专利名称：一种治疗肉瘤的强化疫苗试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种治疗肉瘤的强化疫苗试剂盒及其应用，属于免疫制剂领域。
背景技术：
中国专利申请号为“200410103986.1”的申请文件中公开了一种用于治疗肉瘤的混合热休克蛋白/肽复合物疫苗，该热休克蛋白/肽复合物疫苗可通过以下方法制备而成新鲜的肉瘤组织剪碎，将肉瘤细胞裂解，裂解液离心，取上清，所得上清浓缩或透析后上层析柱，截取分子量在50～150KD段，分装，冻干即得。该肉瘤疫苗的组成成分以HSP-60为主，同时含有Gp-96、HSP-90、HSP-70，以HSP-70含量为最少。动物实验结果表明，该热休克蛋白/肽复合物疫苗对于肉瘤具有一定的预防和治疗作用，但其效果尚有待提高。
白介素-12是一种最强的抑制肿瘤生长的细胞因子，它可促进及活化自然杀伤细胞及T淋巴细胞，分泌γ-IFN(干扰素)，还可活化趋向因子IP-10，抑制血管增生，在国外曾应用它治疗肿瘤，但在临床II期时因大量给药时毒副作用过大(2例死亡)而停止。在动物实验中也表明白介素-12对无免疫预存的肿瘤无效。目前，为减低白介素-12的毒副作用，国外进行了给药途径及恰当剂量的研究，其给药途径包括皮内、皮下、粘膜、鼻腔及瘤内注射等。也有应用白介素-12与其他疫苗(黑色素瘤)共用，以增强其疫苗的预防作用，可达剂量低而无副作用，但还没有白介素-12与疫苗共用于治疗肿瘤的报道，而现有的各种疫苗单独使用时，对于肿瘤的治疗效果尚差强人意。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种治疗肉瘤的强化疫苗试剂盒，该试剂盒包括置于其中，但分开包装的混合热休克蛋白/肽复合物、环磷酰胺(Cy)及白介素-12(IL-12)；其中三种组分的重量够用一个治疗肉瘤的疗程即可。
优选的，三种组分的用量为混合热休克蛋白/肽复合物75ug、环磷酰胺430mg-460mg及白介素-121500ug。
其中，本发明试剂盒中环磷酰胺的用量可参照如下标准人体每一平方米体表面积需要使用300mg环磷酰胺。
所述的混合热休克蛋白/肽复合物可按照中国专利申请号为“200410103986.1”所公开的方法制备；也可直接按照如下方法制备新鲜的肉瘤组织剪碎，将肉瘤细胞裂解，裂解液离心，取上清，所得上清浓缩或透析后上层析柱，截取分子量在50～150KD的部分，分装，冻干即得。
本发明将混合热休克蛋白/肽复合物、环磷酰胺及白介素-12联合在一起组成一种治疗肉瘤的强化疫苗试剂盒，首先利用混合热休克蛋白/肽复合物免疫后导致肿瘤产生免疫预存，随后再依次使用环磷酰胺和白介素-12，使白介素-12能够发挥出最佳抑制肿瘤的效果。
本发明强化疫苗试剂盒的用法与用量一个疗程首先用混合热休克蛋白/肽复合物免疫3次，间隔7天，25ug/次，用混合热休克蛋白/肽复合物第3次免疫后的次日用环磷酰胺静脉注射1次，用量为430mg-460mg；3天后用白介素-12皮下注射，每天1次，每次300ug，连续注射5次，总剂量为1500ug。
图1用混合热休克蛋白/肽复合物疫苗免疫荷载S180肉瘤小鼠后的肿瘤病理切片，图示肿瘤区内多灶性免疫细胞侵润。
图2用混合热休克蛋白/肽复合物疫苗免疫荷载S180肉瘤小鼠后的肿瘤病理切片，图示肿瘤区内血管内淋巴细胞靠边，欲游走出血管。
图3未用混合热休克蛋白/肽复合物疫苗免疫荷载S180肉瘤小鼠的肿瘤病理切片，肿瘤区内无免疫细胞侵润，即无免疫预存。
图4对照组小鼠30天，肿瘤长的很大。
图5第III组小鼠(HSP/肽+Cy+IL-12)，肿瘤移植40天后，9/10肿瘤消退，达到无瘤生存，但停止治疗后，又有一只鼠肿瘤渐长大，于90天死亡，总生存率为80％。
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
具体实施例方式本发明强化疫苗试剂盒的免疫效果试验Balb/c小鼠，体重18-20克，购自解放军军事医学科学院，分别移植S180肉瘤细胞4×104，分为6组，分别编号为I-VI。
