生长激素释放激素增强疫苗接种应答的制作方法

专利名称：：生长激素释放激素增强疫苗接种应答的制作方法背景本申请要求美国临时专利申请序列号60/590,739的优先权，所述临时专利申请的标题为“GROWTHHORMONERELEASINGHORMONEENHANCESVACCINATIONRESPONSE”，于2004年7月23日提交，所列出的发明人有Ruxandra、Draghia-Akli、PatriciaA.Brown、AmirS.Khan和WilliamC.Davis，其全部内容引入本文作为参考。本发明涉及下述组合物及方法对受试者进行疫苗接种；增强疫苗接种的效能；在接种疫苗之前准备受试者；以及改善接种了疫苗的受试者在感染性攻击后的临床结果。更具体而言，本发明涉及在将疫苗递送给受试者之前或与之相伴地将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸构建体递送到受试者组织中，其中GHRH在受试者体内表达，并且受试者包括人、猪、牛、鸟或接受疫苗的其他任何动物种类。传染病在人和动物中仍然是一个重大问题。因此，需要适合年龄的抗生素选择，和特异性疫苗以及其他免疫增强疗法的临床效力的评估。大量的努力致力于疾病的预防而不是治疗。每年对于疫苗接种的市场超过200亿美元。众多报道指出神经内分泌和免疫系统之间相互依赖的关系。下丘脑的GHRH刺激垂体前叶分泌生长激素(“GH”)，但近期研究也已证实这种肽的免疫调节特性(Siejka等人，2004)。GHRH在生理和病理条件下调节免疫状态的重要性(Marshall等人，2001)已得到描述，通过刺激GH/胰岛素样生长因子-I(“IGF-I”)轴和直接作为免疫调节剂(Dialynas等人，1999；Khorram等人，2001)。GHRH在免疫系统的发育和调节中是必需的。然而，关于GHRH究竟真正如何介导那些作用或GHRH治疗对疫苗接种和病原体攻击的影响，仍然还缺乏细节。生长激素释放激素(“GHRH”)和生长激素(“GH”)轴为了更好地理解利用GHRH质粒介导的补充给药法作为增强特异性疫苗接种应答和改善感染性攻击后的临床结果的方法，将提及关于GHRH/GH轴的机制和目前的了解。尽管不希望被理论束缚，但GH的中心作用是控制人和其他脊椎动物的躯体生长。调节垂体分泌GH的生理学相关途径完全是本领域众所周知的。GH途径基因包括(1)配体，例如GH和IGF-I；(2)转录因子，例如pit1的前体(prophet)，或prop1，和pit1；(3)激动剂和拮抗剂，例如分别为GHRH和生长激素释放抑制激素(“SS”)；以及(4)受体，例如GHRH受体(“GHRH-R”)和GH受体(“GH-R”)。这些基因在不同的器官和组织中表达，包括下丘脑、垂体、肝脏和骨骼。GH途径的有效且受调节的表达是最佳线性生长，以及碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢的体内稳态所必需的。GH从垂体前叶的合成及分泌受到GHRH的刺激并受到生长激素释放抑制激素的抑制，这两种均为下丘脑激素。GH增加了IGF-I的产生，主要在肝脏以及其他靶器官中。反过来，IGF-I和GH反馈作用于下丘脑和垂体以抑制GHRH和GH释放。GH引发了对外周组织的直接和间接作用，间接效应主要由IGF-I介导。GHRH和免疫功能质粒介导的GHRH补充给药法在由于疾病或各种治疗方案而免疫系统低下的动物中已显示出具有各种免疫刺激作用(Dorshkind和Horseman，2001)。研究表明，免疫系统细胞产生GHRH、GH和IGF-I(Burgess等人，1999)，这提示免疫功能可能被自分泌和旁分泌机制调节。这还提示，在老年人中发病率增加例如呼吸系统疾病可能归因于伴随衰老而发生的改变GH/IGF-I产生减少、IGF-I可用性减少以及免疫监视特别是T细胞介导的免疫监视减少(Gelato，1996；Krishnaraj等人，1998)。相反地，在老年人中施用GHRH或其类似物，在治疗后短期和长期均导致显著的免疫增强效应。这些效应包括淋巴细胞、单核细胞、B细胞以及表达T细胞受体αβ和T细胞受体γδ的细胞的数目增加(Khorram等人，1997)。在无免疫应答的患者中，例如在骨髓移植后，IGF-I的施用可以增强淋巴和骨髓的重建(Alpdogan等人，2003)。同样地，疾病和疫苗接种的动物模型研究显示出，GH的体内施用可以有效地准备好巨噬细胞并增加对病原体的抵抗力(Sakai等人，1997)。在不同动物模型和人中的几项研究已显示，GHRH具有免疫刺激作用，其是通过刺激GH轴和直接作为免疫调节剂(Dialynas等人，1999；Khorram等人，2001)。已知GH直接地或通过由GH诱导的IGF-I而增强免疫应答。近来，发现GH促分泌素(“GHS”)诱导了通过垂体腺产生GH，还决定了年老小鼠中胸腺细胞构成(cellularity)以及分化的统计学上显著的增加。当接种可移植的淋巴瘤细胞系EL4时，经处理的年老小鼠对肿瘤发生和后续的转移显示出统计学上显著的抵抗力。在经处理的小鼠中对于EL4细胞的CTL的产生也是增强的，这提示GHS具有相当大的免疫增强作用(Koo等人，2001)。免疫功能还由IGF-I调节，它对B细胞发育具有两个主要作用增强和成熟，以及作为与白介素-7一起工作的B细胞增殖辅助因子。这些活性通过使用抗IGF-I抗体、针对IGF-I的反义序列以及使用重组IGF-I以替代活性来鉴别。用重组IGF-I处理小鼠证实了这些观察，因为它增加了骨髓中pre-B和成熟B细胞的数目(Jardieu等人，1994)。成熟B细胞保留了对IGF-I的敏感性，因为免疫球蛋白的产生在体外和体内也受IGF-I刺激(Robbins等人，1994)。在衰老的哺乳动物中，GHRH-GH-IGF-I轴经历相当大的减退，与骨骼肌质量损失(肌肉减少(sarcopenia))、骨质疏松症、关节炎、脂肪沉淀增加和瘦体重减少相关的GH分泌和IGF-I产生减少(Caroni和Schneider，1994；Veldhuis等人，1997)。已证实这些改变的形成可以通过重组GH疗法来抵消。致力于感染风险增加和消瘦的治疗在患者健康和生活质量中将会是一个主要的前进步骤。在最近20年中重组蛋白质的产生提供了治疗许多不同病状的有用工具。例如，在身材矮小症儿童中的GH缺乏，在烧伤、败血病和AIDS患者中的同化激素类药。然而，对GH作用的抗性已在营养不良和感染中得到报道。然而，当前的GH疗法具有几个缺点，包括频繁的皮下或静脉内注射、胰岛素耐受性和葡萄糖耐量降低(Rabinovsky等人，1992)；儿童还易遭受骺过早闭合以及首股骨骺滑脱(Liu和LeRoith，1999)。已开发出只需要每14天注射一次的“缓慢释放”形式的GH(来自Genentech)。然而，这种GH产品似乎扰乱了正常生理学脉动的GH特性，并且还与时常发生的副作用相关。生长激素释放激素对生长激素或生长激素释放肽(“GHRP”)GH和GHRH目前在治疗上作为重组蛋白质施用。关于GH及其受体之间的相互作用的当前认识提示，循环性GH的分子异质性可能具有重要的体内稳态关联。已提出，包括胰岛素抗性在内的不良反应可能起因于外源性GH提高了基础GH血清水平并且消除了自然的GH偶发性脉动。研究已显示，GHRH的连续输注恢复了正常的GH脉动模式，而不会使GHRH受体脱敏或损耗人、绵羊或猪中的GH供应(Dubreuil等人，1990；Vance等人，1989；Vance等人，1985)。同时，这个系统能够反馈，这在GH疗法中被完全消除。事实上没有关于GHRH疗法的副作用的报道(Thorner等人，1986a)。因此，GHRH疗法可能比GH疗法更符合生理学。GHRP在临床中用于在人类中短期刺激GH和IGF-I。海沙瑞林(hexarelin)，一种有效且充分研究的GHRP，能够在正常个体中引起明显的GH释放。在人类中GH对海沙瑞林的应答在长期施用后变得具有较为明显的减弱。尽管这种减弱是局部的且可逆的，但它可以严重限制海沙瑞林和类似药剂潜在的长期治疗用途(Rahim和Shalet，1998)。与疫苗相结合的使用海沙瑞林的长期治疗是刺激免疫功能所必需的。随着GH释放药剂的开发及其在人受试者中的应用，很明显这些药剂对于GH释放不是特异的。在人中更近来的研究已证实，在施用GHRP(海沙瑞林，MK-0677)后(Schleim等人，1999)发生了促肾上腺皮质激素(ACTH)(Ghigo等人，1999)、皮质醇和催乳素(PRL)(Svensson和Bengtsson，1999)的急剧增加。在使用GHRP和类似药剂的长期治疗过程中，短暂的(甚至轻微的)高催乳素血症和高皮质醇血症的反复发作的潜在不良反应引起了关注，需要进一步的研究，并且在面对感染性攻击的患者中是不希望的(Rahim等人，1999)。相反地，基本上没有关于重组GHRH疗法的副作用的报道。颅外分泌的GHRH，作为成熟肽或截短的分子(如具有胰岛细胞瘤和各种定位的类癌时可见)，通常是具有生物学活性的并且甚至可以产生肢端肥大症(Esch等人，1982；Thorner等人，1984)。对缺乏GH的儿童或成人施用重组GHRH增加了IGF-I的水平，与GHRH剂量成比例地增加了GH分泌，还引起了对大剂量重组GHRH的应答(Bercu和Walker，1997)。因此，施用GHRH代表了用于增加低于正常的GH和IGF-I水平的更符合生理学的选择方案(Corpas等人，1993)。尽管重组GHRH蛋白疗法产生并刺激基本上没有副作用的正常的周期性GH分泌，但GHRH在体内短暂的半衰期要求频繁的(一天1-3次)静脉内、皮下或鼻内(要求高300倍的剂量)施用。因此，作为长期治疗，施用GHRH不可行。野生型GHRH在人(Frohman等人，1984)和家畜的循环系统中具有相对短暂的半衰期。在血浆中孵育60分钟后，95％的GHRH(1-44)NH2被降解，而该激素的更短的(1-40)OH形式在类似条件下孵育时，在孵育60分钟后只显示出77％的肽降解(Frohman等人，1989)。在治疗性核酸载体中整合入编码特定蛋白酶抗性GHRH类似物的cDNA，产生了在血清中具有更长半衰期并且效力增加的分子，并在注射了质粒的动物中提供了更大的GH释放(Draghia-Akli等人，1999)，此处引用作为参考。通过蛋白酶敏感性氨基酸的氨基酸替代进行诱变延长了GHRH分子的血清半衰期。此外，GHRH的生物学活性的增强通过使用可以增加其与特异性受体的结合亲和力的强效类似物来达到(Draghia-Akli等人，1999)。家畜中的生长激素(“GH”)和生长激素释放激素(“GHRH”)重组GH或重组GHRH的施用已在受试者中使用多年，但不是作为用于刺激疫苗接种后的应答或改善感染性攻击后的临床结果的途径。更具体而言，家畜中的重组GH治疗已显示出可增强无脂肪组织沉积和/或乳汁产生，同时增加饲料转化效率(Etherton等人，1986；Klindt等人，1998)。众多研究已显示，重组GH显著减少屠体的脂肪量；并且因此增加了产品的品质。然而，长期的GH施用具有实践、经济和生理学的局限性，这潜在地减少弱了其有用性和功效(Chung等人，1985；Gopinath和Etherton，1989b)。在实验中，重组GH释放激素(“GHRH”)已被用作更符合生理学的替代方案。GHRH在大的动物种类(例如猪或牛)中的使用不仅增强了生长表现和乳汁产生，而且更重要地，从实践和代谢的观点来看增强了生产效率(Dubreuil等人，1990；Farmer等人，1992)。例如，在泌乳母猪中使用重组GHRH对于刚断奶的小猪的生长具有有利的影响，然而GHRH发挥其全部潜力还需要最佳营养和激素条件(Farmer等人，1996)。GHRH和GH的施用刺激乳汁产生，伴随着饲料向乳汁转化的增加。这种疗法主要通过增加瘦体重(Lapierre等人，1991；vanRooij等人，2000)并同时全面改进饲料转化效率来增加生长。通过施用GHRH和GH，热和冷的屠体重量增加并且屠体脂质(软组织质量的百分比)减少(Etherton等人，1986)。转基因递送和体内表达尽管不希望被理论束缚，但向躯体组织递送特定转基因以校正先天或后天的缺乏和不平衡是可能的。此类基于转基因的递送提供了许多超过施用重组蛋白质的优点。这些优点包括保持天然蛋白质结构；改进生物学活性；避免全身毒性；以及避免有传染性和毒性的杂质。因为蛋白质被连续合成并分泌到循环中，所以质粒介导的疗法允许在治疗范围内的蛋白质的延长产生。相反，使用重组蛋白质的首要局限是在每次施用后蛋白质的有限的生物利用率。在基于质粒的表达系统中，除编码治疗性基因产物的核酸之外，非病毒载体可以包含合成的转基因递送系统。这样，可以避免与大多数病毒载体使用相关的风险，包括能够诱导针对靶组织或病毒载体的免疫应答的病毒蛋白质表达，以及DNA突变或激活癌基因的可能性。由于使用“物种特异性”组分用于基因递送，因而非病毒表达载体产物一般具有低毒性，这将由质粒所靶向的免疫原性和表达丧失的风险降至最低。另外，迄今为止在体内没有报道质粒序列以超过自发突变速度而明显整合入宿主染色体中，因此这种类型的治疗应当不会激活癌基因也不会失活肿瘤抑制基因。因为附加型系统存在于染色体外，所以质粒具有指定的药物动力学和清除特性，导致基因表达在靶组织中的持续时间有限。利用良好的制造实践技术易于制造质粒载体。与病毒载体相比较它们具有低的风险/利益比，如于2003年3月13-14日在由AmericanSocietyofGeneTherapy(ASGT)和FoodandDrugAdministration’sCenterforBiologicsEvaluationandResearch(FDA/CBER)发起的研讨会上所提出的(Frederickson等人，2003)。当前，直接的质粒DNA基因转移是许多涌现的核酸疗法策略的基础并且不需要病毒组分或脂质颗粒(Aihara和Miyazaki，1998；Muramatsu等人，2001)。骨骼肌是靶组织，因为肌纤维具有长的寿命并且可以由在免疫活性宿主中表达的环状DNA质粒来转导(Davis等人，1993；Tripathy等人，1996)。质粒DNA构建体对于进入受试者骨骼肌中的直接治疗来说是有吸引力的候选物，因为构建体是非常明确的实体，其是生物化学稳定的并且已成功使用了很多年(Acsadi等人，1991；Wolff等人，1990)。在直接质粒DNA注射后编码产物的相对低的表达水平有时足以表明被分泌的肽的生物活性(Danko和Wolff，1994；Tsurumi等人，1996)。以前的报道显示，在小鼠中通过质粒可以将人GHRHcDNA递送至肌肉，在那里它短暂地刺激GH分泌至适当的程度超过2周的时间(Draghia-Akli等人，1997)。质粒介导的GHRH补充给药法刺激免疫功能在健康犬中的初步研究提示，单次施用GHRH质粒到骨骼肌中将确保生理学GHRH表达数月(Draghia-Akli等人，2003a)。设计了一项初期研究以评估基于质粒的GHRH治疗在年老的或受癌症折磨的伴侣犬中产生有利效果的能力，以及评估治疗方案的长期安全性。对16只受癌症折磨的犬施用了肌肉特异性的GHRH表达质粒。最初的56天评价(Draghia-Akli等人，2002a)证实GHRH生物活性指示剂即IGF-I的血清浓度增加。在经处理的动物中发现循环淋巴细胞水平显著增加。在极度衰弱的年老犬和具有自发产生的肿瘤的伴侣犬中进行了进一步的先导研究。在这种情况下，发现IGF-I水平在治疗后升高了超过365天。为了这项研究的纵向继续，包括了可以在治疗后被分析至少180天的犬。除了血液学参数的改善和维持之外，还观察了体重、活跃水平和运动耐力的增加。经处理的犬的全面长期评估显示出生活质量的改善，这种改善在研究期间自始至终都保持。这些结果暗示了质粒介导的GHRH治疗在逆转与衰老和癌性贫血和/或恶病质相关的分解代谢过程中的作用，并且暗示了被改善的健康状态可能与刺激了免疫功能相关。质粒递送和电穿孔已付出努力以便通过物理方法(包括电穿孔、声波穿孔和压力)来增强质粒DNA向细胞的递送。尽管不希望被理论束缚，但通过电穿孔施用核酸构建体包括施加脉冲电场以在细胞膜中产生瞬时的孔而不会导致细胞的永久性损伤，这允许外源性分子进入细胞(Smith和Nordstrom，2000)。通过调整由电穿孔系统产生的电脉冲，核酸分子可以穿过在操作过程中产生的细胞中的通道或孔。于1998年1月6日颁发、标题为“Electroporationandiontophoresiscatheterwithporousballoon”、Hofmann等人列为发明人的美国专利5,704,908描述了用于在患者身体内的腔中于选定位置处将分子递送给细胞的电穿孔设备。类似的脉冲电压注射装置还在下述专利文献中得到描述于1997年12月30日颁发、标题为“Needleelectrodesformediateddeliveryofdrugsandgenes”、Hofmann等人列为发明人的美国专利5,702,359；于1995年8月8日颁发、标题为“Electroporationsystemwithvoltagecontrolfeedbackforclinicalapplications”、Hofmann列为发明人的美国专利5,439,440；于1996年5月5日公开、标题为“ElectroporeticGeneandDrugTherapybyInducedElectricFields”、Hofmann等人列为发明人的PCT申请WO/96/12520；于1996年4月25日公开、标题为“FlowThroughElectroporationApparatusandMethod”、Hofmann等人列为发明人的PCT申请WO/96/12006；1995年7月27日公开、标题为“ElectroporationandIontophoresisApparatusandMethodForinsertionofDrugsandgenesintoCells”、Hofmann列为发明人的PCT申请WO/95/19805；以及于1997年3月6日公开、标题为“InVivoElectroporationofCells”、Nicolau等人列为发明人的PCT申请WO/97/07826，上文列举的每一篇参考文献的整体内容引入本文作为参考。近来，利用电穿孔技术获得了增强质粒体内递送以及随后达到分泌型蛋白质的生理学水平的重要进展。电穿孔已非常成功地用于在注射质粒后转染肿瘤细胞(Lucas等人，2002；Matsubara等人，2001)或在人中将抗肿瘤药物博来霉素递送给皮肤和皮下肿瘤(Gehl等人，1998；Heller等人，1996)。电穿孔还在小鼠(Lesbordes等人，2002；Lucas等人，2001；Vilquin等人，2001)、大鼠(Terada等人，2001；Yasui等人，2001)和犬(Fewell等人，2001)中广泛用于递送编码各种激素、细胞因子或酶的治疗性基因。利用GHRH的先前研究显示，使用电穿孔的质粒疗法是可扩缩的并且代表了在大型动物和人中诱导蛋白质的产生和受调节的分泌的有希望的方法(Draghia-Akli等人，1999；Draghia-Akli等人，2002c)。