含有包含在脂质体中的调节性细胞配体的药物的制作方法

专利名称：含有包含在脂质体中的调节性细胞配体的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有包含在脂质体中的调节性细胞配体的药物，更具体而言，涉及治疗过敏性疾病、自身免疫疾病等免疫疾病的药物。
背景技术：
免疫疾病是指过敏性疾病、自身免疫疾病、移植物抗宿主病(GVHDgraft-versus-host disease)等由于免疫系统异常或免疫系统不适所引起的疾病。
已报道其中过敏性疾病患者有逐年增加的趋势，患有某种过敏性疾病的日本国民已达70％。众所周知，过敏性疾病的范围很广，包括哮喘、特应性皮炎、花粉症、食物过敏、皮肤过敏等各种疾病，并且大多数过敏患者连锁并发称为过敏进程(allergy march)的各种过敏性疾病。另外，近年来在日本并发过敏性鼻炎或过敏性结膜炎的花粉症或小儿特应性哮喘的患者急剧增加，其理由被认为是免疫系统形成的婴幼儿时期的生活环境特别是免疫学环境的改变(细菌感染减少、气密性高的住房中室尘浓度增大)提高了IgE抗体的产生。很显然，狭义上称为过敏性疾病的过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性哮喘是由IgE抗体及诱导其产生的Th2细胞相关的I型过敏反应所引起的。另外，已有很多报道表明在除此之外的各种过敏性疾病中IgE抗体或Th2的优势与发病阶段密切相关。基于以上事实，推测抑制控制I型过敏反应的IgE抗体的产生以及抑制Th2分化是过敏性疾病治疗法的有效手段。针对今后预期会进一步增加的过敏患者而言，采用基于过敏发病机理制备的药物的病因疗法或使过敏防患于未然的预防法(疫苗)被认为是有效的，这其中有必要保证较高的安全性(副作用低)。
已揭示出人源化抗IgE抗体(rhuMAb-E25、Genentech Inc.)在以特应性哮喘患者为对象的临床治疗中具有高的有效性(参见非专利文献1)。在使用人工化合物抑制抗原特异性IgE抗体产生的实验中，在用整合了柳杉花粉抗原Cryjl基因的质粒DNA免疫的BALB/c小鼠中引起了Th1型的免疫应答，其结果是产生了IgG2a抗体，即使用Cryjl抗原和氢氧化铝(alum)进行加强免疫，IgG1和IgE抗体的产生也被抑制(参见非专利文献2)。另据报道，在用OVA-IL-12融合蛋白免疫小鼠时也会引起OVA特异性Th1型免疫应答，其效率远比用OVA和IL-12的混合液免疫时的效率要好，使得产生OVA特异性IgG2a抗体(参见非专利文献3)。该报告显示可能出现由于抗原和细胞因子诱导因子复合体的免疫的Th1偏向，并抑制与之相伴的IgE抗体的抗原特异性的产生。
另外，为了预防和缓解过敏性疾病，对抑制产生Th或和产生IgE抗体的B细胞的分化增殖以及机能的调节性细胞的控制成为有效的手段。NKT细胞被认为是在排除癌细胞、寄生虫或和原虫，以及李斯特菌或结核菌等细胞内感染细菌中起着重要作用的调节性细胞(参见非专利文献4)。已表明，NKT细胞为中度表达T细胞受体(TCR)的中间TCR细胞(TCRint细胞)，在表现出大颗粒淋巴细胞(LGL)样的形态、组成性表达IL-2Rβ链和在具有穿孔素颗粒等方面为与自然杀伤(NK)细胞相似的细胞，但在具有TCR方面是与NK细胞完全不同的细胞群(参见非专利文献5)。Vα14+NKT细胞为上述NKT细胞的一种亚型，大多数Vα14+NKT细胞表达Vα14Jα281mRNA，并将其作为TCRα链。与小鼠α14Jα281链相同的人同源物Vα24JaQ链在健康个体的外周血液中的CD4-/CD8-T细胞中存在20-50％(参见非专利文献6)。
由于这些NKT细胞的配体化合物α-半乳糖神经酰胺可诱导IFN-γ和IL-4两种细胞因子产生，因此NKT细胞被认为是Th1/Th2分化的调节细胞(参见非专利文献7)。已知若将α-半乳糖神经酰胺给予C57BL/6小鼠，由DNP-OVA和氢氧化铝引起的IgE抗体的产生就会被抑制，在使用Vα14-NKT细胞缺失小鼠的相同实验中，未观察到IgE抗体产生被抑制(参见非专利文献8)。另外，由于在给予I型糖尿病模型NOD小鼠α-半乳糖神经酰胺的实验中观察到症状得到改善，因此提示Vα14-NKT细胞具有增强Th2介导的免疫应答的可能性(参见非专利文献9)。但是，仅用α-半乳糖神经酰胺得到的效果并不理想，需要药效得到进一步的改善。
另一方面也指出，尽管β-半乳糖神经酰胺和β-葡糖神经酰胺广泛存在于生物体内，但是与α-半乳糖神经酰胺的免疫激活作用或抗肿瘤作用相比，却只有非常低的活性(参见非专利文献10-12、专利文献1)。
另外已知NKT细胞对自身免疫疾病模型也具有有效的作用(参见专利文献13-16)。因此可以认为，若能选择性增强NKT细胞的免疫抑制机能如IL-10的产生，那么不仅仅对过敏疾病的治疗有效，同时对自身免疫疾病或GVHD等其他免疫疾病的治疗也有效。但是，单独地能选择性增强NKT细胞的免疫抑制机能的配体尚不为人所知。另外，尚没有人基于此目的使用脂质体。
专利文献1特开平1-93562号公报非专利文献1Immunopharmacology，48307(2000)非专利文献2Immunology，99179(2000)非专利文献3J.Immunol.，1584137(1997)非专利文献4Clin.Immunol.，28，1069(1996)非专利文献5J.Immunol.，155，2972(1995)非专利文献6J.Exp.Med.182，1163(1995)非专利文献7Nakayama.T.，et al.，Int Arch Allergy Immunol 124，38-42(2001)非专利文献8J.Exp.Med.，190，783-7921999非专利文献9Nat.Med.，71052-1056(2001)非专利文献10Biochem.Biophys.Acta，280，626(1972)非专利文献11Biochem.Biophys.Acta，316，317(1973)非专利文献12Biol.Pharm.Bull.，18，1487(1995)非专利文献13J.Exp.Med.，186677(1997)非专利文献14J.Immunol.，16662(2001)非专利文献15J.Exp.Med.，1941801(2001)非专利文献16Nature，413531(2001)

发明内容
本发明的课题是提供以活体内的调节性细胞作为靶标的药物，主要是提供针对过敏性疾病、自身免疫疾病等免疫疾病的药物。
