专利名称：通过阻断和检测蛋白酶抑制剂改进癌症的治疗和癌症治疗效率的预测的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及提高恶性细胞(而不是非恶性细胞)对各种抗癌药物和抗癌治疗的敏感性的方法。特别地，本发明涉及在治疗癌症患者方面的改进以及在预测癌症治疗效率方面的改进。
背景技术：
凋亡细胞凋亡或程序性细胞死亡是一种细胞自杀机制，其能够使多细胞生物体维持组织的动态平衡并消除威胁动物生存的细胞。在多种疾病中观察到了凋亡的反常，例如发生了过多细胞死亡的神经退行性疾病和凋亡被抑制的癌症。
凋亡可以被多种刺激引发，其包括细胞表面死亡受体(Fas、TRAIL-R1/R2、TNF-R1等)的激活、抗癌药物、辐射、存活因子(survival factor)的缺失以及局部缺血。尽管由于各种刺激所诱导的起始信号通路可以非常不同，但是由它们中的大部分所诱导的信号级联反应最终都集中于通用的凋亡通路，该通路的特征为激活被称作天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的半胱氨酸蛋白酶系。凋亡可以被两种主要的caspase激活通路所诱导即“外部细胞死亡通路(extrinsic cell death pathway)”和“内在细胞死亡通路(intrinsic cell death pathway)”。这两种通路的刺激诱导启始子Caspase(initiator caspase)的激活，其接下来激活了效应子caspase(effector caspase)。一旦被激活，效应子caspase将分裂细胞中的一小部分蛋白质，这些分裂事件的累积作用导致了凋亡的大部分物理特征。
介导凋亡的信号通路受到决定细胞存活或者死亡的正负信号的严格调控。Bcl-2家族的抗凋亡成员在调控由多种不同刺激所诱导的凋亡中发挥了重要的作用，凋亡蛋白抑制剂(IAP)家族以及热休克蛋白(Hsp)家族的成员通过干扰凋亡机制的主要组分提供了负凋亡信号。尽管caspase被认为是凋亡中主要的执行者，但已经提出仍有其他的蛋白酶在细胞死亡中发挥重要的作用。一系列的证据暗示许多非caspase的蛋白类如组织蛋白酶、钙蛋白酶(calpain)和丝氨酸蛋白酶能够与caspase在凋亡信号通路中合作发挥作用。
纤溶酶原激活物抑制剂-1纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)属于抑丝酶(serpin)(丝氨酸蛋白酶抑制剂)超家族，其包括包含了另外两种PAI蛋白PAI-2和PAI-3的多种丝氨酸蛋白酶的抑制剂。PAI-1基因编码大约50kDa的糖基化蛋白质，其从细胞中分泌出来。PAI-1是纤溶酶原激活系统的主要抑制剂，其中纤溶酶原激活系统参与各种生理和病理过程中的蛋白质水解级联反应，其中所述生理和病理过程包括创伤修复、炎症、血管血栓溶解、肿瘤侵入以及血管生成。PAI-1抑制两种主要类型的纤溶酶原激活物组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)。两种激活物都能够催化无活性的酶原纤溶酶原转化为活性蛋白酶血纤维蛋白溶酶，其能够降解大部分细胞外蛋白质，这是一种与癌症扩散有关的机制。
作为纤溶酶原激活系统的抑制剂，人们会认为高水平的PAI-1能够抑制肿瘤的发展。然而肿瘤中高水平的PAI-1在许多肿瘤中与预后差有关，所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肾癌。对这种明显矛盾的一种解释是PAI-1具有前血管生成效应。然而，已经提出PAI-1的预后影响不仅仅是基于其参与血管生成。另一个解释是高水平的PAI-1通过抑制肿瘤细胞的凋亡而有利于肿瘤的生长。作为这种假设的支持，已经表明向培养的肿瘤细胞中加入重组的PAI-1会抑制凋亡(Kwaan等人，Br J Cancer.2000 May；82(10)1702-8)。而且，PAI-1的抑制凋亡的功能可以通过与中和PAI-1的抗体进行共孵育而得到阻断。
PAI-1还已经被提议作为对抗雌激素治疗的预测性标记物；与低肿瘤组织PAI-1含量的患者相比，具有乳腺转移癌和高肿瘤组织PAI-1含量的乳腺癌患者似乎对Tamoxifen治疗有更高的抵抗力(Foekens等人1995，J Natl CancerInst 87(10)751-756)。Harbeck的报告(Harbeck等人2002，Cancer Res 62，4617-4622)与这项观察矛盾，他们分析了肿瘤组织PAI-1含量与对原发性乳腺癌的辅助性化学疗法的效果之间的关系。他们得出结论具有较高肿瘤组织PAI-1含量的患者更有可能从辅助性化学疗法获益。
在过去的几年中，已经对PAI-1的多种功能进行了集中研究，但是对于PAI-1如何调控凋亡却知之甚少。
金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)TIMP-1是基质金属蛋白酶(MMP)的四种内源抑制剂的家族的成员之一。TIMP-1是25kDa的蛋白质，其与大部分MMP按照1∶1的化学剂量比进行结合。TIMP-1出现在许多组织和体液中并存储在血小板的α-颗粒中，其通过激活而被释放。尽管TIMP-1的主要功能被认为是抑制MMP，但是已经描述了TIMP-1的一些其他功能例如抑制凋亡、调节细胞生长和血管生成。另外，一些研究已经暗示TIMP-1也可能在引起恶性表型的早期过程中发挥作用。
我们已经描述对血浆TIMP-1的检测提供了检测早期结直肠癌中的高特异性和高灵敏性(Holten-Andersen等人)。另外，我们已经说明对术前或术后样品中血浆TIMP-1水平的检测提供了患有结直肠癌的患者中强不依赖和阶段不依赖的预后信息(Holten-Andersen等人，2000；Holten-Andersen等人，2005)。通过检测原发性乳腺癌中的TIMP-1蛋白，我们以及他人已经说明高肿瘤组织总TIMP-1水平与更短的患者存活率相关(Schrohl等人，2003，2004；Duffy等人)。
已经报道了TIMP-1在调控凋亡中的作用，并提出了其发生的两种可能途径。这两种都支持TIMP-1抑制凋亡的想法。
第一，在体外和体内，细胞外基质的蛋白质水解降解导致乳腺上皮细胞分化的丧失以及导致凋亡。这说明细胞外基质的完整性以及对细胞-基质的相互作用的保护是确保乳房上皮细胞存活的重要因素。通过抑制MMP，TIMP-1能够抑制细胞外基质的降解，这样可能抑制凋亡。通过将乳腺中过表达MMP-3的小鼠与转基因TIMP-1的小鼠进行杂交，Alexander及其合作者证明了TIMP-1抑制凋亡的作用，其观察到TIMP-1降低了由于MMP-3所诱导的乳腺上皮细胞的凋亡。微小的基膜分裂能够作为解释由于蛋白质水解活性所引起凋亡的原因，但也已经推测整合素(integrin)介导的信号传导发挥了部分作用。
第二，也已经证实了不依赖抑制MMP而出现的TIMP-1的抑制凋亡作用。在人乳房上皮细胞中，已经证明了内源性TIMP-1抑制由于细胞粘附的破坏所诱导的凋亡的能力。这说明TIMP-1能够将细胞从凋亡中拯救出来而不需要稳固细胞外基质和细胞-基质的相互作用。已经丧失全部MMP抑制作用的被还原和烷基化的TIMP-1仍然能够有效地抑制Burkitt’s淋巴瘤细胞系的凋亡的事实支持了抑制凋亡中不依赖MMP抑制。目前不知道这种抑制凋亡作用的机制，但是关于可能被TIMP-1调控的信号通路已经提出了不同的建议。人乳房上皮细胞中TIMP-1的过表达与粘着斑激酶(FAK)的更有效激活和固有活性相关，其中FAK是一种通常参与传导细胞存活信号的激酶。同时，Burkitt’s淋巴瘤细胞中TIMP-1蛋白质表达的上调提高了抗凋亡蛋白质Bcl-xL的表达。推测对细胞信号传导的调控是通过TIMP-1与细胞表面受体的相互作用而介导的，因为Burkitt’s淋巴瘤细胞中的抗凋亡作用会通过使用单克隆抗体中和所分泌的TIMP-1而被彻底破坏。这种观点由证明TIMP-1结合到恶性乳房上皮细胞表面的研究得到了进一步支持。
因此，TIMP-1似乎能够通过两种不同的机制抑制凋亡。通过抑制MMP，TIMP-1稳固了细胞外基质和细胞-基质的相互作用，这样抑制了由于细胞外基质的破坏而诱导的凋亡。然而，TIMP-1还通过不依赖其抑制细胞外基质的蛋白质水解降解的能力的机制来抑制凋亡。后者的机制可以通过TIMP-1与细胞表面的受体的相互作用来介导，其中所述受体调控参与凋亡的细胞内信号通路。
发明内容
已经熟知许多类目前所使用的抗癌药物以及放射治疗通过诱导程序性细胞死亡(即凋亡)而诱导目的肿瘤反应。最近几年中，变得明显的是自然出现的蛋白酶抑制剂的高肿瘤组织水平或者高血浆/血清水平与癌症患者的短存活期相关，例如患有恶性脑瘤、恶性黑素瘤、肉瘤、头颈部癌(head and neckcancer)、消化道癌(例如胃癌、胰脏癌、结肠癌和直肠癌)、类癌、肺癌、乳腺癌、妇科癌症(例如卵巢癌、宫颈癌和子宫癌)以及泌尿系癌症(例如前列腺癌、肾癌和膀胱癌)的患者。
肿瘤组织或血液中的高PAI-1水平和/或高TIMP-1水平与乳腺癌、结直肠癌以及在肺腺癌的预后差相关的事实暗示这些分子促进肿瘤的生长、侵入和/或转移或者提供对抗肿瘤治疗的抗性。正如上面所述的，PAI-1和TIMP-1通过多种机制可以发挥这样的促进作用，例如保护肿瘤组织免受uPA系统的降解；参与癌细胞的迁移；参与肿瘤的血管生成；干扰生长因子的激活或者失活或者抑制凋亡。似乎其他细胞外蛋白质水解酶以及其他非蛋白质水解性基质降解酶的一些抑制剂在促进肿瘤生长、入侵和/或转移方面发挥了相似的作用。
本发明的发明人发现高PAI-1水平通过对凋亡进行负调控有利于肿瘤的生长。因此，具有高含量PAI-1的肿瘤会对诱导凋亡的化学疗法药物较不敏感。另一方面，对PAI-1的抑制将使癌细胞对后续诱导凋亡的化学疗法药物变得敏感，而不影响不过表达PAI-1的正常细胞。
为了测试PAI-1具有调控凋亡的功能的假设，我们建立了从缺乏PAI-1基因的小鼠和野生型的小鼠建立了纤维肉瘤细胞系(原代培养肺成纤维细胞，其中在体外传3～4代(passage)后，成纤维细胞经历了自发的恶性转化)。利用集落形成试验，我们检测了所述细胞系对各种化学疗法药物(依托泊苷(etoposide)、长春新碱(vincristine)、阿霉素(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)和阿糖胞苷(ARA-C))的敏感，已知所有这些药物都诱导凋亡。对于使用这些药物的处理，PAI-1-/-纤维肉瘤细胞比野生型纤维肉瘤细胞要显著的敏感。我们还测试了集落形成能力的差别是否由于PAI-1-/-纤维肉瘤细胞中提高的药物细胞毒性。确实，对于使用依托泊苷的处理，PAI-1-/-纤维肉瘤细胞比PAI-1+/+纤维肉瘤细胞要更敏感。有趣的是，当通过利用TNFα处理的死亡信号通路诱导凋亡时，得到了相似的结果。而且，在新建立的一对PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞系中重复得到了这些结果。在最近的实验中，我们使用介导PAI-1表达的构建稳定转染了PAI-1-/-纤维肉瘤细胞，并显示这些细胞确实表达PAI-1蛋白。通过将这些细胞接受依托泊苷的处理，我们能够说明他们与只是用质粒转染的细胞相比具有对该药物提高的抗性。这些结果共同暗示PAI-1保护免受凋亡。然而，通过检测重量以及白细胞数目，我们也已经证明缺失PAI-1基因的小鼠与野生型小鼠对全身性依托泊苷治疗有同样的敏感，这样暗示了在癌细胞和正常细胞对由于PAI-1所引起的抑制凋亡之间存在敏感上的差异。这种敏感上的差别使PAI-1成为结合化学疗法药物的吸引人的目标，即使用PAI-1抑制剂进行的预处理将提高癌细胞的细胞毒性而对正常组织没有额外的毒性。
类似的，我们已经从TIMP-1+/+和TIMP-1-/-小鼠建立了三组纤维肉瘤细胞系，并显示缺失TIMP-1的纤维肉瘤细胞系对于诱导细胞凋亡的细胞毒性治疗(例如依托泊苷)更敏感。通过进行DNA-组蛋白分析，我们可以证明依托泊苷诱导凋亡。
我们最近得到了对我们假设的临床支持，因为我们已经显示患有转移性疾病以及具有高肿瘤水平的PAI-1和/或TIMP-1的乳腺癌症患者(n＝174)对化学疗法药物(CMF或CEF)有抗性。
