专利名称：偕二氟化c－糖肽、其制备方法及其用于保存生物材料和/或在冷冻外科中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种方法，用于合成偕二氟化(gem-difluorinated)C-糖肽化合物。其特别，但并非排他性地用于制备尤其可用于保存生物材料和用于冷冻外科中的化合物或组合物。
背景技术：
抗冻生物化合物存在于自然环境中，特别是糖蛋白。例如在一些鱼中存在有一些化合物，使得这些鱼能在低温环境存活，即，在接近零度或零度以下的温度存活。
此外，已知当水冻结时，该现象伴随体积增加，这是由于冰的三维生长导致的。
这种体积增加以及导致的渗透，在活组织中造成了严重的损伤细胞膜破裂、血液停止流动以及细胞微结构被扰乱。
很多年来，科学家们一直在研究如何用从自然环境(鱼、两栖动物、植物、昆虫)获得的抗冻化合物对上述现象造成影响，这些化合物尤其是蛋白质和糖蛋白。
深入的研究集中于对足够稳定，并且其活性与天然分子的活性至少相等或者甚至更高的类似化合物的合成，以用于商业应用。
由于存在糖苷(osidic)键(涉及被称为处于异头(anomeric)位置的氧的键)，糖蛋白相对多种酶系统(包括糖苷酶)来说是脆弱的，其还对酸碱水解敏感，从而更难以对它们进行合成。
因此，为允许这些化合物保持它们的生物学性质，替换糖苷键中的氧，使得该键不再被任何酶促过程破坏是人们感兴趣的。
其中氧被CH2基团代替的类似物已被合成，但是尽管有稳定性增加以及类似氧的空间阻碍(steric hindrance)，CH2基团并不总是证明为糖苷键氧的良好模拟物。因此，最初的化合物的生物学性质并没有总能显现出来。
为赋予生物培养基中糖缀合物(glycoconjugate)化合物增加的稳定性，正在研究其中氧被氮或硫以及更近来地二氟亚甲基替换的其它组的化合物。
CF2基团显示出了对于生物化学降解过程的特别的抗性，因此允许对不可水解的结构加以合成。
该O/CF2换位看起来特别适合在电子水平上模拟氧；两个氟原子作为两个不含氧的游离电子对(free doublets)发挥作用。
所述化合物可能能用于大量应用，例如保存细胞、血小板、组织、器官或者用于冷冻外科。
人们存在强烈的需要，以改进对不能代替的活细胞(包括精子、卵子和胚胎)的贮藏和保存，使得较之目前使用的方法它们经历少得多的损伤。
术语“保存(preservation)”通常包括在不同温度下保存，包括低至-196℃的冷冻保存。
因此，用作为佐剂以用于保存并且具有良好稳定性的化合物可用于保存生物材料，尤其是-用于没有时间地情况下贮藏整个的人类器官，例如，待移植的肾脏、心脏和肝脏，-用于在最小损伤的情况下以及足够长时间地保存脆弱的组织，以允许，可选地，国际运送，-用于保存血小板和细胞，-用于保护某些生物体、细菌、病毒或疫苗。
冷冻外科也被称为冷冻疗法，其是用液氮(或氩气)产生极端的冷以破坏异常组织。
其用于治疗外部肿瘤，例如皮肤肿瘤，其还用于治疗体内肿瘤，尤其是前列腺和肝脏中的。研究者已试着将冷冻外科作为治疗手段用于一定数量的癌症，包括乳腺癌、结肠和肾脏癌症。
此外，一些研究报导，一定浓度(5-10mg/ml)的抗冻糖蛋白产生针型冰晶，这增加了冷冻期间细胞破裂和死亡的可能性。如果可与冷冻外科联合使用的话，经由抗冻糖蛋白和蛋白质修饰的冰晶的该性质在治疗某些癌症的方面引起强烈的兴趣。
基于此，本发明的目的是解决上面提到的缺陷。
发明内容
为实现此目的，我们提出了一种偕二氟化C-糖肽，其具有通式I 其中N是1至5的整数，R4＝H、AA1、AA1-AA2，R5＝OH、AA1、AA1-AA2，AA1和AA2是独立的，它们代表具有非官能性侧链的氨基酸，并且R1、R2、R3是独立的基团，以及如果R1＝R2＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R3＝
其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，如果R1＝R3＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R2＝
其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，如果R2＝R3＝H、CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R1＝
其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基。
在R4和R5官能基中，氨基酸AA1和AA2是具有非官能性侧链的氨基酸，即，非极性的，例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸......
在R6官能基中，糖苷可以是任何糖，例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、......
根据一种变体，本发明的偕二氟化C-糖肽化合物是结构式II的 其中N是1至5的整数，并且R1、R2、R3是独立的基团，以及如果R1＝R2＝H、CH3，那么R3＝ 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，如果R1＝R3＝H、CH3，那么R2＝ 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，
R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，如果R2＝R3＝H、CH3，那么R1＝ 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基。
根据第二种变体，所述化合物可以更为精确地是通式III 其中N是1至5的整数，n是3至4的整数，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氢原子，或游离的或受保护的醇官能基，R9＝H、CH3，
R10＝H、CH3，R11是氢原子(H)，或保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)。
当处于可能的可药用碱(base)、对酸的加成盐、水合物或溶剂化物以及其任何衍生物的状态时，通式I-III的化合物可以以适合使用的不同盖仑剂型生产，例如作为溶液或混悬剂，可选地为可注射的。
通式II和III的化合物以及通式I的一些化合物可以是通式I的化合物的合成中间体。
一些组合物可含有至少一种通式I、II或III的化合物或者至少一种其衍生物或者至少一种通过向可药用无机或有机酸加成获得的其盐。
此外，通式I-III的该化合物可通过具有通式IV的化合物 其中Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR、......
其中，R＝H、Bn、Ac、TMS、TBDMS、TBDPS、......
R’、R”＝H、烷基、烯丙基、Bn、甲苯磺酸酯基(Ts)、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn、......
R＝H、烷基、Ac，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)、CH2-糖苷基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，例如烷基、苄基(Bn)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、乙酸酯基(Ac)，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基与通式V的化合物之间的反应来制备， 其中N是1至5的整数，R15＝H、AA1、AA1-AA2或保护基，R16＝OH、AA1、AA1-AA2或保护基，AA1和AA2是独立的，它们代表具有非官能性侧链的氨基酸，并且R12、R13、R14是独立的基团，如果R12＝R13＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R14＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整数，如果R12＝R14＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R13＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整数，如果R13＝R14＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R12＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整数。
除了可药用惰性、无毒赋形剂，例如蒸馏水、葡萄糖、淀粉、乳糖、滑石粉、植物油、乙二醇......之外，由此获得的组合物还可含有防腐剂。
其它活性成分可加入到上述组合物中。
所述组合物中，根据本发明的化合物和其它可选活性成分的量可根据应用、可应用的患者的年龄和体重而变化。
下面是对本发明的化合物的制备的例子，它们作为非限制性的例子，并参考附图，其中图1是获得化合物3的反应方程式；图2是获得化合物5的反应方程式；图3是获得化合物1的反应方程式；图4是获得化合物7的反应方程式；图5是获得化合物9的反应方程式；图6是获得化合物10的反应方程式；图7是获得化合物12的反应方程式；图8是获得化合物13的反应方程式；图9是获得化合物14的反应方程式；图10是获得化合物15的反应方程式；图11是获得化合物16的反应方程式；图12是获得化合物19的反应方程式；图13是获得化合物21的反应方程式；图14是获得化合物22的反应方程式；图15a、15b、15c是分别获得化合物23、24、25的反应方程式；图16是获得化合物26的反应方程式；图17是获得化合物12或27的反应方程式；图18是获得化合物28的反应方程式；图19是获得化合物29的反应方程式；图20是获得化合物30的反应方程式；图21是4℃时化合物15对HEK293存活率的影响的示意图；
图22是2℃时化合物15对HEK293存活率的影响的示意图；图23是0℃时化合物15对HEK293存活率的影响的示意图；图24是-2℃时化合物15对HEK293存活率的影响的示意图；图25是-4℃时化合物15对HEK293存活率的影响的示意图；图26是-20℃时化合物15对HEK293存活率的影响的示意图；图27是22℃时化合物15对血小板凝聚的影响的示意图；图28是15℃时化合物15对血小板凝聚的影响的示意图；图29是4℃时化合物15对血小板凝聚的影响的示意图；图30是-2℃时化合物15(单体)对H9c2(2-1)细胞的影响的示意图；图31是-2℃时化合物30(二聚体)对H9c2(2-1)细胞的影响的示意图；图32是不同时间对单体15和二聚体30的比较的示意图；图33是采用1mg/mL单体15和二聚体30，暴露8小时后心脏细胞的存活率的示意图；图34是采用1mg/mL单体15和二聚体30，暴露16小时后心脏细胞的存活率的示意图；图35是采用1mg/mL单体15和二聚体30，暴露22小时后心脏细胞的存活率的示意图；图36是室温(22℃)存在1mg/mL单体15和二聚体30时心脏细胞的存活率随时间的示意图；图37是4℃存在1mg/mL单体15和二聚体30时心脏细胞的存活率随时间的示意图；图38是-3℃存在1mg/mL单体15和二聚体30时心脏细胞的存活率随时间的示意图；图39是-10℃存在1mg/mL单体15和二聚体30时心脏细胞的存活率随时间的示意图；图40是3℃存在1mg/mL单体15时心脏细胞的存活率随时间的示意图；
图41是3℃以及4.4mM糖蛋白15和30的情况下心脏细胞的存活率的示意图；图42是-3℃以及4.4mM糖蛋白15和30的情况下心脏细胞的存活率的示意图；图43是-3℃时随着糖蛋白15和30的浓度增加心脏细胞的存活率的示意图；图44是采用5mg/mL单体15，暴露8小时后皮肤细胞的存活率的示意图；图45是采用5mg/mL单体15，暴露12小时后皮肤细胞的存活率的示意图；图46是采用5mg/mL单体15，暴露20小时后皮肤细胞的存活率的示意图；图47是采用5mg/mL单体15，暴露30小时后皮肤细胞的存活率的示意图；图48是室温(22℃)存在5mg/mL单体15时皮肤细胞的存活率随时间的示意图；图49是3℃存在5mg/mL单体15时皮肤细胞的存活率随时间的示意图；图50是-3℃存在5mg/mL单体15时皮肤细胞的存活率随时间的示意图；图51是在化合物15的逐渐增加的浓度下暴露20小时后皮肤细胞的存活率随时间的示意图；图52是在化合物15的逐渐增加的浓度下暴露34小时后皮肤细胞的存活率随时间的示意图；图53是37℃时低血清培养基(粘附培养)中10mg/ml的化合物15对于细胞存活率的影响的示意图；图54是15℃时低血清培养基中10mg/ml的化合物15对于细胞存活率的影响的示意图；图55是第1天细胞的示意图；
图56是15℃时培养基中15mg/ml的化合物15对于细胞存活率的影响的示意图；图57是3℃时培养基中15mg/ml的化合物15对于细胞存活率的影响的示意图；图58是37℃时H2O2对于用15mg/ml的化合物15处理的细胞的影响的示意图；图59是化合物15对于H2O2诱导的氧化应激的影响的示意图。
具体实施例方式
使用的缩写如下所示eq.当量 g克Hz赫兹mg毫克MHz兆赫兹min.分钟 mL毫升mmol毫摩尔μmol微摩尔 nmol纳摩尔用于进行对本文所述所有化合物的分析的设备特征在下文中给出1H、13C和19F NMR谱记录于BRUKER DPX 300和DPX 600波谱仪上。对于1H和13C NMR而言，四甲基硅烷用作为内标。对19F NMR而言，外标是氟三氯甲烷CFCl3。化学位移以百万分数(ppm)表示，偶合常数J以赫兹(Hz)表示。
使用下述缩写s表示窄的单峰(pour singlet)，bs表示宽的单峰，d表示双重峰，t表示三重峰，q表示四重峰，m表示多重峰，dd表示两组双重峰......