本发明人发现脂质体中含有β-半乳糖神经酰胺、α-半乳糖神经酰胺等调节性细胞配体的组合物，具有在仅有这类化合物的溶液中并不能表现出的对产生IL-10的T细胞的诱导作用和抑制IgE抗体产生的作用，并且作为过敏性疾病等免疫疾病的预防剂或治疗剂是有效的。另外还发现，脂质体中含有α-半乳糖神经酰胺的组合物通过选择性增强NKT细胞的免疫抑制机能，能抑制病原性T细胞的分化增殖，因此，作为自身免疫疾病或移植物抗宿主病的预防剂或治疗剂也是有用的。到此完成本发明。
或者说，本发明为如下所述(1)含有调节性细胞配体的脂质体作为有效成分的药物。
(2)(1)的药物，其中调节性细胞为NKT细胞。
(3)(1)或(2)的药物，其中调节性细胞配体为β-半乳糖神经酰胺。
(4)(1)或(2)的药物，其中调节性细胞配体为α-半乳糖神经酰胺。
(5)(1)～(4)任一项的药物，其中上述脂质体进一步含有CpG寡核苷酸或咪喹莫特。
(6)(1)～(5)任一项的药物，其中上述脂质体进一步含有过敏原。
(7)(1)～(6)任一项的药物，为免疫疾病的预防剂或治疗剂。
(8)(7)的药物，其中免疫疾病为过敏性疾病。
(9)(8)的药物，其中过敏性疾病为特应性支气管哮喘、过敏性鼻炎、花粉症或特应性皮炎。
(10)(4)的药物，为自身免疫疾病或移植物抗宿主病的预防剂或治疗剂。
(11)含有调节性细胞配体的脂质体作为有效成分的调节性细胞诱导剂。


图1示出在BALB/c小鼠脾脏中CD11c+DC培养系统中添加Lipo-β或其它脂质体组合物或生理盐水后，体外产生细胞因子的实验结果。纵轴表示添加之后培养上清中的各种细胞因子的浓度。
图2示出在C57BL/6 小鼠脾脏中CD11c+DC培养系统中添加Lipo-β或其它脂质体组合物或生理盐水后，体外产生细胞因子的实验结果。纵轴表示添加之后培养上清中的各种细胞因子的浓度。
图3示出在BALB/c小鼠脾脏中CD11c+DC培养系统中添加Lipo-β或其它脂质体组合物或生理盐水后，体外产生细胞因子的实验结果。纵轴表示添加之后培养上清中的IL-10的浓度。
图4示出用DNP-OVA和氢氧化铝初次免疫给予Lipo-β或生理盐水的BDF1小鼠之后，以及仅用DNP-OVA加强免疫之后，用ELISA法测定血浆中DNP-OVA特异性抗体产生的结果。
图5示出给予Lipo-β或生理盐水(阴性对照)的BALB/c小鼠第七天的脾脏中CD11c+DC细胞和DO11.10(OVA特异性TCRαβ转基因)小鼠来源的CD4+T细胞在OVA肽存在下培养四天后培养上清中细胞因子浓度的测量结果。
图6示出在将图5的实验中增殖的细胞过继转移到BALB/c小鼠中后，用DNP-OVA和氢氧化铝免疫第14天的血液中抗体效价的测定结果。
图7示出在C57BL/6小鼠脾脏的全细胞(上部分)、添加了抗CD1d中和抗体的相同细胞(下部分)或NKT缺失小鼠脾脏的全细胞(下部分)的培养液中添加培养液、α-半乳糖神经酰胺水溶液(α-GalCer)、对照脂质体组合物(Lipo-(-))或含有α-半乳糖神经酰胺的脂质体(Lipo-αGC)后体外细胞因子产生的实验结果。横轴表示添加后第2天的培养上清中各种细胞因子的浓度。
图8示出将生理盐水、Lipo-(-)或Lipo-αGC给予C57BL/6小鼠后第3天或第7天，用流式细胞术分析脾脏中Vα14-NKT细胞数的结果。横轴表示FITC标记的抗TCRβ抗体的荧光强度，纵轴表示PE标记的CD1d四聚体+α-Galcer的荧光强度。
图9示出在C57BL/6小鼠(上部分)或IL-10基因缺失小鼠(下部分)中给予生理盐水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第三天用DNP-OVA和氢氧化铝免疫，此后，第14天测定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a的抗体效价。
图10示出在给予BDF1小鼠生理盐水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第三天(day0)用DNP-OVA和氢氧化铝免疫，此后，在day55仅用DNP-OVA进行加强免疫的实验中，day0、14、55、64测定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a的抗体效价以及IgE、IgG1、IgG2a的总值。
图11示出在给予BDF1小鼠生理盐水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第3天用DNP-OVA和氢氧化铝免疫，第7天的脾脏CD4+T细胞与放射线照射的正常BDF1小鼠脾脏全细胞一起用DNP-OVA或PMA和离子霉素(Ionomycin)刺激48小时后，用MTT法测定得到的细胞增殖能力的结果。左图的横轴和纵轴分别表示DNP-OVA浓度和在波长570nm的吸光度。
图12表示给予BALB/c小鼠生理盐水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第3天的脾脏中的细胞用抗CD11c抗体和抗CD45RB抗体染色后，用流式细胞术分析得到的结果。
图13表示采用图11的流式细胞术分析得到的细胞数比值和脾脏的全部细胞数相乘得到的CD11clowCD45RBhigh细胞数和CD11chighCD45RBlow细胞数。
图14表示给予BALB/c小鼠Lipo-αGC后，第3天从脾脏细胞分离回收CD11clowCD45RBhigh细胞和CD11chighCD45RBlow细胞，用LPS刺激后第2天培养上清中的细胞因子的测定结果。横轴表示培养上清中的细胞因子浓度。
图15表示用OVA323-339肽脉冲的CD11clowCD45RBhigh细胞或CD11chighCD45RBlow细胞与DO11.10小鼠脾脏来源的CD4+T细胞共培养，48小时后用MTT法测定得到的细胞增殖能力的结果。横轴表示波长为570nM的吸光度。
图16表示用OVA323-339肽脉冲的CD11clowCD45RBhigh细胞或CD11chighCD45RBlow细胞与DO11.10小鼠脾脏来源的CD4+T细胞共培养，用抗CD4抗体和抗CD25、CD28、CD152、ICOS抗体对增殖的细胞进行流式细胞术的分析结果。
图17表示用OVA323-339肽脉冲的CD11clowCD45RBhigh细胞或CD11chighCD45RBlow细胞与DO11.10小鼠脾脏来源的CD4+T细胞共培养，用PMA和离子霉素刺激增殖的细胞后，用流式细胞术分析细胞内细胞因子表达的结果。上部分和下部分分别表示同种型对照抗体、细胞因子特异性抗体的细胞内染色模式。