电穿孔还已经广泛用于啮齿动物和其他小型动物中(Bettan等人，2000；Yin和Tang，2001)。肌内注射质粒后进行电穿孔已在反刍动物中成功用于接种疫苗的目的(Babiuk等人，2003；Tollefsen等人，2003)。已观察到，电极构造影响电场分布以及后续结果(Gehl等人，1999；Miklavcic等人，1998)。尽管不希望被理论束缚，但在大型动物模型中与外部钳状电极相比，针状电极一致地产生更好的结果并且可以用于人类。电穿孔增强将质粒摄入骨骼肌内的能力已被充分证明。类似地，观察到用聚L-谷氨酸(“PLG”)或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)配制的质粒具有增加的质粒转染，这从而增加了所需转基因的表达。例如，观察到用PLG或PVP配制的质粒使小鼠、大鼠和犬的骨骼肌中的基因表达增至高达10倍(Fewell等人，2001；Mumper等人，1998)。尽管不希望被理论束缚，但阴离子聚合物PLG钠增强了在低质粒浓度下的质粒摄取并减少了由该操作引起的任何可能的组织损伤。PLG是稳定的化合物并且它对相对较高的温度有抵抗力(Dolnik等人，1993)。PLG已用于增加抗癌药物的稳定性(Li等人，2000)，并且在受伤和组织修复过程中作为“胶”使伤口闭合或阻止组织出血(Otani等人，1996；Otani等人，1998)。PLG已用于增加疫苗制剂的稳定性(Matsuo等人，1994)而不增加其免疫原性。PLG还已经在抗原吸入或暴露于臭氧后用作抗毒素(Fryer和Jacoby，1993)。尽管不希望被理论束缚，但PLG增加了电穿孔过程中的质粒转染，不仅通过稳定质粒DNA以及促进经过膜孔的胞内运输，还通过活性机制。例如，细胞上带正电荷的表面蛋白质可以通过蛋白质-蛋白质相互作用而与连接至质粒DNA的带负电荷的PLG复合。当施加电场时，表面蛋白质倒转方向并且活跃地内在化DNA分子，这个过程实质上增加了转染效率。此外，PLG还将会防止与体内质粒递送相关的肌肉损伤(Draghia-Akli等人，2002b)，并且将会增加注射前质粒的体外稳定性。存在旨在用线性DNA对真核细胞进行电穿孔的研究(McNally等人，1988；Neumann等人，1982)(Toneguzzo等人，1988)(Aratani等人，1992；Nairn等人，1993；Xie和Tsong，1993；Yorifuji和Mikawa，1990)，但这些例子只举例说明了转染入细胞悬液、细胞培养物等之中，而此类经转染的细胞不存在于躯体组织中。美国专利号4,956,288旨在用于制备包含高拷贝数的外源DNA的重组宿主细胞的方法，该方法包括在外源DNA存在下对一群细胞进行电穿孔，培养所述细胞，和杀死具有低拷贝数的外源DNA的细胞。尽管不希望被理论束缚，但GHRHcDNA可以与可注射的肌源性表达载体一起递送给小鼠肌肉，其中它可以短暂地刺激GH分泌超过2周的时间(Draghia-Akli等人，1997)。这种可注射的载体系统通过整合入与新型蛋白酶抗性GHRH分子(pSP-HV-GHRH)(Draghia-Akli等人，1999)偶联的强有力的合成肌肉启动子(Li等人，1999)而得到优化，所述GHRH分子具有实质上更长的半衰期和更大的GH分泌活性。优化高效的电穿孔技术以将核酸构建体递送给动物的骨骼肌(Draghia-Akli等人，2002b)。利用载体设计和电脉冲质粒递送方法的这种组合，发明人能够在猪中显示出生长加速以及经有利修饰的机体组成(Draghia-Akli等人，1999；Draghia-Akli等人，2003b)。经修饰的GHRH核酸构建体在患有癌症和与癌症治疗相关的贫血的伴侣动物中增加了红细胞的产生(Draghia-Akli等人，2002a)。在猪中，可获得的数据提示，经修饰的猪HV-GHRH类似物(SEQID#1)在促进生长和积极的机体组成改变方面比野生型的猪GHRH更有效(Draghia-Akli等人，1999)。已经报道了，为了增加生长激素释放的目的而施用新型GHRH类似物蛋白(美国专利号5,847,066；5846,936；5,792,747；5,776,901；5,696,089；5,486,505；5,137,872；5,084,442，5,036,045；5,023,322；4,839,344；4,410,512，RE33,699)或者合成或天然发生的GHRH肽片段。已经报道了包含下述突变的GHRH类似物(美国专利号5,846,936)第1位的Tyr突变为His；第2位的Ala突变为Val、Leu或其他；第8位的Asn突变为Gln、Ser或Thr；第15位的Gly突变为Ala或Leu；第27位的Met突变为Nle或Leu；以及第28位的Ser突变为Asn。该GHRH类似物是于2003年4月22日颁发、标题为“Super-activeporcinegrowthhormonereleasinghormoneanalog”、Schwartz等人列为发明人的美国专利6,551,996(“‘996专利”)的主题，它教导了包含突变的GHRH类似物的应用，所述突变能改善引起生长激素释放的能力。此外，‘996专利申请涉及利用施用生长激素释放激素类似物来治疗生长不足；改善生长表现；在动物中刺激以比与正常生长相关的水平更高的水平来产生生长激素；以及增强生长，该专利引入本文作为参考。总之，增强疫苗接种应答和效力并改善受试者在感染性攻击后的临床结果在以前是不经济的而且在范围上受到限制。相关技术已显示，利用重组蛋白技术可以以有限的容量改善这些不同的病状，但这些治疗具有一些明显缺陷。已教导编码重组蛋白的核酸表达构建体是频繁注射和传统重组疗法的高成本这些问题的可行的解决方法。本领域需要通过利用核酸表达构建体来扩展对患有疾病的受试者的治疗，所述核酸表达构建体递送到受试者中并在体内表达稳定的治疗性蛋白质。发明概述本发明涉及对受试者进行疫苗接种的组合物和方法；在接种疫苗前准备受试者的方法；以及在已接种疫苗的受试者中改善感染性攻击后的临床结果的方法。本发明的具体实施方案涉及在向需要疫苗接种的受试者递送疫苗之前或与之相伴地将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体递送到受试者的组织中，其中GHRH在受试者体内表达并且受试者包括人、猪、牛、鸟或接受疫苗的其他任何动物种类。本发明的一个方面包括准备需要接种疫苗的受试者的方法。这个方法包括将编码体内表达的GHRH的核酸表达构建体递送到受试者的组织中。本发明的优选GHRH包括与SEQID#14编码的GHRH至少90％同一的序列，并且优选的核酸表达构建体包括与小鼠pAV0202(SEQID#23)；大鼠pAV0203(SEQID#24)；HV-GHRHpAV0224(SEQID#25)；猪-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26)；犬pAV0235(SEQID#27)；牛pAV0236(SEQID#28)；猫pAV0238(SEQID#29)；TI-GHRHpAV0239(SEQID#30)；羊pAV0240(SEQID#31)；鸡pAV0241(SEQID#32)；马pAV0249(SEQID#33)；或人pAV0226(SEQID#34)至少97％同一的序列。本发明涵盖的疫苗包括被杀死的微生物；活的减弱的生物；亚基抗原；类毒素抗原；缀合物抗原或当导入受试者体内时通过引起免疫系统的激活、抗体形成和/或造成T-细胞和/或B-细胞应答而产生对于特定疾病的免疫性的其他类型疫苗。然而，本发明的优选实施方案包括的疫苗接种包含牛疱疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹泻(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬钩端螺旋体(Leptospiracanicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospiragrippotyphosa)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospirahardjo)、出血黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagiae)、波摩那钩端螺旋体(LeptospiraPomona)bacterinsmycoplasmahyopneumonia、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumonia)或其组合。一般地，核酸表达构建体可以在受试者进行疫苗接种前最多1年递送到受试者中，然而，这个时间可以改变。例如，在一个优选实施方案中，核酸表达构建体在受试者进行疫苗接种前约0-约14天递送。将核酸表达构建体递送到受试者组织中的一个优选方法包括组织电穿孔。组织电穿孔的许多方法在以前已得到描述，然而，一个优选的组织电穿孔方法包括用多个针状电极穿透受试者的组织，其中所述多个针状电极以间隔关系排列并且所述受试者的组织包括肌细胞；以约0.01-5mg的量将核酸表达构建体导入所述多个针状电极之间的组织中；以及对所述多个针状电极施加电脉冲，其中所述电脉冲允许所述核酸表达构建体穿过肌细胞膜。另外，核酸表达构建体还可包括促进转染的多肽或带电荷的多肽(例如，聚L-谷氨酸)。本发明的第二个方面是对受试者进行疫苗接种的方法。这个方法包括将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体递送到受试者的组织中；并随后以对于诱导受试者中抗疫苗抗体来说有效的量向受试者提供疫苗。优选的GHRH表达构建体如上所述。疫苗可以与将GHRH核酸表达构建体递送给受试者相伴地提供或者在构建体递送后一段时间之后提供。在优选实施方案中，疫苗在递送GHRH核酸表达构建体后最多1年递送。本发明涵盖的疫苗包括被杀死的微生物；活的减弱的生物；亚基抗原；类毒素抗原；缀合物抗原或当导入受试者体内时通过引起免疫系统的激活、抗体形成和/或造成T-细胞和/或B-细胞应答而产生对于特定疾病的免疫性的其他类型疫苗。然而，本发明的优选实施方案包括上述疫苗接种。在更优选的实施方案中，疫苗在递送GHRH核酸表达构建体后约7天-约14天递送。在另一优选实施方案中，利用组织电穿孔将GHRH核酸表达构建体与促进转染的多肽一起递送。本发明的第三个方面包括改善具有关节炎并接种了疫苗的受试者在感染性攻击后的临床结果的方法。该方法包括用多个针状电极穿透受试者的肌肉组织，其中所述多个针状电极以间隔关系排列；将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体递送到受试者的肌肉组织中，从而使得表达的GHRH的量能有效增强疫苗接种应答；以及对所述多个针状电极施加电脉冲，其中所述电脉冲允许所述核酸表达构建体穿过肌细胞膜。将优选范围的0.01-5mg的核酸表达构建体与指定浓度的聚L-谷氨酸多肽一起递送到受试者的肌肉组织中，并且所述核酸表达构建体包括编码多肽的序列，所述多肽具有与SEQID#14编码的GHRH至少90％同一的氨基酸序列。优选的核酸表达构建体包括与小鼠pAV0202(SEQID#23)；大鼠pAV0203(SEQID#24)；HV-GHRHpAV0224(SEQID#25)；猪-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26)；犬pAV0235(SEQID#27)；牛pAV0236(SEQID#28)；猫pAV0238(SEQID#29)；TI-GHRHpAV0239(SEQID#30)；羊pAV0240(SEQID#31)；鸡pAV0241(SEQID#32)；马pAV0249(SEQID#33)；或人pAV0226(SEQID#34)至少97％同一的序列。优选的疫苗包括被杀死的微生物；活的减弱的生物；亚基抗原；类毒素抗原；缀合物抗原或当导入受试者体内时通过引起免疫系统的激活、抗体形成和/或造成T-细胞和/或B-细胞应答而产生对于特定疾病的免疫性的其他类型疫苗。本发明的第四个方面包括含有编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体和疫苗的组合物。优选的核酸表达构建体包括与小鼠pAV0202(SEQID#23)；大鼠pAV0203(SEQID#24)；HV-GHRHpAV0224(SEQID#25)；猪-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26)；犬pAV0235(SEQID#27)；牛pAV0236(SEQID#28)；猫pAV0238(SEQID#29)；TI-GHRHpAV0239(SEQID#30)；羊pAV0240(SEQID#31)；鸡pAV0241(SEQID#32)；马pAV0249(SEQID#33)；或人pAV0226(SEQID#34)至少97％同一的序列。优选的疫苗包括被杀死的微生物；活的减弱的生物；亚基抗原；类毒素抗原；缀合物抗原或当导入受试者体内时通过引起免疫系统的激活、抗体形成和/或造成T-细胞和/或B-细胞应答而产生对于特定疾病的免疫性的其他类型疫苗。附图简述图1显示了用不同浓度的表达SEAP的质粒注射猪后分泌型碱性磷酸酶(“SEAP”)蛋白质的血浆水平。图2显示了在对照和经pSP-HV-GHRH处理的动物中的葡萄糖和胰岛素水平。图3的图版A和图版B显示了处理后第0和18天时CD2+细胞和CD4+CD45R+幼稚T细胞的百分比，图版C显示了在处理后300天时CD45R+/CD45R-幼稚T细胞的比率，其中值以平均值±SEM表示，*P＜0.001。图4显示在接受了GHRH质粒的牛中用Surround-9way疫苗(Biocor)进行疫苗接种14天后，与对照动物相比，CD4+/CD8+比率显著增加，所述对照动物在相同时间段中CD4+/CD8+比率下降，P＜0.05。图5显示在接受了GHRH质粒的动物中于Surround9-way(Biocor)疫苗接种14天后，与对照动物相比，幼稚T细胞的相对比例增加，P＜0.05。图6显示了在60至80DIM时用pSP-HV-GHRH处理的小母牛与对照比较的身体状况得分。身体状况得分在处理组之间不同，P＜0.0001。图7显示了用表达pSP-HV-GHRH的质粒处理的动物在注射后不同时间点上与对照比较的体重。图8显示了pAV0224表达质粒的限制性图谱。图9显示了pAV0225表达质粒的限制性图谱。图10显示了pAV0235表达质粒的限制性图谱。图11显示了pAV0236表达质粒的限制性图谱。图12显示了pAV0238表达质粒的限制性图谱。图13显示了pAV0239表达质粒的限制性图谱。图14显示了pAV0240表达质粒的限制性图谱。图15显示了pAV0241表达质粒的限制性图谱。图16显示了pAV0249表达质粒的限制性图谱。图17显示了pAV0226表达质粒的限制性图谱。优选实施方案的详述对于本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对此处所公开的本发明进行各种替代和修改而不背离本发明的范围和精神。如本文说明书中所使用的，术语“a”或“an”可以指一个或多个。如本文权利要求中所使用的，当与词语“包括或者包含”结合使用时，词语“a”或“an”可以指一个或超过一个。如本文所使用的，“另一个”可以指至少第二个或更多。如本文所使用的，术语“类似物”包括GHRH的任何突变体，或者合成的或天然发生的GHRH肽片段，例如HV-GHRH(SEQID#1)、猪-GHRH(SEQID#2)、牛-GHRH(SEQID#3)、犬-GHRH(SEQID#4)、猫-GHRH(SEQID#5)、TI-GHRH(SEQID#6)、羊-GHRH(SEQID#7)、鸡-GHRH(SEQID#8)、马-GHRH(SEQID#9)、TV-GHRH(SEQID#11)、15/27/28-GHRH(SEQID#12)、人GHRH(1-44)NH2(SEQID#13)、人GHRH(1-40)OH(SEQID#10)形式，或不少于(1-29)个氨基酸的任何更短的形式。如本文所使用的，术语“体脂肪比例”被定义为躯体脂肪质量除以总体重。如本文所使用的，术语“身体状况得分”(BCS)被定义为评估马或任何其他家畜的总体营养和管理的方法。如本文所使用的，术语“盒”被定义为一个或多个转基因表达载体。如本文所使用的，术语“细胞转染脉冲”被定义为导致载体例如线性DNA片段转染入细胞中的力量传输。在一些实施方案中，力量来自电，如在电穿孔中，或者力量来自血管压力。如本文所使用的，术语“编码区”指被转录为信使RNA(mRNA)并随后被翻译为具有特定多肽特征的氨基酸序列的DNA序列的任何部分。如本文所使用的，术语“递送”被定义为在有压力下或无压力的情况下通过化学或生物方法、注射、混合、电穿孔、声波穿孔或其组合，将材料导入组织、受试者、细胞或任何受者中的手段。如本文所使用的，术语“患有慢性疾病的”被定义为具有下述病状的患者例如慢性阻塞性肺病、慢性心力衰竭、中风、痴呆、髋骨骨折后的恢原、慢性肾衰竭、关节炎、类风湿性关节炎、以及老年人中的多重病症，所述病状一个月一次由医生出诊和/或住院治疗，持续至少2年。如本文所使用的，术语“供体受试者”指动物界中的任何物种，其中细胞被取出并且在受试者体外以有生活力的状态维持任何一段时间。如本文所使用的，术语“供体细胞”指被取出并在供体受试者体外以有生活力的状态维持任何一段时间的细胞。如本文所使用的，术语“电穿孔”指利用电脉冲将核酸序列递送入细胞内的方法。如本文所使用的，术语“电脉冲”和“电穿孔”指对组织或细胞施加电流以便将核酸分子摄入细胞内。技术人员将认识到，这些术语与术语“脉冲电场”、“脉冲电流装置”和“脉冲电压装置”相关。技术人员将认识到，电脉冲的量和持续时间取决于受者受试者的组织、大小和总体健康状态，并且进一步知道如何凭经验确定此类参数。如本文所使用的，术语“编码的GHRH”是生长激素释放激素的有生物学活性的多肽。如本文所使用的，术语“增强的疫苗接种应答”包括通过允许免疫系统的更快激活、抗体的更快形成、更高的抗体滴度、T-细胞应答增强和/或B-细胞应答增强而获得的增强了的对于特定疾病的免疫力。如本文所使用的，术语GHRH的“功能性生物学等价物”是这样的多肽，其具有与野生型GHRH多肽不同的氨基酸序列，而同时具有当与GHRH多肽相比较时类似或改进的生物学活性。功能性生物学等价物可以是天然发生的或者它可以是被个别修饰的。技术人员将认识到，如本文所使用的，类似或改进的生物学活性指促进和/或释放生长激素或其他垂体激素。技术人员将认识到，在一些实施方案中，编码的GHRH功能性生物学等价物是这样的多肽，其已被改造为含有不同的氨基酸序列，而同时具有当与GHRH多肽相比较时类似或改进的生物学活性。