通过对来自乳腺癌组织的石蜡块进行免疫组织化学，通过使用抗TIMP-1的单克隆抗体，我们已经表示，在大约20％的病例中，TIMP-1免疫反应性被限制在肿瘤细胞中，而在其他病例中，TIMP-1免疫反应性定位于肿瘤组织的基质细胞。关于PAI-1的相似的结论也已经被发表(Bianchi等人)。因此，似乎可行的是表现对化学疗法有抗性的高肿瘤组织TIMP-1或者PAI-1的病例是癌细胞中具有TIMP-1和/或PAI-1免疫活性的。这项发现的应用是对存档的石蜡块进行的TIMP-1和/或PAI-1免疫组织化学能够用于预测对化学疗法的抗性。
因此，本发明涉及一种抑制PAI-1、TIMP-1和/或其他蛋白酶抑制剂的抗凋亡功能的方法，这样使得癌细胞对诱导凋亡的抗癌治疗更敏感，例如对在已经被确定具有高肿瘤水平、高血液水平、高尿液水平或高唾液水平的PAI-1和/或TIMP-1和/或癌细胞中TIMP-1和/或PAI-1的免疫反应性的患者进行化学疗法、内分泌疗法或放射疗法，该方法包括抑制恶性肿瘤组织中或潜在恶性肿瘤组中蛋白酶或者非蛋白质水解性基质降解酶的抑制剂的抗凋亡功能，而不提高正常细胞对抗肿瘤治疗的敏感。后者需要在正常细胞和恶性细胞之间存在PAI-1和TIMP-1抑制的不同作用，因此PAI-1和/或TIMP-1全身性的抑制将只是使恶性细胞对后面的诱导凋亡的治疗变得敏感。
我们已经说明，缺失PAI-1或TIMP-1基因使纤维肉瘤细胞对由化学疗法药物和TNFα所诱导的凋亡变得敏感。而且，我们发现缺失PAI-1基因的小鼠和野生型小鼠表现出对全身性依托泊苷治疗相同的敏感，这样暗示癌细胞与正常细胞对由PAI-1所引起的凋亡抑制之间有不同的敏感。
这样，本发明所提出的方法依赖于惊人的发现，即可能优先抑制恶性肿瘤组织以及潜在恶性肿瘤组织中蛋白酶抑制剂的阻止凋亡的作用，而不影响正常的组织/细胞。根据本发明，预计(尽管并不受任何理论上的限制)在一些肿瘤/患者血液样品中所发现的高水平的蛋白酶抑制剂参与保护肿瘤细胞免受凋亡刺激的影响。这样，如果患者的肿瘤含有高水平蛋白酶抑制剂的话，接受通过诱导凋亡发挥作用的抗癌药物治疗的患者将不会通过治疗得到任何好处。
通过本发明的方法恶性肿瘤组织或者潜在恶性肿瘤组织中所述抑制剂的抑制作用被降低、抑制或者被中和，这样使恶性肿瘤细胞而不是正常细胞对诱导凋亡的药物变得敏感。
这样，本发明一方面涉及改进对患者抗癌治疗效果的方法，该方法包括提高患者的恶性细胞对所述抗癌治疗的敏感，而基本上不提高非恶性细胞对所述抗癌治疗的敏感。
例如获得了影响降低蛋白酶抑制剂(例如纤溶酶原激活物抑制剂-1或者组织型金属蛋白酶组织抑制剂-1)的效果，这样导致蛋白酶抑制剂抑制凋亡功能的消除，进而提高通过诱导凋亡的抗癌治疗所引起的肿瘤细胞死亡。本发明期望对蛋白酶抑制剂的全身抑制并不影响非恶性细胞对后续或者所伴随施加抗癌治疗的敏感性。
简言之，本发明涉及用于增强癌症治疗效率的方法，其中通过蛋白酶抑制剂干扰实现所述增强。
本发明还涉及选择和鉴定能够抑制蛋白酶抑制剂防止凋亡作用的化合物的方法，以及这些化合物在治疗癌症患者中的应用。
进一步，本发明还提供了用于鉴定抗癌治疗的方法，所述治疗的效果受到蛋白酶抑制剂存在的抑制，并且根据这一点，本发明提供了用于鉴定抗癌治疗的方法，所述治疗的效果并不受到蛋白酶抑制剂存在的抑制。
最后，本发明包括鉴定患者的方法，该患者对于传统癌症治疗没有反应，但将会成为蛋白酶抑制剂抑制治疗结合传统抗癌治疗的候选者。
图1表示野生型细胞与来自野生型小鼠和缺失PAI-1基因的小鼠中缺失PAI-1基因动物的细胞的肿瘤发生能力的图。
不考虑寄主的PAI-1基因型(p＝0.0001)，在这些肿瘤第74天尺寸达到40mm3(中部)时与第19天达到该体积的PAI-1+/+纤维肉瘤相比，形成自PAI-1-/-转化成的纤维细胞的肿瘤(纤维肉瘤)生长显著地得到延迟。
图2依托泊苷对PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞的细胞毒性作用。
使用依托泊苷对PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞处理48小时，通过所释放乳酸脱氢酶的活性(总活性的百分比％)来检测细胞毒性。数值代表3次独立实验的平均值±SD。
图3TNF-α对PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞的细胞毒性作用。
使用TNF-α对PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞处理24小时，通过所释放乳酸脱氢酶的活性(总活性的百分比％)来检测细胞毒性。数值代表3次独立实验的平均值±SD。
图4各种类型细胞毒性药物分别对野生型细胞和缺失PAI-1基因的细胞的形成集落的效果。
图5依托泊苷对PAI-1-/-和转染PAI-1的PAI-1-/-纤维肉瘤细胞的细胞毒性作用。使用依托泊苷对PAI-1-/-和转染的PAI-1-/-纤维肉瘤细胞处理48小时，通过所释放乳酸脱氢酶的活性(总活性的百分比％)来检测细胞毒性。数值代表3次独立实验的平均值±SD。
图6依托泊苷对TIMP-1-/-和TIMP-1+/+纤维肉瘤细胞的细胞毒性作用。
使用依托泊苷对TIMP-1-/-和TIMP-1+/+纤维肉瘤细胞处理48小时，通过所释放乳酸脱氢酶的活性(总活性的百分比)来检测细胞毒性。数值代表3次独立实验的平均值±SD。
图7TIMP-1在福尔马林固定的内含石蜡的乳腺癌组织中的免疫反应。A在所述肿瘤基质细胞中观察到TIMP-1的免疫反应。B在肿瘤细胞中观察到TIMP-1的免疫反应。
发明的详细描述下面将定义一些术语以限定本发明的范围。
术语“抑制”是指蛋白酶或者非蛋白水解性基质降解酶的抑制剂的抑制凋亡的活性被显著的降低，即降低至少25％的程度，但优选的是降低更高程度例如大约50％、60％、70％或者更高例如75％、80％、90％、95％或者100％。所讨论的各种化合物对抑制剂的抑制程度可以通过使用适当的抑制测试来确定。
本文中，术语“化合物”作为由两种或者更多元素所组成的物质，应该被理解为其最宽的范围，元素的原子被紧密联结在一起并以一定的比例出现，这样该术语包括传统的化学化合物以及如抗体。显然，为了筛选能够抑制蛋白酶或者非蛋白水解性基质降解酶的抑制剂的抑制凋亡的活性的化合物的目的，将在本领域技术人员能力范围内根据本发明说明书的教导而开发和利用测试。
“蛋白酶抑制剂”和“蛋白质酶抑制剂”(术语可以互换使用)是一种抑制一种或者多种蛋白酶的蛋白质水解活性的分子。这意味着蛋白酶抑制剂可以是特异性的，或者其表现出更普遍的蛋白酶抑制效果。为了本发明的目的，蛋白酶抑制剂还可以表示抑制非蛋白水解性基质降解酶的分子。
蛋白酶抑制剂的“阻断剂”是制止或者抑制蛋白酶抑制剂抗凋亡作用的分子。
“凋亡”是在标题为“发明背景”的部分中所限定的过程。
“优先提高”恶性细胞凋亡的意思是使恶性细胞对凋亡性细胞死亡比非恶性细胞更敏感，其具有如下效果已知的抗癌治疗方案通常会诱导X％的恶性细胞和Y％的相关正常细胞发生凋亡性细胞死亡，而现在是诱导(X+n)％的恶性细胞和Y％的相关正常细胞发生凋亡性细胞死亡，或者达到出现较温和的治疗方案，其诱导X％的恶性细胞和(Y-m)％的相关正常细胞发生凋亡性细胞死亡，其中n和m均为正数。说明这个的另一种方式是说明抗癌治疗方案的治疗指数得到了提高。
“抗癌治疗”是用于任何针对治疗或者减轻癌症的非外科手术治疗方案的术语。下面提供了抗癌治疗的例子，但是抗癌治疗可以为化学疗法和放射治疗，也可以为化学疗法或放射治疗。
“抑制细胞增殖治疗”是属于化学疗法的抗癌治疗，其包括干扰细胞分裂，即其是一种施加以某些方式与有丝分裂的过程相互作用进而杀死活跃分裂的细胞的药物的治疗方案。抑制细胞增殖治疗可以通过具有连接到能够或多或少结合恶性细胞组分的部分(例如抗体或者抗体片断)的细胞毒性物质而成为定向的。
“细胞毒性治疗”是属于化学疗法的抗癌治疗，其包括施加细胞毒性物质，即能够通过多种机制杀死细胞的物质。细胞毒性治疗可以通过具有连接到能够或多或少结合恶性细胞组分的部分(例如抗体或者抗体片断)的细胞毒性物质而成为定向的。
“内分泌治疗”是属于化学疗法的抗癌治疗，其包括施加激素或者合成或天然存在的激素模拟物，或者可以选择的是施加激素或激素受体的抑制剂或其类似物。同样内分泌治疗也可以成为定向的。
“放射治疗”是通过对恶性细胞进行离子射线来治疗癌症。除了传统的外部施加的射线，通过具有连接到定向部分的放射性核，放射治疗也可以成为定向的。
“免疫治疗”是依靠免疫机制的癌症治疗。一种可能性是施加结合到肿瘤中肿瘤特异性抗原的抗体(单克隆抗体、多克隆抗体或其片断)。这些抗体也可以能够引发次级免疫机制(NK细胞活性、激活补体等)。同样也可能是激活的树突细胞，其能够诱导细胞毒性T细胞介导的杀死肿瘤细胞。第三，可以通过对癌症抗原活跃地发生免疫反应，进而诱导针对恶性细胞的活跃免疫性(细胞的和体液的)。
本发明优选实施方式的描述优选的是本发明的治疗方法，其包括实现对患者中至少一种蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制活性的抗凋亡作用进行抑制，进而相对于非恶性细胞对所述抗癌治疗的敏感，提高恶性细胞对所述抗癌治疗的敏感。即本发明的方法预期优先提高恶性细胞对抗癌治疗的敏感，即不改变恶性细胞对抗癌治疗的敏感，不显著改变非恶性细胞对抗癌治疗的敏感。
通常，通过为患者施加体内蛋白酶抑制剂抗凋亡功能的阻断剂而达到抑制。所考虑的加以抑制/阻断的蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶的抑制剂、金属蛋白酶的抑制剂、半光氨酸蛋白酶(硫蛋白酶)的抑制剂、天门冬氨酸蛋白酶的抑制剂、任何其他蛋白降解酶的抑制剂、合浦安酶(Heperanase)的抑制剂或者任何其他参与降解细胞外基质的酶的抑制剂例如非蛋白水解性酶的抑制剂。优选的是，蛋白酶抑制剂选自由以下所组成的组PAI-1、PAI-2、PAI-3，蛋白酶Nexin-1、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、Stephin A、Stephin B和Cystatin C。
根据本发明所使用的阻断剂是适当地从由以下所组成的组中选择的多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片断、可溶性受体、低分子量分子、天然产品、肽、反义多聚核苷酸、核酶、反义寡聚核苷酸的模拟物例如反义LNA或者PNA分子。本领域已经表明单克隆抗体能够对肿瘤细胞的凋亡产生影响(Kwaan等人)。
根据本发明通常的实施方式，阻断剂在抗癌治疗的刺激前施加，但取决于抗癌治疗的特殊类型和阻断剂的药物动力学性能，阻断剂也可以在发作时或抗癌治疗期间内施加。
阻断剂可以以其纯的形式作为药物，或者作为药物组合物，可以通过本领域已知的通常和可以接受的任何方法施加他们，可以单独使用，也可以结合使用。如上面所述的，已经知道了一些这样的阻断剂，其可以以已经被管理部门接受的方式加以施用。
这些组合物可以被配制为口服(包括口腔或者经舌下)或者经肠胃外给药(包括经静脉给药(i.v.)、皮下给药(s.c.)、 肌肉给药(i.m.)、经腹腔给药(i.p.))。其他的给药途径包括脊柱硬脊膜间给药、经直肠给药、经鼻内给药或者经皮给药或者经肺部吸入。
含有这里所述阻断剂作为活性成分的药物组合物与药物上可以接受的载体、稀释剂、赋形药或者赋形剂混合。通常，这样的药物组合物具有从选自由下列所组成的组中的剂型经口服剂型、经口腔剂型、经舌下剂型、经肛门剂型、经注射用药物剂型例如经静脉剂型、经动脉剂型、经腹腔剂型、经皮下剂型、经皮内剂型或者经颅内剂型。特别优选的是提供连续释放阻断剂的制剂。
根据对阻断剂的特定选择，可以以本领域熟知的方法制备所述组合物。所述组合物优选固体或者液体制剂，在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第17版(Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985年)中整体上描述了制备他们的方法。固体形式特别适合口服给药，而溶液最可以用于注射或者灌输(i.v.、s.c.、i.m.或i.p.)或者经鼻内给药。