图18表示给予Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA的BDF1小鼠脾脏来源的CD4+T细胞与在体外用同种放射线照射的脾细胞一起在OVA蛋白质存在下培养，第6天用PMA和离子霉素刺激后，用流式细胞术分析细胞内细胞因子表达的结果。上部分和下部分分别表示给予Lipo-αGC的小鼠脾脏来源的CD4+T细胞和给予Lipo-αGC+OVA的小鼠脾脏来源的CD4+T细胞的细胞内染色。
图19表示在用DNP-OVA和氢氧化铝免疫BDF1小鼠后第21、28、35天给予单独的脂质体(载体)、Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA，此后，第42天仅用DNP-OVA抗原进行加强免疫，第48天测定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗体效价(上部分)和IgE、IgG1、IgG2a总值(下部分)。*，p＜0.05；**，p＜0.005；***，p＜0.00具体实施方式
在本说明书中，所述“调节性细胞”是指NKT细胞(自然杀伤T细胞)、产生IL-10的Tr1细胞、DC细胞(树突细胞)等，其中特别优选NKT细胞。
所述“调节性细胞配体”没有特别的限制，只要它能够与上述调节性细胞的细胞表面受体相结合，促进该调节性细胞的分化增殖或活化，如下文所列举的物质。但是，调节性细胞配体不仅限于此。
(i)NKT细胞的配体α-半乳糖神经酰胺、β-半乳糖神经酰胺等半乳糖神经酰胺类；(ii)对调节性树突细胞(DC)的分化增殖起作用的维生素D3、地塞米松、TGF-β、IL-10等；(iii)对调节性T细胞的分化增殖起作用、诱导IL-10或FoxP3等表达的物质。
本发明所述的“调节性细胞诱导剂”是指诱导调节性细胞的分化增殖或活化的药剂。调节性细胞的分化增殖或活化的促进可通过例如下述方法确定如实施例所示，使用脾脏CD11c+DC等，可以对其中所含有的NKT细胞和产生IL-10的Tr1细胞的增殖情况进行测定，也可以对由NKT细胞和产生IL-10的Tr1细胞产生的细胞因子(IFN-γ、IL-10、IL-4等)进行定量。
本发明所述“含有调节性细胞配体的脂质体”优选可诱导作为调节性细胞的NKT细胞和产生IL-10的Tr1细胞，还具有抑制辅助T细胞活化的活性，并且具有抑制B细胞释放IgE抗体产生的作用。具体而言，脂质体中含有上述“调节性细胞配体”，其中优选的是在脂质体的双层脂质膜内含有α-半乳糖神经酰胺或β-半乳糖神经酰胺的组合物。此外，本发明的“含有调节性细胞配体的脂质体”也可以含有2种以上“调节性细胞配体”。
本发明所述“含有调节性细胞配体的脂质体”除含调节性细胞配体外，还可含有TLRs(Toll样受体)家族配体类物质。通过添加TLRs家族配体类物质，能增加调节“调节性细胞”作用的细胞因子的产生，更能提高效果。TLRs家族配体类物质可为CpG寡核苷酸(CpGODN)咪喹莫特(imiquimod1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺，1-(2-methylproryl)-1H-imidazo[4，5-c]quinolin-4-amine)等。
此外，所述“含有调节性细胞配体的脂质体”还可含有过敏原。过敏原是引起过敏的物质，优选为花粉抗原或螨抗原。具体而言，过敏原可为OVA(卵白蛋白)。
本发明提供包括作为水溶性高分子物质的上述调节性细胞配体、优选半乳糖神经酰胺等脂溶性化合物的脂质体。
在本发明书中，微团(由含有亲水性区域和疏水性区域的两亲性分子凝集得到的水溶性颗粒)是具有封闭的囊泡结构的物质，被称为脂质体。脂质体组分可为用现有的方法能形成囊泡的两亲性分子中的任何物质，优选脂质。在本发明中，脂质为例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等磷脂、神经鞘脂等脂质、甘油糖脂等，可将一种或两种以上这类物质用于脂质体的制备，或者将其与脂质衍生物等组合用于脂质体的制备，该脂质衍生物是胆固醇等非极性物质或聚乙二醇等水溶性高分子结合在脂质上所形成的物质。
脂质体可用公知的方法制备。例如可采用记载在《脂质体技术》(Liposome Technology，vol.1，2ndedition(by Gregory Gregoriadis(CRC Press，Boca Raton，Ann Arbor，London，Tokyo))第4章第67-80页，第10章第167-184页和第17章第261-276页(1993)中的方法。更具体而言，例如超声处理法、乙醇注入法、French压力法、乙醚注入法、胆酸法、钙融合法、冻融法、反相蒸发法等，但不限于此。本发明的脂质体的大小并没有特别的限制，通常优选平均为100～200nm，更优选100-150nm。脂质体的结构也没有特别的限定，单层、多层等任何脂质体均可。在脂质体的内部所含有的溶液，除水之外，可以使用缓冲液、生理盐水等。也可在其中添加适量的水溶性有机溶剂(例如丙三醇等)使用。
此外，为了将“含有调节性细胞配体的脂质体”靶向到目标位置，也可以将本发明的药物中所使用的脂质体的表面进行修饰。目标位置为例如肝脏、脾脏、淋巴结、骨髓、肺、眼、皮肤、眼、鼻等。
修饰脂质体表面的物质可为低分子化合物、高分子化合物、核酸、肽、蛋白质、糖链等。高分子化合物可为聚乙二醇等(参见例如特许第2948246号)。核酸可为例如识别目标细胞Toll样受体TLR-7或TLR-9的单链RNA或单链DNA以及这些核酸的衍生物等。蛋白质可为例如识别在抗原提呈细胞树突细胞(DC)或其前体细胞等目标细胞表面特异性表达的分子的抗体或受体等。用糖链修饰包括使用能与在DC细胞表面表达的甘露糖受体相结合的甘露糖结合脂质的修饰等(参见例如Copland，M.J.，et al.，(2003)Liposome delivery of antigento human dendritic cells，Vaccine，21883-890)。
将配体装入脂质体可通过常规方法进行。例如，如实施例所示，将脂质体成分和配体分别溶解到有机溶剂中，然后将其混合，通过加水就可得到含有调节性细胞配体的脂质体。但是，含有调节性细胞配体的脂质体的制备方法不限于上述方法。
“含有调节性细胞配体的脂质体”可作为药物的有效成分使用。