质谱在下述型号的质谱仪上获得Micromass TOF-SPEC，E 20 kV，α-氰基。对于MALDI离子化而言JEOL AX500，3 kV，Canon FAB JEOL，Xe，4 kV，courant限10μA，Gly-NBA 5050用于FAB离子化。
通过柱层析进行的分离在轻的(light)压力下按照层析技术在Kiesel 60硅胶(230-400目，Merck)上进行。追踪通过薄层色谱(TLC)使用Kieselgel 60F-254-0.25mm板来进行。比移值(ratio-to-front，Rf)是给定支持物上化合物的移动距离与洗脱液移动距离之间之比。
下面的图描述了对具有下述结构式的偕二氟化糖缀合物化合物的制备 对最初的内酯1的制备最初，通过对甲基半乳吡喃糖苷(methylgalactopyrannoside)2的苄基化(图1)、对异头位的脱保护(图2)，接下来是氧化(图3)来制备内酯1。
惰性气氛下，在含有处于二甲基甲酰胺(dimethylformaldehyde)DMF(250ml)中的甲基-D-吡喃半乳糖苷2(5g；26mmol、1eq.)以及四丁基碘化铵nBu4NI(500mg；1.3mmol；0.05eq.)的烧瓶中，以小份加入氢化钠NaH(3.7g；0.15mol；6eq.)。然后加入苄基溴BnBr(18ml；0.15mol；6eq.)，混合物在搅拌下保持至少36小时。
用水水解介质(medium)。然后用乙醚对水相进行三次萃取。然后收集有机相，在水中洗几次，在硫酸镁上干燥，过滤，然后蒸发。
在二氧化硅柱上，使用比例为9比1的环己烷/乙酸乙酯混合物进行洗脱，通过层析对获得的产物加以纯化。浓缩收集到的级分(fraction)后，产物3是白色晶体形式，其重量收率为95％。
对产物3的鉴定Rf0.38(环己烷/乙酸乙酯8/2)。
C35H38O6M＝554.67g·mol-1在含有处于80mL乙酸4中的1-O-甲基-2，3，4，6-四-O-苄基-D-吡喃半乳糖3(5.5g；9.92mmol)的烧瓶中，加入摩尔浓度为3M的11mL硫酸H2SO4。反应介质被加热至100℃，1小时。然后在100mL冷水中对溶液进行稀释。
用100mL甲苯对混合物进行四次萃取。收集有机相，用100mL碳酸氢钠NaHCO3饱和溶液洗涤，最后用100mL水洗。然后在硫酸镁上干燥有机相，过滤及浓缩。
使用比例为8.5比1.5的环己烷/乙酸乙酯混合物进行洗脱，通过二氧化硅柱层析，对获得的产物加以纯化。浓缩收集到的级分后，产物5是白色晶体，其重量收率为75％。
对产物5的鉴定Rf0.65(环己烷/乙酸乙酯6/4)。
C34H36O6M＝540.65g·mol-1惰性气氛下，在含有2，3，4，6-四-O-苄基-D-吡喃半乳糖5(4g；7.4mmol)的烧瓶中，加入二甲基亚砜DMSO(25.6mL)和乙酸酐Ac2O(16.8mL)。混合物在搅拌下保持12小时。
加入碳酸氢钠NaHCO3的饱和溶液，然后用乙醚对水相萃取4次。收集有机相，用水洗5次。然后在硫酸镁上对该有机相进行干燥、过滤和浓缩。
然后使用比例为8比2的环己烷/乙酸乙酯混合物作为洗脱剂，在二氧化硅层析柱上对产物加以纯化。浓缩收集到的级分后，内酯1是无色油的形式，其重量收率为82％。
对产物1的鉴定Rf0.61(环己烷/乙酸乙酯8/2)。
C34H34O6M＝538.63g·mol-1NMR1H(CDCl3，300 MHz)3.6(m，2H，H6)；3.8(dd，2，1-9，6，1H，H3)；4.1(s，1H，H4)；4.2(m，1H，H5)；4.4-5.1(m，9H，H2；4OCH2Bn)；7.2(m，20H，Har.)NMR13C(CDCl3，75.5 MHz)67.4(C6)；72.4(C5)；72.6(OCH2Bn)；73.5(OCH2Bn)；74.5(C4)；75.1(OCH2Bn)；77.1(C2)；79.9(C3)；127.4-128，3(Car.)；137.2；137.3；137.6(Car.quat.)；169.8(CO)。
对偕二氟酯化合物7的制备使用Reformatsky反应将溴二氟酯加入内酯1(图4)。
惰性气氛下，在含有锌Zn(1.7g；26mmol；7eq.)(预先活化并粗磨过的(scoured))的烧瓶中，加入四氢呋喃THF(30mL)。介质置于回流下，然后逐滴加入由溶于THF(30mL)中的内酯1(2g；3.7mmol；1eq.)和溴二氟乙酸乙酯6(1.42mL；11mmol；3eq.)构成的混合物。反应在回流下进行3小时。回到环境温度后，过滤掉锌，向反应介质中加入1N盐酸HCl溶液(60mL)然后加入二氯甲烷(6mL)。
分开水相和有机相，再用二氯甲烷对水相进行两次萃取。收集有机相，在硫酸镁上干燥、过滤以及然后浓缩。
随后用比例为八比二的环己烷/乙酸乙酯混合物进行洗脱，在二氧化硅层析柱上对产物加以纯化。浓缩收集到的级分后，产物7是白色晶体形式，其重量收率为82％。
对产物7的鉴定
Rf0.35(环己烷/乙酸乙酯8/2)。
C38H40F2O8M＝662.72g·mol-1NMR19F(CDCl3；282.5 MHz)-118.4(d，JF-F＝256Hz)；-120.2(d，JF-F＝256Hz)。
NMR1H(CDCl3，300MHz)1.1(t，7，2，3H，CH3)；3.4-3.5(m，2H，H6)；3.7-3.8(dd，2.5-9.5，1H，H3)；3.8(d，2，1H，H4)；4-4.1(m，3H，H5；CH2)；4.25-4.85(m，9H，H2；4OCH2Bn)；7.2(m，20H，Har)。
NMR13C(CDCl3，75.5 MHz)14.2(CH3)；63.6(CH2)；68.6(C6)；71.7(C5)；73.2(OCH2Bn)；73.9(OCH2Bn)；74.1(C4)；74.9(OCH2Bn)；75.1(C2)；75.8(OCH2Bn)；81.2(C3)；96.9(t，27Hz，C1)；113(t，264Hz，CF2)；128.0-128.9(Car.)；138.2；138.3；138.6；139.1(Car.quat.)；163.3(t，31Hz，CO2Et)。
用于加入肽链的第一条途径肽键的加入可通过两种不同方法来进行。第一种用于合成赖氨酸-丙氨酸-丙氨酸单体。首先，加入与二氟酯官能基反应的第一个氨基酸(图5)。获得第一个糖基氨基酸后，赖氨酸的酯被皂化(图6)，然后通过肽偶联加上丙氨酸-丙氨酸单元(图7)。
然后，由此获得的单体的N之后O末端官能基被脱保护(图8和9)，最后进行对半乳糖苷单元的去苄基化(图10)A)加入第一个氨基酸(图5)在惰性气氛下，含有溶液中的起始物7(50mg；0.075mmol；1eq.)以及二氯甲烷(3mL)中的Boc-赖氨酸-OMe 8的乙酸酯(48mg；0.15mmol；2eq.)的烧瓶中，加入三乙胺Et3N(53μl；0.375mmol；5eq.)。在回流下加热混合物48小时，然后用水水解，在二氯甲烷中萃取三次。收集有机相，在硫酸镁上干燥，过滤，然后浓缩。
蒸发溶剂，然后用比例为七比三的环己烷/乙酸乙酯混合物作为洗脱剂，在二氧化硅柱上通过层析对混合物加以纯化。浓缩收集到的级分后，产物9是白色固体形式，其重量收率为84％。
对产物9的鉴定Rf0.58(环己烷/乙酸乙酯7/3)。
C48H58F2N2O11M＝876.98g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-117.1(d，JF-F＝260Hz)；-121.8(d，JF-F＝260Hz)。
NMR1H(CDCl3，300 MHz)1.1(m，2H，CH2)；1.2-1.5(m，2H，CH2)；1.3(s，9H，(CH3)3C)；1.6(m，2H，CH2)；3.0-3.1(m，2H，CH2NH)；3.4-3.5(m，2H，H6)；3.6(s，3H，OCH3)；3.8(m，2H，H3；H4)；4.1(m，2H，CHNH(Lys)；H5)；4.2-4.9(m，8H，4OCH2Bn)；4.3(d，3.3，1H，H2)；5(s，2H，2NH)；6.7(s，1H，1NH)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)22.9(CH2)；27.3(CH2)；28.7((CH3)3C)；32.4(CH2)；39.4(CH2N)；52.7(OCH3)；53.6(NCH Lys)；68.7(C6)；71.1(C5)；73.4和73.7(2OCH2Bn)；74.5(C4)；75.0(OCH2Bn；C2)；75.8(OCH2Bn)；80.3((CH3)3C)；80.9(C3)；97.1(t，28Hz，C1)；112.8(t；260Hz)；128.0-128.9(Car.)；138.2；138.3；138.7；139.0(Car.quat.)；155.9(CO(Boc))；164.1(t，28Hz，CF2CONH)；173.6(CO2Et)。
B)赖氨酸酯的皂化(图6)在含有处于THF(10mL)中的起始物9(1.25g；1.43mmol；1eq.)的烧瓶中，加入水(1mL)溶液中的氢氧化锂LiOH(70mg；2.9mmol；2eq.)，让混合物反应24小时。然后在二氯甲烷中收集反应介质。加入1 N的盐酸HCl(5mL)。在二氯甲烷中对水相进行三次萃取。收集有机相，在水(5mL)中洗，在硫酸镁上干燥、过滤，然后浓缩。获得的产物10为白色固体形式，具有定量的重量收率。