这些组合物会含有有效量的一种或者多种活性阻断剂以及适当的载体，以提供与所选择给药途径相适合的剂型。所述组合物含有至少一种阻断剂以及生理上可以接受的载体，其形式为赋形药、稀释剂、缓冲剂、涨度调节剂、防腐剂和稳定剂。构成载体的赋形剂必须要与药物活性成分相兼容，优选能够稳定阻断剂而不对所治疗的目标有害。
固体组合物可以以传统的形式出现例如药片、药丸、胶囊、栓剂、粉末或者肠衣肽。液体组合物可以是溶液、悬浮液、分散液、乳剂、酏剂以及连续释放的制剂等形式。局部用组合物可以是膏药或者糊状的形式。吸入药组合物可以被容纳在喷射释放系统中。
在本发明的优选实施方式中，设计了含有至少一种阻断剂的长效制剂，在需要进行抗癌治疗的长期治疗时(例如活跃免疫治疗或者其他几小时后抗癌作用不结束的的治疗方案)，这是非常有用的。在经皮注射或者沉积后，可以使用贮存或长效制剂的形式，以便将治疗有效量的制剂释放入血流中超过几个小时或者几天。适合连续释放药剂的药剂包括生物可降解聚合物并可以由适当的生物可降解聚合物组成例如L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、乙交酯、羟基乙酸及其任何异构体。相似的，载体或者稀释剂可以包括本领域已知的任何连续释放的材料，例如单硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯，其单独使用或者与蜡混合。
其他的长效制剂可以包括但不限于含有这里所公开的至少一种阻断剂与脂质体、微滴、乳剂或者胶囊以及液体稳定剂结合的制剂。
可以制备阻断剂的水制剂，用于通过注射或者灌输经肠胃外给药(i.v.、s.c.、i.m.或i.p.)。根据选择，可以作为游离酸或碱或者作为盐来利用该阻断剂。当然，所述盐必须是药物上可以接受的，并且这些将包括酸性阻断剂的碱盐和金属盐例如钾、钠或者镁盐。碱性阻断剂的盐将包括卤化物的盐以及无机酸和有机酸的盐例如氯化物、磷酸盐或者醋酸盐。通过本领域技术人员熟知的方法，可以很容易制备这些组合物的盐。
可以作为液体或半液体组合物提供所述阻断剂，用于经肠胃外给药(例如注射、灌输或者沉积缓释长效制剂)。可以将阻断剂悬浮或者溶解在含水载体中，例如在pH为大约3.0～大约8.0的被适当缓冲的溶液中，优选为大约3.5～大约7.4、3.5～6.0或者3.5～大约5.0的pH。可以使用的缓冲液包括柠檬酸钠/柠檬酸、磷酸钠/磷酸、醋酸钠/醋酸或者其组合。
这类水溶液可以表现为等渗压的，其通过使用缓冲试剂调节渗透压，通过含有生理食盐水、葡萄糖水、乙二醇，或者通过使用糖类如乳糖、葡萄糖或甘露醇等。
所述组合物可以含有其他的药物上可以接受的赋形剂例如防腐剂、稳定剂以及湿润剂和乳化剂，如在″Handbook of Pharmaceutical Excipients″第三版(Arthur H.Kibbe(Ed.)，Pharmaceutical Press，London，UK(2000))中所描述的。防腐剂可以包括甲苯酸钠、山梨酸钠、苯酚或者甲酚和对羟基苯甲酸酯(paraben)。稳定剂可以包括羧甲基纤维素、环糊精或者去污剂。
可以在使用之前立即从活性药物物质和无菌载体溶液制备该制剂。可以替换的是，该组合物可以被填充入封口的玻璃瓶中或者安瓿中，如果必要的话使用惰性气体进行清洁，在无菌的情况下并进行储存直到使用。这考虑到连续的多剂量的治疗并且需要最高水平的化合物稳定性。
可以制备阻断剂的油质制剂，用于通过注射(s.c.、i.m.或i.p.)或者局部经肠胃外给药。所述载体可以选自各种油类，包括石油来源、动物来源、植物来源或者合成来源，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。该组合物可以是溶液或者悬浮液的形式。可以使用去污剂和乳化剂制备阻断剂的溶液，使用粉末或者晶体盐可以制备悬浮液。可以使用防腐剂来稳定该组合物(例如丁基对羟基苯甲醚或者丁羟甲苯)。
对于通过肺部吸入的经鼻给药，，该制剂可以含有一种或者多种阻断剂，其溶解或者悬浮在液体载体中，特别是含水载体用于气雾剂应用。该载体可以含有辅助添加剂例如加溶剂(例如丙二醇)、表面活性剂(例如聚氧乙烯、高醇酯)以及吸收增强剂(例如卵磷脂或环式糊精)以及防腐剂(例如山梨酸、甲酚或者对羟基苯甲酸酯(paraben))。
用于局部应用和阻断剂发挥功能的局部给药(如果癌症治疗只提供局部凋亡作用的话是便利的)可以是糊状的形式，通过将活性化合物分散在药物上可接受的油(例如花生油、芝麻油、玉米油等)中而制得所述糊状。可以替换的是，可以将阻断剂结合到薄片上用于经皮给药。可以以用于离子电渗疗法应用的形式制备布片。
用于透过粘膜给药的栓剂可以是含有有效量阻断剂的球状形式，其通过将阻断剂与稀释剂(例如碳蜡(carbowax)、Carbuna蜡，等)以及润滑剂(例如硬脂酸镁或硬脂酸钙)混合而制备。
以药片、药丸、胶囊、粉末等形式的固体组合物优选用于口服给药。药片可以含有稳定用缓冲试剂(例如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙)、分解质(例如马铃薯或木薯淀粉以及复合硅酸盐)、结合试剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、甘露醇、蔗糖、凝胶、琼脂、果胶以及阿拉伯树胶)、润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸或者月桂基硫酸钠)以及其他填充剂(例如纤维素或者聚乙二醇)。除了稀释剂(例如水、乙醇、丙二醇和甘油)外，用于口服给药的液体制剂可以与多种甜味剂、调味剂、着色剂结合。
用于达到期望的治疗效果的本发明组合物和阻断剂的剂量依赖于阻断剂的能力、所使用的特定组合物以及所选择给药的途径。通常以每日每患者大约0.001～10g的范围进行阻断剂给药，优选的是每日每患者大约1～大约1000mg，更优选的是每日每患者大约10～大约100mg，每日每患者大约50mg。需要提高某些途径(例如口服以及其他非经肠胃外的给药途径)的剂量以解决任何降低的生物利用度，例如大约5～100倍。
最适合的给药剂量方法最好是由每个患者个人的医疗从业者来确定。阻断剂和药物组合物的最佳给药剂量方案依赖于一些因素，例如所需要治疗的特定癌症、所期望的效果和年龄、重量或者体重指数以及患者的整体身体状态。可以以单次单元剂量的形式或者以长时间多次剂量的形式作为连续治疗来进行给药。可以选择的是，根据情况而定可以采用连续灌输系统或者缓释长效制剂。两种或者多种阻断剂或者药物组合物可以同时或者以任何顺序共同给药。另外，阻断剂可以为预防目的与相似的方式给药。最佳的给药方案将最终由每个患者个人的主治医师决定。
优选的，通过本发明方法加强的抗癌治疗包括使患者处于通过凋亡诱导细胞死亡的条件。因此，根据本发明，恶性细胞在敏感方面的提高是被进行抗癌治疗的恶性细胞优先提高凋亡的结果。
这提供了一种可能的优选实施方式，其中抗癌治疗补充了使用抗癌药物对患者进行治疗，其效率并不依赖于肿瘤组织中蛋白酶抑制剂的表达。因此，本发明提供了可能选择利用这些药物(其不会有癌症细胞能够转化为对凋亡不敏感的形式进而摆脱药物作用的缺陷)的最佳癌症治疗，而同时使现有的治疗更加合理和有效(因为相关的现有治疗能够与本发明的发现结合以通过阻断蛋白酶抑制剂保持依赖凋亡药物的效率)。
对效率不受肿瘤组织中蛋白酶抑制存在与否影响的抗癌药物的鉴定，能够通过下面所描述的用于鉴定相似抗癌(以及实施例9中所提供的)的方法完成，因为用于鉴定抗癌治疗的方法更通常地提供了用于鉴定任何治疗癌症的方法，包括药物。
因此，鉴定抗癌药物是在本发明范围内，其效率不依赖于抑制凋亡的蛋白酶的抑制剂出现与否，其通过1)提供第一批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-；2)提供第二批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是-/-；3)在存在和不存在阻断蛋白酶抑制剂防止凋亡的有效浓度试剂的情况下，将所述第一和第二批细胞样品使用假定或者已知的抗癌药物进行抗癌处理；4)确定所述样品中所诱导凋亡的程度；以及5)鉴定假定或者已知的抗癌药物是一种其效率不受肿瘤组织中蛋白酶抑制存在与否影响的抗癌药物如果1)在存在所述试剂时，来自第一批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著的更高，并且2)在存在所述试剂时，来自第二批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著的更高。下面提供了关于对方法的这种选择的更详细的描述。
抗癌治疗通常选自由下列所组成的组放射治疗、内分泌治疗以及细胞毒性或者抑制细胞生长的化学疗法、免疫治疗、使用生物响应修饰剂的治疗、使用蛋白激酶抑制剂的治疗或者其结合。也就是，任何这些不同的治疗模式能够与本发明的使用阻断剂增强效率的作用共同使用。
根据本发明，所有这些可能类型的癌症治疗可以以他们已经被医疗从业者实践所接受的形式进行应用。
在优选的实施方式中，细胞毒性或者抑制细胞生长的化学疗法使用选自由下列所组成的组的物质进行治疗使用烷基化试剂、I型拓扑异构酶抑制剂和II型拓扑异构酶、抗代谢物、微管蛋白抑制剂、铂系金属(patinoid)以及紫杉醇(taxane)。
在另一个优选实施方式中，使用抗雌激素、芳香酶抑制剂、促性腺激素抑制剂、抗雄激素、抗孕酮或其组合进行内分泌治疗。
有利的是针对具有与蛋白酶抑制剂高表达水平相关的差预后的恶性目标。因此，有利的是针对选自由下列所组成的组的目标肿瘤恶性脑瘤、恶性黑素瘤、肉瘤、头颈部癌、消化道癌(例如胃癌、胰脏癌、结肠癌和直肠癌)、类癌、肺癌、乳腺癌、妇科癌症(例如卵巢癌、宫颈癌和子宫癌)以及泌尿系癌症(例如前列腺癌、肾癌和膀胱癌)。
基于形成上面所述治疗方面基础的相同的发现，本发明的另一部分是预测是否癌症患者将通过抗癌治疗受益的方法，其中所述抗癌治疗的效率依赖肿瘤组织蛋白酶抑制剂的表达。该方法包括确定来自患者肿瘤组织中的细胞表达一些预先选定的蛋白酶抑制剂中的任何一种，如果任何一种蛋白酶抑制剂表达超过相应的极限值，则确定患者不会通过抗癌治疗受益，如果没有任何所选定的蛋白酶抑制剂表达超过他们相应的极限值，则确定患者会通过抗癌治疗受益。
本发明的另一个方面是基于组织部分或者肿瘤活组织样品等预测癌症患者是否通过抗癌治疗受益，其中所述抗癌治疗的效率依赖肿瘤组织中蛋白酶抑制剂的表达。这可以通过确定肿瘤组织中的肿瘤细胞是否表现提高的蛋白酶抑制剂的表达(如通过确定免疫反应性所确定的)来进行，即抑制剂如PAI-1或TIMP-1。如上面所提到的，我们已经通过利用抗TIMP-1的单克隆抗体对来自乳腺癌的石蜡块进行了免疫组织化学，并表示在大约20％的病例中，TIMP-1免疫反应性被限制在肿瘤细胞中，而在其它的病例中TIMP-1免疫反应性定位于肿瘤组织中的基质细胞。我们已经得出结论这些对化学疗法表现出抗性的高肿瘤组织TIMP-1或PAI-1病例是那些在肿瘤细胞中具有TIMP-1和/或PAI-1免疫反应性的(而不是仅仅在基质细胞中表现免疫反应性)。
这项发现暗示即使对材料诸如存档的来自相应患者的石蜡块(或其它保存的样品)进行TIMP-1和/或PAI-1免疫组织化学分析(或者下面的提供相似信息的分析)，也能够用于预测对化学疗法的抗性，例如，在转移性或者残余性(residual)疾病(在这些疾病中，能够表示来自患者的最初检测过的肿瘤组织表达蛋白酶抑制剂)的病例中，这将与避免完全化学疗法或者优选地将化学疗法与这里所教导的给药蛋白酶抑制剂的阻断剂相结合有关。因此，本发明不仅考虑到基于通过取样提供的材料进行患者评价，也能够基于存档的材料例如多年前的石蜡部分进行患者评价。然而，对于本领域技术人员清楚的是，本发明并不以任何方式限于使用这些存档的材料，而且可以对新鲜的组织样品和活组织样品等进行免疫组织化学和类似的方法。
需要说明的是，代替通过例如免疫组织化学来确定免疫反应，也可以确定编码抑制剂的基因的扩增诸如原位荧光杂交(FISH)和原位发光杂交(CISH)的方法是检测这些基因扩增的是示范性方法。在Tanner等人，Am JPathol.2000 Nov；157(5)1467-72中详细描述了使用免疫组织化学、FISH和CISH在对肿瘤组织的分析中的实际应用，其中通过全部的三种方法检测了HER-2/neu肿瘤基因的扩增。