试验方法第I组(对照组)肿瘤移植后不给药。
第II组用混合热休克蛋白/肽复合物疫苗(即HSP/肽，该疫苗按照中国专利申请号为“200410103986.1”所公开的方法制备而成)免疫，接种肿瘤后第2天开始第1次免疫，皮下注射，每次20ug，间隔7天，共免疫3次。
第III组用本发明强化疫苗试剂盒治疗，具体如下首先用混合热休克蛋白/肽复合物疫苗(即HSP/肽，该疫苗按照中国专利申请号为“200410103986.1”所公开的方法制备而成)免疫，接种肿瘤后第2天开始第1次免疫，皮下注射，每次20ug，间隔7天，共免疫3次(同II组)，最后一次免疫的次日，用环磷酰胺(Cy)腹腔注射一次，剂量为100mg/kg体重，3天后，皮下注射白介素-12(IL-12)，连续5天，每次100ng。
第IV组不用混合热休克蛋白/肽复合物疫苗免疫，与第III组同时用Cy腹腔注射100mg/kg，3天后，皮下注射L-12，连续5天，每次100ng。
第V组混合热休克蛋白/肽复合物疫苗(即HSP/肽，该疫苗按照申请号为“200410103986.1”所公开的方法制备而成)免疫，接种肿瘤后第2天开始第1次免疫，皮下注射，每次20ug，间隔7天，共免疫3次，最后一次免疫的3天后，皮下注射白介素-12(IL-12)，连续5天，每次100ng。但不给Cy。
第VI组混合热休克蛋白/肽复合物疫苗(即HSP/肽，该疫苗按照中国专利申请号为“200410103986.1”所公开的方法制备而成)免疫，接种肿瘤后第2天开始第1次免疫，皮下注射，每次20ug，间隔7天，共免疫3次，最后一次免疫的次日，用环磷酰胺(Cy)腹腔注射一次，剂量为100mg/kg。
试验结果对照组在40天内全部因肿瘤长大而死亡(见图4)，用本发明强化疫苗试剂盒治疗的肉瘤小鼠，60天后观察结果有90％活存(见图5)，长期(3个月)活存达80％。Cy+IL-12组90天后30％存活。HSP/肽组2/20(10％)活存。HSP/肽+IL-12组，HSP/肽+Cy组90天后全部死亡(见表1)。HSP/肽免疫后，在S180肉瘤组织中产生了预存免疫，在肿瘤组织中有多灶性淋巴细胞及单核细胞侵润，血管中有大量淋巴细胞靠边，将游走出血管，出现免疫预存(见图1和图2)，而未用混合热休克蛋白/肽复合物疫苗免疫的肿瘤组织中，没有淋巴细胞侵润，无免疫预存(见图3)。
表1 本发明强化疫苗试剂盒治疗小鼠S180肉瘤的结果
上述试验结果表明，本发明强化疫苗试剂盒对肉瘤有显著的治疗作用。
权利要求
1.一种治疗肉瘤的强化疫苗试剂盒，该试剂盒包括置于其中，但分开包装的用于一个疗程的下述三种组分混合热休克蛋白/肽复合物、环磷酰胺及白介素-12。
2.按照权利要求1的强化疫苗试剂盒，其特征是三种组分的重量为混合热休克蛋白/肽复合物75ug、环磷酰胺430mg-460mg及白介素-121500ug。
3.权利要求1的强化疫苗试剂盒在制备抑制肿瘤药物中的用途。
4.按照权利要求2的用途，其特征是所述的肿瘤为肉瘤。
全文摘要
本发明公开了一种新的治疗肉瘤的强化疫苗试剂盒及该试剂盒的使用方法。本发明治疗肉瘤的强化疫苗试剂盒包括置于其中，但分开包装的下述三种组分混合热休克蛋白/肽复合物75ug、环磷酰胺430mg－460mg及白介素－121500ug。本发明强化疫苗试剂盒的使用方法如下首先用混合热休克蛋白/肽复合物免疫3次，每次25ug，间隔七天注射一次，再用430mg－460mg的环磷酰胺皮下注射1次，一天后，再用白介素－12皮下注射5次，每次300ug，每天一次。动物试验结果表明，本发明强化疫苗试剂盒对于肉瘤有显著的治疗作用。
文档编号A61P35/00GK1990040SQ20051013524
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者袁玫, 卢世璧, 崔雪梅, 宋舸, 眭翔, 彭江, 张莉 申请人:中国人民解放军总医院