专利名称：二种新型血管生成抑制药物及其防治肿瘤的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子药物学，生物技术和疾病防治，具体地说是涉及基于kallistatin和vasostatin的两种血管生成抑制药物，和采用该药物进行肿瘤治疗，或预防肿瘤复发或转移，以及增强肿瘤化疗或放疗疗效的应用。
背景技术：
目前恶性肿瘤已经成为发达国家和地区居于前列的致死性疾病。虽然外科手术，放疗和化疗作为的常规治疗手段仍在不断发展，但由于其固有的局限，其疗效已基本达到极限，因而迫切需要开发新的治疗手段。
在世界上最常见癌症中，肝癌排位第六。在各种不同类型的肝癌中，肝细胞肝癌(HCC)为最常见的原发性恶性肝癌。国际癌症研究机构估计，在世界范围内每年有626,000例HCC的新发病例，598,000例因HCC致死病例。HCC在东亚和撒哈那以南非洲地区发生率很高，在该地区为主要的癌症致死原因。在1990年，HCC列中国和日本癌症致死率的第3位。最近发现在发达国家，HCC呈稳定的上升趋势，如在意大利，法国和美国。
有许多手段已应用于HCC的治疗。对HCC病人，手术切除原发性肿瘤和原位肝移植(OLT)是最有治愈可能的方法。因保留的部分肝脏的功能对治疗的决定性作用，HCC病人不仅需要有效的治疗肿瘤的药物，还需要稳定和治疗潜在肝病的药物，因而手术切除方法的治疗面临很大困难。费用高昂，器官短缺，移植受体再感染HBV或HCV等因素，也限制了OLT的应用。手术切除的疗效需要切除所有的肿瘤组织，并依赖剩余肝脏承受体积损失，再生以及延续生命的能力。然而，大部分HCC发生于肝硬化病人，如进行剧烈的手术，病人会处于肝功能补偿不全或丧失的危险境地。另外，手术还会增加术后复发的可能性。因此，仅5-10％的病人适用手术切除治疗。对剩余的90％的病人，则无金标准的治疗手段。肿瘤无法切除，现行的化疗和放疗又存在极大的副反应，因此急需新的HCC治疗手段。
自于1971年首次提出肿瘤的生长浸润依赖于肿瘤内新生血管的形成这一观点，以肿瘤新生血管为靶点的抗血管生成治疗成为抗肿瘤研究的热点。
血管生成在肿瘤生长的各不同阶段均发挥关键作用。肿瘤扩张阶段依赖于血管生成获得氧气和营养，以克服低氧和饥饿。有证据显示直径大于0.5mm的肿瘤的生长和存活，需要血管生成。在肿瘤生长过程中，持续的血管生成是肿瘤获得的能力之一(Hanahan D，WeinbergRA.Cell 2000；10057-70)，因而再次强调了抑制血管生成的重要性。在肿瘤转移的开始和结束，均需要血管的生成。因为血管生成是肿瘤生长和转移的先决条件，以肿瘤新生血管为靶将证明是有效的抗肿瘤治疗手段。当然，抗血管生成的内在特点也使得该技术特别具有吸引力。首先，它不可能产生耐受性，因为其目标为基因稳定的内皮细胞。其次，因正常血管处于静息状态，以血管生成为目标副作用会很小。第三，肿瘤细胞的生长依赖于血流供应，以新生血管为目标增强了抗肿瘤效果。第四，与肿瘤细胞相比，药物更易于进入内皮细胞，由于高组织压梯度，肿瘤实体内部的药物渗透不足非常常见。由于血管生成对肿瘤转移的作用，抗血管生成的手段被寄予了提高肿瘤治疗疗效的希望。
HCC为多血管瘤。通过血管造影术，可以明显地将含有丰富且多分支血管的HCC与良性肿瘤区分开来。血液供应异常也是HCC的特征之一。肝有双重血液供应，75％来自门静脉，25％来自肝动脉。在人和动物模型，发现恶性肝肿瘤的血液供应，主要来自肝动脉。这也许意味着在肿瘤发生时，血流的改变是HCC恶化的关键原因，HCC恶化也可能是血流增加的结果生长快，体积大是HCC的特征。在HCC扩张阶段，肿瘤诱发了血管生成，肿瘤动脉血管化，形成在动脉造影下非常特征的富血管性。因阻断血管生成可能在HCC肿瘤生长的早期，甚至在启动血管生成前，实现阻止肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞的目的，所以对HCC，抗血管生成的肿瘤治疗更加有前途。
在众多血管生成抑制因子中，血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)为研究最充分的药物，内皮抑素在美国已被批准上临床。