对产物10的鉴定C47H56F2N2O11M＝862.95g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-117.2(d，JF-F＝260Hz)；-121.5(d，JF-F＝260Hz)。
NMR1H(CDCl3，300MHz)1.2(m，2H，CH2)；1.3-1.5(m，2H，CH2)；1.3(s，9H，(CH3)3C)；1.6(m，2H，CH2)；3.0-3.1(m，2H，CH2NH)；3.4-3.5(m，2H，H6)；3.8(m，2H，H3；H4)；4.1(m，2H，CHNH(Lys)；H5)；4.2-4.9(m，8H，4OCH2Bn)；4.4(d，3，4，1H，H2)；5.1(d，7.5，1H，NH)；6.6(s，1H，NH)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)22.6(CH2)；27.3(CH2)；28.7((CH3)3C)；32.0(CH2)；39.4(CH2N)；53.7(NCH Lys)；68.7(C6)；71.1(C5)；73.4 et 73.7(2OCH2Bn)；74.4(C4)；74.9(C2)；75.0(OCH2Bn)；75.8(OCH2Bn)；80.5((CH3)3C)；80.9(C3)；97.0(t，28Hz，C1)；112.8(t；260Hz)；127.9-128.9(Car.)；138.1；138.2；138.6；139.0(Car.quat.)；156.2(CO(Boc))；164.0(t，28Hz，CF2CONH)；176.7(CO2H)。
C)通过肽偶联加上丙氨酸-丙氨酸单元(图7)在惰性气氛下，含有处于二氯甲烷(15mL)中的酸10(520mg；0.6mmol；1eq.)，加入羰基二咪唑CDI(117mg；0.72mmol；1.2eq.)。混合物在搅拌下保持1小时。然后将在惰性气氛下制备的、由二氯甲烷(15mL)中的二异丙基乙胺DI EA(347μL；1.99mmol；3.3eq.)、三氟乙酸酯-丙氨酸-丙氨酸-OMe 11(229mg；0.79mmol；1.3eq.)构成的溶液加入到该混合物中，反应介质在搅拌下保持36小时。然后用水水解混合物，接着在二氯甲烷中萃取三次。收集有机相，在硫酸镁上干燥，过滤，然后浓缩。
蒸发溶剂，然后用比例为三比七的环己烷/乙酸乙酯混合物作为洗脱剂，在二氧化硅柱上通过层析对混合物加以纯化。浓缩收集到的级分后，产物12是白色固体形式，其重量收率为55％。
对产物12的鉴定Rf0.46(乙酸乙酯)。
C54H68F2N4O13M＝1019.13g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-116.9(d，JF-F＝260Hz)；-121.7(d，JF-F＝260Hz)。
NMR1H(CDCl3，300MHz)1.2-1.4(m，10H，2CH3，2CH2)；1.3(s，9H，(CH3)3C)；1.6(m，2H，CH2)；3.0-3.2(m，2H，NHCH2)；3.4-3.5(m，2H，H6)；3.6(s，3H，OCH3)；3.8-3.9(m，2H，H3；H4)；4.0(m，1H，CHNH(Lys))；4.1(t，6，2，1H，H5)；4.2-4.9(m，10H，4OCH2Bn；2CH(Ala))；4.3(d，.，3，1H，H2)；5.3(d，6，4，2H，2NH)；7(m，1H，NH)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)18.3和18.6(2CH3)；22.8(CH2)；28.7((CH3)3C和CH2)；32.1(CH2)；39.3(CH2N)；48.5和49.2(2CH Ala)；52.9(OCH3)；54.8(NCH Lys)；68.7(C6)；71.1(C5)；73.5和73.7(2OCH2Bn)；74.5(C4)；75.0(OCH2Bn；C2)；75.7(OCH2Bn)；80.5((CH3)3C)；80.8(C3)；97.1(t，27Hz，C1)；127.9-128.9(Car.)；138.2；138.3；138.7；139.0(Car.quat.)；156.0(CO(Boc))；164.2(t，28Hz，CF2CONH)；172.3和172.5(2CONH)；173.6(CO2Et)。
D)对获得的单体的N端官能基脱保护然后是O端官能基脱保护(图8和9)在惰性气氛下，在含有处于二氯甲烷(10mL)中的起始物12(0.607mg；0.6mmol；1eq.)的烧瓶中，加入三氟乙酸TFA(900μL；12mmol；20eq.)。令混合物反应12小时，然后浓缩反应介质。用甲苯进行四至五次共蒸发，从而以定量收率获得无色油形式的产物13。
对产物13的鉴定
C51H61F5N4O13M＝1033.04g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-75.9；-116.9(d，JF-F＝260Hz)；-120.7(d，JF-F＝260Hz)。
NMR1H(CDCl3，300 MHz)1.2-1.4(m，10H，2CH3，2CH2)；1.6(m，2H，CH2)；3.0(m，2H，NHCH2)；3.4(m，2H，H6)；3.5(s，3H，OCH3)；3.8-3.9(m，3H，CHNH(Lys)；H3；H4)；4.1(m，1H，H5)；4.2-4.9(m，11H，4OCH2Bn；2CH(Ala)；H2)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CDCl3，75.5 MHz)17.7和18.1(2CH3)；21.9(CH2)；28.5(CH2)；31.0(CH2)；39.1(CH2N)；48.7和50.0(2CH Ala)；52.8(OCH3)；53.7(NCH Lys)；68.8(C6)；71.2(C5)；73.3和73.8(2OCH2Bn)；74.3(C4)；75.0(OCH2Bn)；75.1(C2)；75.8(OCH2Bn)；80.9(C3)；97.1(t，27Hz，C1)；127.9-128.9(Car.)；138.1；138.3；138.6；138.9(Car.quat.)；162.0(qdt，34Hz，COCF3)；164.2(t，28Hz，CF2CONH)；169.4和172.7(2CONH)；173.6(CO2Et)。
在含有处于THF(5mL)中的起始物13(671mg；0.65mmol；1eq.)的烧瓶中，加入水(1mL)溶液中的氢氧化锂LiOH(47mg；1.9mmol；3eq.)。令混合物反应12小时，然后在二氯甲烷中收集。加入1N的盐酸HCl溶液(4mL)，用二氯甲烷对水相进行三次萃取。收集有机相，在水(4mL)中洗涤，然后浓缩。
用甲苯进行四至五次共蒸发，以去除痕量的水，以及以定量收率获得白色固体形式的产物14。
对产物14的鉴定C48H59ClF2N4O11M＝941.45g·mol-1NMR19F(CD3OD，282.5MHz)-120.4；-120.5。
NMR1H(CD3OD，300 MHz)1.2-1.3(m，12H，2CH3，2CH2)；1.6(m，2H，CH2)；3.0(m，2H，NHCH2)；3.1(m，2H，H6)；3.5(m，3H，CHNH(Lys)；H3；H4)；3.8-3.9(m，1H，H5)；4.2-4.9(m，11H，4CH2OBn；2CH(Ala)；H2)；7.2(m，20H，Har.)。
NMR13C(CD3OD，75.5MHz)17.7和18.1(2CH3)；23.5(CH2)；29.9(CH2)；32.7(CH2)；40.5(CH2N)；49.7和50.0(2CH Ala)；53.7(NCH Lys)；70.2(C6)；72.4(C5)；74.2和74.7(2OCH2Bn)；76.1和76.6(2OCH2Bn)；76.7(C4和C2)；82.1(C3)；98.0(t，27Hz，C1)；111.7(t，260Hz；CF2)；129-130.6(Car.)；139.7；140.1；140.2；140.5(Car.quat.)；165.5(t，28Hz，CF2CONH)；174.0和174.5(CO)。
E)对半乳糖苷单元进行脱苄基(图10)在一刮勺尖(spatula tip)的钯炭Pd/C存在的情况下，含有处于乙酸CH3CO2H(5mL)、四氢呋喃THF(1.5mL)和水(1.5mL)的混合物中的起始物14(150mg；0.16mmol)的烧瓶被放置于氢气氛下。混合物在搅拌下放置过夜然后滤经Millipore过滤器。然后浓缩混合物，以获得白色固体形式的产物15，收率为70％。
对产物15的鉴定C20H35ClF2N4O11M＝580.96g·mol-1NMR19F(CD3OD，282.5MHz)-120.0(d，JF-F＝258Hz)；-121.3(d，JF-F＝258Hz)；-121.6(d，JF-F＝258Hz)；-123.0(d，JF-F＝258Hz)。
