专利名称：防治流感病毒感染的寡核苷酸药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制流感病毒复制和增强宿主抗病毒力的寡核苷酸。本发明还涉及含此寡核苷酸的药物组合物以及用途。
背景技术：
流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传播迅速。在流行季节，可造成世界人口约20％的感染率，每年由于该传染病死亡的人数达25至50万人(世界卫生组织2002年报告，11月26日)。流感病毒分甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒威胁性最大。根据其神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)的变异，甲型病毒又可分为许多不同的亚型。目前已确定的HA亚型为15种，NA为9种(Cox和Subbarao，The Lancet，3541277-1282，1999)，不同HA和NA亚型的组合形成了大量甲型病毒的亚型。流感病毒为RNA病毒，致病力强，易发生变异，若人群对变异株缺乏免疫力，则很容易发生爆发性流行。近年来，人类在努力控制人流感病毒感染的同时，禽流感病毒对人类的潜在威胁也愈来愈受到重视。
当前，防治流感的最有效手段之一是使用灭活流感病毒疫苗来降低流感的发病率。但由于所制备疫苗具有病毒株特异性，每年的疫苗均需使用当年可能流行的病毒株进行制备。另外，疫苗所诱导的免疫反应为IgG型，一般只能保持6个月左右(Castle，ClinicalInfectious Diseases，31578-585，2000)。用于治疗流感病毒感染的另一种手段是使用抗病毒制剂。这些制剂包括Amamtadine，Rimatadine，Relenza和Tamiflu。临床结果证明，尽管使用这些制剂对部分患者有一定的疗效，但其很容易诱导产生病毒抗性株和具有很强的副作用，特别对中枢神经系统的影响很大(Wenzel，Journal of AmericanMedicial Assiciation，2831057-1059，2000)。
由此可见，人类面临的巨大挑战是寻找一种疗效高、副作用小或无副作用、不易诱导产生变异病毒株的新型抗流感病毒制剂和方法。本发明可提供一种满足这一迫切需要的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一类有效的抑制流感病毒复制和/或相关宿主基因表达的药物。
流感病毒侵染细胞后，通过病毒基因的表达和与宿主多种不同基因产物的相互作用造成细胞病变。很显然，通过对病毒和异常表达的宿主基因的调节，可以达到防治流感的目的。
本发明发现某些寡核苷酸具有治疗流感病毒感染和调节宿主抗病毒能力的作用。
所述的寡核苷酸的特征是(1)含有7～75个核苷酸；(2)含有通过非手性5′到3′磷酸核苷间键连接的7～75个邻接的核糖基团；(3)互补于流感病毒基因和宿主相关靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和/或翻译终止区；(4)具有75℃～115℃的熔解温度(Tm，1毫摩尔浓度)当本发明所述寡核苷酸用作治疗流感病毒感染时，可使用一种，也可使用二种或更多种。当使用多种寡核苷酸时，这几种寡核苷酸将各自与相同或不同的靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和/或翻译终止区的不同区域互补，所述靶基因包括流感病毒基因和宿主细胞相关基因。
例如，当使用二种寡核苷酸时，这二种寡核苷酸可以与同一个流感病毒基因或宿主细胞基因的5′端非翻译区、翻译起始位点、3′端非翻译区和/或翻译终止位点的不同区域互补；二种寡核苷酸也可以与不同的流感病毒基因或宿主细胞基因的5′端非翻译区、翻译起始位点、3′端非翻译区和/或翻译终止位点的区域互补；还可以第一种寡核苷酸与流感病毒基因的5′端非翻译区、翻译起始位点、3′端非翻译区和/或翻译终止位点的区域互补，第二种寡核苷酸与宿主细胞基因的5′端非翻译区、翻译起始位点、3′端非翻译区和/或翻译终止位点的区域互补。
优选地，上述寡核苷酸由10～26个核苷酸组成，具有40℃～85℃的熔解温度(Tm，l微微摩尔浓度)。
所述寡核苷酸还可经化学修饰成为修饰性寡核苷酸，如在糖基2′位上带有取代基团的修饰性寡核苷酸，其也具有较好的抗流感病毒的作用，这些基团包括氧、甲氧基、丙氧基、甲氧-乙氧基、氟、氯、溴、碘。