用于根据上面提到的实施方式的石蜡块的免疫组织化学的抗体(例如单克隆抗体)必须必要地能够识别相应的蛋白酶抑制剂上所出现的抗原(在抗原是变性的形式时)。因此，优选与相应蛋白酶抑制剂上的线性抗原结合的抗体。
预先选择的蛋白酶抑制剂列表包括从下列中所选择的成员丝氨酸蛋白酶的抑制剂、金属蛋白酶的抑制剂(如TIMP-1或TIMP-2)、半光氨酸蛋白酶(硫蛋白酶)的抑制剂、天门冬氨酸蛋白酶的抑制剂、是一种任何其他蛋白降解酶的抑制剂、合浦安酶(Heperanase)的抑制剂和任何其他参与降解细胞外基质的酶的抑制剂(例如非蛋白水解性酶的抑制剂)，优选的是，蛋白酶抑制剂选自由以下所组成的组PAI-1、PAI-2、PAI-3，蛋白酶Nexin-1、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、Stephin A、Stephin B和Cystatin C。
本发明的预测方法优选包括确定是否来自患者肿瘤组织的细胞表达任何一种预选的蛋白酶抑制剂，其通过对选自由下列所组成的组的样品检测而进行肿瘤组织样品、血液样品、血浆样品、血清样品、尿样、粪便样品、唾液样品以及来自胸腔或腹腔的水状液体样品。检测方法通常通过DNA水平检测(包括原位杂交)、mRNA水平检测(例如原位杂交、Northern印迹、QRT-PCR和差异显示)以及蛋白质水平检测(例如Western印迹、免疫组织化学、ELISA和RIA)进行。
根据本发明对治疗方法的讨论，预测方法需要抗癌治疗(其效率被预测)通过凋亡诱导细胞死亡。进一步，如果认为癌症治疗不适用或者以其他方式不能得到承认的，作为预测方法能够确定患者将通过治疗或者其它药物(如果任何一种蛋白酶抑制剂表达超过了其极限值，其能够被发现不依赖蛋白酶抑制剂表达水平)受益。
本发明的预测方法可以方便地与抗癌治疗结合以提供改进的癌症治疗方案。这样，本发明还设计了一种用于对癌症患者进行抗癌治疗的方法，该方法包括根据本发明的预测方法预测是否癌症患者将通过所选择的抗癌治疗受益，其中所述抗癌治疗的效率取决于肿瘤组织的蛋白酶抑制剂的表达，接着a)如果该预测提供正应答，则对患者进行该抗癌治疗，或者b)如果该预测提供负应答，则对患者进行根据本发明的改进的抗癌治疗。
在本文中，正应答是基于统计学的指示，其所预选的蛋白酶抑制剂的每个表达水平低于分离值(极限值)，这指示所述的蛋白酶抑制剂的最低表达水平，该最低表达水平将对抗癌治疗的治疗效率没有负面影响。
因此，负应答是通过至少一种预选蛋白酶抑制剂的表达水平超过所述分离值来定义的。
为了确定给定蛋白酶抑制剂的极限水平以便确定个体患者对抗癌治疗的抗性/灵敏度，可以进行回顾/前瞻临床试验。
回顾性地，从经历了癌症的重复出现的患者获得存储的肿瘤组织或者血液或者尿，或者唾液或者其他体液，并且已经知道这些患者对特定的抗癌治疗如何反应。对于肿瘤组织的情况，将组织进行匀浆并检测每个个体患者样品中蛋白酶抑制剂的水平。可以替换的是，对内含组织的固定石蜡可以进行免疫组织化学。对于体液的情况，可以将样品进行稀释并且接着通过这里所描述的方法之一来确定蛋白酶抑制剂的浓度。
个体患者中蛋白酶抑制剂的含量随后与对该患者的抗癌治疗的目标反应相关。使用逻辑回归分析(Logistic Regression Analysis)和/或接收者工作特性(Receiver Operating Characteristics)(ROC)曲线，可以为研究人群计算通过任何蛋白酶抑制剂含量所得到的灵敏度和特异性。
相似的，可以进行同样的研究，其中在预先收集的样品中确定蛋白酶抑制剂的含量，接着在蛋白酶抑制剂含量和个体患者的目标反应之间建立相关性。使用逻辑回归分析或ROC曲线，可以为研究人群计算通过任何蛋白酶抑制剂含量所得到的灵敏度和特异性。
可以替换的是，本发明设计监控经历现有抗癌治疗的患者，其中通过重复进行本发明的预测方法来进行所述监控，以便确定是否患者将通过现有的抗癌治疗继续受益，并a)如果监控中的该预测提供正应答，则对患者继续进行该抗癌治疗，或者b)如果监控中的该预测提供负应答，则对患者转换为通过根据本发明的改进的抗癌治疗进行另一种抗癌治疗。
与本发明的方法结合使用的抗癌治疗，有利地选自新辅助治疗、辅助治疗以及对转移性疾病的治疗。
本发明还包括用于鉴定可以用于本发明实施的试剂的设备和方法。
本发明涉及一种(依赖细胞的)用于鉴定阻断蛋白酶抑制剂的抗凋亡作用的试剂的方法，该方法包括-提供第一批恶性衍生细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-(意味着蛋白酶抑制剂具有一定的表达水平)，或者其中从外部来源提供蛋白酶抑制剂；-提供第二批恶性衍生细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是-/-；-在存在或者不存在所限定浓度的候选试剂时，将所述第一和第二批细胞的样品进行基本相同的诱导凋亡条件的处理；-确定所述样品中所诱导凋亡的程度；以及如果1)在存在候选试剂时，来自第一批细胞的样品中所诱导的凋亡程度显著地更高，并且2)在存在候选试剂时，来自第二批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著地更高，则鉴定了候选试剂为阻断蛋白酶抑制剂的抗凋亡作用的试剂。
还可以在体内进行实验。实验动物必须不排斥所移植细胞(对于蛋白酶抑制剂为+/+、+/-或-/-的细胞)，因为细胞与该动物属于相同的MHC类别，或者因为动物能够接受异种移植(例如裸鼠的情况)。另外，可以使用对于蛋白酶抑制剂为+/+、+/-或-/-的小鼠。本领域的技术人员将知道在面对实施本发明的方法以及从特定的细胞类型进行实施的任务时，选择何种动物模型进行移植。终点将是细胞死亡，其通过例如在利用所采用的药物进行治疗和全身毒性后的肿瘤体积来确定。
在某些情况中，还可以采用无细胞(不依赖细胞的)系统用于这样的鉴定如果已知蛋白酶抑制对蛋白酶的特定效果，并且其底物与蛋白酶抑制剂的抑制凋亡作用有关，简单的分析将包括将所确定含量的候选试剂加入到包括蛋白酶抑制剂、蛋白酶及其底物的体系中，其与底物的转化速率的检测相结合。在存在所确定含量时转化速率的提高暗示候选试剂是蛋白酶抑制剂活性的假定阻断剂。
有利的是，在可能的设备中对不同的所确定的候选试剂进行测试，其根据情况可以为平行的，这样允许确定通过该方法所鉴定的阻断剂的最佳含量。在依赖细胞的方法和不依赖细胞的方法中，优选补充确认步骤，其通过后续将-/-(对于相应的蛋白酶抑制剂)回复为+/+细胞并确定所回复的细胞对凋亡的敏感能够被候选试剂显著地提供高。
在依赖细胞的体系中，优选的是，在不存在候选试剂时将第一批细胞和第二批细胞都置于诱导凋亡的情况下，第一批细胞对于诱导凋亡的情况不如第二批敏感。可以将第一和第二批细胞的样品生长在实验动物中以及培养中，重要的事情是实验设置的再现性。实验动物用作细胞样品的寄主的模型具有优点即获得了副作用/毒性的直接反应，然而当使用细胞培养体系时，这需要单独的实验设备。以任何速率，优选还要确定实验动物中副作用的程度。
可以替换的是利用-/-细胞作为对照，在鉴定阻断蛋白酶抑制剂的抗凋亡作用的试剂时可以利用相对简单的动物模型。该方法包括-提供第一批衍生自肿瘤的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-，或者其中从外部来源提供蛋白酶抑制剂；
-将第一批细胞移植入实验动物中并使其生长；-在存在或者不存在所限定浓度的候选试剂时，将动物进行诱导凋亡的条件的处理；-确定所述动物中肿瘤发育和/或进展的程度；-确定动物中与凋亡相关的副作用的程度；以及如果1)在存在所候选试剂时，肿瘤发育的程度显著地更低，并且2)在存在候选试剂时，与凋亡相关的副作用的程度不是显著地更高，则鉴定了候选试剂为阻断蛋白酶抑制剂的抗凋亡作用的试剂。
当然，这种设置与上述的系统相似，其中实验动物用作+/+、+/-和-/-细胞的寄主，但在这种情况中，对动物的非恶性细胞的作用被用作假定阻断剂效率的指示剂。
本发明还能够确定特定的抗癌治疗或者抗癌药物事实上是否依赖在所要治疗的肿瘤中抑制凋亡的蛋白酶抑制剂的存在与否。该方法包括-提供第一批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-；-提供第二批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是-/-；-在存在或者不存在阻断蛋白酶抑制剂防止凋亡作用的有效浓度的试剂(例如通过本发明的方法鉴定的试剂)时，将所述第一和第二批细胞的样品进行基本相同的抗癌处理(即所要评估的抗癌治疗)或者药物处理；-确定所述样品中所诱导凋亡的程度；以及如果1)在存在所述试剂时，在来自第一批细胞的样品中所诱导的凋亡程度显著地更高，并且2)在存在候选试剂时，在来自第二批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著地更高，则鉴定了该抗癌治疗或者药物的效率依赖是否出现抑制凋亡的蛋白酶抑制剂。
在更简单(但不严格)的没有负对照的版本中，该方法包括-提供第一批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-；-在存在或者不存在阻断蛋白酶抑制剂防止凋亡作用的有效浓度的试剂(例如通过本发明的方法鉴定的试剂)时，将所述第一批细胞的样品进行基本相同的抗癌处理(即所要评估的抗癌治疗)或者药物处理；-确定所述样品中所诱导凋亡的程度；以及如果1)在存在所述试剂时，在来自第一批细胞的样品中所诱导的凋亡程度显著地更高，则鉴定了该抗癌治疗或者药物的效率依赖是否出现抑制凋亡的蛋白酶抑制剂。
当然所有这些实验设置都能用于鉴定抗癌治疗或者药物，其效率不依赖是否出现抑制凋亡的蛋白酶抑制剂，该方法包括相同的起始步骤，但如果1)在存在所述试剂时，在来自第一批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著地更高，则其鉴定了其效率不依赖是否出现抑制凋亡的蛋白酶抑制剂的抗癌治疗或者药物。当然，如果实验也利用-/-细胞，则在出现试剂时，来自第二批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不应当显著地更高。
在实施例9中提供了这类筛选药物和治疗的实施例。
通过下面的非限制性实施例对本发明进一步进行说明，本领域技术人员将理解如何将本发明的示范性实施方式扩展到一般性的发明概念。
实施例1从缺失基因的动物建立和确定细胞系根据本发明，为了研究特定基因产物对癌症的抗肿瘤治疗的敏感的重要性，从野生型和缺失基因的动物建立了细胞系。接着可以将这些细胞系用于筛选系统，以研究各种抗肿瘤治疗与细胞死亡之间的联系，以及鉴定蛋白酶抑制剂的抗凋亡功能的阻断剂。
本实施例描述了从缺失PAI-1基因的小鼠建立和鉴定永生纤维肉瘤细胞系的方法。
小鼠将小鼠分别进行12小时昼/夜循环，并使用普通饲料进行喂养。前人已经描述了PAI-1-/-小鼠的产生(Carmeliet P等人，Dec 1993，J Clin Invest 92(6)2746-55)。将PAI-1基因定位的小鼠与METATM/Bom-nu(＝METATM/Bomnu/nu)(Brünner N等人，1993，Breast Cancer Res Treat 24，257-64)无胸腺小鼠进行杂交，并回交6～8代。用于实验的小鼠是几对同属的，其代表通过杂合育种获得的纯合的基因缺失型和纯合的野生型小鼠。在所有包括野生型小鼠作为对照的试验中，这些与缺失PAI-1基因的小鼠是同窝出生的，因此，每次独立的实验只包括来自相同回交代的小鼠。所有的实验评估(包括检测肿瘤大小和从血液取样)都是由不知道动物基因型的研究人员进行的。所有的试验都根据由Danish Animal Care Committee出版的指南进行。
原代培养将10～13星期的老雄性Meta nu/nu小鼠的肺切离并置于带有10ml培养基(含有30％FCS、P/S和0.15％NaHCO3的M199)的Petri盘中。将肺机械地切成多个小片(大约0.5～1mm2)，接着3-6片置于六孔板(Nunc，Tissue cultureQuality)的一个孔的一滴培养基(来自切割)中，接着置于CO2恒温箱中37℃下20分钟，以使细胞附着到孔的底部。20分钟后，加入1ml培养基将组织完全覆盖。再过30分钟后，再加入另外ml的培养基。