NMR1H(CD3OD，300MHz)1.4(2d，7.7，6H，2CH3)；1.3-1.5(m，2H，CH2)；1.7(m，2H，CH2)；1.9(m，2H，CH2)；3.2(m，2H，NHCH2)；3.7-3.8(m，4H，H6；H5；H3)；4.2和4.4(2m，2H，H2)；3.9(m，1H，CHNH(Lys)；4.3和4.5(2m，2H，2 CH(Ala))。
NMR13C(CD3OD，75.5 MHz)18.7和18.9(2CH3)；23.5(CH2)；30.1(CH2)；32.8(CH2)；40.5(CH2N)；50.9(2CH Ala)；54.7(NCH Lys)；64.7(C6)；72.7(C5)；76.2，77.7(C4et C2)；82.4(C3)；100.6(C1)；115.6(t，260Hz；CF2)；165.5(CF2CONH)；170.7和174.6(CO)。
Mass(FAB+)545(M+-Cl)。
用于制备肽链的第二条途径这包括对偕二氟酯衍生物7的皂化，其随后与不同的肽偶联。
A)对偕二氟酯衍生物7的皂化(图11)在含有处于THF(5mL)中的酯7(0.5g；1.75mmol，1eq.)的烧瓶中，加入溶解于最小量的水中的氢氧化锂LiOH(84mg；3.5mmol，2eq.)的水溶液。混合物在搅拌下放置12小时，然后用乙酸乙酯收集。用1N盐酸水溶液对混合物进行酸化，然后用乙酸乙酯萃取若干次。收集有机相，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩。
以定量收率获得白色油形式的产物16。
对产物16的鉴定C36H36F2O8M＝634.66g·mol-1NMR19F(CDCl3，282.5MHz)-117.3(d，JF-F＝259Hz)；-119.0(d，JF-F＝259Hz)。
NMR1H(CDCl3，300MHz)3.2(dd，4，5Hz和9.8Hz，1H，H6)；3.5(dd，7.7Hz和9，8Hz，1H，H6)；3.7(d，2Hz，1H，H4)；3.8(dd，2.6Hz和9.5Hz，1H，H3)；4(dd，4.5Hz和7.7Hz；1H，H5)；4.3-4.9(m，9H，H2；4OCH2Bn)；7.2(m，20H，Har)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)69.4(C6)；71.7(C5)；73.5(OCH2Bn)；74.0(OCH2Bn)；74.1(C4)；75.0(OCH2Bn)；75.1(C2)；75.9(OCH2Bn)；80.8(C3)；95.4(t，27Hz，C1)；112.5(t，260Hz，CF2)；127.8-129.0(Car.)；137.6；138.0；138.1(Car.quat.)；163.1(t，30Hz，CO2H)。
B)制备将与偕二氟化化合物16偶联的不同的肽使用一系列脱保护反应和肽偶联，来制备将与偕二氟化化合物16偶联的每种肽进行两个丙氨酸之间的第一次偶联(图12)在惰性气氛下，在含有处于二氯甲烷(25mL)中的Boc-丙氨酸-OH 17(1g；5.29mmol；1eq.)的烧瓶中，加入羰基二咪唑CDI(882mg；5.44mmol；1.03eq.)。混合物在搅拌下保持1小时。然后将在惰性气氛下制备的、由二氯甲烷(15mL)中的Cl-+H3N-丙氨酸-OMe 18(738mg；5.29mmol；1eq.)和二异丙基乙胺DIEA(1.94mL；11.1mmol；2.1eq.)构成的溶液加入到该混合物中。混合物在搅拌下保持36小时。然后用水水解混合物，用二氯甲烷萃取三次。收集有机相，在硫酸镁上干燥，过滤，然后浓缩。
蒸发溶剂，然后用比例为五比五的环己烷/乙酸乙酯混合物作为洗脱剂，在二氧化硅柱上通过层析对混合物加以纯化。浓缩收集到的级分后，产物19是白色固体形式，其重量收率为82％。
对产物19的鉴定C12H22N2O5M＝274.31g·mol-1NMR1H(CDCl3，300MHz)1.3(2d，7.2，6H，2CH3)；1.4(s，9H，((CH3)3C)；3.7(s，3H，OCH3)；4.2(m，1H，CH)；4.6(m，1H，CH)；5.2(d，7，4，1H，NH)；6.9(s，1H，NH)。
NMR13C(CDCl3，75.5 MHz)18.6和18.8(2CH3)；28.7((CH3)3C)；48.3和50.2(2CH)；52.8(OCH3)；80.4((CH3)3C)；155.80(CO(BoC))；172.8和173.6(CONH和CO2Et)。
获得的二肽19的O端官能基被脱保护，然后二肽19与N保护的赖氨酸氨基酸偶联(图13)1)对二肽单元的脱保护在惰性气氛下，在含有处于二氯甲烷(20mL)中的Boc-丙氨酸-丙氨酸-OMe 19(1g；3.8mmol；1eq.)的烧瓶中，加入三氟乙酸TFA(5.6mL；76mmol；20eq.)。用甲苯进行四至五次共蒸发。
2)肽合成在惰性气氛下，在含有处于二氯甲烷(20mL)中的Boc-赖氨酸(Z)-OH 20(1.32g；3.46mmol；1eq.)的烧瓶中，加入羰基二咪唑CDI(560mg；3.56mmol；1.03eq.)。混合物在搅拌下保持1小时。然后将在惰性气氛下制备的、由二氯甲烷(20mL)中的CF3CO2-+H3N-丙氨酸-丙氨酸-OMe(前文反应期间获得的)(3.8mmol；1.1eq.)和二异丙基乙胺DIEA(1.26mL；7.27mmol；2.1eq.)构成的溶液加入到该产物中。混合物在搅拌下保持36小时。然后用水水解混合物，接着用二氯甲烷萃取三次。收集有机相，在硫酸镁上干燥，过滤，然后浓缩。
蒸发溶剂，然后用乙酸乙酯作为洗脱剂，在二氧化硅柱上通过层析对混合物加以纯化。浓缩收集到的级分后，产物21是白色固体形式，其重量收率为66％。
对产物21的鉴定C26H40N4O8M＝536.62g·mol-1NMR1H(CDCl3，300MHz)1.3(d，7.2，6H，2CH3)；1.4(s，9H，((CH3)3C)1.3-1.7(m 6H；3CH2)；3.1(m，2H，NHCH2)；3.7(s，3H，OCH3)；4.1(m，1H，CHLys)；4.6(m，2H，CHAla)；5.0(s，2H，PhCH2)；5.6和5.7(m，2H，2NH)；7.3(m，5H，Har.)；7.4(d，7Hz，14Hz，1H，NH)。
NMR13C(CDCl3，75.5MHz)18.1和18.7(2CH3)；22.7(CH2)；28.7((CH3)3C)；29.7(CH2)；32.5(CH2)；40.7(NCH2)；48.4和49.1(2CH)；52.7(OCH3)；54.6(CH Lys)；66.8(OCH2Bn)；80.2((CH3)3C)；128.3-128.8(Car.)；137.1(Car.quat.)；156.2和157.1(CO(Boc)和CO(Z))；172.4，172.7和173.6(2CONH和CO2Et)。
通过氢化对位于化合物21侧链的氨基官能团进行脱保护(图14)。然后获得的化合物22可直接参与与产物16的肽偶联，以通过下文段落C)所述的另一合成途径产生前述化合物12。
在存在一刮勺尖钯炭Pd/C的的情况下，含有处于甲醇(20mL)中的起始物21(1.6g；3mmol)的烧瓶被放置于氢气氛围下。混合物在搅拌下放置过夜然后滤经Millipore过滤器。然后浓缩介质。产物22为白色粉末形式，以定量收率获得。
对产物22的鉴定C18H34N4O6M＝402.49g·mol-1RMN1H(CD3OD，300MHz)1，4(2d，7，2Hz，6H，2CH3)；1，5(s，9H，((CH3)3C)1，5-1，8(m 6H；3CH2)；2，7(m，2H，NHCH2)；3，7(s，3H，OCH3)；4(m，1H，CHLys)；4，4(m，2H，CHAla)。
在其N端官能基(图15a)或O端官能基(图15b)对三肽单元脱保护，对在其N端官能基被脱保护的三肽单元和在其O端官能基被脱保护的三肽单元之间进行肽合成(图15c)N-脱保护(图15a)在惰性气氛下，在含有处于二氯甲烷(40mL)中的Boc-赖氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-OMe 21(2g；3.7mmol；1eq.)的烧瓶中，加入三氟乙酸TFA(5.5mL；75mmol；20eq.)。令混合物反应12小时，然后浓缩。用甲苯进行四至五次共蒸发，以获得CF3CO2-+H3N-赖氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-OMe 23。
O-脱保护(图15b)在惰性气氛下，在含有处于乙醇(45mL)中的Boc-赖氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-OMe 21(2g；3.7mmol；1eq.)的烧瓶中，加入氢氧化锂LiOH(107mg；4.5mmol；1.2eq.)在水(2mL)中的溶液。令混合物反应12小时，然后浓缩。之后蒸发反应介质，然后用二氯甲烷收集。加入1N的盐酸HCl水溶液(20mL)。用二氯甲烷对水相萃取三次。收集有机相，在硫酸镁上干燥，过滤，然后浓缩以获得Boc-Lys(Z)-Ala-Ala-OH 24。