Kallistatin是一新型的具有抗血管生成作用的内源性蛋白(Miao RQ，et al.Blood2002；1003245-52)，其抗血管生成作用与内皮抑素类似。内皮抑素通过其肝素结合活性介导其对血管生成的抑制作用。各种生长因子必须结合细胞表面两种不同的受体，才能引发一个信号。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受体，在调节多种生长因子的作用时，发挥关键作用。许多生长因子，如VEGF和bFGF是肝素结合生长因子，VEGF和bFGF与内皮细胞表面的HSPGs结合，可以调节它们与专属受体的结合。Kallistatin是肝素结合蛋白，可以与VEGF和bFGF，以及其它含有肝素结合区的生长因子竞争结合HSPGs，因此阻断了这些生长因子与HSPGs的结合，阻断了这些生长因子引发的血管生成事件。另外，kallistatin还是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一员，最初被认为是组织胰激肽原酶结合蛋白。越来越多的证据显示，组织胰激肽原酶在肿瘤相关事件中非常重要，其中包括肿瘤生长调节，血管生成，侵入和转移等。我们的研究发现，在kallistatin的作用下，HCC中作为细胞增殖的标志Ki-67染色降低，显示Kallistatin与组织胰激肽原酶的结合可能与HCC细胞增殖抑制有关。Kallistatin可以从不同途径抑制血管生成，因此是HCC抗血管生成治疗的良好候选者。
1998年Pike等发现的Vasostatin显著抑制内皮细胞的增殖和小鼠肿瘤的生长(Pike SE，et al.J Exp Med 1998；1882349-56)。最近局部应用Vasostatin显示可以抑制角膜血管的生长。有报道Vasostatin可以与基底膜的重要成分层粘蛋白结合，因而阻制了内皮细胞在层粘蛋白-1包被板的附着。就HCC而言，在人和大鼠均发现了层粘蛋白沉积的明显增加。最近在HCC病人的肿瘤结节中发现层粘蛋白-5(α3β3γ2)，但在正常人的肝细胞中未发现。层粘蛋白-5直接与HCC病人的不良预后有关，γ2链是HCC病人的预后标志。因基底膜在血管的覆盖达99.9％以上，它应当是抗血管生成治疗的良好靶子。
尽管kallistatin和vasostatin通过循环系统分布，但还可以靶向性作用于肿瘤活化的内皮细胞，因为宿主的大部分内皮细胞处于静息状态，仅在伤口愈合和再生等生理性血管生成过程中，内皮细胞才处于活化状态。肿瘤生成血管的内皮细胞增殖活跃，分化度低，而成人组织的大部分内皮细胞增殖非常迟缓，为高分化表型。因此通过循环系统应用血管生成抑制剂后副反应会很小。
据报道，抗血管生成治疗会使肿瘤血管的内皮细胞对化疗和放疗更敏感，因为在血管内皮细胞生长因子受体-2阻断、激素的清除氧化和化疗中，肿瘤氧化发生乃是激素依赖型(Hansen-Algenstaedt，et al.Cancer Res 2000；604556-60)。肿瘤血管的结构是异常的，皆因内皮细胞过多而不成熟，易漏，扩张，曲折，呈囊状。血管外周细胞与血管松散结合或根本没有，血管基底膜不正常。肿瘤微环境的特点导致释放至肿瘤的药物量降低，肿瘤对化疗和放疗的耐受性增加，基因型不稳定，浸润的免疫细胞的作用降低。抗血管生成治疗可以改变血管的不成熟和低功能，使得肿瘤血管正常化。人们可能会说，肿瘤血管正常化后，会改善氧气和营养的供应，加快肿瘤的生长，因而降低了化疗和放疗的疗效。实际上，这一看似悖论的推论并不真实。给化疗和放疗的直肠癌病人服用抗血管生成药bevacizumab(VEGF的抗体)后，血管生成降低，但肿瘤中放射性标志物的摄取并没有减少直接证据显示VEGF特异抗体bevacizumab有在人类颈癌有直接的抗血管生成作用(Willett CG，et al.Nat Med2004；10145-7)。到目前为止，血管生成抑制剂还不能实现传统意义上的治疗作用(指造成肿瘤衰退)，但它可以制止肿瘤的进一步扩张。因此，血管生成抑制与传统肿瘤治疗相结合，应当成为一种优化的肿瘤治疗方法。手术切除肿瘤或放疗经常会引起血管生成和静息转移肿瘤的生长。其原因可能是其它肿瘤结节对其生长的抑制作用。对肿瘤高风险或复发病人，预防性给予抗血管生成治疗是有益的，因抑制剂毒性小，也不易引起药物耐受。Teicher甚至提出，合并抗血管生成治疗和化疗，将达到最佳效果，因对肿瘤和肿瘤血管内皮细胞两种组织均有摧毁作用(Teicher BA.Cancer Metastasis Rev 1996；15247-72)。