每三天更换培养基一次。按照规律的间隔对孔进行观察。三星期后，将他们换到不含有青霉素和链霉素的培养基中。4～5周后，收获长满成纤维细胞的孔，并收集细胞。对细胞系进行传代和扩大。对细胞进行检测支原体污染以及基因分型以确认其来源。通过使用RT-PCR和Western印迹，分别检测细胞的PAI-1mRNA的表达以及蛋白质的生成。现在，细胞可以在不同的代进行应用。
对小鼠和原代培养进行PAI-1的基因分型在所采用缺失PAI-1的小鼠的被破坏的等位基因中(Carmeliet等人1993，J Clin Invest 92(6)2746-55和Carmeliet等人1993，3 Clin Invest 92(6)2756-60)中，来自pPNT的XhoI-BamHI新霉素盒(Xho-BamHI neomycincassette)(Tybulewicz VL等人，Jun 1991，Cell 65(7)1153-63)代替PAI-1基因的XhoI-HindIII片段。XhoI(911)位于PAI-1基因的启动子区域(AccM33961)。pPNT新霉素盒的5′XhoI末端由507bp的小鼠磷酸激酶-1(PGK)启动子(Acc.M18735)的EcoRI(417)-TaqI(924)片段组成，其中其EcoRI位点平末端连接到pIBI30(ACC.L08878)的多聚连接子的HincII-XhoI区域的HincII。XhoI(911)位点的上游MPAIl.1p(TTC ATG CCC TCT GGT CGC TG，SEQ IDNO1)和下游mpail.2M(CTC CCT CCC TCC CAG TGA CTT G，SEQ ID NO2)扩增349bp的片段，其对于内源性等位基因是特异性的，而新霉素盒PGK启动子的5’末端的mPAIl.1p和mPGK2m(GCC TTG GGA AAA GCG CCT C，SEQ ID NO3)扩增219bp的片段，其对于所被破坏的等位基因是特异性的。
检测肿瘤的发生将0.2ml体积的等渗NaCl中的2×106个细胞(第34代PAI-1-/-和第28代PAI-1+/+)皮下接种到野生型或者缺失PAI-1基因的雌性小鼠的侧腹部。
将PAI-1-/-细胞接种到PAI-1+/+小鼠(n＝27)或者接种到PAI-1-/-小鼠(n＝20)，将PAI-1+/+细胞接种到PAI-1+/+小鼠(n＝10)或者接种到PAI-1-/-小鼠(n＝10)。对小鼠进行规律地观察并记录肿瘤的发生和肿瘤的生长。将所得到的肿瘤进行处理用于直接的组织学分析(HE染色)。
检测在软琼脂上的成斑率将细胞悬浮在3.5ml体积的培养基中，并向其加入琼脂和培养基的混合物(琼脂将990mg Bacto琼脂和30ml PBS煮60分钟；培养基将M199和FCS 10％加热到37℃；混合物将10ml琼脂和90ml培养基混合并在水浴中加热到37℃)。使用1ml注射器重复小心的抽吸以获得单细胞悬浮液。
接着将1ml涂布三份在SRBC滋养层(如下)上的Petri盘上。
当琼脂凝固时，在顶部加入1ml培养基。将18～24个盘置于塑料碟上，每个碟上放置两个含水的Petri盘置进行处理。使细胞在CO2恒温箱(CO27.5％)中37℃和100％的湿度下生长。三个星期后对集落(colony)(＞64个细胞)进行计数。
用1ml注射器抽吸细胞以获得单细胞悬浮液，并与0.1％的Nigrosin混合(1∶1)。8分钟后对存活的细胞进行计数。
制备培养基将M199补充10％的FCS、25mM Hepes缓冲液、1.9mM的L-谷氨酰胺、10ml 7.5％的NaHCO3、50U/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素。
制备SRBC(Sheep Red Blood Cell羊血红细胞)琼脂平板琼脂将1200mg琼脂和100ml无菌水煮1个小时，接着置于37℃水浴中5分钟。
SRBC对羊血在5500rpm进行离心，并去除上清，接着在等渗的生理盐水中将血红细胞清洗两次。
完整的滋养层将琼脂、SRBC、培养基和补充物进行混合(溶液中达到了下面的最终浓度)不含L-谷氨酰胺的Earle′s MEM(×0.55)、Earle′s MEM氨基酸(×0.547)、Earle′s MEM维生素(×0.55)、L-谷氨酰胺(1.1mM)、青霉素(27.4U/ml)、链霉素(27.4U/ml)、葡萄糖(0.03％)、碳酸氢钠(0.06％)、2-巯基乙醇(3μl/l)、琼脂(0.5％)和SRBC(0.03ml/ml)。
接着将1ml这种混合物置于Petri盘中并在室温下凝固1个小时。在制备后，5℃下进行保存并在1星期内进行使用。
材料PBS(pH7.5)含有NaCl 8.0g/l；KCl 0.2g/l；Na2HPO4·2H2O 1.44g/l；KH2PO40.2g/l，将其在高压灭菌器中灭菌。
Bacto琼脂从Bie&Bemtsen(Redovre，Denmark)获得，Aisevers液体(1∶1)中的羊血是从国家血清研究所The State Serum Institute(Copenhagen，Denmark)获得。
所有的试剂均从Gibco(Taastrup，Denmark)获得。
结果原代培养3～4天后，细胞开始从原代外植体生长。在大约1～2代后(培养3～4个星期)，细胞经历了危险期(持续最高达到8个星期)，接着细胞成长为单层的大约1.5天倍增期。现在，这两种类型的细胞都已经传代了40代以上。
RT-PCR显示只在野生型细胞中表达PAI-1mRNA，Wester印迹确认了只有野生型细胞具有PAI-1蛋白。
体内的肿瘤生长野生型细胞和来自缺失PAI-1基因的动物的细胞均在野生小鼠和缺失PAI-1基因的小鼠中形成肿瘤。然而，来自缺失PAI-1基因的动物的细胞具有更长的滞后期。参见图1。
所有的肿瘤有纤维肉瘤的组织学特征，两种细胞系都在软琼脂上形成集落，但是PAI-1+/+具有比PAI-1-/-高10倍的成斑率。
讨论这项实施例表示在体外培养时，小鼠成纤维细胞经历了自发的恶性转化。所得到的被转化的细胞形成了小鼠内的肿瘤并形成了软琼脂上的集落，这都是他们恶性转化的强烈暗示。另外，所述细胞系似乎是永生的，因为他们能够传代许多代。这样，可以获得野生型和基因缺失的连续细胞系用于实验。
通过相当的实验程序，能够建立多对来自其他类型的基因缺失小鼠和野生型小鼠的细胞系。
实施例2使用集落形成检验进行测试纤维肉瘤细胞系的化学敏感性已经描述了许多蛋白酶抑制剂保护细胞免于凋亡。因为许多类型的抗肿瘤治疗通过诱导凋亡杀死细胞，因此可以预计缺失蛋白酶抑制剂表达的细胞系将对诱导凋亡的抗肿瘤治疗更敏感。
本实施例描述了野生型和缺失PAI-1基因的细胞系对多种细胞毒性药物的化学敏感的检测。
细胞系使用在实施例1中所描述的细胞系。细胞为第35代(野生型细胞)和第50代(缺失PAI-1基因的细胞)。
集落形成检验将药物(35μl)和细胞(0.35ml)进行混合，并向其加入3.15ml琼脂和培养基的混合物(琼脂将990mg Bacto琼脂和30ml PBS煮60分钟；培养基将M199和FCS 10％加热到37℃；混合物将10ml琼脂和90ml培养基混合并在水浴中加热到37℃)。使用1ml注射器重复小心的抽吸以获得单细胞悬浮液。
接着将1ml涂布在SRBC滋养层(参见关于其制备的独立的一段)上的Petri盘上。
当琼脂凝固时，在顶部加入1ml培养基。将18～24个盘置于塑料碟上，每个碟上放置两个含水的Petri盘置进行处理。使细胞在CO2恒温箱(CO27.5％)中37℃和100％的湿度下生长。三个星期后对集落(colony)(＞64个细胞)进行计数。
药物的制备
将进行实验的药物按照最终浓度的300倍溶解在培养基中。
细胞细胞用1ml注射器抽吸细胞以获得单细胞悬浮液，并与0.1％的Nigrosin混合(1∶1)。8分钟后对存活的细胞进行计数。
制备培养基将M199补充10％的FCS、25mM Hepes缓冲液、1.9mM的L-谷氨酰胺、50U/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素。
制备SRBC(Sheep Red Blood Cell羊血红细胞)琼脂平板琼脂将1200mg琼脂和100ml无菌水煮1个小时，接着置于37℃水浴中5分钟。
SRBC对羊血在5500rpm进行离心，并去除上清，接着在等渗的生理盐水中将血红细胞清洗两次。
完整的滋养层将琼脂、SRBC、培养基和补充物进行混合(溶液中达到了下面的最终浓度)不含L-谷氨酰胺的Earle′s MEM(×0.55)、Earle′s MEM氨基酸(×0.547)、Earle′s MEM维生素(×0.55)、L-谷氨酰胺(1.1mM)、青霉素(27.4U/ml)、链霉素(27.4U/ml)、葡萄糖(0.03％)、碳酸氢钠(0.06％)、2-巯基乙醇(3μl/l)、琼脂(0.5％)和SRBC(0.03ml/ml)。
接着将1ml这种混合物置于Petri盘中并在室温下凝固1个小时。在制备后，5℃下进行保存并在1星期内进行使用。
材料PBS(pH7.5)含有NaCl 8.0g/l；KCl 0.2g/l；Na2HPO4·2H2O 1.44g/l；KH2PO40.2g/l，将其在高压灭菌器中灭菌。
Bacto琼脂从Bie&Bemtsen(Redovre，Denmark)获得，Aisevers液体(1∶1)中的羊血是从国家血清研究所The State Serum Institute(Copenhagen，Denmark)获得。
所有的试剂均从Gibco(Taastrup，Denmark)获得。
结果图4中表示了各种类型的细胞毒性药物对野生型细胞和缺失PAI-1基因的细胞的集落形成的影响。能够看出，缺失PAI-1基因的细胞对于所有所采用的药物比野生型细胞更敏感。
讨论该实施例表示缺乏PAI-1表达的细胞对于诱导凋亡的试剂比表达PAI-1的细胞更敏感。
相当的实验设计能够用于检测其他对野生型和基因缺失的细胞对抗癌药物的敏感。
实施例3PAI-1基因的缺失对体内依托泊苷(etoposide)的毒性的作用(VP-16)当对癌症患者进行全身性给药细胞毒性的药物时，癌细胞和身体其他部位的正常细胞也都受到药物的毒性作用的影响。如果使细胞对药物的毒性作用变得敏感，则这样的致敏作用将潜在地影响癌细胞和正常细胞。
在这个实施例中，我们显示尽管在缺乏PAI-1表达的癌细胞中对细胞毒性药物的敏感得到了增强，但在研究正常细胞的毒性时则没有这种情况。
体内毒性实验通过比较PAI-1+/+和-/-小鼠之间在体重损失方面的灵敏，我们研究了完整小鼠(intact mouse)的灵敏。
进一步，在根据血液学评估期望的最低点(第3天(WBC))和第5天，对血液进行取样。在这项研究中所使用的实验用药物是依托泊苷(etoposide)。
小鼠METATM/Bom nu/nu；PAI-1+/+和PAI-1-/-。大小(克)24～30克的雌性和雄性。(参见实施例1进行进一步鉴定)。
在进行血液取样之前，使用0.15ml芬太尼(hypnorm)/多美康(dormicum)(2.5mg/ml；1.25mg/ml)对小鼠进行麻痹，因为已经发现在未麻痹的小鼠进行从尾部静脉取血样时，WBC会被提高。4只雄性和6只雌性PAI-1+/+小鼠以及8只雄性和6只雌性PAI-1-/-小鼠接受了使用75mg/kg的依托泊苷(etoposide)的治疗(i.p.)。
作为对照，4只雄性和4只雌性PAI-1+/+小鼠以及5只雄性和4只雌性PAI-1-/-小鼠接受了载体(i.p.)。
药物/测试项目依托泊苷从Pharmacia A/S，Denmark购得，批号T309A。根据下表通过i.p.进行给药该新制备的相对于体重在NaCl溶剂(批号3036111)中的药物
*)如(～依托泊苷75mg/kg)结果体内药物诱导的对体重损失的效果
在使用依托泊苷处理的小鼠中有显著的体重损失。
通过统计学标准化为初始体重，对于处理的小鼠相对于未处理的小鼠，治疗的作用是显著的体重损失(p＜0.0001)，而在基因型(p＝0.30)或者性别(p＝0.41)之间没有显著的差别。