也就是说，由于“含有调节性细胞配体的脂质体”可诱导调节性细胞NKT或产生IL-10的Tr1细胞、具有抑制辅助T细胞活化的活性，并且具有抑制从B细胞释放IgE抗体产生的作用，因此本发明的药物作为IgE抗体所引起的过敏性疾病的预防剂或治疗剂是有效的。IgE抗体与过敏性疾病的关系特别密切，通过对其产生(分泌)进行抑制，能获得对I型过敏性疾病的预防或治疗效果。与IgE抗体相关的过敏性疾病包括特应性支气管哮喘、特应性皮炎以及过敏性鼻炎或花粉症等过敏性鼻炎。此外，在本发明中，过敏性疾病的预防不仅包括使包括未患过敏性疾病的人在内的哺乳动物不患该疾病，并且还包括暂时未出现症状的过敏性疾病患者(包括人在内的哺乳动物)中也不出现该症状。
另外，由于“含有调节性细胞配体的脂质体”具有抑制T细胞活化的作用，因此本发明的药物作为暴发性肝炎等疾病的预防剂或治疗剂也是有效的。
另外，由于含有α-半乳糖神经酰胺的脂质体具有选择性增强NKT细胞的免疫抑制机能的效果，因此含有作为有效成分的脂质体的药物作为具有免疫抑制能力的药物也是有效的，该脂质体含有α-半乳糖神经酰胺。具体而言，作为针对风湿病、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、胶原病等自身免疫疾病的药物，或者作为针对移植时出现的排异反应等GVHD的药物是有效的。
此外，α-半乳糖神经酰胺没有特别的限制，只要它能够结合NKT细胞表面受体、选择性增强NKT细胞的免疫抑制机能，优选结合在人中由Vα24JαQ、在小鼠中由Vα14Jα281构成的受体，分子量优选400～2000。
另一方面，本发明中所用的β-半乳糖神经酰胺优选分子量为400～2000。
本发明的另一个实施方案提供了含有将米喹莫特的脂质体作为有效成分的药物。由于脂质体中含有米喹莫特，与单独使用米喹莫特时相比，IL-10和IFN-α等的产量上升，由此NKT细胞被活化。因此，含有米喹莫特的脂质体作为有效成分的药物作为预防或治疗上述过敏性疾病的药物是有用的。
作为本发明的药物的给予途径，口服给予和非口服给予均可，由临床医生适当选择。另外，可单独或与通常使用的载体一起给予有效成份“含有调节性细胞配体的脂质体”。
口服给予本发明的药物时，药物的形态可为片剂、包被片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂等固体制剂，液剂(如滴眼剂、点鼻药等)，悬浊剂、乳剂、糖浆剂等液体制剂、气雾剂、雾化剂、喷雾剂等吸入剂以及脂质体封入剂等。
非口服给予本发明的药物时，药剂的形态可为在静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射以及腹腔内注射等中所使用的注射剂(液剂、悬浊剂等)、液剂、悬浊剂、乳剂、点滴剂等。
本发明的药物为液体制剂时，可冷冻保存或通过冷冻干燥等除去水分保存。冷冻干燥制剂在使用时加入注射用蒸馏水再次溶解后使用。
本发明的药物中所使用的可药用的载体为例如根据制剂的使用状态通常所使用的结合剂、分解剂、表面活性剂、吸收促进剂、保湿剂、吸附剂、润滑剂、填充剂、扩张剂、付湿剂、防腐剂、安定剂、乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐、缓冲剂等稀释剂或赋形剂，这些载体应根据得到的制剂的给药单位形态适当选择使用。
进一步而言，必要时本发明的药物中还可含有着色剂、防腐剂、香料、调味剂、甜味剂等其它医药品，可以药剂方式制备。
技术人员参照现有的技术可很容易地决定“含有调节性细胞配体的脂质体”的有效量，如体重1kg为0.1-100mg，优选1-10mg，可将其在1天里分1到3次给予，优选根据各种制剂的形态、患者的性别、年龄、疾病程度作适合调整。
实施例以下通过列举实施例说明本发明，但是本发明并不由这些实施例作任何限制，因此无需说明在本发明的技术领域里能进行常规改变。
实施例1《含有配体的脂质体的制备和活性测定》1.含有β-半乳糖神经酰胺的脂质体(Lipo-β)的制备将L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光纯药#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)盐酸碳酸酯-胆固醇(DC-Chol，cholesteryl3β-N-(dimethylaminoethyl)carbonate hydrochloride，SIGMA-Aldrich)0.83mg、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1，2-distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(polyethylene glycol)-2000]，AVANTI POLAR-LIPIDS，INC.#i88653)0.0029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶剂中。再将β-半乳糖神经酰胺(Ceramide β-D-galactoside，Sigma-Aldrich#C4905)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶剂中。然后，将两者混合、用蒸发器干燥后，在真空干燥器内干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超声破碎装置中处理1分钟后，用挤压机(AVESTIN；LiposoFast-Basic)通过加压过滤制备成颗粒，用孔径为0.22μm的膜灭菌。该脂质体组合物(Lipo-β)的最终浓度为200μl/ml。用相同的方法制备不含β-半乳糖神经酰胺的脂质体组合物(Lipo-0)。另外，将寡核苷酸CpGODN(1668)(SIGMA GENOSIS制备)以重量比1∶5混合在Lipo-β中之后，过脱盐柱NAP-10回收洗脱物Lipo-β-CpG。