肽合成(图15c)在惰性气氛下，在含有处于二氯甲烷(50mL)中的Boc-赖氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-OH 24(3.7mmol；1eq.)，加入羰基二咪唑CDI(665mg；4.10mmol；1.1eq.)。混合物在搅拌下保持1小时。然后向该产物加入在惰性气氛下制备的、由二氯甲烷(50mL)中的CF3CO2-+H3N-赖氨酸(Z)-丙氨酸-丙氨酸-Ome 23(3.7mmol；1eq.)和二异丙基乙胺DIEA(1.62mL；9.32mmol；2.5eq.)构成的溶液。混合物在搅拌下保持48小时。然后用水水解混合物，接着用二氯甲烷萃取两次，用氯仿萃取两次。收集有机相，在硫酸镁上干燥，过滤，然后浓缩。
蒸发溶剂，然后用比例为九比一的乙醇/甲醇混合物作为洗脱剂，在二氧化硅柱上通过层析对混合物加以纯化。浓缩收集到的级分后，产物25是白色粉末形式，其重量收率为56％。
对产物25的鉴定C46H68N8O13M＝941.08g·mol-1NMR1H(DMSO，300MHz)1.3(d，12H，4CH3)；1.4(s，9H，((CH3)3C)1.3-1.7(m 12H；6CH2)；3.0(m，4H，2NHCH2)；3.6(s，3H，OCH3)；4.1(m，1H，CHLys)；4.3(m，5H，5CHAla et Lys)；5.0(s，4H，PhCH2)；5.0(s，2H，PhCH2)；6.9(m，1H，NH)；7.3(m，5H，Har.)。
NMR13C(DMSO，75.5MHz)17.2、18.3、18.4和18.6(4CH3)；22.8和23.2(2CH2)；28.5((CH3)3C)；29.3和29.5(2CH2)；31.8和32.0(2CH2)；39.5和39.8(2NCH2)；47.8、48.0、48.2和48.5(4CH Ala)；52.2(OCH3)；52.6和54.6(2CH Lys)；65.4(2OCH2Bn)；78.4((CH3)3C)；128.0和128.6(Car.)；137.6(Car.quat.)；155.7和156.4(CO(Boc)和2CO(Z))；171.3、172.3、172.4、172.5和173.3(6CONH和CO2Et)。
通过氢化对位于化合物24侧链的氨基官能团进行脱保护(图16)在存在一刮勺尖钯炭Pd/C的情况下，含有处于甲醇(10mL)中的起始物25(400mg；0.43mmol)的烧瓶被放置于氢气氛围下。混合物在搅拌下放置过夜，滤经Millipore过滤器。然后浓缩混合物。产物26为白色粉末形式，以定量收率获得。
对产物26的鉴定C30H56N8O9M＝672.81g·mol-1NMR1H(DMSO，300 MHz)1.2(m，12H，4CH3)；1.4(s，9H，((CH3)3C)1.3-1.7(m 12H；6CH2)；2.6(m，4H，2NHCH2)；3.6(s，3H，OCH3)；3.8(m，1H，CHLys)；4.2(m，5H，5 CHAla和Lys)。
Mass(ES+)696(M+Na)；674(M+H)C)偕二氟化化合物16与肽22的偶联(图17)在惰性气氛下，在含有处于DMF(50mL)中的酸16(2g；3.15mmol；1.05eq.)、肽22(1.2g；3.0mmol；1eq.)、1-羟基苯并三唑HOBT(425mg；3.15mmol；1.05eq.)和N-甲基吗啉NMM(346μl；3.15mmol；1.05eq.)的烧瓶中，加入EDCI(604mg；3.15mmol；1.05eq.)。反应介质在搅拌下放置48小时，然后蒸发溶剂，在水-二氯甲烷混合物中收集混合物。用二氯甲烷对水相萃取三次。收集有机相，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩。
以58％的收率获得产物12。该产物之前已被分析过。
D)偕二氟化化合物16与肽26的偶联(图17)在惰性气氛下，在含有处于DMF(3mL)中的酸16(200mg；0.32mmol；1eq.)、肽26(105mg；0.16mmol；0.5eq.)、1-羟基苯并三唑HOBT(45mg；0.33mmol；1.05eq.)和N-甲基吗啉NMM(32μl；0.33mmol；1.05eq.)的烧瓶中，加入EDCI(63mg；0.33mmol；1.05eq.)。反应介质在搅拌下放置48小时，然后浓缩。向介质中加入水-二氯甲烷混合物。用二氯甲烷对水相萃取三次。收集有机相，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩。
以35％的收率获得产物27，其为白色粉末形式。
对产物27的鉴定
C102H124F4N8O23M＝1906.11g·mol-119F NMR(CDCl3，282.5MHz)-120.4。
1H NMR(CD3OD，300MHz)1.2(m，12H，4CH3)；1.3(s，9H，((CH3)3C)；1.3-1.7(m，12H；6CH2)；3.0(m，4H，2NHCH2)；3.4(m，4H，H6)；3.6(s，3H，OCH3)；3.8(m，1H，CHNH(Lys))；3.9(m，4H，H3；H4)；4.0(m，2H，H5)；4.1-4.8(m，23H，8OCH2Bn，4CH(Ala)，CHNH(Lys)，2H2)；7.2(m，40H，Har.)。
13C NMR(CD3OD，75.5 MHz)16.1、16.2、16.3和16.7(4CH3)；22.7和22.9(2CH2)；27.4和28；2((CH3)3C和2CH2)；30.8(2CH2)；38.7和39.0(2CH2N)；48.1(OCH3)；48.8. 50.0、50.1、51.4、53.7和55.7(4CH Ala和2NCH Lys)；68.2和68.5(2C6)；70.2和70.7(C5)；72.4(2OCH2Bn)；72.6(C4)；73.0(2OCH2Bn)；74.4(2OCH2Bn)；74.9(C2)；75.0(2OCH2Bn)；79.7((CH3)3C)；80.3(C3)；96.2(t.27Hz.C1)；127.3-128.1(Car.)；138.0-138.9(Car.quat.)；157.0(CO(Boc))；160.2(t，28Hz，CF2CONH)；172.5、173.1、173.2、174.1和174.5(CONH和CO2Me)。
Mass(MALDI+)1929(M+Na)；1945(M+K)E)对获得的二聚体27的N-端然后是O-端官能基的脱保护(图18和图19)在惰性气氛下，在含有处于二氯甲烷(2mL)中的起始物27(107mg；0.6mmol；1eq.)的烧瓶中，加入三氟乙酸TFA(89μL；1.2mmol；20eq.)。令混合物反应12小时，然后浓缩反应介质。用甲苯进行四至五次共蒸发，以定量收率获得无色油形式的产物28。
对产物28的鉴定C99H117F7N8O23M＝1920.02g·mol-119F NMR(CD3OD，282.5 MHz)
-77.4；-120.2。
1H NMR(CD3OD，300 MHz)1.3(m，12H，4CH3)；1.3-1.7(m，12H；6CH2)；3.0(m，4H，2NHCH2)；3.5(m，4H，H6)；3.5(s，3H，OCH3)；3.7(m，1H，CHNH(Lys))；3.8(m，4H，H3；H4)；4.0(m，2H，H5)；4.2-4.8(m，23H，8OCH2Bn，4CH(Ala)，CHNH(Lys)，2H2)；7.2(m，40H，Har.)。
在含有处于THF(2mL)中的起始物28(115mg；0.06mmol；1eq.)的烧瓶中，加入溶于最少量的水中的氢氧化锂LiOH(6mg；0.24mmol；4eq.)溶液。令混合物反应12小时，然后在二氯甲烷中收集。加入1N的盐酸HCl溶液(4mL)，用二氯甲烷对水相萃取三次。收集有机相，在水(4mL)中洗，然后浓缩。
用甲苯进行四至五次共蒸发，以除去痕量的水，以89％的收率获得白色固体形式的产物29。
对产物29的鉴定C96H115ClF4N8O21M＝1828.43g·mol-119F NMR(CD3OD，282.5 MHz)120。
1H NMR(CD3OD，300 MHz)1.3(m，12H，4CH3)；1.3-1.7(m，12H；6CH2)；3.0(m，4H，2NHCH2)；3.5(m，4H，H6)；3.7(m，1H，CHNH(Lys))；3.9(m，4H，H3；H4)；4.1(m，2H，H5)；4.2-4.8(m，23H，8OCH2Bn，4CH(Ala)，CHNH(Lys)，2H2)；7.2(m，40H，Har.)。
F)对半乳糖苷单元进行脱苄基(图20)在存在一刮勺尖(spatula tip)钯炭Pd/C的的情况下，在含有处于乙酸CH3CO2H(2.5mL)、四氢呋喃THF(0.8mL)和水(0.8mL)的混合物中的起始物29(90mg；0.05mmol)的烧瓶被置于氢气氛下。混合物在搅拌下放置过夜然后经Millipore过滤器过滤。浓缩混合物，以以定量收率获得白色固体形式的产物30。
对产物30的鉴定