药物诱导的对白细胞(WBC)的效果但在来自PAI-1+/+和PAI-1-/-小鼠的相应之间(p＝0.99)或者在雄性和雌性之间(p＝0.58)没有差异。
讨论该实施例证明，尽管癌细胞对细胞毒性药物的敏感通过缺失PAI-1基因得到增强，但是通过药物诱导的死亡、体重损失以及WBC计数所表示的活动物中正常细胞并没有对细胞毒性药物的细胞毒性作用通过诱导的PAI-1基因缺失变得敏感。这样，本发现暗示使用细胞毒性药物和蛋白酶抑制剂的阻断剂的共同治疗将提高细胞毒性药物的治疗指数。更大范围的意义上，本实施例说明，在给药细胞毒性药物之前，可以进行蛋白酶抑制剂抗凋亡功能的阻断剂给药，而不导致提高的全身的毒性。
实施例4对VP-16或者肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在野生型和缺失PAI-1基因的纤维肉瘤细胞中所诱导的凋亡的量化测试是否成集落能力的差别是由于在PAI-1-/-纤维肉瘤细胞中药物提高的细胞毒性。
材料和方法传统上将细胞质膜的破坏作为细胞死亡的参数。体内，凋亡细胞的细胞质膜会一直保持，直到细胞被吞噬。相反，坏死性细胞死亡导致细胞质泄漏到细胞外的环境中，这导致了炎症反应。在细胞培养的条件下，已经被进行凋亡刺激的细胞最初将通过凋亡死亡，但后来由于细胞培养中缺乏吞噬作用而改变为继发性坏死。可以通过确定培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放来检测细胞毒性或者细胞裂解。采用“细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicitydetection kit)”(Roche，Mannheim，Germany)用于该目的。
将PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞接种在96孔微孔板上(2500个细胞/孔)。24个小时后，使用TNF-α和依托泊苷对细胞分别处理24小时和48小时，如图3和2所示。将50μl(总共200μl)培养上清转入新的96孔微孔板，并与50μl底物混合物混合。弃掉剩余的上清，通过加入200μl裂解缓冲液(CM中的1％Triton-X100)对剩余的完整细胞进行裂解。在37℃下裂解30分钟后，将50μl裂解液转入新的96孔微孔板并与50μl底物混合物混合。将细胞培养上清和裂解液与底物混合物孵育10分钟，防止其受光的影响。在分光光度计在λ1＝490nm和参照λ2＝650nm处检测吸光率。以相对于总量百分比计所释放LDH的量 结果为了分析是否缺失PAI-1基因会使纤维肉瘤细胞对凋亡敏感，使用依托泊苷和TNF-α对PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞进行处理。图3和2表示依托泊苷和TNF-α诱导PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞二者的剂量依赖的细胞裂解。然而，PAI-1-/-纤维肉瘤细胞比PAI-1+/+纤维肉瘤细胞对依托泊苷和TNF-α要显著地更敏感。如图2所表示的，使用1.25μM依托泊苷的处理诱导1％的LDH从PAI-1+/+纤维肉瘤细胞释放，而41.1％的LDH从PAI-1-/-纤维肉瘤细胞释放。如图3所表示的，使用2.5ng/mlTNF-α的处理诱导7.3％的LDH从PAI-1+/+纤维肉瘤细胞释放，而46.3％的LDH从PAI-1-/-纤维肉瘤细胞释放。在新确立的一对PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞系中重现了这些结果。
结论综上，该实施例表示缺失PAI-1基因的表达使恶性细胞对诱导凋亡的试剂更敏感。这项发现与实施例2和3中的发现完全一致，并强调了可以补充诱导凋亡的抗癌治疗以便提高相应抗癌治疗的治疗指数(TD50/ED50)。
实施例5对VP-16在野生型和缺失TIMP-1基因的纤维肉瘤细胞所诱导的凋亡的量化测试是否依托泊苷诱导TIMP-1-/-纤维肉瘤细胞与野生型细胞相比提高的细胞毒性。
材料和方法传统上将细胞质膜的破坏作为细胞死亡的参数。体内，凋亡细胞的细胞质膜会一直保持，直到细胞被吞噬。相反，坏死性细胞死亡导致细胞质泄漏到细胞外的环境中，这导致了炎症反应。在细胞培养的条件下，已经被进行凋亡刺激的细胞起初将通过凋亡死亡，但后来由于细胞培养中缺乏吞噬作用而改变为继发性坏死。可以通过确定培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放来检测细胞毒性或者细胞裂解。采用“细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicitydetection kit)”(Roche，Mannheim，Germany)用于该目的。
将TIMP-1-/-和TIMP-1+/+纤维肉瘤细胞(参见上述从小鼠建立纤维肉瘤细胞的方法)接种在96孔微孔板上(2500个细胞/孔)。24个小时后，使用依托泊苷对细胞处理24小时。将50μl培养上清(总共200μl)转入新的96孔微孔板，并与50μl底物混合物混合。弃掉剩余的上清，通过加入200μl裂解缓冲液(CM中的1％Triton-X100)对剩余的完整细胞进行裂解。在37℃下裂解30分钟后，将50μl裂解液转入新的96孔微孔板并与50μl底物混合物混合。将细胞培养上清和裂解液与底物混合物孵育10分钟，防止其受光的影响。在分光光度计在λ1＝490nm和参照λ2＝650nm处检测吸光率。以相对于总量百分比计所释放LDH的量 结果为了分析是否缺失TIMP-1基因会使纤维肉瘤细胞对凋亡敏感，使用依托泊苷对TIMP-1-/-和TIMP-1+/+纤维肉瘤细胞进行处理。图6表示依托泊苷诱导TIMP-1-/-和TIMP-1+/+纤维肉瘤细胞二者的剂量依赖的细胞裂解。然而，TIMP-1-/-纤维肉瘤细胞比TIMP-1-/-纤维肉瘤细胞对依托泊苷要显著地更敏感。在另外两对PAI-1-/-和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞系中重现了这些结果。
结论该实施例表示缺失TIMP-1基因的表达使恶性细胞对诱导凋亡的试剂更敏感，并强调了可以补充诱导凋亡的抗癌治疗以便提高相应抗癌治疗的治疗指数(TD50/ED50)。
实施例6高通量筛选能够抑制蛋白酶抑制剂抗凋亡功能的化学或者天然产物A用于筛选PAI-1阻断剂的简单的基于细胞的分析将PAI-1+/+纤维肉瘤细胞接种在96孔微孔板上(2500个细胞/孔)。24小时后，在使用化学疗法药物处理之前1个小时，使用化合物或者天然产物对细胞进行处理。通过在实施例4中所描述的细胞毒性检测试剂盒(Roche，Germany)对细胞死亡进行分析。阳性结果(hit)被定义为化合物或者天然产物，其是PAI-1+/+纤维肉瘤细胞对使用化学疗法药物敏感的。接着将在筛选中所鉴定的阳性结果在PAI-1-/-纤维肉瘤细胞上进行检测，以验证该阳性结果的致敏作用是由于抑制了PAI-1。这样，选择使PAI-1+/+纤维肉瘤细胞变得敏感但对PAI-1-/-纤维肉瘤细胞没有作用的化合物或者天然产物进行进一步分析。
相似的实验设置可以用于其他对的野生型和缺失基因的纤维肉瘤细胞系例如TIMP-1细胞。
B用于筛选PAI-1抗凋亡功能阻断剂的简单可替换的基于细胞的分析当将rRPI-1直接加入到培养的细胞中时，已经证明重组PAI-1抑制依托泊苷和喜树碱(camptothcin)所诱导的肿瘤细胞凋亡(Kwaan等人，2000，BJC)。该保护作用可以用于筛选抑制PAI-1的抗凋亡作用的化合物(天然的或者合成的)。将PC-3细胞接种在96孔微孔板上。24小时后，在使用化学疗法药物处理之前1个小时，使用重组人PAI-1(rhPAI-1)对细胞进行处理。对照是1)使用化学疗法药物对细胞进行处理，而不加入rhPAI-1和化合物或者天然产物；以及2)使用化学疗法药物与rhPAI-1结合对细胞进行处理，但不使用化合物或者天然产物。处理48小时后，通过在实施例4中所描述的细胞毒性检测试剂盒(Roche，Germany)对细胞死亡进行分析。选择使细胞对由化学疗法药物所诱导的凋亡变得敏感的化合物或者天然产物用于进一步的分析。相似的实验设置可以用于其他对的野生型和缺失基因的纤维肉瘤细胞系例如TIMP-1细胞，以及重组的蛋白酶抑制剂例如TIMP-1。
C用于筛选PAI-1的抗凋亡功能的推定阻断剂的无细胞分析将重组PAI-1涂在多孔板的底部。可以替换的是，使用抗体将rPAI-1连接到多孔板的塑料表面。加入含有潜在阻断剂的测试材料，并将混合物进行孵育。接着将所述孔进行清洗，接着加入被标记的uPA或者tPA并将混合物进行孵育。现在对所述孔进行清洗，并采用检测被标记分子的检测系统进行检测。如果测试材料含有PAI-1/uPA或者PAI-1/tPA的阻断剂，则不会检测到标记。
相似的实验设置可以用于其他的蛋白酶抑制剂例如TIMP-1和基质金属蛋白酶。
实施例7通过基因型的复原进行确认为了确认缺失PAI-1基因的纤维肉瘤细胞对凋亡的提高的敏感确实由于缺失了PAI-1的表达，则检测是否通过PAI-1表达的重新发生能够将灵敏表型进行回复。
材料和方法根据操作介绍，采用2×105个细胞，利用Lipofectamine 2000(Roche)进行PAI-1-/-纤维肉瘤细胞的转染。两天后，将细胞接种在组织培养盘中，并向培养基中加入100μg/ml的潮霉素(hygromycin)以在所得到细胞群中筛选被转染的细胞。在转染两个月后进行实验。通过如实施例4中所描述的使用依托泊苷和TNF-α对细胞进行处理并检测LDH释放，测量对凋亡的灵敏。
结果为了分析是否PAI-1-/-纤维肉瘤细胞中鼠PAI-1的异常表达使纤维肉瘤细胞对凋亡较不敏感，将PAI-1-/-纤维肉瘤细胞稳定转染含有鼠PAI-1 cDNA的表达质粒。选择被转染的细胞后，使用依托泊苷和TNF-α对被转染的和亲代纤维肉瘤细胞进行处理。图5a和5b表示依托泊苷和TNF-α诱导被转染的和亲代纤维肉瘤细胞二者的细胞裂解。然而，异常表达mPAI-1的PAI-1-/-细胞(PAI-1-/-(PAI-1组))对于依托泊苷和TNF-α比PAI-1-/-(载体组)和亲代PAI-1-/-纤维肉瘤细胞显著地更有抗性。PAI-1-/-(PAI-1组)细胞表现出对依托泊苷和TNF-α所诱导的细胞死亡与亲代PAI-1+/+纤维肉瘤细胞几乎相同的抗性。与这个结果一致的是，PAI-1-/-(PAI-1组)和PAI-1+/+纤维肉瘤细胞具有相似的PAI-1表达水平(数据未显示)。
结论该实施例显示PAI-1表达的重新发生使恶性细胞对诱导凋亡的药物更有抗性。这项发现确认PAI-1-/-纤维肉瘤细胞的敏感表型是由于PAI-1基因表达的缺失。这支持PAI-1抗凋亡功能的假设。
实施例8TIMP-1和PAI-1在患有转移性乳腺癌的患者中的预测价值介绍很多乳腺癌患者会经历疾病的复发。当诊断为转移性疾病时，这些患者被进行抗癌治疗，这可以是细胞毒性治疗、内分泌治疗、放射治疗或者其他治疗形式。患有转移性乳腺癌的患者中治疗目标响应率通常低到50～60％，并且很少的患者被治愈。这样，由于只有50～60％的患者对治疗有反应，因此很大比例的治疗没有作用。而且，这组被治疗的没有反应的患者还要忍受与治疗有关的副作用。
这样，用于鉴定患者不会通过特定的治疗受益的方法对于患者的生活质量是非常重要的，并且还将具有社会经济学价值。理想的是，能够检测不同治疗的效率，在这种情况下，患者可以在早期被提供最有效的治疗类型。
我们研究了TIMP-I和PAI-1在来自原代乳房肿瘤的肿瘤组织中浓度的预测价值。在这项研究中包括了174位患者，所有的都患有乳腺转移癌，并且所有都已经接受了使用细胞毒性药物的化学疗法。