本领域已知的用于改造此类序列的方法包括定点诱变。如本文所使用的，术语“生长激素”(“GH”)被定义为与生长相关并且作为化学信使以对靶细胞发挥其作用的激素。在一个具体的实施方案中，生长激素通过生长激素释放激素的作用而得到释放。如本文所使用的，术语“生长激素释放激素”(“GHRH”)被定义为促进或刺激生长激素释放的激素，并且以小得多的范围来说为其他垂体激素例如催乳素。如本文所使用的，术语“异源核酸序列”被定义为包括不同调节和表达元件的DNA序列。如本文所使用的，术语“免疫疗法”指促进或增强机体免疫系统以形成保护性抗体的任何治疗，它将减少医学病状的症状、阻止感染性病状在受试者中的发展和/或减少对于药物治疗的需要。如本文所使用的，术语“修饰的细胞”被定义为来自受试者且含有导入细胞内的另外核酸序列的细胞。如本文所使用的，术语“修饰的供体细胞”指已具有被递送的编码GHRH的核酸序列的任何供体细胞。如本文所使用的，术语“分子开关”指可以调节基因转录的被递送到受试者中的分子。如本文所使用的，术语“核酸表达构建体”指任何类型的分离的基因构建体，其包含编码能够被转录的RNA的核酸。术语“表达载体”在本文还可以互换使用。在具体实施方案中，分离的核酸表达构建体包含启动子；目的核苷酸序列；以及3’非翻译区；其中启动子、目的核苷酸序列和3’非翻译区是有效连接的；并且目的核苷酸序列的体内表达由启动子调节。如本文所使用的，术语“DNA片段”指基本上为双链的DNA分子。尽管片段可以通过本领域已知的任何标准分子生物学手段来产生，但在一些实施方案中，DNA片段或表达构建体通过亲本DNA分子的限制性消化来产生。术语“表达载体”、“表达盒”或“表达质粒”也可互换使用。尽管亲本分子可以是任何标准的分子生物学DNA试剂，但在一些实施方案中，亲本DNA分子是质粒。如本文所使用的，术语“有效连接的”指核酸序列中的元件或结构通过操作能力而不是物理位置进行连接。元件或结构能够完成所需操作或以完成所需操作为特征。本领域普通技术人员将认识到，核酸序列中的元件或结构不必以串连或邻接顺序来有效连接。如本文所使用的，术语“聚L-谷氨酸(“PLG”)指L-谷氨酸的生物可降解聚合物，其适合用作通过利用或不利用电穿孔将DNA转移到细胞内的载体或佐剂。如本文所使用的，术语“注射后”指这样的时间段，其位于将包含编码GHRH或其生物学等价物的异源核酸序列的核酸盒导入受试者细胞内之后，并允许编码的基因进行表达而修饰的细胞仍在活生物体内。如本文所使用的，术语“质粒”一般指可以不依赖染色体DNA进行复制的包含染色体外遗传物质(通常为DNA环状双链体)的构建物。质粒或其片段可以用作载体。质粒是存在于或来源于细菌以及(罕有地)其他微生物的双链DNA分子。然而，线粒体和叶绿体DNA、酵母杀手(yeastkiller)以及其他情况通常被排除在外。如本文所使用的，术语“质粒介导的基因补充给药法”指在体内通过利用核酸表达构建体而允许受试者延长暴露于治疗范围的治疗蛋白质的方法。如本文所使用的，术语“脉冲电压装置”或“脉冲电压注射装置”涉及通过向细胞发射局部化的电脉冲而能够导致或导致核酸分子摄入生物体细胞内的设备。随后，细胞膜变得不稳定，形成通道或孔。这种类型的常规装置被标准化以允许人们选择或调整所需的电压幅度和脉冲电压的持续时间。脉冲电压装置的主要作用是该装置促进将本发明的组合物特别是线性DNA片段递送到生物体细胞内的能力。如本文所使用的，术语“质粒骨架”指通常包含细菌复制起点和细菌抗生素选择基因(其是只有转化了适当质粒的细菌的特异生长所必需的)的DNA序列。然而，存在被称为小环(mini-circle)的质粒，其缺少抗生素抗性基因和复制起点(Darquet等人，1997；Darquet等人，1999；Soubrier等人，1999)。体外扩增的表达质粒DNA(即非病毒表达系统)的使用避免了与病毒载体相关的风险。由于使用“物种特异性”组分用于基因递送，所以非病毒表达系统产物一般具有低毒性，这使得通常与病毒载体相关的免疫原性风险降至最低。本发明的一个方面是质粒骨架不包含病毒核苷酸序列。如本文所使用的，术语“启动子”指指导基因转录的DNA序列。启动子可以指导原核或真核基因的转录。启动子可以是“诱导型的”，其对于诱导剂作出响应而起始转录，或者，相反地，启动子可以是“组成型的”，由此诱导剂无法调节转录速度。启动子可以以组织特异性或组织优先的方式进行调节，从而使得它只在转录特定组织类型中的有效连接的编码区时才是有活性的。如本文所使用的，术语“生活质量”或“健康相关的生活质量”指被患者及其监护者重视的那些性质，包括他们综合的舒适和安康；他们能够维持适当的身体、感情和智力功能的程度；他们保持其参与家庭内、工作场所中以及社区中有价值活动的能力的程度。如本文所使用的，术语受试者的“幸福”指成为或做得很好，在功能水平执行任务和活动的状态；健康、快乐和舒适的情况；安康；顺利。如本文所使用的，术语“复制元件”包含将会导致质粒在特定宿主中复制的核酸序列。分子生物学领域的技术人员将认识到，复制元件可以包括，但不限于，选择性标记基因启动子、核糖体结合位点、选择性标记基因序列和复制起点。如本文所使用的，术语“残留的线性质粒骨架”包括在使得核酸表达质粒变成线性的过程结束时留下的质粒骨架的任何片段。如本文所使用的，术语“受者受试者”指可以从供体受试者将修饰的供体细胞导入其中的动物界的任何物种。如本文所使用的，术语“调节蛋白质”指可以用于控制基因表达并且对于诱导剂作出响应而增加转录速度的任何蛋白质。如本文所使用的，术语“促分泌素”指刺激分泌的药剂。例如，生长激素促分泌素是当递送到动物内时刺激垂体释放生长激素的任何分子。生长激素释放激素是生长激素促分泌素。如本文所使用的，术语“受试者”或“动物”指动物界中的任何物种。在优选实施方案中，它更具体地指人和驯养动物，所述驯养动物用于宠物(例如猫、犬等)；工作(例如马等)；食物(牛、鸡、鱼、羊、猪等)；以及本领域已知的所有其他用途。如本文所使用的，术语“组织”指类似细胞和它们周围的细胞间物质的集合。技术人员将认识到，组织是用于执行特殊功能的类似地特化的细胞的聚集体。对于本发明的范围，术语组织不指细胞系、细胞悬浮液或细胞培养物。在一个具体的实施方案中，组织在体内进行电穿孔。在另一实施方案中，组织不是植物组织。技术人员将认识到，机体内存在4种基本组织1)上皮组织；2)结缔组织，包括血液、骨和软骨；3)肌肉组织；以及4)神经组织。在一个具体的实施方案中，方法和组合物旨在通过电穿孔将线性DNA转移到肌肉组织中。如本文所使用的，术语“治疗元件”包括将会导致所编码的基因产物的体内表达的核酸序列。分子生物学领域的技术人员将认识到，治疗元件可以包括，但不限于，启动子序列、转基因、polyA序列或者3’或5’UTR。如本文所使用的，术语“转染”指将核酸导入真核细胞内。在一些实施方案中，细胞不是植物组织或者酵母细胞。如本文所使用的，术语“载体”指将核酸递送到细胞或生物体中的任何媒介物。实例包括质粒载体、病毒载体、脂质体或阳离子脂质。该术语还指包括遗传物质的构建物，其设计为通过将核酸序列递送到细胞内来直接转化靶细胞。载体可以包含与其他必需元件在位置上和顺序上定向的多个基因元件，从而使得内含的核酸盒可以在转染的细胞中进行转录并且当需要时进行翻译。这些元件是有效连接的。术语“表达载体”指包含对于在异源细胞中产生重组蛋白质所需的所有信息的DNA质粒。如本文所使用的，术语“病毒性骨架”指不包含启动子、基因和3’polyA信号或非翻译区，但包含下述元件的核酸序列，所述元件包括但不限于，位点特异性基因组整合Rep和反向末端重复(“ITRs”)或用于逆转录的tRNA引物的结合位点，或当在体内插入时诱导病毒免疫原性应答、允许整合、影响组织特异型启动子的特异性和活性、导致转录沉默或对受试者造成安全风险的核酸序列组分。术语“血管压力脉冲”指来自大容积液体的压力脉冲以促进载体摄入细胞内。技术人员将认识到，血管压力脉冲的量和持续时间取决于受者动物的组织、大小和总体健康状态，并且进一步知道如何凭经验确定此类参数。如本文所使用的，术语“疫苗”指被杀死的微生物，活的减弱的生物，亚基抗原，类毒素抗原，缀合物抗原或当导入受试者体内时通过引起免疫系统的激活、抗体形成和/或造成T-细胞和/或B-细胞应答而产生对于特定疾病的免疫性的其他类型抗原分子的任何制剂。一般地，针对微生物的疫苗指向病毒、细菌、寄生虫、支原体或其他传染剂的至少一部分。对于特定病原体的疫苗接种或免疫接种的功效以及在感染性攻击后的临床结果对于人和动物医学具有特别的重要性。本发明的一个具体实施方案是增强对于疫苗接种的应答的方法。该方法包括用多个针状电极穿透受试者的肌肉组织，其中所述多个针状电极以间隔关系排列；将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体递送到受试者的肌肉组织中，从而使得表达的GHRH的量能有效增强对于特定疫苗接种的应答；以及对所述多个针状电极施加电脉冲，其中所述电脉冲允许所述核酸表达构建体穿过肌细胞膜。将0.01-5mg的核酸表达构建体与指定浓度的聚L-谷氨酸多肽一起递送到受试者的肌肉组织中，并且所述核酸表达构建体包括编码多肽的序列，所述多肽具有与SEQID#14编码的GHRH至少90％同一的氨基酸序列。优选的受试者包括人、反刍动物、食物动物、马或工作动物。虽然存在对于疫苗接种的应答得到增强的许多指标，但少数实例包括特异性抗体滴度增加、在感染性攻击后应答更快速、临床结果改善或其组合。本发明的其他具体实施方案涵盖了将核酸表达构建体递送到受试者组织中的各种方式(例如，电穿孔法，病毒载体，与承载体(carrier)相结合，通过肠胃外途径，或其组合)。第二个优选的实施方案包括以单剂量递送核酸表达构建体，并且所述单剂量包含总量约0.01-5mg的核酸表达构建体。一般地，将核酸表达构建体递送到受试者的组织中，包括二倍体细胞(例如肌细胞)。在第三个具体实施方案中，用于转染的核酸表达构建体包括wt-猪-GHRH质粒(SEQID#26)。其他具体实施方案利用其他核酸表达构建体(例如，优化的牛GHRH质粒，pAV0236(SEQID#28)；TI-GHRH质粒，pAV0239(SEQID#30)；HV-GHRH质粒，pAV0224(SEQID#25)；羊GHRH质粒，pAV0240(SEQID#31)；鸡GHRH质粒，pAV0241(SEQID#32)；犬GHRH质粒，pAV0235(SEQID#27)；猫GHRH质粒，pAV0238(SEQID#29)；马GHRH质粒，pAV0249(SEQID#33)；人GHRH质粒，pAV0226(SEQID#34)。在第四个具体实施方案中，核酸表达构建体进一步包括促进转染的多肽(例如带电荷的多肽，或聚L-谷氨酸)。将核酸表达构建体递送到受试者组织中后，编码的GHRH或其功能性生物学等价物开始进行表达。编码的GHRH包括生物学活性多肽；并且编码的GHRH功能性生物学等价物是这样的多肽，其已被改造为含有不同的氨基酸序列，而同时具有当与GHRH多肽相比较时类似或改进的生物学活性。具体的编码的GHRH或其功能性生物学等价物的一个实施方案具有式(SEQID#14)。动物包括人、食物动物、工作动物(例如猪、牛、绵羊、山羊或鸡)、或宠物(例如犬、猫、马)。本发明还涉及用于改善患者在感染性攻击后的临床结果的方法。本发明的一般方法包括用质粒介导的基因补充给药法治疗受试者。该方法包括将编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物学等价物的核酸表达构建体递送到受试者的组织例如肌肉中。本发明的具体实施方案旨在通过质粒介导的GHRH补充给药法来改善被治疗的受试者中的疫苗接种应答。质粒注射可以在特定疫苗接种之前进行或与其相伴进行。GHRH或其生物学等价物随后在受试者中的体内表达足以改善疫苗接种应答。因此，如果感染性攻击发生在较后的日期，那么临床结果明显得到改善。通过将多个电极放置在所选择的组织中，随后将核酸表达构建体在介于所述多个电极之间的区域中递送给所选组织，并在其中递送了核酸表达构建体的所选组织的区域中向所选组织施加细胞转染脉冲(例如电脉冲)，还可以增强这种方法。但是，细胞转染脉冲不必是电脉冲，也可利用一种不同的方法例如血管压力脉冲。电穿孔、直接注射、基因枪或金颗粒轰击也可在具体实施方案中用于将编码GHRH或生物学等价物的核酸表达构建体递送到受试者中。在本发明中的受试者包括动物(例如，人、猪、马、牛、小鼠、大鼠、猴、绵羊、山羊、犬或猫)。重组GH替代疗法广泛用于农业和临床中，具有有利的作用，但一般而言，剂量是超生理学的。此类剂量提高的重组GH与有害的副作用相关，例如，高达30％的经重组GH治疗的患者以较高频率形成了胰岛素耐受性(Gopinath和Etherton，1989a；Gopinath和Etherton，1989b；Verhelst等人，1997)或在儿科患者中加速的骨骺生长和闭合(Blethen和Rundle，1996)。此外，循环性GH的分子异质性在生长和体内稳态中可能具有重要的关联(Satozawa等人，2000；Tsunekawa等人，1999；Wada等人，1998)。不希望的副作用是由于用重组外源性GH蛋白质进行治疗提高了GH的基础水平并且消除了自然的GH偶发性脉动。与此相反，没有关于重组GHRH疗法的副作用的报道。垂体门脉循环中的GHRH的正常水平为约150-800pg/ml，而该激素的全身性循环值最多为约100-500pg/ml。具有由颅外肿瘤引起的肢端肥大症的一些患者具有将近高100倍的水平(例如50ng/ml的免疫反应性GHRH)(Thorner等人，1984)。在儿童和老年人中使用重组GHRH疗法的长期研究(1-5年)已显示没有传统的GH副作用，例如空腹葡萄糖浓度的改变，或者在儿科患者中加速的骨骺生长和闭合或首股骨骺滑脱(Chevalier等人，2000)(Duck等人，1992；Vittone等人，1997)。人、绵羊或猪中的研究显示，重组GHRH蛋白质的连续输注恢复了正常GH模式，而不会使GHRH受体脱敏或消耗GH供应(Dubreuil等人，1990)。因为这个系统具有一定程度的反馈，这在GH疗法中被消除，所以GHRH重组蛋白质疗法可能比GH疗法更符合生理学。可是，由于GHRH在体内短暂的半衰期，频繁的(一天1-3次)静脉内、皮下或鼻内(要求高300倍的剂量)施用是必需的(Evans等人，1985；Thorner等人，1986b)。因此，作为长期疗法，重组GHRH蛋白质施用不可行。然而，质粒介导的补充给药法可以克服这种对于GHRH使用的局限。选择GHRH用于基因治疗应用由下述事实支持对于人、猪、牛和其他物种已表征了该基因、cDNA以及天然的和几种突变的分子(Bohlen等人，1983；Guillemin等人，1982)；猫、犬和马特异性GHRH的cDNA已被分离。治疗效果的测量是简单明了且明确的。在用于体内基因转移的非病毒技术中，将质粒DNA直接注射到肌肉中是简单、价廉且安全的。在简单的直接注射后低效的DNA摄入肌纤维中导致相对低的表达水平(Prentice等人，1994；Wells等人，1997)。此外，转基因表达的持续时间是短暂的(Wolff等人，1990)。以前最成功的临床应用被限制于疫苗(Danko和Wolff，1994；Tsurumi等人，1996)。近来，利用电穿孔技术获得了增强质粒体内递送并随后达到分泌型蛋白的生理学水平的重要进展。电穿孔已非常成功地用于在质粒注射后转染肿瘤细胞(Lucas等人，2002；Matsubara等人，2001)或用于在人中将抗肿瘤药物博来霉素递送给皮肤和皮下肿瘤(Gehl等人，1998；Heller等人，1996)。电穿孔还在小鼠(Lesbordes等人，2002；Lucas等人，2001；Vilquin等人，2001)、大鼠(Terada等人，2001；Yasui等人，2001)和犬(Fewell等人，2001)中广泛用于递送编码各种激素、细胞因子或酶的治疗性基因。我们利用生长激素释放激素(GHRH)所进行的先前研究显示，使用电穿孔的质粒疗法是可扩缩的并且代表了在大型动物和人中诱导蛋白质的产生和受调节的分泌的有希望的方法(Draghia-Akli等人，1999；Draghia-Akli等人，2002c)。电穿孔还已经广泛用于啮齿动物和其他小型动物中(Bettan等人，2000；Yin和Tang，2001)。已观察到电极构造影响电场分布以及后续结果(Gehl等人，1999；Miklavcic等人，1998)。初步实验指出，对于大型动物或人，针状电极一致地产生比外部钳状电极更好的可重复的结果。如上所述，电穿孔增强质粒摄入骨骼肌的能力已被充分证明。此外，已观察到用PLG或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)配制的质粒在小鼠、大鼠和犬的骨骼肌中使基因转染并从而使基因表达增至高达10倍(Fewell等人，2001；Mumper等人，1998)。尽管不希望被理论束缚，但PLG将会增加电穿孔过程中的质粒转染，不仅通过稳定质粒DNA以及促进经过膜孔的胞内运输，还通过活性机制。例如，细胞上带正电荷的表面蛋白质可以通过蛋白质-蛋白质相互作用而与连接至质粒DNA的带负电荷的PLG复合。当施加电场时，表面蛋白质倒转方向并且活跃地内在化DNA分子，这个过程实质上增加了转染效率。尽管不希望被理论束缚，但本文所描述的用于增强疫苗接种应答并且改善患者在感染性攻击后的临床结果的质粒补充给药法提供了超越直接注射重组GH或GHRH蛋白质的局限的优点。GHRH或GHRH的新型生物学等价物的表达可以通过由合成的肌肉特异性启动子控制的表达质粒来指导。此类GHRH或其生物学等价物的表达引发了受试者中的高GH和IGF-I水平，所述受试者已通过肌内注射或体内电穿孔而将编码序列递送到细胞中。尽管体内电穿孔是将异源核酸编码系统导入受试者细胞内的优选方法，但存在其他方法且应当被本领域技术人员了解(例如电穿孔、lipofectamine、磷酸钙、离体转化、直接注射、DEAE葡聚糖、超声处理加载、受体介导的转染、微粒轰击等)。例如，还可以通过下列步骤将编码GHRH或其功能性生物学等价物的核酸序列直接导入受试者的细胞中首先从受试者或供体的机体取出细胞，将细胞维持在培养物中，随后通过各种方法(例如电穿孔、lipofectamine、磷酸钙、离体转化、直接注射、DEAE葡聚糖、超声处理加载、受体介导的转染、微粒轰击等)导入该核酸编码系统，最后将修饰的细胞再次导入最初的受试者或其他宿主受试者中(离体方法)。GHRH序列可以被克隆到腺病毒载体或腺相关载体中，并通过简单的肌内注射或经静脉内或动脉内递送。携带GHRH序列的质粒DNA可以与阳离子脂质或脂质体复合，并经肌内、静脉内或皮下递送。如本文所使用的，施用指将DNA的载体或承载体导入机体内的途径。施用可以直接至靶组织或在全身施用后通过对靶组织的靶向递送而至靶组织。特别地，本发明可以用于通过将载体施用于机体来改善受试者中的疫苗接种应答，所述载体的施用是为了建立对于质粒介导的补充给药法有用的任何特定核酸序列在组织中在一定水平上的受控表达。