C40H67ClF4N8O21M＝1107.45g·mol-11H NMR(D2O，300MHz)1.5(m，12H，4CH3)；1.7-2.0(m，12H；6CH2)；3.4(m，4H，2NHCH2)；3.7-4.5(m，18H，2H6，CHNH(Lys)，2H3，2H4，2H5，4CH(Ala)，CHNH(Lys)，2H2)；7.2(m，40H，Har.)。
13C NMR(D2O，75.5 MHz)16，9 et 17，0(4CH3)；21，7 et 22，6(2CH2)；27，9 et 30，8(4CH2)；39，3 et 39，6(2CH2N)；49，6、49，8 et 50，0(4CHAla)；53，2 et 53，8(2NCH Lys)；61，1 et 62，6(2C6)；67，1、68，9、70，6、70，9、72，4、73，9、75，5、80，2(2C5，2C4，2C2，2C3)；173，9、174，5 et 175，1(CONH etCO2Me)。
Masse(ESI+)1071(MH+)；1093(M+Na)；1109(M+K)本发明并不被限制于前述实施例。
对R4中携带有二氨基酸单元AA1-AA2的属于通式I的化合物的合成将通过两种不同方法容易地获得，其中使用本文已描述过的非常经典的化学反应-起始自糖肽12或22，在对NBoc部分脱保护之后，AA1-AA2的羧基官能基之间发生的偶联在常规的N、O脱保护以及对糖单元的脱苄基之后将产生想要的化合物。
-还可在前一个步骤，以及尤其是在肽21或25上，引入二氨基酸AA1-AA2，这在通过常规偶联反应对Nboc脱保护之后进行。然后对赖氨酸侧链的脱保护以及碳水化合物衍生物16之间的偶联反应将在常规脱保护步骤之后得到糖肽。
对生物材料的初步保存试验初步生物试验在糖蛋白尤其是合成的产物上进行。它们使得我们能在不同温度，以及变化的时间段，测定这些化合物对不同细胞培养物的影响。目的是观察这些化合物是否对细胞具有保护作用。
在下文中化合物15和30可被命名为AAGP或AFGP。
A)产物15对于保存HEK 293肾细胞的影响在75cm2的培养皿中将HEK 293细胞培养至100％存活。然后将细胞稀释至75,000个细胞/mL。随后，将它们分布到6个平板上，每个平板具有6个3mL的孔。该浓度是在足够低以预防自身细胞毒性导致细胞死亡的浓度以及足够高以允许细胞取样和计数(而无须可能降低它们存活的任何预浓缩)的浓度之间的良好折中。每个平板具有两个对照孔，其中不含产物15，两个孔具有调节至0.01mg/mL的产物15浓度，另外两个具有0.1mg/mL。然后在下述温度温育每个平板4℃、2℃、0℃、-2℃、-4℃和-20℃。随后在下述温育时间对每个孔取样2、8和22小时。
材料-HEK 293细胞(Graham et al.)-DMEM cat#D5671，Sigma-Trypsin，Cat#25-052-Cl，MultiCell-PBS，Cat#SH30028.02，HyClone-台盼蓝，Cat#72-57-1耗材-微量进液器枪头，200μL，Axygen-6孔平板，用于细胞培养，cat#353046，Falcon-T-瓶，用于细胞培养，75cm2，cat#430725，Corning-移液管，2mL，5mL，10mL和25mL，Falcon设备-冰箱，Danby-冷冻箱，Frigidaire-温育箱，Sanyo-显微镜，Zeiss-倒置(inverted)显微镜，Olympus-台面离心机，IEC-血细胞计，Rechter
-可追踪数字温度计，Fisher Scientific-温度计，VWR-细胞计数仪，No.8-004，HOPE结果细胞计数显示，两次重复实验互相一致，因为差别没有超过10％，只有一个例外，其中显示了13％的变化。
用于开始实验的细胞培养物为100％，显微镜下它们的形态特征显示了良好的状态。
在六个试验温度(图21-26)中的五个下，以0.10mg/mL(用于本次实验的最高浓度)存在的产物15导致了最好的细胞存活率，即使该提高较低。0.01mg/mL的产物15的浓度看起来较之阴性对照对于细胞存活没有改进。
-20℃时，2小时之后，所有孔都结冻了，介质具有胶冻状外观。解冻后，显微镜观察显示，对照细胞具有虚幻的(phantom)外观，其立刻吸收台盼蓝，而有化合物15的细胞保持球形有折射能力的细胞的外观，与活细胞类似，其不吸收台盼蓝。因此，在存在产物15时，保持了细胞结构和外形和一些渗透性功能，这与对照的情况不同。
该解冻后，将平板在-20℃重新放置，但是对两种浓度的产物15而言，在8小时温育后类似的程序导致所有细胞完全消失。
B)产物15对于保存红细胞的影响可通过细胞膜的破裂来探知红细胞的死亡。该现象被称为溶血。对溶血的探测是本次实验的主要工具，用于确定不同温度下产物15对于保存红细胞的影响。
实验计划取血样→分成小份→加入AAGP(化合物15)→多种温度→观察溶血在3、0、-3、-5、-10、-15、-23、-78℃的温度下，对浓度为0mg/mL、0.1mg/mL、1.0mg/mL的产物15加以试验。
从肝素处理过的硼硅酸盐玻璃试管中的人类血样，装满275μL的微试管。三分之一的微试管装入2.75μL的产物15(H2O溶液，10mg/mL)，三分之一的微试管装有27.5μL的产物15(H2O溶液，10mg/mL)。将血液分装进这些试管至满，以尽可能防止空气接触。
在不同温度温育微试管不同的时间，从2小时到9小时不等。将微试管在微试管支持物上冷冻，使用缓慢冷冻装置在-78℃进行实验，解冻一直在室温在微试管架上进行。解冻后，通过颠倒若干次使微试管均质，取红细胞样。在观察之前，以及获得例如下式定义的溶血百分比之前，将红细胞(Ery)稀释于PBS 500x和台盼蓝2x中。
％溶血＝[1-(Co-Cexp)]*100其中Co是最初的Ery计数Cexp是实验Ery计数材料-15mL人类血样，在肝素处理过的硼硅酸盐玻璃试管中-PBS，Cat#SH30028.02，HyClone-台盼蓝，Cat#72-57-1耗材-微量移液器枪头，200μL，Axygen-200μL PCR微试管-2灭菌肝素处理过的试管，Cat#366480，Becton-Dickinson设备-Fisher Isotemp低温温育箱，Fisher Scientific-冰箱，Danby -冷冻箱，Frigidaire-超低温冷冻箱 -低速冷冻设备，Nalgene-显微镜，Zeiss-数码相机，Olympus-血球计，Rechter-可追踪数字温度计，Fisher Scientific-温度计，VWR -细胞计数仪，No.8-004，HOPE在表1中，可看出，2至-10℃的温度范围内没有溶血。不管有没有产物15，在这些温度温育0至24小时之后，红细胞看起来保持完整。
表1.在不同浓度的产物15以及3、0、-3、-5和-10℃时％溶血vs.温育时间
将血样在-15℃放置同样的时间。在表2中，两小时后，可以看出，产物15在0.1mg/mL的浓度能部分保护红细胞，在1.0mg/mL的浓度能完全保护。在4和9小时，仅有1.0mg/mL的浓度获得了完全的保护。
表2.在不同浓度的产物15以及-15℃时％溶血vs.温育时间
还测试了更极端的条件。在-23℃和-78℃，如果这些温度迅速达到的话，红细胞会破裂。
因此，使用缓慢冷却达到-78℃来进行试验。对没有产物15的血样温育不同的时间，以测定冷冻点。如可从表3中看出的，冷冻点在40分钟后达到。在该点，在％溶血和产物15的浓度之间观察到了直接相关性。
表3.在不同浓度的产物15以及-78℃时％溶血vs.温育时间
在大多数情况下，除了在-15℃温育2小时后，观察到了完整的或者说根本没有溶血。明显地，溶血过程非常迅速，并且在冻结时发生。在低于-15℃的温度没有观察到1.0mg/mL的产物15的任何保护这一事实可能表示，该化合物通过减少冻结过程而非通过停止冻结来保护红细胞，至少在1.0mg/mL时是这样。结晶的现象导致红细胞膜的破裂。但是通过降低时间(少于2小时)可获得关于在冻结点附近溶血动力学的更多细节。但是，观察到产物15在-15℃的确能保护红细胞。
C)产物15对于保存血小板的影响目的是测试产物15对于保存血小板的影响，以改善仅能允许保存5天的现有方案。试验在四种不同的温度进行22℃、15℃、4℃以及最终的0℃。血小板试验进行21天，以检查血小板聚集。聚集是血小板降解的第一种并且最确定的指示。在它们的降解期间，血小板变得具有活性，丧失了它们的外形，成为纤维状，形成聚集体(cluster)，最终变质。进行血小板计数，但是结果更大程度上取决于聚集的程度。
图27和29展示了由于存在产物15对血小板聚集的正面影响。在图27中，22℃时，对结果(阴性对照、1mg/mL和4mg/mL的产物15)进行比较。观察到在对照中，几乎立刻(两天后)开始发生聚集，并且继续增加，而有糖蛋白15的样品直到达到7天之前都没有显示出任何聚集。在第13、17和21天的时间段，发现了明显得多的差别，以及由此的通过产物15对血小板聚集的真正的抑制。最浓的样品(4mg/mL)显示出了最少的聚集。
图28在15℃时显示了与前述相同的结果类型。在该温度的聚集在4天后变得尤其明显。随着时间，在对照组观察到的聚集要比含有化合物的样品中所观察到的增加更多。但是，在该温度比在22℃时的聚集要少。
在4℃时(图29)，不管是什么浓度，采用产物15时都几乎没有观察到聚集。在对照中，聚集的数量也比其它温度时要显著更低。
在0℃时，不管用没有糖蛋白15都没有看到聚集。