材料和方法患者收集组织样品作为大量研究的一部分，这是得到Erasmus UniversityRotterdam，The Netherlands医学伦理委员会的批准的(第MEC 02.953号规程)。用于这项大型研究所包括的标准如下在1978～1992年之间被诊断为患有原发性乳腺癌的患者，其在诊断时没有转移性疾病，没有之前肿瘤的诊断(除了皮肤基底细胞肿瘤和I期宫颈癌以外)，并且在最初手术的1个月内没有疾病现象。排除了患有不可进行手术的T4肿瘤的患者(根据InternationalUnion Against Cancer TNM肿瘤-结-转移分类进行的分阶段)，以及在外科手术之前接受新辅助治疗的患者。不包括从活组织检查中获得的组织样品。而且，得到研究所的确认在初次外科手术之后超过100天的患者和在初次外科手术时发生远距离转移的患者(M1患者)被排除。对样品的选择基于所存储细胞质提取物(在液氮中)的有效性，其在常规雌激素受体(ER)和孕酮受体(PgR)分析后仍有残余。
基于出现转移性疾病，在本研究中所包括的174个样品选自整个样品组，其已经被进行了细胞毒性治疗。
在手术时，患者的平均年龄为47岁(在24～79岁之间)。116人(67％)是淋巴结阳性(包括两位未知淋巴结状态的患者)，58人(33％)是淋巴结阴性。在第一次化学疗法开始时，93位患者(53％)是绝经前的，81位患者(47％)是绝经后的。在42位患者(24％)中出现T1肿瘤(≤2cm)，在101位患者(58％)中出现T2肿瘤(2-5cm)，在16位患者(9％)中出现T3肿瘤(＞5cm)，在11位患者(6％)中出现可以治疗的T4肿瘤。4位患者具有未知的T状态肿瘤。如下进行病理检测根据肿瘤的最大直径记录肿瘤大小。如地方生理学家的报告中所描述的，分化级别基于组织学和细胞学特征，并且其不基于所有肿瘤样品的主要病理学论述，因此其反应日常的实践。地方病理学家将肿瘤区分为好、适中和差。对淋巴结进行组织学检测以确认肿瘤包含的结的数目。在112位患者(64％)中，组织学分化等级是差，在10个患者(6％)中为适中，在52个患者(30％)中是未知的。为37位患者提供辅助化学疗法(主要是环磷酰胺/甲氨蝶呤/5-氟尿嘧啶，CMF)，而25位患者(主要是绝经后的患者)接受了辅助激素，单独治疗(24位患者)或者与化学疗法相结合的治疗(1位患者)。
25位患者发生局部疾病复发，18位患者发生锁骨上复发，116位患者发生远距离转移，7位发生疾病扩散到乳房后侧，8位患者发生转移到局部淋巴结。复发的主要位点在30位患者中为软组织，在31位患者中为骨，在113位患者中为内脏。在开始对转移性疾病进行化学疗法时，平均年龄为50岁。94位患者(54％)接受转移性疾病的CMF治疗，80位患者(46％)接受含有蒽环霉素(anthracycline)的治疗方案。从第一系列化学疗法开始到有进展的平均时间为5个月，存活的平均时间是14个月。整体上，对化学疗法的目标响应率为37％。
提取肿瘤组织将肿瘤组织样品保存在液氮中，并在冷冻的情况下进行磨碎，其使用欧洲癌症研究和治疗组织(EORTC)所推荐的微型细胞研磨器用于处理乳房肿瘤组织以确定胞质ER和PgR。将最终的组织粉末悬浮在EORTC受体缓冲液(10mM EDTA氯代二钾盐、3mM叠氮钠、10mM单巯基甘油和10％v/v的甘油，pH7.4)中。在100,000×g下降悬浮液离心30分钟以获得上清部分(细胞溶质)。
TIMP-1 ELISA通过夹心型ELISA来确定TIMP-1的总水平将免疫分析板(NuncMaxisorp，Nunc，Denmark)覆盖100μL的羊多克隆抗TIMP-1抗体(在0.1M碳酸盐缓冲液中稀释到4mg/L，pH9.5)在4℃下过夜。
接着使用200μLPierceSuperblock(Pierce Chemicals)(1∶1稀释在PBS中)将孔清洗两次。接着使用含有1g/L Tween-20的PBS对孔进行5次清洗。清洗后，将孔与两份组织提取物在30℃下孵育1小时。将之前在EORTC受体缓冲液中稀释到1mg蛋白质/ml的提取物进一步在样品稀释缓冲液(50mM磷酸盐，pH7.4，10mg/ml牛血清清蛋白(Fraction V，Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)以及0.1％v/vTween-20中稀释22倍。在每个分析板上，包括两份一系列标准(如上面所述的在分析稀释缓冲液中稀释的)以及两份空白孔(只有分析稀释缓冲液)，其中所述的一系列标准由人重组TIMP-1的7种稀释组成(分别为5、3、2、1、0.5、0.25和0.1ng/ml)。结合TIMP-1后，使用含有1g/L Tween-20的PBS将孔清洗5次，并使用特异性的抗TIMP-1的单克隆抗体检测TIMP-1，所述抗体检测游离的TIMP-1和TIMP-1与各种MMP复合物[MAC 15]。将单克隆抗体在样品稀释缓冲液中稀释到0.5mg/L的浓度，并在30℃下与每孔100μL稀释的抗体孵育1个小时。接着使用含有1g/L Tween-20的PBS将板清洗5次，并在30℃下与每孔100μL偶联碱性磷酸酶的兔抗鼠多克隆抗体(DAKO，Glostrup，Denmark)孵育1个小时。将该抗体在样品稀释缓冲液中按1∶2000稀释。孵育后，使用含有1g/L Tween-20的PBS将板清洗5次，用纯水清洗3次。在每个孔中加入100μL新配制的p-硝基苯基磷酸(Sigma)底物溶液(在0.1MTris-HCl，pH9.5，0.1M NaCl，5mM MgCl中1.7g)，并在吸光率平板读数器中在405nm处对平板进行阅读。每隔10分钟自动进行读数一次，共进行1个小时。
该分析已经对检测TIMP-1在肿瘤的细胞溶质提取物中的浓度完全有效(Schrohl等人2003，Mol Cell Proteomics.2(3)164-72)。
PAI-1 ELISA通过夹心型的方式来确定PAI-1的浓度。将微孔板(Greiner，Alphen a/dRijn，the Netherlands)覆盖抗PAI-1的多克隆抗体(#395-G，AmericanDiagnostica，Greenwich，CT，每孔100μL，2μg/L)。去除覆盖溶液后，将孔与100μL组织提取物或PAI-1标准物孵育。之前已经将提取物稀释到1mg蛋白质/ml的浓度，并进一步稀释20倍。PAI-1标准覆盖0.05～5.0ng/ml的范围，其从American Diagnostica(#1090)获得。在潮湿室中4C下孵育过夜。之后，将板清洗四次，在23℃下，与1∶20稀释的抗PAI-1单克隆抗体(HD-PAI-I 14.1ref.)的培养上清孵育1小时。该抗体检测活性以及无活性形式的PAI-1以及与尿激酶、组织型纤溶酶原激活物和Vitronectin的复合物中的PAI-1。孵育后，对板进行清洗，并按照每孔100μL偶联过氧化物酶的羊抗鼠抗体在23℃下孵育1小时。使用1，2-苯二胺反应(DAKO，Glostrup，Denmark)检测PAI-1的量，并在反应10分钟后使用H2SO4停止反应，并检测490nm处的吸光率。
在所有板(所收集的人乳房肿瘤细胞溶质)中都包括对照，并用于计算分析间的差别，并确定了分析间的差别。
确定总蛋白质含量通过使用考马斯亮蓝方法(Bio-Rad Laboratories，CA)并以人血清清蛋白作为标准对总的细胞溶质蛋白进行定量。蛋白浓度用于将TIMP-1和PAI-1的浓度进行标准化(每mg总蛋白，TIMP-1或PAI-1的ng数)。
结果使用组织提取物的总蛋白浓度将TIMP-1和PAI-1的含量进行标准化(每mg总蛋白，TIMP-1或PAI-1的ng数)。
为了将肿瘤分类为低TIMP-1和高TIMP-1类，以及分类为低PAI-1和高PAI-1类，通过保序回归分析来确定区分点。
使用这些区分点，18位患者被分类为具有高TIMP-1肿瘤(156位患者具有低TIMP-1肿瘤)，25位患者具有高PAI-1肿瘤(149位具有低PAI-1肿瘤)。我们检测了下面组中对化学疗法的反应a)低TIMP-1和低PAI-1肿瘤组织(142位患者)b)低TIMP-1和高PAI-1肿瘤组织，或者高TIMP-1和低PAI-1肿瘤组织
b)低TIMP-1和高PAI-1肿瘤组织，或者高TIMP-1和低PAI-1肿瘤组织(32位患者)将对化学疗法的响应评估为响应(完全和部分)或者没有响应(发展的或者稳定的疾病)。结果如下
因此，具有TIMP-1、PAI-1或者其二者的高肿瘤组织水平的患者组中，对化学疗法(CMF或者蒽环霉素)的响应率仅为6％。在其肿瘤中具有低TIMP-1和低PAI-1水平的患者组中，响应率为44％。
结论这项研究说明其原发性肿瘤表达高水平TIMP-1和/或PAI-1的乳腺癌患者，对在转移性疾病中采用基于CMF或蒽环霉素的治疗方案的化学疗法具有最小的发生响应可能性。然而，在原发性肿瘤中具有低水平TIMP-1和PAI-1的患者组成了对使用CMF或蒽环霉素的化学疗法的响应可以被预测的小组。
如本发明上面的概述中所描述的，还可以通过免疫组织化学或FISH或CISH来确定是否来自相同患者的癌细胞表达TIMP-1或者PAI-1。图7证明了TIMP-1在肿瘤组织中的定位区域的显著的差别，其中TIMP-1位于基质细胞(图7A)和癌细胞(图7B)，这样证明了通过对肿瘤组织的免疫组织化学分析可以容易得出对PAI-1和TIMP-1表现出免疫反应性(或者，可以替换的是，如通过FISH或CISH所示的对响应基因的扩增)的患者在这种情况下将被认为是对使用CMF或蒽环霉素的化学疗法没有响应的。
实施例9测试药物对蛋白酶抑制剂的依赖性将PAI-1+/+或PAI-1-/-纤维肉瘤细胞接种在多孔盘中。加入抗癌药物，24～48小时后，，检测通过LDH释放确定的作用(参见实施例4)。如果与PAI-1+/+细胞相比，PAI-1-/-细胞对该治疗更敏感，则所研究的药物的效率可以被认为是依赖PAI-1的，而如果在两种细胞系中观察到相似的敏感，则该抗癌药物的作用是不依赖PAI-1的。相似的实验设置可以用于检测其它队的序列表<110>丹麦皇家兽医和农业学院<120>通过阻断和检测蛋白酶抑制剂改进对癌症的治疗和癌症治疗效率的预测<130>1566OPCTOO<160>3<170>PatentIn Version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人<400>1ttcatgccct ctggtcgctg<210>2<210>2<211>22<212>DNA<213>人<400>2ctccctccct cccagtgact tg<210>3<211>19<212>DNA<213>人<400>3gccttgggaa aagcgcctc
权利要求
1.一种用于改进对患者进行抗癌治疗效果的方法，所述方法包括提高患者中恶性细胞对所述抗癌治疗的敏感，而不提高非恶性细胞对所述抗癌治疗的敏感。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括对患者中至少一种蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂活性的抗凋亡作用进行抑制，进而相对于非恶性细胞对所述抗癌治疗的敏感，提高了恶性细胞对所述抗癌治疗的敏感。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抑制是通过对患者进行给药蛋白酶抑制剂的体内抗凋亡作用的阻断剂来达到的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶的抑制剂、金属蛋白酶的抑制剂、半光氨酸蛋白酶(硫蛋白酶)的抑制剂、天门冬氨酸蛋白酶的抑制剂、任何其他蛋白降解酶的抑制剂、合浦安酶的抑制剂或者任何其他参与降解细胞外基质的酶的抑制剂，优选的蛋白酶抑制剂选自由以下所组成的组PAI-1、PAI-2、PAI-3，蛋白酶Nexin-1、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、Stephin A、Stephin B和Cystatin C。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述阻断剂选自由下列所组成的组多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片断、可溶性受体、低分子量分子、天然产品、肽、反义多聚核苷酸、核酶、反义寡聚核苷酸的模拟物例如反义LNA或者PNA分子。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的方法，其中在进行抗癌治疗刺激之前进行阻断剂给药。
7.根据权利要求3～6中任一项所述的方法，其中在发作时或者在进行抗癌治疗的期间进行阻断剂给药。