2.含有米喹莫特的脂质体的制备将L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光纯药#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)盐酸碳酸酯-胆固醇(DC-Chol，SIGMA-Aldrich)0.83mg、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](AVANTI POLAR-LIPIDS，1NC.#i88653)0.029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶剂中。再将米喹莫特(Imiquimod，SequoiaResearch Products Ltd；SRP0058i)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶剂中。然后，将两者混合、用蒸发器干燥后，在真空干燥器内干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超声破碎装置中处理1分钟后，用挤压机(AVESTIN；LiposoFast-Basic)通过加压过滤制备成颗粒，用孔径为0.22μm的膜灭菌。该脂质体组合物(Lipo-Imq)的最终浓度为200μl/ml。用与制备上述组合物相同的方法再制备含有β-D-半乳糖神经酰胺(Sigma-Aldrich#C4905)的脂质体组合物(Lipo-Imq-βGC)。另外，将寡核苷酸CpGODN(1668)以重量比1∶5混合在Lipo-Imq中之后，过脱盐柱NAP-10回收洗脱物Lipo-Imq-CpG。
3.针对含有配体的脂质体的树突细胞(DC)的体外活性测定在BALB/c或C57BL/6 小鼠的脾脏中注入1mg/ml的胶原酶D(Roche)，在CO2培养箱内孵育45分钟。再将从脾脏中提取的细胞悬浮于3ml HistoDenz(14.1％，SIGMA)中后，将含有50μM 2-巯基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15(Takara Bio公司)覆于其上。1500rpm离心5分钟后，回收中间层的细胞，在含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培养基中、CO2培养箱内培养1小时30分钟。轻轻吹打后，除去未贴壁细胞，加入含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培养基，在CO2培养箱内培养18小时。将未贴壁细胞回收之后，回收与抗CD11c抗体磁性微球(Miltenyi)结合的细胞，此即脾脏CD11c+DC。在将1×104个CD11c+DC悬浮于200μl含有10％胎牛血清的RPMI培养基中后，添加最终浓度为1μg/ml脂质体组合物，在96孔U底微量培养板中，于37℃、含有5％CO2培养箱内培养。48小时后回收培养上清，用ELISA法测定IFN-α、IL-10、IL-12(图1、2)。在Lipo-β和Lipo-Imq添加组中，IL-10和IFN-α的产生较高，IL-12的产生较低，相反的是，在Lipo-β-CpG和Lipo-Imq-CpG添加组中，IL-10和IFN-α的产生较低，IL-12的产生较高。另一方面，在非添加组(对照组)以及Lipo-0或β-半乳糖神经酰胺(β-GalCer)溶液添加组中，全部细胞因子的产生不能检出或者值较低。另外，用相同的评估方法测定在Lipo-Imq-βGC的影响下CD11c+DC产生IL-10的产生能力，结果表明与仅有Lipo-β或仅有Lipo-Imq相比，具有显著提高的IL-10产生能力(图3)。
实施例2《Lipo-β抑制体内IgE抗体产生的效果》以2μg/只的用量腹腔内给予BDF1小鼠(5只/组)Lipo-β，第7天(0天)用DNP-OVA 0.1μg(Cosmobio)和氢氧化铝10mg进行初次免疫。初次免疫后第14天眼窝采血，用ELISA法测定小鼠血浆中的抗DNP-IgG1、-IgE、-IgG2a抗体效价(图4中的14天)。然后，在初次免疫后第35天仅用DNP-OVA抗原进行加强免疫，此后第7天眼窝采血，用ELISA法测定血浆中的抗DNP-IgG1、-IgE抗体效价(图4的42天)。在Lipo-β给予组中，在14天观察到对IgG1抗体和IgE抗体的产生已经具有抑制倾向，在加强免疫后的42天IgG1抗体和IgE抗体的增加被完全抑制。
实施例3《(给予Lipo-β的小鼠来源树突细胞(DC)对调节性T细胞的诱导作用》
1.体外的T细胞活化能力的评价2μg/只腹腔内给予BALB/c小鼠Lipo-β或生理盐水，7天后取出脾脏。将1mg/ml胶原酶D(Roche)注入脾脏，CO2培养箱中孵育45分钟。再将从脾脏中提取的细胞悬浮于3ml HistoDenz(14.1％，SIGMA)中后，将含有50μM 2-巯基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15覆于其上。1500rpm离心5分钟后，回收中间层的细胞，在含有50μM2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培养基中、于CO2培养箱内培养1小时30分钟。轻轻吹打后，除去未贴壁细胞，加入含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培养基，在CO2培养箱内培养18小时。将未贴壁细胞回收之后，回收与抗CD11c抗体磁性微球(Miltenyi)结合的细胞，此即脾脏CD11c+DC。用抗体磁性微球(Miltenyi)从OVA特异性TCRαβ转基因DO11.10小鼠(Science，1990，vol.250，p1720；从千叶大学研究生院医学研究院中山俊宪氏获得)的脾脏回收CD4+T细胞。然后将2×104个CD11c+DC和1×105个CD4+T细胞在OVA肽存在下于CO2培养箱内培养4天，然后回收培养上清，用ELISA法测定IFN-γ、IL-4和IL-10的产量(图5)。其结果是在使用给予Lipo-β小鼠脾脏来源的DC和给予生理盐水小鼠(正常)脾脏来源的DC时，未观察到IL-4和IFN-γ的产量存在差异，IL-10的产生仅仅在给予Lipo-β小鼠脾脏DC中、OVA肽浓度为3nM和30nM时才被检出。另外同时也确认了调节性细胞的增殖情况。
2.通过过继转移法对体内IgE抗体产生的抑制作用的评价回收在上述1.的体外实验中给予Lipo-β的小鼠来源脾脏DC和在OVA肽浓度为3nM或30nM下增殖的DO11.10-CD4+T细胞，将1×106个细胞转移到BALB/c小鼠(3只/组)的腹腔内。此后1个小时后，用DNP-OVA(10μg)和氢氧化铝(10mg)进行初次免疫，第14天进行眼窝采血。用ELISA法测定血浆中的抗DNP-IgG1、抗DNP-IgE、抗DNP-IgG2a各自的抗体效价(图6)。其结果是在用浓度为3nM的OVA肽刺激后增殖得到的DO11.10-CD4+T细胞过继转移的小鼠中，IgE抗体的产生被完全抑制。另一方面，在用浓度为30nM的OVA肽刺激后增殖得到的DO11.10-CD4+T细胞过继转移的小鼠中，对IgE抗体产生的抑制效果较低。另外，对IgG1抗体和IgG2a抗体的抑制在两组中均不显著。