虽然抗血管生成治疗肿瘤被赋予了极大的希望，但已进行的有关临床实验却未取得预期的效果，其具体原因尚不十分清楚。但一个值得关注的问题是在临床实验中，瘤体内是否已达到有效药物浓度，该浓度能否长时间维持。
基因治疗药物，可以实现目的蛋白在人体内的长期稳定的表达，为解决上述问题提供了思路。基因治疗药物对肿瘤的治疗呈现出巨大的希望。如在美国和英国，已有63个前列腺癌的基因治疗临床得以注册，早期临床疗效令人鼓舞。一种可以在人体或瘤体内产生足以抑制肿瘤生长，但又不干扰正常生理性血管生成的效果，作用时间足够长，副反应非常小的抗血管生成基因治疗药物，正是本发明所要实现的目标。
发明内容
本发明的一个目的是提供可以持续生成kallistatin和/或vasostatin的血管生成抑制药物。本发明所进行的实验证明，无论在体外还是在体内，本发明的血管生成抑制药物均可以高效表达kallistatin和/或vasostatin。
本发明的另一个目的是提供一种用于肿瘤治疗，预防肿瘤复发和转移的药物。本发明所进行的实验证明，荷瘤小鼠在应用本发明的血管生成抑制药物后，可以显著地抑制肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的增殖和肿瘤生长。
本发明的再一个目的是提供一种用于提高肿瘤化疗和放疗疗效的血管生成抑制药物。血管生成抑制药物和化疗与放疗方法，分别作用于肿瘤组织和肿瘤血管的内皮细胞，双管齐下，有利于达到最佳疗效。
本发明还提供一种突变的kallistatin，本发明所进行的实验证明，该突变型kallistatin同样具备抑制肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的增殖和肿瘤生长的作用。
图1(A)从人肝cDNA扩增的Kallistatin核苷酸序列(nt1132-1158)与Genebank报道的核苷酸序列(L19684)的比较。两序列中核苷酸和密码子的不同之处用下划线标注。
(B)rAAV-kallistatin和rAAV-vasostatin的示意图。
图2.(A)感染rAAV-eGFP后HEK 293的荧光显微照片。
(B)Kallistatin和vasostatin在小鼠肝中的持续表达。未接种肿瘤的BALB/c小鼠经肝门静脉注射同样数量的rAAVs。RT-PCR显示在一个月，两个月和六个月时两种外源人基因在小鼠肝中的持续表达。18S rRNA为PCR内标。-ve和M分别表示无模板和长度为100对碱基的标准DNA。
图3.由rAAV介导的转基因在鼠肝中的专属表达。BALB/c小鼠经肝门静脉注射编码kallistatin(A)或vasostatin(B)的载体，转染6个月后处死，取心脏，肾，肝，肺，骨骼肌，小肠，脾和胃进行RT-PCR。3个小鼠的结果相似。-ve和M分别表示无模板和DNA标准。
图4.皮下接种HCC的小鼠注射不同的rAAVs后的代表病例。BALB/c小鼠皮下接种HCC7天后经肝门静脉注射rAAVs。对照组(A，B)肿瘤体积明显大于kallistatin治疗组(C，D)和vasostatin治疗组(E，F)。
图5.皮下接种HCC的小鼠注射不同的rAAVs后，肿瘤生长曲线的比较。在治疗过程中，kallistatin治疗组和vasostatin治疗组持续地延迟肿瘤生长，与对照组rAAV-EGFP比较，肿瘤明显减小。‘*’p＜0.05‘**’p＜0.01图6.肿瘤的CD34免疫组化染色。(A)肿瘤的微血管密度照片，放大倍数×200。(B)治疗组肿瘤的微血管密度明显低于对照组rAAV-EGFP。‘*’p＜0.05图7.肿瘤中Ki-67细胞的定量。(A)肿瘤中增殖细胞经抗Ki-67抗体免疫组化染色。放大倍数×200。(B)增殖指数为Ki-67阳性细胞与总细胞数的比值。经kallistatin治疗后，增殖细胞明显少于rAAV-eGFP和rAAV-vasostatin组，表明vasostatin抑制细胞增殖的作用较小。‘***’p＜0.00具体实施方式
