化下得到含有胺酰氯或异氰酸功能基的化合物，再用10-羟基喜树碱或它的类似物和相应的胺酰氯或异氰酸类化合物，通过缩合反应而制备10位取代基上含有机羧酸基团的喜树碱化合物的羧酸酯，最后是所述的羧酸酯水解成相应的羧酸化合物，该羧酸化合物与碱反应制成盐，其特征在于合成反应步骤中包括下列试剂，催化剂及反应条件首先制备相应的含两个或两个以上有机羧酸基团的胺酰氯或异氰酸类化合物，将含有胺基的化合物与相应的酰化试剂反应，酰化试剂为光气或双光气，催化剂为有机碱，包括三乙胺或吡啶，溶剂为四氢呋喃或乙醇，再用10-羟基喜树碱或它的类似物和相应的含两个或两个以上有机羧酸基团的胺酰氯或异氰酸类化合物，通过缩合反应制备相应的羧酸酯，缩合反应温度为0-60℃，反应的溶剂为无水有机溶剂，包括二氯甲烷、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃，反应的催化剂为有机碱，包括三乙胺或吡啶，最后是10位取代基上含有机羧酸基团的喜树碱化合物的羧酸酯水解成相应的羧酸化合物，其取代基终端是叔丁基酯的水解，试剂选用甲酸，如果取代基终端是甲酯或乙酯的羧酸酯水解，采用等当量的无机硷，包括氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钠，反应温度为0-60℃，时间为1-24小时，水解反应溶剂是甲醇的硷水溶液或1，4-二氧六环的硷水溶液。
5.根据权利要求1或2所述的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物，其特征在于所述化合物包括其药效学上可接受的盐、盐的水合物、羧酸酯或前体药物。
6.一种药物组合物，其特征在于含有有效量的权利要求1或2所述的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物和药学上可接受的载体。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于所述的组合物可以是片剂、胶囊、注射剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。
全文摘要
本发明涉及如通式(I)所示的10位取代基上含多个有机羧酸基团的喜树碱化合物，其特征在于A
文档编号A61K9/00GK1982313SQ20051004797
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月13日 优先权日2005年12月13日
发明者李嘉和, 王颖实, 邓小斌 申请人:深圳市天和医药科技开发有限公司