实施例4《含有配体的脂质体的制备和活性测定》1.含有α-半乳糖神经酰胺的脂质体的制备将L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光纯药#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)盐酸碳酸酯-胆固醇(DC-Chol，SIGMA-Aldrich#C2832)0.83mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶剂中。然后再将α-半乳糖神经酰胺(独立行政法人理化学研究所免疫过敏科学综合研究中心制；KRN7000、参见国际公开小册子第98/44928号)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶剂中。然后，将两者混合、用蒸发器干燥后，在真空干燥器内干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超声破碎装置中处理1分钟，然后通过孔径为0.22μm的灭菌用膜。该脂质体组合物(Lipo-αGC)的最终浓度为200μg/ml。再用同样的方法制备不含有α-半乳糖神经酰胺的对照用脂质体组合物(Lipo-(-))。
2.Lipo-αGC的细胞因子产生能力的测定将C57BL/6小鼠脾脏的全细胞2×105个悬浮在200μl含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中，该培养基添加了100ng/ml的Lipo-(-)、Lipo-αGC或α-半乳糖神经酰胺水溶液(α-GalCer)，然后添加到96孔U底培养板中，于37℃、含有5％CO2的培养箱内培养2天。用ELISA法测定培养上清中的IFN-γ、IL-4、IL-10(图7上部分)。Lipo-αGC添加组的IF-γ、IL-4的产量与α-GalCer添加组相同，但是Lipo-α添加组的IL-10的产生大约是α-GalCer水溶液添加组的5倍。另外在最终浓度为10μg/ml的抗CDld中和抗体(1B1，BDBioscience Pharmingen)存在下进行相同的实验时，以及使用Vα14-NKT细胞缺失小鼠(C57BL/6本底)脾脏的全细胞时，在培养上清中不能检出IFN-γ、IL-4、IL-10(图7下部分)。
3-Lipo-αGC的Vα14-NKT细胞增殖能力的评价以2μg/小鼠腹腔内给予C57BL/6小鼠Lipo-αGC、作为对照的Lipo-(-)或生理盐水，第3天(DAY3)和第7天(DAY7)的脾脏中用α-GalCer/CD1d四聚体和抗TCRβ抗体染色双阳性的细胞(Vα14-NKT细胞)数用流式细胞术分析。其结果表明给予Lipo-α后DAY3的小鼠脾脏中Vα14-NKT细胞数相对于生理盐水组增殖了2倍以上，而在DAY7与给予对照的小鼠相比反而有所减少(图8)。
实施例5《Lipo-αGC的体内抗体产生的抑制效果》1.使用C57BL/6小鼠和IL-10缺失小鼠的体内抗体产生系统的活性评价以2μg/小鼠腹腔内给予C57BL/6小鼠(5只/组)生理盐水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3天用DNP-OVA和氢氧化铝免疫。免疫后第14天眼窝采血，用ELISA法测定小鼠血浆中的抗DNP-IgG1、-IgE、IgG2a抗体效价。其结果表明与α-GalCer给予组相比，在Lipo-αGC给予组中抗体产生的抑制效果就全部同种型而言有较高的倾向(图9上部分)。另外，用C57BL/6本底IL-10缺失小鼠进行同样的实验，结果没有观察到上述抗体产生的抑制效果(图9下部分)。
2.使用BDF1小鼠的体内抗体产生系统的活性评价以2μg/小鼠腹腔内给予BDF1小鼠(C57BL/6×DBA/2F1)(5只/组)生理盐水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3天(day0)用DNP-OVA和氢氧化铝进行初次免疫，初次免疫后第55天(day55)仅用DNP-OVA抗原进行加强免疫。分别在day0、14、55、64眼窝采血，用ELISA法测定小鼠血浆中的抗DNP-IgE、-IgG1、IgG2a抗体效价以及IgE、IgG1、IgG2a的总值。其结果表明Lipo-αGC给予组的全部同种型抗DNP抗体的效价的上升以及全部IgE的产生基本被完全抑制(图10)。另一方面，IgG1和IgG2a的总值变化在Lipo-αGC给予组和α-GalCer或Lipo-(-)给予组间基本相同(图10)。
3.使用BDF1小鼠的T细胞活化能力的评估以2μg/小鼠腹腔内给予BDF1小鼠生理盐水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3日用DNP-OVA和氢氧化铝进行初次免疫，此后第7天取出脾脏，用磁性微球(Miltenyi)制备CD4+T细胞。然后用20Gy放射线照射正常BDF1小鼠脾脏全细胞，制备抗原提呈细胞。在96孔U底培养板的1个孔内，加入200μl培养液，该培养液中悬浮了2×105个CD4+T细胞和用DNP-OVA脉冲的2×105个抗原提呈细胞，于37℃、含有5％CO2培养箱中培养。48小时后用MTT法(Promega#G4000)测定细胞增殖能力，结果表明给予Lipo-αGC的BDF1小鼠脾脏来源的CD4+T细胞针对所有浓度的DNP-OVA没有增殖能力，其他CD4+T细胞按照α-GalCer、生理盐水、Lipo-(-)的顺序增殖能力递增(图11左图)。另一方面，在37℃、含有5％CO2的培养箱内，分别用50ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA；Sigma-aldrich#P-1585)和500nM离子霉素(Sigma-aldrich，#I-0634)对2×105个CD4+T细胞施加48小时的抗原非特异性刺激时，给予Lipo-αGC的小鼠来源的CD4+T细胞与其他细胞相比，表现出虽然比较低但显著的增殖能力(图11右图)。