(1)rAAV-kallistatin和rAAV-vasostatin的构建通过PCR获得kallistatin和vasostatin的cDNA，经DNA测序验证正确性。Kallistatin的序列除两个核苷酸外，与NCBI报道相同。其不同的两个核苷酸列第1145和1146位，结果导致突变，原苏氨酸变为丝氨酸(图1A)。因vasostatin为钙网蛋白的一个片段，在钙网蛋白的第180位密码子后，经3’引物引入终止密码子(TAG)，在翻译后就生成截短的钙网蛋白，即vasostatin。vasostatin的序列与NCBI报道的钙网蛋白54-594位核苷酸相同。
为获得构成性kallistatin和vasostatin高表达，将两种cDNAs分别插入AAV载体的ITRs之间，启动子为CMV增强子/鸡β-actin启动子。为加强表达，在插入基因后，还引入了WPRE元件。
(2)原位肝转导后转基因的长期表达在注射前，将包装好的rAAV载体通过HEK 293细胞计算转导效率(图2A)。为证明转基因的长期持续表达，给未接种肿瘤细胞的小鼠注射同样剂量的rAAV载体rAAV-kallistatin或rAAV-vasostatin。在1，2和6周后，取动物肝脏进行RT-PCR。由图2B可见外源基因kallistatin和vasostatin在鼠肝内的持续表达，且维持在同一水平。
在转导6月后，将分离的各种器官行RT-PCR，结果显示仅肝中有转基因的高表达，而其它器官几乎没有表达(图3)。将PCR再增加8个循环后，仅在脾，肺和小肠见微弱的信号，其它器官仍无信号。结果显示，在门静脉注射rAAV6个月后，鼠肝中可持续表达转基因。更重要的是rAAV基因组主要存在于肝中，而在其它器官几乎没有。
(3)对体内异位肿瘤的抑制作用为评价rAAV-kallistatin和rAAV-vasostatin是否能够在体内抑制血管生成，并抑制HCC肿瘤的生长，我们在HCC小鼠模型进行了预实验。每组至少有6只小鼠皮下接种3×106个BNL肿瘤细胞，当肿瘤直径达3mm时(BNL细胞接种大约4周)，经门静脉注射3×1011v.g rAAV。治疗组(rAAV-kallistatin或rAAV-vasostatin)与对照组(rAAV-eGFP)的肿瘤生长速率没有明显差异。其原因可能为(1)在注射AAV载体后，其基因表达一般要延迟2-3周；(2)肿瘤体积过大(在注射AAV载体4周后，肿瘤直径达2cm)。
为克服病毒转染与转基因在转染细胞表达的时滞，我们调整了实验时间安排，以建立持续的转基因表达。在接种BNL肿瘤细胞后7天，注射同样剂量的AAV载体。在注射AAV载体56天后，治疗组(rAAV-kallistatin和rAAV-vasostatin)小鼠取出肿瘤，而对照组(rAAV-eGFP)由于肿瘤过大，在注射AAV载体49天后就取出了肿瘤。
对所有小鼠均检测了肿瘤的形成，治疗组(rAAV-vasostatin)肿瘤的形成时间为29天，长于治疗组(rAAV-kallistatin)的22.5天，也长于对照组(rAAV-EGFP)的23.4天。
与对照组(rAAV-EGFP)相比，治疗组(rAAV-kallistatin和rAAV-vasostatin)的肿瘤生长速率明显减慢(图4和5)。
在注射rAAV后49天，对照组(rAAV-EGFP)肿瘤体积为1630.3±621.5mm3，治疗组(rAAV-kallistatin)肿瘤体积为392.4±137.0mm3，肿瘤生长速率减慢了76％(P＜0.01)。在注射rAAV后53天，对照组(rAAV-EGFP)肿瘤体积为3190.8±1284.1mm3，治疗组(rAAV-kallistatin)肿瘤体积为848.6±291.1mm3，肿瘤生长速率减慢了73％(P＜0.05)。