D)产物15和30对保存心脏成肌细胞的影响本实验的目的是检查偕二氟化糖蛋白对于心脏组织的细胞的影响，以及在合成的化合物的单体(产物15)和二聚体(产物30)之间进行比较。
试验在大鼠心脏成肌细胞上进行，以考虑这些化合物用于保存器官(例如心脏)以备日后移植之用。
初步实验1)解冻细胞，在DMEM培养基中，5％CO2以及37℃下，将其培养直到加倍(doubling)实现稳定。
2)在瓶中扩增细胞。
3)将具有100 000个细胞的300μL分进微试管。
4)向阴性对照管中加入3μL PBS。
5)在三个微试管中，分别加入0.3、1.5和3μL的100mg/mL的产物15，以获得0.1、0.5和1mg/mL的浓度。
6)在三个微试管中，分别加入0.3、1.5和3μL的100mg/mL的产物30，以获得0.1、0.5和1mg/mL的浓度。
6)在-2℃温育细胞。
7)在培养之后0、2、7、20和43小时时对细胞取样。
主实验1)在瓶中扩增细胞。
2)将具有100 000个细胞的300μL分进微试管。
3)向阴性对照管中加入3μL PBS。
4)在四个试管中，加入3μL产物15，以获得1mg/mL。
5)在四个试管中，加入3μL产物30，以获得1mg/mL。
6)将一组试管(对照-单体15-二聚体30)在室温(22℃)温育。
7)将一组试管(对照-单体15-二聚体30)在4℃温育。
8)将一组试管(对照-单体15-二聚体30)在-3℃温育。
9)将一组试管(对照-单体15-二聚体30)在-10℃温育。
10)在培养之后0、8、16和22小时时对细胞取样，对活细胞和死细胞计数。
11)仅对-3℃单体15的试管，在0、8、12、16、20和22小时取样，对活细胞和死细胞计数。
材料-H9c2(2-1)细胞，ATCC编号CRL-1446，来自大鼠心肌组织的粘附(adherent)细胞系(1，2，3)-DMEM 4mM L-谷氨酰胺-温育箱，37、22、4、-3、-2和-10℃-移液管 -微量移液器枪头-血细胞计-台盼蓝-显微镜 -细胞计数仪-微试管 -微试管架对初步实验而言对2℃时单体15而言(图30)，0、2和7小时时所有浓度的存活百分比都非常接近100％。在20小时时，对1mg/mL的，百分比降低至44％，对0.5mg/mL的，降低至28％，而0.1mg/mL与对照相同。这导致猜想保护作用取决于糖蛋白的浓度。
对二聚体30而言(图31)，使用同样的步骤，观察到相同的结果。20小时后，细胞存活百分比在1mg/mL为25％，0.5mg/mL为11％，0.1mg/mL为6％。
当平行比较两种糖蛋白时(图32)，最显著的结果是，用1mg/mL时，20小时后，观察到两种化合物15和30对细胞的保护作用为对单体15而言44％的存活率以及对二聚体30而言25％，相比之下，对照仅为8％。
对于主实验而言这用1mg/mL浓度的单体15或二聚体30在四种不同温度下进行22、4、-3和-10℃。直到8小时，所有温度下都没有显著不同(图33)。16小时后(图3 4)，在4和-3℃时，较之阴性对照，在糖蛋白的存在和细胞存活百分比之间观察到了强烈的相关。不幸的是，这些结果不能推断出这两种形式的哪种具有最好的保护作用；在4℃时，单体15给出了最佳结果，而在-3℃时，二聚体30最好。22小时后(图35)，活细胞的数量有大的降低。但是，在-3℃时，二体形式被注意到具有17％的存活率。
在22℃(图36)，45小时后，在对照中观察到了51％的存活，而单体15和二聚体30的情况仅分别降低至65和80％。
在4℃获得了同样类型的曲线(图37)，最终结果不如45小时时显著，但单体显示了在整个实验持续期间而言更好的存活百分比。-3℃时(图38)，结果类似于二聚体，特别是8-22小时的范围。
-10℃时(图39)，对于二聚体和对照观察到了类似的结果，而单体略为提高。
图40在-3℃显示了存在单体时活细胞数量随着温育时间缓慢降低。
在这些对于成肌细胞的实验期间，我们发现，单体和二聚体化合物对这些细胞具有保护作用。这表现为●在糖蛋白15和30的浓度增加与细胞存活率之间有着相关性，在1mg/mL时单体15和二聚体30给出了比0.1和0.5mg/mL更好的结果。
●仅在8小时之后看到显著的效果。所有实验都尤其在8至20小时之间显示了令人感兴趣的结果。
●最令人感兴趣的保护作用出现在4℃和-3℃。
●无法验证究竟是单体还是二聚体最有活性。
在3℃和-3℃的温度，对成肌细胞进行另一试验。这次该实验的目的是以等摩尔当量的方式增加糖蛋白15和30的浓度(二聚体的分子量是单体的2倍)。浓度增加对于单体15来说是2.5mg/mL，对于二聚体30来说是5mg/mL。在通常用于保存细胞和组织的范围上选择温度。想法是随后在组织上继续进行该实验。
方法1)将细胞扩展于瓶中。
2)用0.2×106个细胞/mL来制备具有1.0mL细胞的三个试管。
3)向一个试管中加入25μL的100mg/mL的单体15，以获得2.5mg/mL(4.3mM)4)向一个试管中加入50μL的100mg/mL的二聚体30，以获得5.0mg/mL(4.5mM)。
5)将试管上样至2×96孔板，其中每孔100μL。
6)一块平板在3℃培养，另一块在-3℃。
7)在0、8、12、16、20和24小时时对活细胞和死细胞计数。
图41和42给出了3℃和-3℃时8、12、16、20和24小时后，阴性对照中、存在单体和二聚体时的细胞存活比例。
根据图41和42，心脏细胞在-3℃比3℃活得更长。24小时后，在3℃没有存活的，而在-3℃，用二聚体时观察到了70％的存活率。
在大多数情况下，单体给出了与二聚体相同的结果。图42显示，在3℃时，8小时后对照降低至19％的存活比例，而用单体时其保持为两倍高，用二体时，四倍高。AAGP因此延长了心脏细胞的存活，尤其是8至12小时之间时，但也能达到24小时。
在图43中，来自前面实验1mg/mL的数据已与用于该实验的最大浓度组合。上述化合物15和30在更高的浓度下具有更好的效果。
这些结果强调了与浓度相关的、化合物15和30对于细胞存活的保护作用。最令人感兴趣的结果出现在图41和42中。24小时后，成肌细胞中的大约75％在用二聚体的情况下依然存活，用单体时为65％，而对照中仅保留了30％。甚至16小时后，单体和二聚体还保存了大约90％的细胞。
此外，当糖蛋白浓度增加时，无论单体还是二体，细胞存活都是一样的(图43)。
这些结果因此显示，当在低温以及存在产物15和30的情况下保存时，从成肌细胞获得的细胞是可存活的。
E)产物15对于保存皮肤成纤维细胞的影响目的是在不同温度下在皮肤成纤维细胞上测试产物15。
1)解冻细胞，在DMEM培养基中，5％CO2以及37℃下，将其培养直到加倍达到稳定。
2)在Petri培养皿中扩增细胞。
3)令细胞浓度为0.27×106个细胞/mL。
4)用90μL AFGP母液(100mg/mL)来完成1.8mL细胞悬浮液，最终分布进四个细胞培养板中，每个孔100μL。
5)用90μL PBS溶液来完成1.8mL细胞悬浮液，均匀分布到四个细胞培养板中，每个孔100μL。
6)一块板在22℃温育，另一块在3℃，另一块在-3℃，最后一块在-20℃。
7)在8、12、20和30小时对细胞取样，以使用台盼蓝排除技术来继续细胞存活性实验。
材料-细胞CCD-27Sk，ATCC编号CRL-1475，来自人类的粘附正常胎儿成纤维皮肤细胞(1)-DMEM 4mM L -谷氨酰胺-温育箱， 22、3和-3℃-移液管 -微量移液器枪头-血球计 -台盼蓝-显微镜 -细胞计数计-微试管 -微试管架-细胞培养板，Costar 96孔，平底，不针对细胞培养进行处理。
在图44中，在整个温度范围上，用或不用产物15保存的细胞之间没有发现差别。但是，在-20℃，样品冻结，导致解冻后细胞死亡。
12小时后，在22℃、3℃和-3℃的范围上仍然没有观察到大的差别，另一方面，在22℃和-3℃，用化合物15时看到了更好的保存效果。
在图46中，结果显示，用单体15较之对照有更好的细胞存活比例。但是，在-3℃，甚至存在单体时，存活比例也降低至50％。30小时后(图47)，尤其在3℃，受产物15保护的细胞展示出明显的改进。在-3℃，即使化合物的存在能提高存活，其仍降低至70％。
如果在同样的温度下随时间的趋势继续(图48至50)，应当注意，对照显示出在-3℃存活率迅速降低，在3℃降低，在22℃缓慢降低。在存在产物15时发现了同样类型的情况，但比较而言，具有好得多的存活比例。
使用5mg/mL单体15对应于8.6mM。这是我们在所述浓度进行的第一项实验，结果非常乐观，因为在除了-20℃(此时细胞冻结并死亡，无论是否存在单体15)的所有温度下皮肤成纤维细胞都展示出更好的保存。最好的改进在3℃发现。
因此决定在3和-3℃进行工作，但是使用了高达15mg/mL的更高的化合物15浓度。
图51和52清楚地展示，产物15浓度的增加在3和-3℃提高了细胞存活比例。这些结果显示，34小时后，化合物15对于细胞具有接近100％的强烈保护作用。
还在37℃和15℃在成纤维细胞上对这些化合物(10mg/mL)的潜力进行了评估，这对于这些化合物在化妆品中的应用可能是有兴趣的。
在该实验中，目的是研究偕二氟化糖蛋白在生理条件下的效果化合物15在37℃即使在四天之后也保存了大约100％的细胞，而对照中存活比例为20％。这显示了生理条件下的强烈保护作用(图53)。
单体15还能在15℃保存细胞(46％存活)，而在对照中四天后仅发现有11％(图54)。