用于施用载体的优选手段和用于递送的制剂的应用在上文中得到描述。在以溶液、悬浮液或胶体形式简单注射DNA颗粒到肌肉内后，肌细胞具有从细胞外间隙摄入DNA的独特能力。通过这种方法表达DNA可以持续数月。DNA摄入肌细胞内可通过利用体内电穿孔而被进一步增强。所配制的DNA载体的递送包括将DNA整合到大分子复合物中，所述大分子复合物经历靶细胞的胞吞作用。此类复合物可以包括脂质、蛋白质、碳水化合物、合成的有机化合物或无机化合物。用载体形成的复合物的特征(大小、电荷、表面特征、组成)决定了载体在机体内的生物利用率。制剂的其他成份用作与细胞表面上或内部的特异性受体相互作用的配体。制剂的其他成份用于增强进入细胞、从内体中释放和进入细胞核。递送还可以通过DNA转运体的使用。DNA转运体指与DNA载体结合并能够被表皮细胞吸收的分子。DNA转运体包含能够与DNA非共价结合且有效将DNA转运通过细胞膜的分子复合物。优选地，转运体还将DNA转运通过核膜。参见，例如，下述申请，所有这些申请(包括附图)引入本文作为参考(1)Woo等人，标题为″ADNATransporterSystemandMethodofUse″的美国专利号6,150,168；(2)Woo等人，于1993年3月19日提交、标题为″ADNATransporterSystemandmethodofUse″的PCT/US93/02725；(3)Woo等人，美国专利号6,177,554，″NucleicAcidTransporterSystemsandMethodsofUse″；(4)Szoka等人，标题为″Self-AssemblingPolynucleotideDeliverySystem″的美国专利号5,955,365；以及(5)Szoka等人，于1993年4月5日提交、标题为″Self-AssemblingPolynucleotideDeliverySystem″的PCT/US93/03406。另一种递送方法牵涉DNA转运体系统。DNA转运体系统由包含几种成份的颗粒组成，所述成份独立地且非共价地与DNA结合。每个成份由识别特异性受体的配体或其他功能性基团例如与结合DNA的阳离子基团复合的蛋白质组成。可以使用的阳离子的例子有精胺、精胺衍生物、组蛋白、阳离子肽和/或聚赖氨酸；一个成份能够与DNA载体以及靶细胞上的细胞表面受体结合。此类成份的例子是与脱唾液酸糖蛋白受体、叶酸受体、甘露糖-6-磷酸受体或肉碱受体相互作用的有机化合物。第二个成份能够与DNA载体以及核膜上的受体结合。核配体能够识别并将转运体系统运输通过核膜。此类配体的一个例子是来自SV40大T抗原或组蛋白的核靶向序列。第三个成份能够与DNA载体以及诱导游离体裂解的成份结合。实例包括灭活的病毒颗粒例如腺病毒、与流感病毒血凝素相关的肽、或上文引用的Skoka专利中描述的GALA肽。施用还可涉及脂质。脂质可以形成脂质体，它是中空球状囊泡，由以单层、双层或多层形式排列的脂质以及用于捕获水溶性化合物例如DNA的内部含水空间组成，直径大小为0.05微米至数微米。脂质不形成脂质体也可以是有用的。具体例子包括阳离子脂质和包含DOPE的复合物的使用，其与DNA以及与靶细胞的膜相互作用以促进DNA进入细胞内。基因递送还可通过移植经基因改造的细胞来完成。例如，被称为成肌细胞的未成熟的肌细胞可以用于携带基因进入肌纤维。经基因改造为表达重组人生长激素的成肌细胞可以将生长激素分泌到动物血液中。整合的基因的分泌可以持续高达3个月的时间段。成肌细胞最终分化并融合为现有的肌肉组织。因为细胞被整合入现有结构中，所以它不仅是被耐受的而且是被培养的。通过提取来自需要质粒介导的补充给药法的个体的肌肉组织可以容易地获得成肌细胞，并且经基因改造的细胞还可以容易地放回去而不引起患者肌肉损伤。类似地，角质形成细胞可以用于将基因递送给组织。大量的角质形成细胞可以通过小活组织检查物的培养来产生。培养物可以制备为成层的薄片，并且当移植给人时产生表皮，所述表皮持续改善组织质量许多年。在培养时通过用合适的载体转染角质形成细胞而对角质形成细胞进行基因改造。尽管角质形成细胞通过将表皮与真皮分开的基底膜而与循环分隔开，但人角质形成细胞将产生的蛋白质分泌到循环中。递送还可涉及病毒载体的使用。例如，通过用本发明中所述的载体元件(包括启动子、5’UTR，3’UTR和核酸盒)替代病毒基因组的E1和E3区，并将这个重组基因组导入293细胞中，可以构建腺病毒载体，所述293细胞将把这个基因包装入感染性病毒颗粒。来自这种细胞的病毒随后可以用于感染离体或体内组织以将该载体导入组织中，导致核酸盒中的基因的表达。载体术语“载体”用于指可以向其中插入核酸序列以导入细胞内的承载体核酸分子，在一些实施方案中，它可以在所述细胞中进行复制。核酸序列对于动物可以是天然的，或者它可以是“外源的”，这表示它对于将向其中导入载体的细胞来说是外来的，或者表示该序列与细胞中的序列是同源的，但位于在那里通常找不到该序列的宿主细胞核酸内位置处。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)、线性DNA片段以及人工染色体(例如，YACs、BACs)，尽管在一个优选实施方案中，载体基本上不包含病毒序列。本领域技术人员将会是经良好训练的，以通过标准重组技术来构建载体。术语“表达载体”指任何类型的基因构建体，它包括编码能够被转录的RNA的核酸。在某些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，这些序列是不翻译的，例如在产生反义分子或核酶的情况下。表达载体可以包含各种“控制序列”，这指对于有效连接的编码序列在特定宿主细胞中的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可包含也用作其他功能的核酸序列，其在下文中进行描述。质粒载体在某些实施方案中，考虑将来自质粒载体的线性DNA片段用于转染真核细胞，特别是哺乳动物细胞。一般而言，包含复制子和来源于与宿主细胞相容的物种的控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点以及标记序列，所述标记序列在经转化的细胞中能够提供表型选择。在非限制性例子中，大肠杆菌(E.coli)通常利用pBR322或pUC(来源于大肠杆菌物种的质粒)的衍生物进行转化。pBR322包含氨苄青霉素和四环素抗性的基因，因此提供了用于鉴别经转化的细胞的简便手段。其他质粒包含卡那霉素或新霉素基因，或具有非抗生素选择机制。pBR质粒或其他微生物质粒或噬菌体还应当包含，或经修饰而包含，例如可以被微生物体用于表达其自身蛋白质的启动子。技术人员将认识到，本领域的任何质粒均可进行修饰以用于本发明的方法中。在一个具体实施方案中，例如，用于治疗应用的GHRH载体是合成产生的并且具有卡那霉素抗性基因。此外，包含复制子和与宿主微生物相容的控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主相关的转化载体。例如，噬菌体λGEMTM-11可以用于制备能够用于转化宿主细胞例如大肠杆菌LE392的重组噬菌体载体。其他有用的质粒载体包括pIN载体(Inouye等人，1985)；和pGEX载体，其用于产生谷胱甘肽S-转移酶可溶性融合蛋白以用于随后的纯化和分离或切割。其他合适的融合蛋白是具有β-半乳糖苷酶、泛素等的那些。包含表达载体的细菌宿主细胞例如大肠杆菌生长在许多种合适的培养基中的任何一种之中，例如LB。如本领域技术人员将会理解的，某些载体中的重组蛋白质的表达可以如此进行诱导，即通过将宿主细胞与对某些启动子特异的试剂接触，例如向培养基中加入IPTG，或将孵育转为更高的温度。将细菌进一步培养一段时间(一般为2-24小时)后，通过离心收集细胞并进行洗涤以去除残留的培养基。启动子和增强子启动子是控制序列，所述控制序列是在此处控制基因产物转录的起始和速度的核酸序列区域。它可以包含这样的基因元件，在所述基因元件处调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶及其他转录因子以起始核酸序列的特异性转录。短语“有效定位”、“有效连接”、“在控制下”以及“在转录控制下”表示，启动子处于对于核酸序列来说正确的功能位置和/或定位中以控制那个序列的转录起始和/或表达。启动子一般包括用于定位关于RNA合成的起始位点的序列。启动子最有名的例子是TATA框，但在某些启动子中缺少TATA框，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子以及SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点本身的分立元件帮助固定起始位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些定位在起始位点上游30-110bp区域内，尽管已显示许多启动子在起始位点下游也包含功能性元件。为了产生在启动子控制下的编码序列，将转录阅读框的转录起始位点的5’端定位在所选启动子的下游(即3’端)。“上游”启动子刺激DNA的转录并且促进编码的RNA的表达。启动子元件之间的间隔常常是可变的，因此当元件相对于彼此倒置或进行移动时启动子功能被保留。在胸苷激酶(timidinekinase)(tk)启动子中，在活性开始减退前启动子元件之间的间隔可以增至相距50bp。取决于启动子，看起来单个元件可以合作或独立地发挥作用以激活转录。启动子可以与“增强子”结合或不结合使用，增强子指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。启动子可以是与核酸序列天然联合的，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列而获得。此类启动子可以被称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然联合的，位于那个序列的下游或上游。可替代地，通过将编码性核酸区段置于重组、合成或异源启动子的控制下将得到一定的好处，所述重组、合成或异源启动子指在其自然环境中通常不与核酸序列联合的启动子。重组、合成或异源增强子同样也指在其自然环境中通常不与核酸序列联合的增强子。此样的启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或者原核或真核细胞分离出的启动子或增强子，以及非“天然发生的”启动子或增强子(即包含不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变)。例如，在重组DNA构建中最常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，与本文所公开的组合物有关地，利用重组克隆和/或核酸扩增技术包括PCRTM也可以产生序列(参见美国专利号4,683,202和5,928,906，每一个均引入本文作为参考)。此外，考虑了还可采用在非核细胞器例如线粒体、叶绿体等内指导序列的转录和/或表达的控制序列。自然，采用有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在适当条件下可用于指导所导入的DNA区段高水平表达的，例如在重组蛋白质和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。另外，任何启动子/增强子组合(按照例如EukaryoticPromoterDataBase，EPDB，http://www.epd.isb-sib.ch/)也可以用于驱动表达。使用T3、T7或SP6胞质表达系统是另一种可能的实施方案。如果合适的细菌聚合酶作为递送复合物的一部分或作为另外的基因表达构建体来提供，则真核细胞可以支持从某些细菌启动子的胞质转录。表1和2列出了在本发明范围内可以用于调节RNA表达的元件/启动子的非限制性例子。表2提供了诱导型元件的非限制性例子，所述诱导型元件是可以响应特定刺激而被激活的核酸序列的区域。组织特异性启动子或元件的鉴定，以及表征其活性的测定法是本领域技术人员众所周知的。此类区域的非限制性例子包括人LIMK2基因(Nomoto等人，1999)、促生长激抑制素受体2基因(Kraus等人，1998)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等人，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等人，1998)、小鼠α2(XI)胶原(Liu等人，2000；Tsumaki等人，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee等人，1997)、胰岛素样生长因子II(Dai等人，2001；Wu等人，1997)、以及人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等人，1996)。在一个优选实施方案中，利用合成的肌启动子，例如SPc5-12(Li等人，1999)，它包含来邻近的自骨骼α-肌动蛋白的血清效应元件(“SRE”)、多个MEF-2位点、MEF-1位点和TEF-1结合位点，并且极大地超过了天然肌原性启动子的转录能力。此类合成启动子的独特性是超过例如下列所颁发的专利的重要改进，涉及肌原性启动子及其用途的专利(例如，美国专利号5,374,544)或涉及用于核酸序列的肌原性表达的系统的专利(例如，美国专利号5,298,422)。在一个优选实施方案中，本发明中采用的启动子不通过内源性细胞机制或因素而明显关闭或降低活性。依照本发明的这个实施方案可以使用其他元件，包括反式作用因子结合位点和增强子。在一个可选择的实施方案中，采用天然的肌原性启动子，并且技术人员知道如何从数据库中获得这样的启动子序列，所述数据库包括NationalCenterforBiotechnologyInformation(“NCBI”)GenBank数据库或NCBIPubMed网站。技术人员知道这些数据库可以用于获得与本发明有关的序列或相关文献。起始信号和内部核糖体结合位点特异性的起始信号也可以是编码序列的有效翻译所必需的。这些信号包括ATG起始密码子或邻接序列。可能需要提供外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必需的信号。众所周知，起始密码子应当是在所需编码序列的阅读框的“框内的”，以确保整个插入片段的翻译。外源性翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可以增强表达的效率。在本发明的某些实施方案中，内部核糖体进入位点(“IRES”)元件的用途是用于形成多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模式并且在内部位点上开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小RNA病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎病毒)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源的开放阅读框连接。多个开放阅读框可以一起转录，每个由IRES隔开，产生多顺反子信息。借助于IRES元件，每个开放阅读框对于核糖体来说是可接近的以有效翻译。多基因可以利用单个启动子/增强子来有效表达以转录单个信息(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，每个引入本文作为参考)。多克隆位点载体可以包括MCS，这是包含多个限制性内切酶位点的核酸区域，它们中的任何一个均可与标准重组技术结合使用以消化载体(参见，例如(Carbonelli等人，1999；Cocea，1997；Levenson等人，1998)，引入本文作为参考)。“限制性内切酶消化”指用只在核酸分子的特定位置处起作用的酶来催化切割核酸分子。这些限制性内切酶中的许多是市售的。此类酶的用途被本领域技术人员广泛了解。通常，利用在MCS内切割的限制性内切酶将载体线性化或片段化，以使得外源序列能够与载体连接。“连接(ligation)”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述核酸片段可以是或不是互相邻近的。涉及限制性内切酶和连接反应的技术是重组