8.根据权利要求3～7中任一项所述的方法，其中所述阻断剂是作为药物组合物的一部分进行给药的，该药物组合物含有药物上可以接受的载体、赋形剂或者稀释剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述药物组合物具有选自由下列所组成的组中的剂型经口服剂型、经口腔剂型、经舌下剂型、经肛门剂型、经注射用药物剂型例如经静脉剂型、经动脉剂型、经腹腔剂型、经皮下剂型、经皮内剂型、经肌肉剂型以及经颅内剂型。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中给药是通过选自由下列所组成的途径经肠胃外途径例如经皮内、经皮下、经动脉、经静脉以及经肌肉途径；腹腔途径；口服途径；口腔途径；舌下途径；脊柱硬脊膜间途径；脊椎途径；肛门途径；以及颅内途径。
11.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中所述抗癌治疗包括使患者经受通过凋亡诱导细胞死亡的条件的处理。
12.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中恶性细胞敏感的提高是优先提高受到抗癌治疗的恶性细胞的凋亡的结果。
13.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中抗癌治疗被补充对患者使用抗癌药物的治疗，其中所述抗癌药物的效率不依赖肿瘤组织中蛋白酶抑制剂的表达。
14.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中抗癌治疗选自由下列所组成的组放射治疗、内分泌治疗以及细胞毒性或者抑制细胞生长的化学疗法、免疫治疗、使用生物响应修饰剂的治疗、使用蛋白激酶抑制剂的治疗，或者其结合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中细胞毒性或者抑制细胞生长的化学疗法是用选自下列组中的物质进行治疗烷基化试剂、I型和II型拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、微管蛋白抑制剂、铂系金属以及紫杉醇。
16.根据权利要求14所述的方法，其中内分泌治疗是使用抗雌激素、芳香酶抑制剂、促性腺激素抑制剂、抗雄激素、抗孕酮或其组合进行的治疗。
17.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中所述抗癌治疗针对选自由下列所组成的组的恶性肿瘤恶性脑瘤；恶性黑素瘤；肉瘤；头颈部癌；消化道癌例如胃癌、胰脏癌、结肠癌和直肠癌；类癌；肺癌；乳腺癌；妇科癌症例如卵巢癌、宫颈癌和子宫癌；以及泌尿系癌症例如前列腺癌、肾癌和膀胱癌。
18.根据权利要求17所述的方法，其中提高的蛋白酶抑制剂表达与差预后相关。
19.一种用于预测癌症患者是否将通过抗癌治疗受益的方法，其中所述抗癌治疗的效率依赖肿瘤组织蛋白酶抑制剂的表达，该方法包括确定来自患者肿瘤组织中的细胞是否表达一些预先选定的蛋白酶抑制剂中的任何一种，如果蛋白酶抑制剂表达超过相应的极限值，则确定患者不会通过抗癌治疗受益，如果没有任何所选定的蛋白酶抑制剂表达超过他们相应的极限值，则确定患者会通过抗癌治疗受益。
20.根据权利要求19所述的方法，其中预先选定的蛋白酶抑制剂选自由根据权利要求4所述的蛋白酶抑制剂所组成的组。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中确定是否来自肿瘤组织的细胞表达一些预先选定的蛋白酶抑制剂中的任何一种是通过对选自由下列所组成的组的样品检测来完成的肿瘤组织样品、血液样品、血浆样品、血清样品、尿样、粪便样品、唾液样品以及来自胸腔或腹腔的水状液体样品。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述检测是通过DNA水平检测、mRNA水平检测例如原位杂交、Northern印迹、QRT-PCR和差异显示以及蛋白质水平检测例如Western印迹、免疫组织化学、ELISA和RIA进行的。
23.根据权利要求19～22中任一项所述的方法，其中所述抗癌治疗通过凋亡诱导细胞死亡。
24.根据权利要求22的方法，其中所述检测是通过DNA水平检测或者蛋白质水平的检测的方法，以及对来自患者的存档的材料例如含有肿瘤组织的石蜡块的检测而完成的。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述DNA水平检测选择原位荧光杂交和原位发光杂交。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质水平的检测是免疫组织化学。
27.一种用于癌症患者的抗癌治疗的方法，该方法包括根据权利要求19～26中所述的方法预测癌症患者是否将通过抗癌治疗受益，其中所述抗癌治疗的效率依赖蛋白酶抑制剂在肿瘤组织的表达，接着a)如果该预测提供正应答，则对患者进行该抗癌治疗，或者b)如果该预测提供负应答，则对患者进行根据权利要求1～18中任一项所述的改进的抗癌治疗。
28.一种用于癌症患者的抗癌治疗的方法，该方法包括监控经历现有抗癌治疗的患者，其中通过重复进行根据权利要求19～23中任一项所述的预测方法来进行所述监控，以确定是否患者将继续通过现有的抗癌治疗受益，并且a)如果监控中的预测提供正应答，则对患者继续进行该抗癌治疗，或者b)如果监控中的该预测提供负应答，则借助于根据权利要求1～18中任一项所述的方法，将患者转换为另一种抗癌治疗。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中抗癌治疗选自新辅助治疗以及对转移性疾病的治疗。
30.一种用于鉴定阻断蛋白酶抑制剂的抗凋亡作用的试剂的方法，该方法包括-提供第一批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-，或者其中从外部来源提供蛋白酶抑制剂；-提供第二批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是-/-；-在存在或者不存在所限定浓度的候选试剂时，将所述第一和第二批细胞的样品进行基本相同的诱导凋亡的条件的处理；-确定所述样品中诱导凋亡的程度；以及如果1)在存在候选试剂时，来自第一批细胞的样品中所诱导的凋亡程度显著地更高，并且2)在存在候选试剂时，来自第二批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著地更高，则鉴定了该候选试剂为阻断蛋白酶抑制剂的抗凋亡作用的试剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中测试不同的限定浓度的候选试剂，根据情况可以是平行测试。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中接着通过将-/-细胞回复为+/+细胞对该结果进行确认，并确定所回复的细胞对凋亡的敏感会被候选试剂显著地提高。
33.根据权利要求30～32中任一项所述的方法，其中在不存在候选试剂时，对于诱导凋亡的条件，第一批细胞不如第二批细胞敏感。
34.根据权利要求27～33中任一项所述的方法，其中第一和第二批细胞的样品生长在实验动物中。
35.根据权利要求27～33中任一项所述的方法，其中第一和第二批细胞的样品生长在培养基中。
36.根据权利要求34所述的方法，其中还检测动物中的副作用程度。
37.一种用于鉴定阻断蛋白酶抑制剂的抗凋亡作用的试剂的方法，该方法包括-提供第一批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-，或者其中从外部来源提供蛋白酶抑制剂；-将第一批细胞移植入实验动物中并使其生长；-在存在或者不存在所限定浓度的候选试剂时，将动物进行诱导凋亡的条件的处理；-确定所述动物中肿瘤发育和/或进展的程度；-确定动物中与凋亡相关的副作用的程度；以及如果1)在存在所候选试剂时，肿瘤发育的程度显著地更低，并且2)在存在候选试剂时，与凋亡相关的副作用诱导的程度不是显著地更高，则鉴定了候选试剂为阻断蛋白酶抑制剂的抗凋亡作用的试剂。
38.一种用于鉴定抗癌治疗的方法，其效率依赖是否出现抑制凋亡的蛋白酶抑制剂，该方法包括-提供第一批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-；-提供第二批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是-/-；-在存在或者不存在阻断蛋白酶抑制剂防止凋亡作用的有效浓度的试剂时，将所述第一和第二批细胞的样品进行基本相同的抗癌处理；-确定所述样品中所诱导凋亡的程度；以及如果1)在存在所述试剂时，在来自第一批细胞的样品中所诱导的凋亡程度显著地更高，并且2)在存在所述试剂时，在来自第二批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著地更高，则鉴定了该抗癌治疗或者药物的效率依赖是否出现抑制凋亡的蛋白酶抑制剂。
39.一种用于鉴定抗癌治疗的方法，其中所述抗癌治疗的效率不依赖是否出现抑制凋亡的蛋白酶抑制剂，该方法包括-提供第一批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是+/+或者+/-；-提供第二批恶性衍生的细胞，其对于所述蛋白酶抑制剂是-/-；-在存在或者不存在阻断蛋白酶抑制剂防止凋亡作用的有效浓度的试剂时，将所述第一和第二批细胞的样品进行基本相同的抗癌处理；-确定所述样品中所诱导凋亡的程度；以及如果1)在存在所述试剂时，在来自第一批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著地更高，并且2)在存在所述试剂时，在来自第二批细胞的样品中所诱导的凋亡程度不是显著地更高，则鉴定了该抗癌治疗或者药物的效率依赖是否出现抑制凋亡的蛋白酶抑制剂。
40.蛋白酶抑制剂的阻断剂在制备用于增强抗癌治疗效果的药物制剂中的应用。
41.根据权利要求40所述的应用，其中所述蛋白酶抑制剂选自由根据权利要求4所述的蛋白酶抑制剂所组成的组。
42.根据权利要求40或41所述的应用，其中所述阻断剂选自由根据权利要求5所述的阻断剂所组成的组。
43.根据权利要求40～42中任一项所述的应用，其中所述抗癌治疗包括使患者受到通过凋亡诱导细胞死亡的条件的处理。
44.根据权利要求40～43中任一项所述的应用，其中在对患者进行抗癌治疗时，与非恶性细胞相比，阻断剂诱导恶性细胞凋亡的优先提高。
45.根据权利要求40～44中任一项所述的应用，其中抗癌治疗选自由下列所组成的组放射治疗、内分泌治疗以及细胞毒性或者抑制细胞生长化学疗法，或者其结合。
46.根据权利要求45所述的应用，其中细胞毒性或者抑制细胞生长的化学疗法为选自包括使用根据权利要求1中所述试剂进行治疗的组。
47.根据权利要求45所述的应用，其中内分泌治疗为选自包括使用根据权利要求15中所述试剂进行治疗的组。
全文摘要
本发明公开了一种用于改进癌症治疗的方法，其依赖诱导恶性细胞中的凋亡。已经发现，对蛋白酶抑制剂PAI－1和TIMP－1的阻断使表达这些抑制剂的恶性细胞对凋亡更敏感，而非恶性细胞不会改变它们对凋亡诱导的敏感。因此，可以以合理的方式提高各种抗癌治疗的效果，并且可以预测是否诱导凋亡的癌症治疗将对患者有利。本发明还提供了用于鉴定通过调控蛋白酶抑制剂抑制凋亡敏感的试剂的方法，以及鉴定能够被蛋白酶抑制剂调控不依赖诱导凋亡机制的抗癌化合物的方法。
文档编号A61P35/00GK1972703SQ200580013583
公开日2007年5月30日 申请日期2005年3月30日 优先权日2004年3月30日
发明者马里亚·温尼·罗默, 乌尔里克·阿克塞尔·拉泽曼, 肯尼思·弗朗西斯·霍夫兰德, 彼得·布尔·延森, 玛丽昂·埃伦·迈耶·范格尔德, 约翰内斯·阿尔贝特·福肯斯, 安内－索菲耶·施罗尔·拉斯穆森, 尼尔斯·奥厄·布伦纳, 佩妮莱·奥特泽恩·厄舍 申请人:丹麦皇家兽医和农业学院, 丹麦国家教学研究医院