与该化合物温育的细胞保留其球形并且保持了它们的完整性，而在阴性对照中，细胞丢失了它们的结构形态，变成粘附性的(图55)。
关于化合物15对成人初级皮肤成纤维细胞的保护的初步结果前文结果显示，单体15在变化的温度范围内对于胚胎皮肤成纤维细胞具有强烈的保护作用。该试验被延伸至成人初级成纤维细胞。在下述研究中，在15℃、3℃在成人成纤维细胞上进行实验，还在H2O2下于37℃在胚胎成纤维细胞上进行实验。
实验方案培养条件对于成人成纤维细胞，使用培养用培养基(富含因子)对于胚胎成纤维细胞，使用具有0.5mM EDTA的不含血清的培养基，以预防聚集。用1mM H2O2处理细胞，以诱导氧化应激。对于在成人成纤维细胞上进行的实验，在0、1、2、3、4和6天检查样品，在胚胎成纤维细胞上在2和10小时检查。产物15的浓度为15mg/mL。
在成人初级成纤维细胞上在15℃(图56)，6天后化合物15能保护100％的细胞，而几乎所有的对照细胞都死了。在3℃(图57)，也观察到了100％的存活，而对照中6天后仅有9％。
在胚胎成纤维细胞上单体15以大约80％的存活率保护细胞，较之对照，其中细胞在10小时后全部死亡(图58和59)。在用AAGP和对照处理的细胞之间清楚地看到了差别(活细胞显示为绿色，死细胞显示为红色)。产物15因此可作为针对氧化应激的保护剂发挥作用，氧化应激是皮肤衰老和皮肤疾病的主要问题。
权利要求
1.通式I的偕二氟化C-糖肽 其中N是1至5的整数，R4＝H、AA1、AA1-AA2，R5＝OH、AA1、AA1-AA2，AA1和AA2是独立的，它们代表具有非官能性侧链的氨基酸，并且R1、R2、R3是独立的基团，以及如果R1＝R2＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R3＝ 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、苄基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，如果R1＝R3＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R2＝ 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、苄基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，如果R2＝R3＝H、CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R1＝ 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、苄基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-糖苷基、CH2-OGP，其中GP是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其包含通式II的化合物 其中N是1至5的整数，并且R1、R2、R3是独立的基团，以及如果R1＝R2＝H、CH3，那么R3＝ 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、苄基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，如果R1＝R3＝H、CH3，那么 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、苄基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，如果R2＝R3＝H、CH3，那么 其中n是3至4的整数，Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、苄基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基。
3.如权利要求1所述的C-糖肽化合物，其特征在于其包含通式III的化合物 其中N是1至5的整数，n是3至4的整数，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，诸如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氢原子，或游离的或受保护的醇官能基，R9＝H、CH3，R10＝H、CH3，R11是氢原子(H)，或保护基，例如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基。
4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其特征在于，其处于可药用碱、酸的加成盐、水合物或溶剂化物的状态。
5.制备权利要求1的化合物所需的中间体，其特征在于，其满足权利要求1至3中任一项的结构式之一。
6.用于制备根据权利要求1-4的偕二氟化化合物的方法，其特征在于，其包括具有通式IV的化合物 其中Y、Y’是独立的基团，其中，Y、Y’＝H、OR、N3、NR’R”、SR，其中，R＝H、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R’、R”＝H、烷基、烯丙基、苄基、甲苯磺酸酯基、C(＝O)-烷基、C(＝O)-Bn，R＝H、烷基、乙酸酯基，R6尤其是基团H、CH3、CH2OH、CH2-OGP，其中GP是保护基，例如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R7＝OH、OGP’、NH2、N3、NHGP’、NGP’GP”，其中，GP’和GP”是或不是保护基，例如烷基、苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、乙酸酯基，R8是氢原子H，或游离的或受保护的醇官能基，与通式V的化合物之间的反应 其中N是1至5的整数，R15＝H、AA1、AA1-AA2或保护基，R16＝OH、AA1、AA1-AA2或保护基，AA1和AA2是独立的，它们代表具有非官能性侧链的氨基酸，并且R12、R13、R14是独立的基团，而且如果R12＝R13＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R14＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整数，如果R12＝R14＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R13＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整数，如果R13＝R14＝H、CH3、CH2Ph、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3那么R12＝-(CH2)n-NH2，并且，n是3至4的整数。
7.组合物，其特征在于，其含有权利要求1至4中任一项所述的至少一种化合物，或其衍生物之一，或通过与可药用无机酸或有机酸加成获得的其盐之一。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，其含有可药用惰性、无毒赋形剂，例如蒸馏水、葡萄糖、淀粉、乳糖、滑石粉、植物油、乙二醇和/或防腐剂。
9.如权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备可用于冷冻外科的化合物或组合物的用途。
10.如权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备可用于保存生物材料的化合物或组合物的用途。
11.如权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备可用于保存肾脏细胞的化合物或组合物的用途。
12.如权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备可用于保存红细胞的化合物或组合物的用途。
13.如权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备可用于保存血小板的化合物或组合物的用途。
14.如权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备可用于保存心脏细胞的化合物或组合物的用途。
15.如权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备可用于保存成纤维细胞的化合物或组合物的用途。
全文摘要
本发明涉及结构式(I)的偕二氟化C－糖肽化合物，其中，N是1至5的整数，R
文档编号A61K38/14GK101090910SQ200580044994
公开日2007年12月19日 申请日期2005年12月2日 优先权日2004年12月2日
发明者J－C·基里翁, G·卡斯特洛－德利安古－戈德弗鲁瓦 申请人:鲁昂国家应用科学学院