4.对给予Lipo-αGC的小鼠脾脏中树突细胞(DC)的分析4-1流式细胞术分析以2μg/小鼠腹腔内给予BALB/c小鼠生理盐水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3日取出脾脏。脾脏中注入1mg/ml胶原酶D(Roche)、CO2培养箱中孵育45分钟。再将从脾脏中提取的细胞悬浮于3ml HistoDenz(14.1％，Sigma-aldrich)中后，将含有50μM2-巯基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15培养基(CAMBREX Bio SicenceWalkerville，Inc.)覆于其上。1500rpm离心5分钟后，回收中间层的细胞，用含有50μM 2ME、10％FCS的X-VIVO 15培养基洗涤细胞后、悬浮于含有0.5％FCS的磷酸盐缓冲液(PBS)中，添加生物素化抗CD3、CD11b、CD19、CD49b、Gr-1、TER-119、B220抗体(以上购自BD Bioscience Pharmingen)。10℃孵育20分钟后，用含有0.5％FCS的PBS洗涤一次，然后添加结合磁性微球的链霉亲和素(SA，Miltenyi)。10℃孵育15分钟，接着用含0.5％FCS的PBS洗涤两次，然后用微球分离柱和磁石(以上购自Miltenyi)回收磁性微球阴性细胞。用PE标记抗CD11c抗体(BD Bioscience Pharmingen)和APC标记抗CD45RB抗体(BD Bioscience Pharmingen)将此细胞染色后，用流式细胞术分析。其结果是在给予Lipo-αGC的小鼠脾脏来源细胞中，CD45RBhighCD11clow细胞的比例比CD45RBlowCD11chigh细胞的比例高，与之相对的是，在给予生理盐水、Lipo-(-)或α-GalCer的小鼠来源的细胞中，该比例反而降低(图12)。此后换算脾脏中的细胞数，结果表明给予Lipo-αGC的小鼠脾脏中的CD45RBhighCD11clow细胞数较给予α-GalCer的小鼠脾脏中相应细胞数增加了大约三倍，与之相对的是，CD45RBlowCD11chigh细胞数在给予α-GalCer小鼠中的与给予Lipo-αGC小鼠的相比反而有所增加(图13)。
由于CD45RBhighCD11clow细胞被报道是调节性树突细胞的细胞群，能引起免疫抑制，相反，CD45RBlowCD11chigh细胞是活化T细胞的树突细胞，能引起免疫激活，因此认为NKT细胞的免疫抑制机能是由于CD45RBhighCD11clow细胞数的增加所引起的。
4-2细胞因子产生能力的评价用流式细胞仪(FACS Vantage SE、BD Bioscience)分别回收用上述1中所记载的方法分离得到的CD45RBhighCD11clow细胞团和CD45RBlowCD11chigh细胞团，在96孔U底培养板的1个孔内加入1×105个细胞/200μl培养液。在含有或不含最终浓度为1μg/ml脂多糖(LPS，T3382、Sigma-ald rich)的情况下将细胞培养2天。ELISA法测定培养上清中的细胞因子IL-10和IL-12的结果是在LPS刺激的CD45RBhighCD11clow细胞的培养上清中检出IL-10，而未检出IL-12，另一方面不管有无LPS刺激，在CD45RBlowCD11chigh细胞的培养上清中检出IL-12，而未检出IL-10(图14)。
4-3T细胞活化能力的评价在96孔U底培养板的1个孔内以1×104个细胞/200μl培养液加入通过上述2中所述的方法分离得到的CD45RBhighCD11clow细胞或CD45RBlowCD11chigh细胞，然后以4×105个细胞/200μl培养液加入用磁性微球(Miltenyi)从DO11.10小鼠脾脏纯化得到的CD4+T细胞。在添加或未添加最终浓度为600nM OVA323-339肽的条件下，于37℃、含5％CO2培养箱内培养。48小时后，用MTT法(Promega#G4000)测定细胞增殖能力，结果表明CD45RBhighCD11clow细胞和OVA肽刺激的CD4+T细胞与CD45RBlowCD11chigh细胞所引起的增殖能力相比，略为逊色，但增殖能力依然很强(图15)。在培养第7天回收用CD45RBhighCD11clow细胞和OVA肽刺激增殖得到的CD4+T细胞，在添加OVA肽条件下，与刚刚分离回收得到的CD45RBhighCD11clow细胞或CD45RBlowCD11chigh细胞进行两个7天的培养，之后第5天用流式细胞术分析培养液中的细胞。其结果表明增殖的细胞群为CD4+CD25+CD28+CD152-ICOS+基本均一的细胞团(图16)。然后在最终浓度PMA为50ng/ml、离子霉素为500nM以及莫能霉素(Monensin，Sigma-aldrich#M-5273)为2μM存在下将5×105个该细胞于37℃、含有5％CO2培养箱内培养4小时。回收细胞后，悬浮于100μl BD Cytofix/Cytoperm液(BD Bioscience)中，4℃孵育15分钟。用BD Perm/Wash液(BD Bioscience)洗涤后，用FITC标记抗IFN-γ抗体、PE标记抗IL-4抗体(BD Bioscience Pharmingen)和APC标记抗IL-10抗体(BD Bioscience Pharmingen)进行细胞内三重染色，并且采用与之相同的荧光标记的同种型对照抗体进行细胞内三重染色(图17上部分)，用流式细胞术分析。其结果表明在表达细胞因子的细胞群中，仅仅表达IL-4的细胞基本不存在，并且依照仅仅表达IFN-γ的细胞、表达IL-10和IFN-γ的细胞、仅仅表达IL-10的细胞的顺序，细胞数增多(图17下部分)。