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的技术人员众所周知的。剪接位点大多数转录出的真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物中去除内含子。包含基因组真核序列的载体可能需要供体和/或接受体剪接位点以确保用于蛋白质表达的转录物的正确加工(参见，例如(Chandler等人，1997))。终止信号本发明的载体或构建体将一般包括至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”包括在RNA转录物被RNA聚合酶特异性终止中所牵涉的DNA序列。因此，在某些实施方案中，考虑了结束RNA转录物的产生的终止信号。终止子在体内可能是必需的以达到所需的信息水平。在真核系统中，终止子区域还可包括特定的DNA序列，其允许新转录物进行位点特异性切割以便暴露多腺苷酸化位点。这用信号告知专有的内源性聚合酶将约200个A残基(“polyA”)的延伸片段加到转录物的3’末端。用这种polyA尾修饰的RNA分子表现得更稳定且更有效地进行翻译。因此，在涉及真核生物的其他实施方案中，优选地，终止子包括用于RNA的切割的信号，并且更优选地，终止子信号促进信息的多腺苷酸化。终止子和/或多腺苷酸化位点元件可以用于增强信息水平并且使从盒阅读到其他序列的情况减到最小。考虑用于本发明的终止子包括本文所描述的或本领域普通技术人员已知的任何已知转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒的终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可以缺少可转录的或可翻译的序列，例如由于序列截短。多腺苷酸化信号在表达中，特别是在真核生物表达中，一般将包括多腺苷酸化信号以实现转录物的正确多腺苷酸化。不认为多腺苷酸化信号的性质是成功实践本发明的关键，并且可以采用任何这样的序列。优选的实施方案包括方便且已知在各种靶细胞中作用良好的SV40多腺苷酸化信号、骨骼α肌动蛋白3’UTR、或者人或牛生长激素多腺苷酸化信号。多腺苷酸化可以增加转录物的稳定性或可以促进胞质运输。复制起点为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以包含一个或多个复制起始位点(通常称为“ori”)，这是于此处起始复制的特定核酸序列。可替代地，如果宿主细胞是酵母，则可以采用自主复制序列(“ARS”)。可选择的和可筛选的标记在本发明的某些实施方案中，包含本发明的核酸构建体的细胞通过在表达载体中包含标记而可以在体外或体内进行鉴定。此类标记将赋予细胞可鉴定的改变，允许容易地鉴定包含该表达载体的细胞。一般地，选择标记是赋予允许进行选择的特性的标记。正选择标记是其中标记的存在允许它的选择的标记，而负选择标记是其中它的存在妨碍它的选择的标记。正选择标记的例子是药物抗性标记，例如卡那霉素。通常，包含药物选择标记可帮助克隆和鉴定转化体，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于条件的实现来区分转化体的表型的标记之外，还考虑了其他类型的标记，包括可筛选标记例如GFP，GFP的基础是比色分析。可替代地，可以采用可筛选的酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(“tk”)或氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)。本领域技术人员还将知道如何采用免疫学标记，其可能与FACS分析相结合。不认为所用的标记是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。可选择的和可筛选的标记的进一步例子是本领域技术人员众所周知的。诱变当采用时，通过各种标准的导致诱变的操作过程来完成诱变。突变是这样的过程，即通过此过程在生物体的量或结构方面发生改变。突变可以包括单基因、基因群或整条染色体的核苷酸序列的修饰。单基因中的改变可以是点突变的结果，所述点突变包括DNA序列中的单个核苷酸碱基的去除、添加或置换，或者它们可以是涉及大量核苷酸插入或删除的改变的结果。突变可以作为事件的结果而自发地发生，所述事件例如为在DNA复制保真度或转座遗传因子(转座子)于基因组内移动方面的错误。它们还在暴露于化学或物理诱变因素之后而被诱导。此类诱导突变的因素包括电离辐射、紫外线以及各种系列的化学制品，例如烷化剂和多环芳烃，所有这些均能够与核酸直接地或间接地(一般通过某些代谢性生物转化)相互作用。当受影响的DNA进行复制或修复时，由这样的环境因素诱导的DNA损伤可以导致碱基序列的修饰，并因此导致突变。通过使用特殊的靶向方法，突变还可以是定点的。定点诱变结构指导的位点特异性诱变代表了用于剖析和改造蛋白质-配体相互作用的有力工具(Wells，1996，Braisted等人，1996)。该技术为通过将一个或多个核苷酸序列改变导入所选DNA中来制备和测试序列变体作好了准备。位点特异性诱变使用特异的寡核苷酸序列，它编码具有所需突变以及足够数量的邻近且未修饰的核苷酸的DNA序列。以这种方式，提供了具有足够大小和复杂性的引物序列以在被横跨的缺失接点两侧形成稳定的双链体。长度为约17-25个核苷酸的引物是优选的，在被改变的序列的接点两侧有约5-10个残基。该技术一般采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。在定点诱变中有用的载体包括诸如M13噬菌体的载体。这些噬菌体载体是市售的，并且它们的使用一般是本领域技术人员众所周知的。双链质粒也经常用于定点诱变，它消除了将目的基因从噬菌体转移到质粒的步骤。一般而言，首先获得单链载体，或将双链载体的两条链解开，它在其序列中包括编码所需蛋白质或基因元件的DNA序列。随后将合成制备的且具有所需突变序列的寡核苷酸引物与单链DNA制备物一起进行退火，当选择杂交条件时考虑错配程度。对杂交产物施用DNA聚合酶例如大肠杆菌聚合酶I(Klenow片段)以便完成具有突变的链的合成。因此，形成了异源双链体，其中一条链编码原始的无突变的序列，和第二条链具有所需突变。这个异源双链载体随后用于转化合适的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞，并且选择出包括具有突变的序列排列的重组载体的克隆。通过其中检查所有19种氨基酸置换的饱和诱变可以最好地获得关于蛋白质给定残基的功能重要性和信息含量的全面信息。这种方法的缺点是多残基饱和诱变的逻辑是使人畏缩的(Warren等人，1996，Brown等人，1996；Zeng等人，1996；Burton和Barbas，1994；Yelton等人，1995；Jackson等人，1995；Short等人，1995；Wong等人，1996；Hilton等人，1996)。应当要研究成百个并且可能甚至是上千个位点特异性突变体。然而，改进的技术使得突变体的产生和快速筛选要简单得多。还可参见，美国专利号5,798,208和5,830,650，关于“模糊(walk-through)”诱变的描述。定点诱变的其他方法公开于美国专利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377；和5,789,166。电穿孔在本发明的某些实施方案中，通过电穿孔将核酸导入细胞器、细胞、组织或生物体内。电穿孔涉及使细胞和DNA的悬浮液暴露于高电压放电。在这个方法的某些变化形式中，采用某些降解细胞壁的酶例如降解果胶的酶以使靶受者细胞比未经处理的细胞更易通过电穿孔而进行转化(美国专利号5,384,253，引入本文作为参考)。可替代地，通过机械创伤及本领域已知的其他方法可以使受者细胞变得更易转化。利用电穿孔转染真核细胞已经相当成功。通过这种方式已用人κ-免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter等人，1984)，和已用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa等人，1986)。认为电穿孔的基础现象在所有情况下都是相同的，但造成所观察到的效应的确切机制仍未阐明。尽管不希望被理论束缚，但电穿孔效应的明显表现是，在细胞暴露于电脉冲后细胞膜变得暂时能透过大分子。存在穿过细胞壁的管道，它在正常情况下通过允许双向离子迁移而维持大约90mV的静息跨膜电位。尽管不希望被理论束缚，但电穿孔利用相同的结构，通过强迫高离子通量穿过这些结构并打开或扩大这些管道。在现有技术中，将金属电极与组织接触放置，并且将与电极之间的距离成比例的预定电压施加在它们上。根据公式E＝V/d，其中(“E”)为电场、(“V”)为所施加的电压和(“d”)为电极之间的距离，用于电穿孔的方案在所得到的场强方面被限定。当制定用于将药物或大分子递送到受试者细胞内的电穿孔方案时，在现有技术中电场强度E是非常重要的值。因此，通过施加与电极之间的距离成比例的预定电压的脉冲可以计算出用于各种方案的任何电场强度。然而，要注意的是电场可以用绝缘电极在组织中产生(即离子流不是产生电场所必需的)。尽管不希望被理论束缚，但正是电流而不是电场本身是成功的电穿孔所必需的。在电穿孔过程中，所产生的热量是电极间阻抗、电流的平方和脉冲持续时间的乘积。热量是在电穿孔的过程中在组织中产生的，并且可以作为电极间电流、电压和脉冲持续时间的乘积而获得。目前描述的关于电穿孔的方案在所得到的场强E方面是被限定的，E取决于未知电流的短电压脉冲。因此，无法确定组织中产生的电阻或热量，这导致用预定电压的不同脉冲电压电穿孔方案的不同成果。限制越过电极对细胞进行加热的能力可以增加任何给定电穿孔电压脉冲方案的有效性。例如，现有技术教导了6个针状电极的阵列的使用，其利用越过相对电极对的预定电压脉冲。这种情况在电穿孔事件过程中在形成适当且相互交错的重叠点的区域中建立了集中模式。沿着电穿孔途径的细胞和组织的过度发热将杀死细胞，并限制方案的有效性。然而，没有相对的对的对称排列的针状电极在电穿孔事件中在不能形成适当电穿孔重叠点的区域中可以产生分散模式。对电极间电流的控制允许确定细胞的相对发热。因此，正是电流而不是越过电极的电压决定了任何给定脉冲方案的后续有效性。预定电压不产生预定电流，并且现有技术没有提供确定电流的确切量的方法，这限制了该技术的有用性。因此，与预定电压脉冲相比较时，将组织中两个电极间的电流控制和维持在阈值之下将允许改变脉冲条件，减少细胞发热，产生更少的细胞死亡，和更有效地将大分子整合入细胞中。通过提供有效控制递送给电极间空间中的细胞的电量的手段可以克服上述问题，所述手段通过精确控制冲击细胞膜中的管道的离子通量。给组织的精确电量可以作为电流水平、脉冲长度和所递送的脉冲数目的乘积而计算出来。因此，本发明的一个具体实施方案可以沿着多个途径将电穿孔电流递送给一定体积的组织而不会在任何一个位置引起过量浓度的累积电流，从而避免了由于组织过热而引起的细胞死亡。尽管不希望被理论束缚，但待产生的电压脉冲的性质由组织的性质、所选组织的大小以及电极间的距离决定。希望电压脉冲尽可能是同质的并且具有正确的振幅。过量的场强导致细胞裂解，而较低的场强导致电穿孔效率降低。一些电穿孔装置利用电极间的距离来计算用于电穿孔的电场强度和预定电压脉冲。对于知晓电极间距离的这种依赖是电极设计的限制。因为可编程的电流脉冲控制器将决定在电极间一定体积的组织的阻抗，所以电极间的距离不是决定合适电流脉冲的关键因素。因此，针状电极阵列设计的可选择的实施方案将是不对称的实施方案。此外，在不背离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以设想出任何数量的合适的对称和不对称的针状电极阵列。阵列中每个单个电极在所需组织中的深度可以随相当的结果而改变。此外，大分子的多个注射位点可以加到针状电极阵列中。可以用于有效促进大分子导入所选受试者组织的细胞中的电穿孔装置的一个实例描述于美国专利申请10/657,725中，所述专利申请于2003年9月8日提交，标题为“ConstantCurrentElectroporationDeviceAndMethodsOfUse”，Smith等人列为发明人，其整体引入本文作为参考。电穿孔装置包括电动装置(“EKD”)，其操作由软件或固件来具体制定。EKD基于脉冲参数的用户控制和输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒流脉冲模式，并允许储存和获得电流波形数据。电穿孔装置还包括具有针状电极阵列的可替换的电极盘、用于注射针的中心注射通道以及可移动的导向盘。限制性内切酶在本发明的一些实施方案中，通过限制性内切酶消化亲本DNA分子而产生线性DNA片段。下文提供了限制性内切酶的例子。名称识别序列AatIIGACGTCAcc65IGGTACCAccIGTMKACAciICCGCAclIAACGTTAfeIAGCGCTAflIICTTAAGAflIIIACRYGTAgeIACCGGTAluIAGCTAlwIGGATCAlwNICAGNNNCTGApaIGGGCCCApaLIGTGCACApoIRAATTYAscIGGCGCGCCAseIATTAATAvaICYCGRGAvaIIGGWCCAvrIICCTAGGBamHIGGATCCBanIGGYRCCBanIIGRGCYCBbsIGAAGACBbvIGCAGCBbvCICCTCAGCBciVIGTATCCBclITGATCABfaICTAGBglIGCCNNNNNGGCBglIIAGATCTBlpIGCTNAGCBmrIACTGGGBpmICTGGAGBsaAIYACGTRBsaBIGATNNNNATCBsaHIGRCGYCBsaIGGTCTCBsaJICCNNGGBsaWIWCCGGWBseRIGAGGAGBsgIGTGCAGBsiEICGRYCGBsiHKAIGWGCWCBsiWICGTACGBsmAIGTCTCBsmBICGTCTCBsmFIGGGACBsmIGAATGCBsoBICYCGRGBsp1286IGDGCHCBspDIATCGATBspEITCCGGABspHITCATGABspMIACCTGCBsrBICCGCTCBsrDIGCAATGBsrFIRCCGGYBsrGITGTACABsrIACTGGBssHIIGCGCGCBssKICCNGGBst4CIACNGTBssSICACGAGBstBITTCGAABstEIIGGTNACCBstF5IGGATGNNBstNICCWGGBstUICGCGBstYIRGATCYBstZ17IGTATACBsu36ICCTNAGGBtgICCPuPyGGBtrICACGTGCac8IGCNNGCClaIATCGATDdeICTNAGDpnIGATCDpnIIGATCDraITTTAAAEaeIYGGCCREagICGGCCGEarICTCTTCEciIGGCGGAEco0109IRGGNCCYEcoRIGAATTCEcoRVGATATCFauICCCGCNNNNFnu4HIGCNGCFokIGGATGFseIGGCCGGCCFspITGCGCAHaeIIRGCGCYHaeIIIGGCCHgaIGACGCHhaIGCGCHincIIGTYRACHindIIIAAGCTTHinfIGANTCHinP1IGCGCHpaIGTTAACHpaIICCGGHphIGGTGAKasIGGCGCCKpnIGGTACCMboIGATCMboIIGAAGAMfeICAATTGMluIACGCGTMnlICCTCMscITGGCCAMseITTAAMspA1ICMGCKGMspICCGGNaeIGCCGGCNarIGGCGCCNciICCSGGNcoICCATGGNdeICATATGNgoMIVGCCGGCNheIGCTAGCNlaIIICATGNlaIVGGNNCCNotIGCGGCCGCNruITCGCGANsiIATGCATNspIRCATGYPacITTAATTAAPaeR7ICTCGAGPciIACATGTPleIGAGTCPmeIGTTTAAACPmlICACGTGPpuMIRGGWCCYPsiITTATAAPspGICCWGGPspOMIGGGCCCPstICTGCAGPvuICGATCGPvuIICAGCTGRsaIGTACRsrIICGGWCCGSacIGAGCTCSacIICCGCGGSalIGTCGACSapIGCTCTTCSau3AIGATCSau96IGGNCCSbfICCTGCAGGScaIAGTACTScrFICCNGGSexAIACCWGGTSfaNIGCATCSfcICTRYAGSfoIGGCGCCSgrAICRCCGGYGSmaICCCGGGSmlICTYRAGSnaBITACGTASpeIACTAGTSphIGCATGCSspIAATATTStuIAGGCCTStyICCWWGGSwaIATTTAAATTaqITCGATfiIGAWTCTliICTCGAGTseIGCWGCTsp45IGTSACTsp509IAATTTspRICAGTGTth111IGACNNNGTCXbaITCTAGAXhoICTCGAGXmaICCCGGGXmnIGAANNNNTTC如本文所使用的，术语DNA的“限制性内切酶消化”指用只在DNA的某些位置处起作用的酶来催化切割DNA。这样的酶被称为限制性内切核酸酶，并且每一种酶所特异性针对的位点被称为限制性位点。本文所使用的各种限制性内切酶都是市售的，并且使用由酶供应商所制定的其反应条件、辅助因子及其他要求。限制性内切酶通常由缩写来标示，所述缩写的组成为一个大写字母，随后为代表每种限制性内切酶最初从其中获得的微生物的其他字母，以及随后为指明特定酶的数字。一般而言，在约20μl缓冲液中使用约1μg的质粒或DNA片段和约1-2个单位的酶。厂商详细说明了对于特定的限制性内切酶来说合适的缓冲液和底物量。使用限制性内切酶以确保质粒的完整性和正确性。实施例包括了下述实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下文实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明实践中作用良好的技术，因而可以被视为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，在公开的具体实施方案中可以进行许多改变并且仍获得同样或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。实施例1DNA载体的构建和在动物受试者中的方法DNA构建体为了增强疫苗接种应答并改善受试者在感染性攻击后的临床结果，首先必需设计几种GHRH构建体。简言之，质粒载体包含连接在野生型物种特异性或类似的GHRH上的肌肉特异性合成启动子SPc5-12(SEQID#15)(Li等人，1999)。一些野生型GHRH序列在我们实验室中进行克隆(犬、猫和马)；其他的(鸡、羊、牛、猪、人)根据专门的文献进行合成。如所描述的(Draghia-Akli等人，1999)，通过定点诱变产生类似的GHRH序列。简言之，通过GHRHcDNA的定点诱变产生哺乳动物GHRH类似物cDNA(SEQID#18)(AlteredSitesIIinvitroMutagenesisSystem，Promega，Madison，WI)，并将其克隆到pSPc5-12的BamHI/HindIII位点内，以产生特异的GHRH构建体。将生长激素的3’非翻译区(3’UTR)克隆到GHRHcDNA的下游。所得到的质粒包含类似的哺乳动物GHRH编码序列，并且所得到的氨基酸序列在哺乳动物中不是天然存在的。尽管不希望被理论束缚，但增强疫苗接种应答并改善受试者在感染性攻击后的临床结果最终由GHRH激素的循环水平决定。几种不同的质粒编码GHRH或其功能性生物学等价物的不同的突变型或野生型氨基酸序列，例如质粒编码的氨基酸序列HV-GHRH(SEQID#1)HVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH猪-GHRH(SEQID#2)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGA-OH牛-GHRH(SEQID#3)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGA-OH犬-GHRH(SEQID#4)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGA-OH猫-GHRH(SEQID#5)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGA-OHTI-GHRH(SEQID#6)YIDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH羊-GHRH(SEQID#7)YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGA-OH鸡-GHRH(SEQID#8)HADGIFSKAYRKLLGQLSARNYLHSLMAKRVGSGLGDEAEPLS-OH马-GHRH(部分的)(SEQID#9)-ADAIFTNNYRKVLGQLSARKILQDIMSR-----------OH人-GHRH(SEQID#10)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGA-OHTV-GHRH(SEQID#11)YVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OHTA-15/27/28-GHRH(SEQID#12)YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH。一般而言，编码的GHRH或其功能性生物学等价物的通式为-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGE-X6-N-X7-E-X8-GA-OH(SEQID#14)，其中X1是选自酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的氨基酸的D-或L-异构体；X2是选自丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的氨基酸的D-或L-异构体；X3是选自丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的氨基酸的D-或L-异构体；X4是选自甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的氨基酸的D-或L-异构体；X5是选自丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的氨基酸的D-或L-异构体；X6是选自精氨酸(“R”)或丝氨酸(“S”)的氨基酸的D-或L-异构体；X7是选自精氨酸(“R”)或谷氨酰胺(“Q”)的氨基酸的D-或L-异构体；和X8是选自精氨酸(“R”)或谷氨酰胺(“Q”)的氨基酸的D-或L-异构体。上述质粒不包含多位点接头、IGF-I基因、骨骼α-肌动蛋白启动子或骨骼α肌动蛋白3’UTR/NCR。此外，如下所述通过肌肉注射以及随后体内电穿孔来导入这些质粒。关于“功能性生物学等价物”，技术人员会很好地理解，对于改变数目具有限制这一观念为“生物学上功能等价的”蛋白质和/或多核苷酸的定义所固有，所述改变可以在分子的指定部分内进行而同时保留具有可接受水平的等价生物学活性的分子。因此，功能性生物学等价物在本文中被定义为所选氨基酸(或密码子)可以被置换的那些蛋白质(和多核苷酸)。包含GHRH的功能性生物学等价物的肽是这样的多肽，其已被改造为含有不同的氨基酸序列，而同时具有当与GHRH相比较时类似或改进的生物学活性。例如，GHRH的一种生物学活性是促进受试者中的GH分泌。优化的质粒骨架。本发明的一个方面是优化的质粒骨架。下文提出的合成的质粒包含被对于物种特异性哺乳动物转录来说经合成优化的真核序列。合成优化现有的pSP-HV-GHRH质粒(“pAV0125”)(SEQID#22)以形成新质粒(SEQID#25)。质粒pAV0125描述于美国专利6,551,996，所述专利于2003年4月22日颁发，标题为“Super-activeporcinegrowthhormonereleasinghormoneanalog”，Schwartz等人列为发明人(“theSchwartz‘996Patent”)，它教导了包含突变的GHRH类似物的应用，所述突变提高引起生长激素释放的能力。这种3,534bp的质粒pAV0125(SEQID#22)包含具有来自不同市售质粒的各种组分的质粒骨架，例如，合成启动子SPc5-12(SEQID#15)、经修饰的猪GHRH序列(SEQID#18)和人生长激素的3’末端(SEQID#38)。优化的合成质粒的其他具体例子包括优化的wt-猪GHRH质粒，pAV0225(SEQID#26)，图8；犬GHRH质粒，pAV0235(SEQID#27)，图9；牛GHRH质粒，pAV0236(SEQID#28)，图10；猫GHRH质粒，pAV0238(SEQID#29)，图11；TI-GHRH质粒，pAV0239(SEQID#30)，图12；羊GHRH质粒，pAV0240(SEQID#31)，图13；鸡GHRH质粒，pAV0241(SEQID#32)，图14；马GHRH质粒，pAV0249(SEQID#33)，图15；人GHRH质粒(SEQID#34)。对于此类优化质粒的治疗性编码基因还可包括编码经修饰的GHRH分子或其功能性生物学等价物的优化的核酸序列。实施例2质粒注射和电穿孔可以用于向大型动物递送抗原使用混合性别、年龄为3-6周、体重为15-40kg的年幼杂种猪(n＝6-7/组/实验)。将动物成组养在围栏里，随意获取24％蛋白质饮食(ProducersCooperativeAssociation，Bryan，TX)和水。利用市售试剂盒(QiagenInc.，Chatsworth，CA，USA)获得质粒。如由KineticChromagenicLAL(Endosafe，Charleston，SC)所测量的，内毒素水平低于0.01EU/μg。质粒制剂在无菌水中进行稀释，并用聚L-谷氨酸钠盐(MW＝10.5kDa，平均值)(Sigma，St.Louis，MO)配制为1％重量/重量。在实验的第0天，用手制住动物，并在5针电极阵列的中心利用21号针将表达分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的质粒溶液通过完整无损的皮肤直接注射到半膜肌内。在寻找合适的注射位点时避开所有主要的表面血管。在质粒注射后以预定的时间间隔，在我们的情况下为80毫秒，开始电穿孔5次脉冲，长度为52毫秒，电场强度为0.4-1Amp，脉冲间隔为1秒。根据NIH、USDA和AnimalWelfareAct指导方针来饲养动物。血液收集在每次实验的第0、3、7和10天，在8:30AM对动物进行称重并且通过颈静脉穿刺将血液收集到MICROTAINER血清分离管中。允许血液在室温下凝结10-15分钟并随后于3000×g离心10分钟，并将血清储存在-80℃直至进一步分析。分泌型胚胎碱性磷酸酶测定法将血清样品解冻，并利用Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit(AppliedBiosystems，Bedford，MA)根据厂商说明分析50μL血清样品的SEAP活性。该测定法的检测下限是3pg/mL。在SEAP活性测定前将较浓的血清样品在小鼠血清中进行1∶10稀释。所有样品利用LUMIstarGalaxyluminometer(BMGLabtechnologies，Offenburg，Germany)进行读数。SEAP蛋白在猪中是具有免疫原性的，并且当使用直接肌肉注射并随后电穿孔时，在质粒递送后10-14天内发生免疫介导的对该蛋白质的清除(图1)。因此，SEAP的表达水平只能在2周的时间段内进行研究，并被认为是肌内质粒转移后基因表达的可靠量度。然而，该技术可以用于递送特异性增强受试者中的免疫功能的其他类型分子。因为可测量的疫苗接种应答通常发生在疫苗接种后大约14天，所以合理的是，使用免疫调节剂如GHRH的处理可以在疫苗接种前或与疫苗接种操作相伴发生。实施例3在牛中的GHRH施用年龄为18-20个月、平均体重为547±43kg的32头初产Holstein牛在妊娠期的最后三个月期间用2.5mgpSP-HV-GHRH处理一次，并被标示为处理组。类似地，来自相同来源、具有相同品种和年龄的20头怀孕小母牛不接受质粒处理而作为对照。动物在年龄为23个月±24天时产下小牛。牛养在自由的畜棚中并暴露在天然日光中，所述畜棚安装有配备了水雾器(watermister)的鼓风机用于蒸发性冷却。每天两次用基于青贮饲料的总混合配给量随意喂养牛群。每头牛配备有转发器/计步器，这允许在进入畜栏时进行自动识别。在这次实验结束时，以它们的组织不进入食物链的方式处理所有用质粒处理的动物。由处理动物产生的所有奶品和组织被销毁并且不进入人类的食物链。根据NationalResearchCouncil’sGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals来施行动物方案。肌内注射质粒DNA。将pSPc5-12-HV-GHRH的不含内毒素的质粒(QiagenInc.，Chatsworth，CA，USA)制剂在水中稀释为5mg/mL，并用聚L-谷氨酸配制为1％wt/wt。利用21G针(Becton-Dickinson，FranklinLacks，NJ)在斜方肌中肌内给予牛总量为2.5mg的pSP-HV-GHRH。注射2分钟后，如所描述的(Draghia-Akli等人，2002b)，利用Advisys’sEKD装置并采用下述条件对经注射的肌肉进行电穿孔5次脉冲，1Amp，52毫秒/脉冲。在电穿孔过程中电压随组织电阻的改变而改变(以维持恒定电流)，并且它被记录为80-120V/cm。对于所有注射，将2cm的针头通过皮肤插入肌肉中。在注射后立即和24小时之后观察动物在电穿孔位点处的任何不良作用。体重、身体状况和蹄的得分。在处理前，小母牛在相同的经校准的称(与WeighTronix915A指示器和WP233打印机连接的Priefert牛挤压滑运道(squeeze-chute)，CentralCityScale，CentralCity，NE)上进行称重并随机进行分组。由对处理组不知情的2名独立的乳品动物科学家(TexasA&MUniversity)在处理前、60-80DIM以及100-120DIM评估身体状况得分。通过观察和触摸脊椎、腰部和臀部区域来对牛进行评分(Rodenburg，1996)，可能的BCS为1(非常瘦的牛)-5(极其超健壮的牛)。在质粒-GHRH处理前和60DIM测量蹄得分。蹄得分包括每只足的0(没有蹄问题)-4(严重的蹄问题)评价。每只蹄给予额外的2分，用于评估最终出现的脓肿(1分)和在任何给定时间的必需治疗(1分)。可能的蹄得分为0(没有问题)-24(所有4只足上有严重的蹄问题，脓肿，并且每只蹄需要深切治疗)。全血细胞计数和免疫标记物。在处理前，和在处理后18和300天时，以及在疫苗接种攻击后，将来自所有小母牛的全血收集在EDTA中并且进行全血细胞计数分析(TexasVeterinaryMedicalDiagnosticLaboratory，CollegeStation，TX)。血液学参数包括红细胞计数、血细胞比容、血红蛋白、总白细胞计数和不同的淋巴细胞计数(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、血小板计数、平均红细胞容量、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度和纤维蛋白原。在第0和18天对所有经处理的牛和对照，并在处理后300天和在Biocor-9疫苗接种攻击后对20头经处理的和10头对照的牛，测定免疫标记物。利用Dr.Davis’实验室(DepartmentofVeterinaryMicrobiology/Pathology，CVM，WashingtonStateUniversity，Pullman，Washington)开发的单克隆抗体(mAb)通过流式细胞术(FC)进行分析。在3-色FC中使用mAb的组合来确定外周血中外周血单核细胞(PBMC)的不同群体的组成和频率以及CD4和CD8alphabeta(αβ)T细胞和gammadelta(γδ)T细胞的功能状态。在一些组合中使用特异性相同的两种mAb以增加在CD4和CD8T细胞上的荧光信号的强度。在所示时间处获得10mL血液并进行处理以用于FC(Davis等人，1995)。血液在Tris缓冲的NH4Cl中进行裂解，在含有酸性柠檬酸葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水(PBS/ACD)中进行洗涤，并随后分配在包含不同mAb组合的96孔圆锥形底部的组织培养板中。细胞在冰上孵育15分钟，在PBS/ACD中洗涤3次，并与缀合有荧光素、藻红蛋白或藻红蛋白-Cy5的同种型特异性山羊抗-小鼠抗体(SouthernBiotechnologyAssociates，Birmingham，AL，CaltagLaboratories，Burlingame，CA)的不同组合一起再孵育15分钟。然后，将细胞洗涤2次并在PBS缓冲的2％甲醛中固定。将细胞保存在冰箱中直至检查。在配备有CellQuest软件的BectonDickinsonFACSort上检查细胞。在FlowJo(TreeStar，Inc.，SanCarlos，CA)和FCSExpress(DeNovosoftware，Thornton，Ontario，Ca)软件上分析数据。除非另有说明，数据表示为用特定的单克隆抗体或其组合测定的总群体的百分比(例如，总CD4+和CD4-细胞代表100％的被测定的细胞；总CD2-CD3-、CD2-CD3+、CD2+CD3-或CD2+CD3+代表100％的用CD2和CD3抗体测定的细胞，等)。生物化学和胰岛素测量。在60和100DIM时收集血清样品。将血清进行等分用于RIA和生物化学分析，并在分析之前保存在-80℃。生物化学分析在血清收集后48小时内发生(TexasVeterinaryMedicalDiagnosticLaboratory，CollegeStation，TX)。血清生物化学终点包括丙氨酸转氨酶、γ谷氨酰转移酶、肌酸磷酸激酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白、球蛋白、血液尿素氮、肌酸酐、磷、钙和葡萄糖。在血清收集后90天内进行胰岛素和IGF-1测定。由一个独立的实验室分析样品的葡萄糖和胰岛素水平(TexasVeterinaryMedicalDiagnosticLaboratory，CollegeStation，TX)。所有样品在同一测定中进行分析。胰岛素测定的测定可变性为3.6％，而葡萄糖测定的测定可变性为4.4％。利用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒测量血清样品的总蛋白(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)。IGF-I的放射免疫测定。利用异源的人免疫放射分析试剂盒根据厂商的方案(DiagnosticSystemLabs，Webster，TX)来测量血清IGF-1。该试剂盒采用了提取步骤以消除结合蛋白的干扰。所有样品在同一测定中进行。测定内可变性为4％。人IGF-I抗体对于牛IGF-1的交叉反应性为100％。SurroundTM9疫苗接种在研究开始后的300天，利用被称为SurroundTM9(Biocor)的9-way疫苗对参与本研究(用GHRH处理的和对照)的所有动物进行疫苗接种。SurroundTM9是包含灭活、加以佐剂的、高抗原性的下述微生物株系的多价疫苗IBR(牛疱疹病毒-1)、BVD(牛病毒性腹泻病毒)、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒(作为被杀死的病毒)、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体菌苗。所有级分都是灭活的并加以佐剂以维持最大的病毒抗原性。钩端螺旋体血清变型在设计为确保最大生长和抗原性的培养基中产生。这种疫苗接种在牛中引起从腹泻以及乳腺炎病因中所牵涉的病原体到呼吸系统疾病的大量致病状况。在5mL溶液的一次注射中经皮下或肌内施用该疫苗。统计分析。数据由对处理组(经处理的n＝32，对照的n＝20)采用不等的实验单位配置在不同时间点进行重复测量而得到的结果组成。当检测到显著的(P＜0.05)处理-x-天相互作用时，进行额外的比较。使用采用SAS(简单主要作用的分析)的混合模型来检查在不同时间点上每个变量的组之间是否存在任何显著的差异。通过ANOVA分析分类的数据，例如发病率和死亡率、淘选率和蹄问题。数据用数值编码从而使得可以执行ANOVA。在这个参数的分析中使用每个动物的总蹄得分。对于死亡率，使用相当的评分系统活的＝1，死的＝0。对于重复测量，用ANOVA分析血清IGF-I。结果中呈现了用Studentst-检验、ANOVA或线性回归进行比较的值，将P＜0.05视为具有统计学显著性的水平。实施例4用GHRH质粒疗法处理并用多价疫苗进行疫苗接种的牛的临床应答生物化学和CBC值总白细胞计数在组间是相似的。然而，在300天时循环淋巴细胞的百分比在用GHRH处理的动物中是增加的(47.4±3.3％，对照为37.8±5.3％，P＜0.06)。在这个时间点上还观察到血红蛋白(用GHRH处理的为11.55±0.15g/dL，对照为10.9±0.15g/dL，P＜0.02)和红细胞(7.65±0.1百万/mL，7.3±0.2百万/mL，P＜0.07)的生理学增加。在任何测试时间点上，在其他CBC或血清生物化学项目方面，组之间没有发现差异。这些在对于牛来说的值的正常范围内。葡萄糖和胰岛素水平在组间没有不同(图2)。免疫标记物在第0天，白细胞总数、分类计数和流式细胞术(FC)特性图在组间是相似的。在处理后第18天时，CD2+值在经处理的动物中增加了14％，但在对照中与基线值相比较时没有改变用GHRH处理的牛中，43.4±1.7％对37.9±1.4％，P＜0.004，和对照中，37.3±2.1％对38.8±1.8％)(图3A)。CD4+/CD8+比率在经处理的动物中增加(第18天-第0天＝8±0.6％，P＜0.04)，主要是由于CD4+细胞的增加(第18天，29.1±0.7％，第0天，24.5±0.8％)。在相同时间段中，CD4+CD45R+幼稚淋巴细胞通过用GHRH处理增加了53％在用GHRH处理的动物中，第18天，11.1±0.4％，第0天，7.4±0.4％，P＜0.016；以及在对照动物中，第18天，8±0.7％，第0天，7.2±0.8％)(图3B)。CD25+CD4+细胞通过处理也明显增加了在用GHRH处理的动物中，第18天，4.3±0.3％，第0天，1±0.1，P＜0.001；以及在对照中，第18天，3.8±0.2％，第0天，1.7±0.2。在处理后的第300天，当执行更全面的项目时，CD45R+/CD45R0-幼稚淋巴细胞在经处理的动物中(0.98±0.08)比在对照中(0.91±0.08)显著(P＜0.05)更多(图3C)。CD2+CD3+γδ-细胞由于处理而变得更多所有CD2+细胞的68.5±1.4％，对照为60±5.6％，P＜0.02。SurroundTM9-way疫苗接种(Biocor)后2周，当执行更全面的项目时，CD4+/CD8+比率在用GHRH处理的动物中显著增加，而它在对照中是减少的在用GHRH处理的动物中，0.23±0.07；在对照中，-0.09±0.01，P＜0.05(图4)。