治疗组(rAAV-vasostatin)的结果与治疗组(rAAV-kallistatin)类似(图5)。在注射rAAV后49天，对照组(rAAV-EGFP)肿瘤体积为1630.3±621.5mm3，治疗组(rAAV-vasostatin)肿瘤体积为506.9±324.9mm3，肿瘤生长速率减慢了69％(P＜0.01)。在注射rAAV后53天，对照组(rAAV-EGFP)肿瘤体积为3190.8±1284.1mm3，治疗组(rAAV-vasostatin)肿瘤体积为1050.9±591.4mm3，肿瘤生长速率减慢了67％(P＜0.05)。
(4)通过CD34染色评价血管生成如前所示，kallistatin和vasostatin的表达可以显著减慢肿瘤生长速率，证明了该治疗的有效性。因所用的两种蛋白均是抗血管生成因子，为确定注射rAAV-kallistatin或rAAV-vasostatin的小鼠的肿瘤生长抑制是由于转基因产品的抗血管生成作用所致，我们通过内皮细胞抗原CD34染色法评价肿瘤血管系统(图6A)。
与对照组相比(235.58±66.69血管/hpf)，rAAV-kallistatin组的血管密度为235.58±66.69血管/hpf(P＜0.01)，rAAV-vasostatin组的血管密度为102.44±30.74血管/hpf(P＜0.05)，均有显著的降低。
(5)通过Ki-67染色评价细胞增殖肿瘤细胞生长的延迟，可以是细胞增殖减少的结果。为定量比较各组肿瘤的增殖指数，对肿瘤进行了Ki-67染色。Ki-67严格地由增殖细胞表达，通常被作为细胞增殖的标志。
与对照组相比，rAAV-kallistatin组明显减少了增殖细胞(Ki-67染色阳性)的比率(图7B)。基于10个随机视野的观察，细胞增殖指数由对照组的62.17±2.73％，下降为38.89±5.05％(P＜0.001)。
对于rAAV-vasostatin组，细胞增殖指数为55.90±3.71％，与对照组无统计学差异。
权利要求
1.一种基于kallistatin和vasostatin的血管生成抑制药物，其特征在于所述的血管生成抑制药物的有效成分，为经基因工程技术构建的，可表达kallistatin和/或vasostatin的重组腺病毒相关病毒，人或动物应用该药物后，可以在体内持续产生kallistatin和/或vasostatin蛋白。
2.如权利要求1所述的血管生成抑制药物，其剂型为注射剂，或注射用粉针，其组成除有效成分重组腺病毒相关病毒外，还含有药学上可以接受的辅料。
3.如权利要求1所述的血管生成抑制药物，其用药方法为静脉注射，或静脉滴注，或皮下注射，或肌肉注射，或瘤体注射。
4.如权利要求1所述的重组腺病毒相关病毒，其表达的kallistatin为人kallistatin，或大鼠kallistatin，或突变率＜10％的人或大鼠kallistatin。
5.如权利要求1所述的重组腺病毒相关病毒，可以靶向作用于肝或肺细胞瘤。
6.如权利要求4所述的突变人kallistatin，原第382位氨基酸由苏氨酸变为丝氨酸。
7.一种基于kallistatin和vasostatin的血管生成抑制药物，其特征在于所述的血管生成抑制药物的用途为肿瘤治疗，或预防肿瘤复发或转移。
8.如权利要求7所述的血管生成抑制药物的用途，为抑制肝细胞肝癌或肺细胞瘤的生长，复发或转移。
9.一种基于kallistatin和vasostatin的血管生成抑制药物，其特征在于其和肿瘤化疗或放疗合并应用时，通过抑制肿瘤血管生成，增强肿瘤治疗的疗效。
全文摘要
本发明涉及基于kallistatin和vasostatin的二种血管生成抑制药物，该药物为采用基因工程技术构建的可表达kallistatin和/或vasostatin的重组腺病毒相关病毒，该药物的用途为肿瘤治疗，或预防肿瘤复发或转移，以及增强肿瘤化疗或放疗疗效。
文档编号A61K38/16GK1836732SQ200510134979
公开日2006年9月27日 申请日期2005年12月31日 优先权日2005年12月31日
发明者许瑞安, 谢礼贤, 刁勇 申请人:刁勇, 许瑞安