实施例6《含有过敏原和调节性细胞配体的脂质体对IgE抗体产生的抑制效果》1.含有卵白蛋白和α-半乳糖神经酰胺的脂质体的制备将L-α-二油酰磷脂酰胆碱(DOPC，和光纯药)0.77mg和3β-N-(二甲基氨乙基)盐酸碳酸酯-胆固醇(DC-Chol，Sigama-Aldrich)0.83mg和1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(PEG-PE；Avanti Polar Lipids)0.029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶剂中。然后再将α-半乳糖神经酰胺(独立行政法人理化学研究所免疫过敏科学综合研究中心制)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶剂中。然后，将两者混合、用蒸发器干燥后，在真空干燥器内干燥一晚上。然后添加200μl卵白蛋白(OVA，生化学工业)浓度为0.4mg/ml的水溶液，置于超声破碎装置中处理10分钟后，然后通过孔径为0.22μm的灭菌用膜。然后在装有孔径为100nm的聚碳酸酯膜的LiposoFast-Basic挤压机(Avestin Inc.)上通过25次，借此制备成颗粒。用Amicon Ultra-4离心过滤器(PL-100)(Millipore)对封入OVA的脂质体进行浓缩，并用纯水洗涤以除去未封入脂质体的OVA蛋白质，最后用纯水调整成为800μl水溶液。含有该脂质体组合物(Lipo-αGC+OVA)的水溶液用SDS电泳分析，结果表明OVA蛋白质浓度为50μg/ml。另外假定α-GalCer完全进入脂质体膜内，那么Lipo-αGC+OVA溶液中的α-GalCer的最终浓度为200μg/ml。
2.Lipo-αGC+OVA对产生IL-10的调节性CD4+T细胞的诱导BDF1小鼠(C57BL/6×DBA/2F1)腹腔内给予Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA(以α-GalCer的量计相当于2μg)后，第7日取出脾脏，用磁性微球(Miltenyi)制备CD4+T细胞。然后用20Gy的放射线照射正常BDF1小鼠脾细胞，制备抗原提呈细胞。在6孔U底培养板的1个孔中，添加3ml培养液和1.5×106个CD4+T细胞以及7.5×106个抗原提呈细胞，并添加最终浓度为100μg/ml的OVA蛋白质的，在37℃、含5％CO2的培养箱内培养6天。然后在最终浓度PMA为50ng/ml和离子霉素为500nM以及莫能霉素(Sigma-aldrich)为2μM存在下将5×105个细胞于37℃、含有5％CO2培养箱内培养4小时。回收细胞后，用生物素化抗CD4抗体和链霉亲和素-Per CP-Cy5.5(BD Bioscience)染色。然后在100μl BD Cytofix/Cytoperm液(BD Bioscience)中悬浮，4℃孵育15分钟。用BD Perm/Wash液(BDBioscience)洗涤后，用FITC标记抗IFN-γ抗体、PE标记抗IL-4抗体(BD Bioscience Pharmingen)和APC标记抗IL-10抗体(BDBioscience Pharmingen)进行细胞内染色，用流式细胞术分析(图18)。其结果是在给予未封入OVA的Lipo-αGC的小鼠脾细胞来源的CD4+T细胞中，检出1.4％的细胞仅表达IL-4、1.1％的细胞仅表达IFN-γ，而基本没有检出仅产生IL-10、或者同时产生IL-10和IFN-γ两者的CD4+调节性T细胞团。另一方面，在给予Lipo-αGC+OVA的小鼠脾细胞来源的CD4+T细胞的分析中，检出仅表达IL-4(1.0％)、仅表达IFN-γ(9.9％)的辅助T细胞团和产生IL-10的CD4+调节性T细胞(14.1％)、IL-10和IFN-γ两者均表达的CD4+调节性T细胞(9.1％)。以上结果提示含有过敏原的Lipo-αGC能使具有抑制IgE产生作用的过敏原特异性CD4+调节性T细胞在体内分化增殖。
3.Lipo-αGC+OVA对小鼠二次抗体应答的抑制效果用DNP-OVA(0.1μg)和氢氧化铝凝胶(2mg)初次免疫BDF1小鼠，之后，第14天测定血液中抗-DNP-IgE抗体效价，将平均抗体效价相同的组分为3组(5只/组)。初次免疫后第21、28、35天，分别腹腔内给予以α-GalCer的量计相当于2μg的单独的脂质体(载体)、Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA。初次免疫后第42天仅用DNP-OVA抗原进行加强免疫，用ELISA法测定第48日的血液中DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗体效价以及IgE、IgG1、IgG2a的全值(图19)。其结果是在Lipo-αGC+OVA给予组中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗体效价被显著抑制。另一方面，在不含OVA的Lipo-αGC给予组中，没有观察到除抗DNP-IgG1以外的抗体效价被显著抑制。以上结果提示，含有过敏原的Lipo-αGC能抑制由于过敏原所引起的二次抗体产生。
工业实用性本发明的“含有调节性细胞配体的脂质体”由于能诱导调节性细胞的分化增殖以及活化，因此具有抑制辅助T细胞的活化作用以及IgE抗体产生的作用。因此，作为IgE抗体密切相关的I型过敏性反应所引起的过敏性疾病，特别是特应性支气管哮喘、特应性皮炎以及花粉症等过敏性鼻炎和结膜炎的预防剂和治疗剂是有用的。
另外，由于“含有α-半乳糖神经酰胺的脂质体”通过选择性增强NKT细胞的免疫抑制机能，能抑制病原性T细胞的分化增殖，因此作为针对自身免疫疾病或移植物抗宿主病等的药物也是有用的。
另外，由于本发明的药物不仅保持了选择性结合目标细胞的分子，而且在脂质膜内含有细胞配体的脂质体作为有效成分，因此没有令人担心的副作用。
权利要求
1.含有调节性细胞配体的脂质体作为有效成分的药物。
2.权利要求1所述的药物，其中调节性细胞为NKT细胞。
3.权利要求1或2所述的药物，其中调节性细胞配体为β-半乳糖神经酰胺。
4.权利要求1或2所述的药物，其中调节性细胞配体为α-半乳糖神经酰胺。
5.权利要求1到4任一项所述的药物，其中所述脂质体进一步含有CpG寡核苷酸或咪喹莫特。
6.权利要求1到5任一项所述的药物，其中所述脂质体进一步含有过敏原。
7.权利要求1到6任一项所述的药物，为免疫疾病的预防剂或治疗剂。
8.权利要求7所述的药物，其中免疫疾病为过敏性疾病。
9.权利要求8所述的药物，其中过敏性疾病为特应性支气管哮喘、过敏性鼻炎、花粉症或特应性皮炎。
10.权利要求4所述的药物，为自身免疫疾病或移植物抗宿主病的预防剂或治疗剂。
11.含有调节性细胞配体的脂质体作为有效成分的调节性细胞诱导剂。
全文摘要
含有α－半乳糖神经酰胺、β－半乳糖神经酰胺等调节性细胞配体的脂质体作为预防或治疗免疫疾病等疾病的药物的有效成分。
文档编号A61K31/7088GK1997395SQ200580019128
公开日2007年7月11日 申请日期2005年6月3日 优先权日2004年6月11日
发明者石井保之, 野泽理咲, 谷口克 申请人:独立行政法人理化学研究所