SurroundTM9-way疫苗接种后2周，当执行更全面的项目时，与对照相比，CD25-CD4+CD45R0幼稚T淋巴细胞在用GHRH处理的动物中显著增加，P＜0.05(图5)。经处理的动物中的死亡率小母牛的死亡率(不自主淘选率(involuntarycullrate))在用GHRH处理的动物和对照之间是不同的。在360天的研究过程中，没有一头经处理的小母牛死亡，而20％的对照小母牛不得不被淘汰(P＜0.003)。死亡原因如下一头为约内病，一头为由于蹄病状和受感染的切口而引起的全身感染，一头具有并发后腿麻痹的严重蹄问题，和一头为严重的乳腺炎病例。一头经处理的动物由于意外被淘汰。在120天的泌乳天数(DIM)前的总不自主淘选率通过处理而增加了40％。通过GHRH-质粒介导的处理增加了疫苗接种后针对环境病原体的保护。体重和身体状况得分在应激和负能量平衡时、在60-80DIM时，小母牛的身体状况得分(BCS)在组间是不同的。在60-80DIM，用pSP-HV-GHRH处理的小母牛显示出BCS的改善(P＜0.0001，图6)。在第一个100DIM期间，经处理的动物损失了3.5kg的平均重量(总体重的0.06％)(P＜0.02，图7)，而对照牛损失了26.4kg的平均重量(4.6％的在60DIM时的总体重)。较佳的BCS与血清IGF-I水平增加相关对于用GHRH处理的小母牛，第100天-第60天＝22.4±4ng/mL(第100天为119.7±6.9ng/mL，第60天为97.3±6.6ng/mL)；对于对照，8±7.4ng/mL(第100天为99.8±3.9ng/mL，第60天为91.8±6.8ng/mL)(P＜0.04)。发病率在质粒施用前在研究开始时牛群具有明显的蹄病理状态。足部问题，最可能是细菌起因的(Murray等人，1996)，在本研究的整个过程中也是这些动物发病的主要原因之一。构成主要蹄病理状态的趾部皮炎损伤通过GHRH处理而减弱。研究已显示，多达29％的乳牛和4％的肉牛具有十分明显的趾部皮炎损伤，并且在超过60％的情况下涉及螺旋体(Brown等人，2000)。对螺旋体的免疫应答具有较短的持续时间(Trott等人，2003)，因此为了减少感染负荷，稳定的长期治疗将是优选的。疫苗接种和GHRH处理的组合经证明对于被处理的动物是有利的。与经处理的动物相比较时，对于对照来说在本研究的过程中自始至终具有恶化的足部问题的动物的比例高40％32只用GHRH处理的动物中的7只；20只对照中的7只。由于对照组中动物间的高可变性，总蹄得分的改善没有达到统计学显著性(P＜0.4)。与用可以产生不希望的副作用(例如，出血性溃疡、肝和肾的液泡化或甚至是动物死亡(Smith等人，1991))的猪重组促生长素(rpST)或bST进行注射相反，质粒介导的GHRH基因补充给药法是被良好耐受的，在动物中没有观察到副作用。包含受调节的组织/纤维型特异性hGH的质粒先前已在家畜和GH缺乏宿主中用于GH的递送和稳定生产。用于递送包含hGH的质粒的方法包括基因转移、成肌细胞转移或脂质体介导的静脉内注射(Barr和Leiden，1991；Dahler等人，1994；Pursel等人，1990)。然而，这些技术具有明显的缺点，即要将它们从以大规模运作进行使用和/或用于食物动物中排除，包括1)与脂质体递送相关的可能的毒性或免疫应答；2)在经转染的成肌细胞方法中需要大量离体操作；和/或3)在基因转移中重大副作用或无效的风险(Dhawan等人，1991；Miller等人，1989)。与这些技术相比，质粒介导的基因补充给药法和DNA注射是简单且有效的，没有与递送系统或过量表达相关的并发症。本文所提供的实施方案举例说明了，在注射有GHRH质粒的哺乳动物中产生了增强的疫苗接种应答和改善的临床结果。经处理的受试者在受试者对于感染性攻击的应答能力方面显示出明显的改善。经处理的受试者没有经历来自该疗法的任何副作用，包括相关的病理状态或死亡。尽管不希望被理论束缚，但疫苗接种应答的增强表明，肌原性GHRH载体的异位表达将可能以生理学上更合适的方式刺激GH轴。本领域技术人员会容易意识到，本发明非常适合于实现这些目的并获得所提到的以及那些其中所固有的目标和优点。本文所描述的生长激素、生长激素释放激素、类似物、质粒、载体、药物组合物、治疗、方法、操作过程和技术目前代表了优选的实施方案，并且希望是示例性的而不希望作为范围的限制。另外，包括牛疱疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹泻(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体bacterinsmycoplasmahyopneumonia、猪肺炎支原体或其组合的疫苗希望是示例性的而不希望作为范围的限制。因此，对于本领域技术人员而言，将会存在其改变和其他用途，它们包括在本发明的精神之内或由未决的权利要求的范围所限定。所引用的参考文献下述美国专利文件和公开的参考文献中每一个的完整内容引入本文作为参考。美国专利文件于1998年12月8日颁发、Coy等人列为发明人的美国专利号5,847,066。于1998年12月8日颁发、Felix等人列为发明人的美国专利号5,846,936。于1998年8月11日颁发、Schally等人列为发明人的美国专利号5,792,747。于1998年7月7日颁发、Bowers等人列为发明人的美国专利号5,776,901。于1998年5月26日颁发、Schwartz等人列为发明人的美国专利号5,756,264。于1997年12月9日颁发、Felix等人列为发明人的美国专利号5,696,089。于1996年1月23日颁发、Bowers等人列为发明人的美国专利号5,486,505。于1994年3月8日颁发、Boyd等人列为发明人的美国专利号5,292,721。于1992年8月11日颁发、Seely等人列为发明人的美国专利号5,137,872。于1992年7月28日颁发、Boyd等人列为发明人的美国专利号5,134,210。于1992年1月28日颁发、Felix等人列为发明人的美国专利号5,084,442。于1991年10月29日颁发、Kann等人列为发明人的美国专利号5,061,690。于1991年7月30日颁发、Thorner列为发明人的美国专利号5,036,045。于1991年6月11日颁发、Kovacs等人列为发明人的美国专利号5,023,322。于1989年6月13日颁发、Bowers等人列为发明人的美国专利号4,839,344。于1983年10月18日颁发、Bowers等人列为发明人的美国专利号4,410,512。于1991年9月24日颁发、Drengler列为发明人的美国专利号RE33,699。于1989年5月23日颁发、Grosvenor等人列为发明人的美国专利号4,833,166。于1980年10月14日颁发、Momany等人列为发明人的美国专利号4,228,158。于1980年10月14日颁发、Momany等人列为发明人的美国专利号4,228,156。于1980年10月7日颁发、Momany等人列为发明人的美国专利号4,226,857。于1980年9月23日颁发、Momany等人列为发明人的美国专利号4,224,316。于1980年9月16日颁发、Momany等人列为发明人的美国专利号4,223,021。于1980年9月16日颁发、Momany等人列为发明人的美国专利号4,223,020。于1980年9月16日颁发、Momany等人列为发明人的美国专利号4,223,019。于1997年12月30日颁发、标题为“Needleelectrodesformediateddeliveryofdrugsandgenes”、Hofmann等人列为发明人的美国专利号5,702,359。于1995年8月8日颁发、标题为“Electroporationsystemwithvoltagecontrolfeedbackforclinicalapplications”、Hofmann列为发明人的美国专利号5,439,440。于1996年5月5日公开、标题为“ElectroporeticGeneandDrugTherapybyInducedElectricFields”、Hofmann等人列为发明人的PCT申请WO/96/12520。于1996年4月25日公开、标题为“FlowThroughElectroporationApparatusandMethod”、Hofmann等人列为发明人的PCT申请WO/96/12006。于1995年7月27日公开、标题为“ElectroporationandIontophoresisApparatusandMethodForinsertionofDrugsandgenesintoCells”、Hofmann列为发明人的PCT申请WO/95/19805。于1997年3月6日公开、标题为“InVivoElectroporationofCells”、Nicolau等人列为发明人的PCT申请WO/97/07826。参考文献列表Acsadi，G.，G.Dickson，D.R.Love，A.Jani，F.S.Walsh，A.Gurusinghe，Wolff，JA，andK.E.Davies.1991.HumandystrophinexpressioninmdxmiceafterintramuscularinjectionofDNAco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la3540<210>3<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是牛GHRH的氨基酸序列<400>3TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetAsnArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>4<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是犬GHRH的氨基酸序列<400>4TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetSerArgGlnGlnGly202530GluArgAsnArgGluGlnGlyAla3540<210>5<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是猫GHRH的氨基酸序列<400>5TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetSerArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>6<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是TI-生长激素释放激素(“GHRH”)类似物<400>6TyrIleAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuAlaGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleLeuAsnArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>7<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是羊GHRH的氨基酸序列<400>7TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysIleLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetAsnArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>8<211>43<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是鸡GHRH的氨基酸序列<400>8HisAlaAspGlyIlePheSerLysAlaTyrArgLysLeuLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgAsnTyrLeuHisSerLeuMetAlaLysArgValGly202530SerGlyLeuGlyAspGluAlaGluProLeuSer3540<210>9<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是马GHRH的氨基酸序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>″X″可以是任何AA序列<220><221>misc_feature<222>(30)..(40)<223>″X″可以是任何AA序列<400>9XaaAlaAspAlaIlePheThrAsnAsnTyrArgLysValLeuGlyGlnl51015LeuSerAlaArgLysIleLeuGlnAspIleMetSerArgXaaXaaXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa3540<210>10<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是人(1-40)-GHRH的氨基酸序列<400>10TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetSerArgGlnGlnGly202530GluSerAsnGlnGluArgGlyAla3540<210>11<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是TV-生长激素释放激素(“GHRH”)类似物<400>11TyrValAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuAlaGlnl51015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleLeuAsnArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>12<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是TA-生长激素释放激素(“GHRH”)类似物<400>12TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuAlaGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleLeuAsnArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>13<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是人(1-44)生长激素释放激素(″GHRH″)<400>13TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetSerArgGlnGlnGly202530GluSerAsnGlnGluArgGlyAlaArgAlaArgLeu3540<210>14<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>这是GHRH(1-40)OH的人工序列<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa可以是酪氨酸或组氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa可以是丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>第15位的Xaa可以是丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>第27位的Xaa可以是甲硫氨酸或亮氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa可以是丝氨酸或天冬酰胺<220><221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>第34位的Xaa可以是精氨酸或丝氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>第36位的Xaa可以是精氨酸或谷氨酰胺<220><221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>第38位的Xaa可以是精氨酸或谷氨酰胺<400>14XaaXaaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuXaaGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleXaaXaaArgGlnGlnGly202530GluXaaAsnXaaGluXaaGlyAla3540<210>15<211>323<212>DNA<213>人工序列<220><223>这是真核启动子c5-12的核酸序列<400>15cggccgtccgccctcggcaccatcctcacgacacccaaatatggcgacgggtgaggaatg60gtggggagttatttttagagcggtgaggaaggtgggcaggcagcaggtgttggcgctcta120aaaataactcccgggagttatttttagagcggaggaatggtggacacccaaatatggcga180cggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctggg240ggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacga300gctacccggaggagcgggaggcg323<210>16<211>190<212>DNA<213>人工序列<220><223>人生长激素polyA尾的核酸序列<400>16gggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactcca60gtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtcc120ttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagaca180acctgtaggg190<210>17<211>795<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗生素抗性基因卡那霉素的核酸序列<400>17atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattc60ggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtca120gcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactg180caggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtg240ctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcag300gatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg360cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgc420atcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaa480gagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgac540ggcgaggatctcgtcgtgactcatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaat600ggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggac660atagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttc720ctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttctt780gacgagttcttctga795<210>18<211>219<212>DNA<2t3>人工序列<220><223>类似的猪GHRH序列的序列<400>18atggtgctctgggtgttcttctttgtgatcctcaccctcagcaacagctcccactgctcc60ccacctccccctttgaccctcaggatgcggcggcacgtagatgccatcttcaccaacagc120taccggaaggtgctggcccagctgtccgcccgcaagctgctccaggacatcctgaacagg180cagcagggagagaggaaccaagagcaaggagcataatga219<210>19<211>246<212>DNA<213>人工序列<220><223>类似的小鼠GHRH序列的序列<400>19gccatggtgctctgggtgctctttgtgatcctcatcctcacca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cctgaccctgagcagcggctcccacggc60tccctgccctcccagcctctgcgcatccctcgctacgccgacgccatcttcaccaacagc120taccgcaaggtgctcggccagctcagcgcccgcaagctcctgcaggacatcatgaaccgg180cagcagggcgagcgcaaccaggagcagggagcctgataagcttgc225<210>36<211>225<212>DNA<213>人工序列<220><223>类似的羊GHRH序列的序列<400>36gccatggtgctgtgggtgttcttcctggtgaccctgaccctgagcagcggaagccacggc60agcctgcccagccagcccctgaggatccctaggtacgccgacgccatcttcaccaacagc120tacaggaagatcctgggccagctgagcgctaggaagctcctgcaggacatcatgaacagg180cagcagggcgagaggaaccaggagcagggcgcctgataagcttgc225<210>37<211>246<212>DNA<213>人工序列<220><223>类似的鸡GHRH序列的序列<400>37gccatggtgctctgggtgctctttgtgatcctcatcctcaccagcggcagccactgcagc60ctgcctcccagccctcccttcaggatgcagaggcacgtggacgccatcttcaccaccaac120tacaggaagctgctgagccagctgtacgccaggaaggtgatccaggacatcatgaacaag180cagggcgagaggatccaggagcagagggccaggctgagctgataagcttgcgatgagttc240ttctaa246<210>38<211>190<212>DNA<213>人工序列<220><223>人生长激素polyA尾的核酸序列<400>38gggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactcca60gtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtcc120ttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagaca180acctgtaggg190<210>39<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人生长激素5’UTR的核酸序列<400>39caaggcccaactccccgaaccactcagggtcctgtggacagctcacctagctgcc55<210>40<211>782<212>DNA<213>人工序列<220><223>质粒pUC-18复制起点的核酸序列<400>40tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggta60tcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaag120aacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcg180tttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagagg240tggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg300cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggga360agcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgc420tccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt480aactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccact540ggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtgg600cctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtt660accttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggt720ggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcct780tt782<210>41<211>5<212>DNA<213>人工序列<220><223>这是NEO核糖体结合位点<400>41tcctc权利要求1.一种准备需要接种疫苗的受试者的方法，其包括将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体递送到受试者的组织中，其中GHRH在受试者体内表达。2.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体的递送发生在受试者接种疫苗前最多约1年。3.权利要求2的方法，其中核酸表达构建体的递送发生在受试者接种疫苗前约0-约14天。4.权利要求1的方法，其中将核酸表达构建体递送到受试者的组织中包括组织电穿孔。5.权利要求4的方法，其中组织电穿孔包括(a)用多个针状电极穿透受试者的组织，其中所述多个针状电极以间隔关系排列并且所述受试者的组织包括肌细胞；(b)以约0.01-5mg的量将核酸表达构建体导入所述多个针状电极之间的组织中；以及(c)对所述多个针状电极施加电脉冲，其中所述电脉冲允许所述核酸表达构建体穿过肌细胞膜。6.权利要求5的方法，其中所述核酸表达构建体进一步包括促进转染的多肽或带电荷的多肽。7.权利要求6的方法，其中所述促进转染的多肽或带电荷的多肽包括聚L-谷氨酸。8.权利要求1的方法，其中所述核酸表达构建体包括编码多肽的序列，所述多肽具有与SEQID#14编码的GHRH至少90％同一的氨基酸序列。9.权利要求1的方法，其中所述核酸表达构建体包括与小鼠pAV0202(SEQID#23)；大鼠pAV0203(SEQID#24)；HV-GHRHpAV0224(SEQID#25)；猪-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26)；犬pAV0235(SEQID#27)；牛pAV0236(SEQID#28)；猫pAV0238(SEQID#29)；TI-GHRHpAV0239(SEQID#30)；羊pAV0240(SEQID#31)；鸡pAV0241(SEQID#32)；马pAV0249(SEQID#33)；或人pAV0226(SEQID#34)至少97％同一的序列。10.权利要求1的方法，其中所述接种疫苗包括微生物、传染剂或类毒素的至少部分。11.权利要求10的方法，其中所述微生物包括病毒、细菌、支原体或寄生虫。12.权利要求10的方法，其中所述微生物包括牛疱疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹泻(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体bacterinsmycoplasmahyopneumonia、猪肺炎支原体或其组合。13.权利要求1的方法，其中所述受试者包括人、反刍动物、食物动物或工作动物。14.一种对受试者进行疫苗接种的方法，其包括(a)将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体递送到受试者的组织中；以及(b)以对于诱导受试者中抗疫苗抗体来说有效的量向受试者提供疫苗；其中GHRH在受试者体内表达，并且当与没有递送GHRH表达构建体的对照受试者相比较时，疫苗接种应答得到增强。15.权利要求14的方法，其中核酸表达构建体的递送与向受试者提供疫苗相伴发生。16.权利要求14的方法，其进一步包括在将编码GHRH的核酸表达构建体递送到受试者中之后，但在提供疫苗之前等待一段时间。17.权利要求16的方法，其中所述时间段为最多约1年。18.权利要求17的方法，其中所述时间段为约7天-约14天。19.权利要求14的方法，其中将核酸表达构建体递送到受试者的组织中包括组织电穿孔。20.权利要求19的方法，其中组织电穿孔包括用多个针状电极穿透受试者的组织，其中所述多个针状电极以间隔关系排列并且所述受试者的组织包括肌细胞；以约0.01-5mg的量将核酸表达构建体导入所述多个针状电极之间的组织中；以及对所述多个针状电极施加电脉冲，其中所述电脉冲允许所述核酸表达构建体穿过肌细胞膜。21.权利要求20的方法，其中所述核酸表达构建体进一步包括促进转染的多肽或带电荷的多肽。22.权利要求21的方法，其中所述促进转染的多肽或带电荷的多肽包括聚L-谷氨酸。23.权利要求14的方法，其中所述核酸表达构建体包括编码多肽的序列，所述多肽具有与SEQID#14编码的GHRH至少90％同一的氨基酸序列。24.权利要求14的方法，其中所述核酸表达构建体包括与小鼠pAV0202(SEQID#23)；大鼠pAV0203(SEQID#24)；HV-GHRHpAV0224(SEQID#25)；猪-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26)；犬pAV0235(SEQID#27)；牛pAV0236(SEQID#28)；猫pAV0238(SEQID#29)；TI-GHRHpAV0239(SEQID#30)；羊pAV0240(SEQID#31)；鸡pAV0241(SEQID#32)；马pAV0249(SEQID#33)；或人pAV0226(SEQID#34)至少97％同一的序列。25.权利要求14的方法，其中所述疫苗包括微生物、传染剂或类毒素的至少部分。26.权利要求25的方法，其中所述微生物包括病毒、细菌、支原体或寄生虫。27.权利要求25的方法，其中所述微生物包括牛疱疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹泻(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体bacterinsmycoplasmahyopneumonia、猪肺炎支原体或其组合。28.权利要求14的方法，其中所述受试者包括人、反刍动物、食物动物或工作动物。29.一种改善具有关节炎并接种了疫苗的受试者在感染性攻击后的临床结果的方法，其包括(a)用多个针状电极穿透受试者的肌肉组织，其中所述多个针状电极以间隔关系排列；(b)将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体递送到受试者的肌肉组织中，从而使得表达的GHRH的量能有效增强疫苗接种应答；以及(c)对所述多个针状电极施加电脉冲，其中所述电脉冲允许所述核酸表达构建体穿过肌细胞膜，其中，将0.01-5mg的核酸表达构建体与指定浓度的聚L-谷氨酸多肽一起递送到受试者的肌肉组织中，并且所述核酸表达构建体包括编码多肽的序列，所述多肽具有与SEQID#14编码的GHRH至少90％同一的氨基酸序列；并且所述受试者包括人、反刍动物、食物动物或工作动物。30.权利要求29的方法，其中所述核酸表达构建体包括与小鼠pAV0202(SEQID#23)；大鼠pAV0203(SEQID#24)；HV-GHRHpAV0224(SEQID#25)；猪-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26)；犬pAV0235(SEQID#27)；牛pAV0236(SEQID#28)；猫pAV0238(SEQID#29)；TI-GHRHpAV0239(SEQID#30)；羊pAV0240(SEQID#31)；鸡pAV0241(SEQID#32)；马pAV0249(SEQID#33)；或人pAV0226(SEQID#34)至少97％同一的序列。31.权利要求29的方法，其中所述受试者进行疫苗接种以抗微生物、传染剂或类毒素。32.权利要求31的方法，其中所述微生物包括病毒、细菌、支原体或寄生虫。33.权利要求31的方法，其中所述微生物包括牛疱疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹泻(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体bacterinsmycoplasmahyopneumonia、猪肺炎支原体或其组合。34.一种组合物，其包含(a)编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体；以及(b)疫苗；其中，GHRH在受试者体内表达。35.权利要求34的方法，其中所述疫苗包括微生物、传染剂或类毒素的至少部分。36.权利要求35的方法，其中所述微生物包括病毒、细菌、支原体或寄生虫。37.权利要求35的方法，其中所述微生物包括牛疱疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹泻(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体bacterinsmycoplasmahyopneumonia、猪肺炎支原体或其组合。38.一种对受试者进行疫苗接种的方法，其包括(a)用多个针状电极穿透受试者的组织，其中所述多个针状电极以间隔关系排列并且所述受试者的组织包括肌细胞；(b)以约0.01-5mg的量将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体导入所述多个针状电极之间的组织中；以及(c)对所述多个针状电极施加电脉冲，其中所述电脉冲允许所述核酸表达构建体穿过肌细胞膜；(d)以对于诱导受试者中针对疫苗的抗体来说有效的量向受试者提供疫苗；其中所述核酸表达构建体包括编码多肽的序列，所述多肽具有与SEQID#14编码的GHRH至少90％同一的氨基酸序列；并且其中所述疫苗包括牛疱疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹泻(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体bacterinsmycoplasmahyopneumonia、猪肺炎支原体或其组合的至少部分。全文摘要本发明公开了组合物和方法对受试者进行疫苗接种；增强接种疫苗的效率；在接种疫苗应答前准备受试者；以及改善已接种受试者在感染性攻击后的临床结果。更具体而言，本发明适合在给受试者递送疫苗之前或相伴疫苗递送将编码生长激素释放激素(“GHRH”)的核酸表达构建体递送到受试者的组织中，其中，GHRH表达在受试者体内，其中受试者包括人、猪、母牛、鸟、马或接受疫苗的任何其他动物种类。文档编号A61K39/39GK101027081SQ200580031764公开日2007年8月29日申请日期2005年7月21日优先权日2004年7月23日发明者R·德拉吉亚－阿克里,P·A·布朗,A·S·卡恩,W·C·戴维斯申请人:阿德维希斯公司