在一些实例中，修饰性寡核苷酸在3′端和/或5′端带有保护基团。
所述修饰性寡核苷酸还可以是3′末端封闭和/或5′末端封闭的。
本发明所述的寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脱氧核糖寡核苷酸。所述寡核苷酸序列选自SEQ ID NO1-43。
本发明所述的寡核苷酸可以是反义寡核苷酸，包括靶向流感病毒基因的反义寡核苷酸序列和靶向动物或人基因的反义寡核苷酸序列。代表性的反义寡核苷酸的序列见表2和表3。
用本发明所述的寡核苷酸作为活性物质可以制备多种抗流感病毒的药物组合物，适用于动物和人。所述的动物包括鸟类、禽类，如鸡等。所述药物组合物中可以含有各种药学上可接受的赋形剂、辅剂。所述药物组合物中，可以含有一种或几种所述寡核苷酸，比如，可含二种、三种、四种、五种或五种以上的修饰性寡核苷酸。
在有些实例中，本发明提供一种含二种或二种以上抑制流感病毒或宿主基因表达的寡核苷酸的药物组合物，其中至少有一种寡核苷酸的靶基因是流感病毒基因，至少有一种寡核苷酸的靶基因不是流感病毒基因。
本发明所指的流感病毒和宿主相关基因包括，但不限于，表1所列。在有些实例中，药物组合物所含的反义寡核苷酸可从表2、3中选出。
本发明提供的寡核苷酸对于动物或人的给药剂量为每公斤体重0.01～100mg。
发明的详细描述本发明涉及可用于抑制流感病毒复制及相关宿主基因表达的寡核苷酸及其药物组合物，以及用此寡核苷酸抗流感病毒的方法。因此，发明所提供的药物既可用于治疗流感病毒感染相关疾病，又可用于预防流感病毒的感染。
本发明的药物组合物，方法是利用基因调控寡核苷酸来调节靶基因表达，这些基因调控寡核苷酸(或称为调控分子)包括反义寡核苷酸。调控的方式可以是用一种调控分子去控制一种涉及流感病毒复制的基因，例如流感病毒RNA聚合酶(PA，PB1，PB2)，非结构蛋白(NS1)，NA，NP，HA和M基因。调控还可以采用多种组合的方式，例如，采用不同类型调控分子的组合；针对同一基因，但不同位点的多种调节分子组合；针对不同基因的多种调节分子组合及上述各种组合方式形成的新的组合。
本发明的修饰性寡核苷酸具有特定的结构和物理化学特性，例如经过对碱基、糖基及核苷酸之间的磷酸酯键的修饰，末端保护，质子化处理等化学修饰，形成含非手性磷酸酯键、修饰性核糖和脱氧核糖取代基等特定结构，使之具有抗酸性、抗核酸酶等物理化学特性。
本发明的药物组合物中含有一种或多种能够抗流感病毒感染和增强抗病毒力的寡核苷酸。这些寡核苷酸包括反义寡核苷酸。寡核苷酸的靶位点可以是某一基因的一个或多个区域，也可以是多个基因的一个以上的位点。
本发明的药物组合物和应用方法适用于任何与流感病毒感染有关的基因，改变或调节这些基因的表达可以对流感病毒感染的产生治疗效果。尽管在病毒感染过程中，一些主要基因起着重要的作用，但在大多数情况下，疾病往往涉及多个病毒基因以及与病毒发生相互作用的宿主细胞内基因。因此，本发明不仅提供了针对单一基因(例如，流感病毒RNA聚合酶)的药物，而且还提供了针对多个基因或单一基因的不同区域的药物组合，或以上两种药物的组合。
在表1中列出了代表性靶基因，这些基因可用于设计基因调节药物。
I本发明的药物A.调节基因表达的药物任何以核酸为基础的制剂均可用于本发明的药物，其中包括反义寡核苷酸。这些技术方法的共同点是通过Watson-Crick碱基配对原理，与其靶基因mRNA结合。因此，本发明涉及在严格条件下，多核苷酸与相关基因序列之间的杂交。这里所指的严格条件是一定程度的错配，可导致杂交体核酸无法形成。多核苷酸指的是可用于抑制流感病毒相关基因表达的分子，其也可作为探针或引物，用于疾病诊断和实验室研究。
寡核苷酸指的是含核苷酸(核糖核酸，脱氧核糖核酸或两者)的分子，这些核苷酸通过5′与3′端或5′与2′端连接，所用的核苷酸可以是天然的，也可以是化学合成的类似物，这些类似物可与天然核酸形成配对。例如，氮杂(aza)和脱氮杂(deaza)嘧啶类似物，氮杂(aza)和脱氮杂(deaza)嘌呤类似物，及其它杂环碱基类似物。这些碱基类似物包括在嘧啶或嘌呤中的一个或多个碳氮原子由氧、硫、硒、磷等取代。
反义寡核苷酸是化学合成的短DNA或RNA，其可通过碱基配对与mRNA靶结合，从而阻断mRNA的翻译或通过激活RNaseH降解mRNA。反义寡核苷酸的作用可通过抑制RNA的拼接、翻译和细胞核与细胞质之间的输送过程来实现。作用机理受寡核苷酸的母体结构改变的影响。反义寡核苷酸可以互补于整个基因序列，也可以互补于靶基因的一部分。
典型的设计反义寡核苷酸的方法包括(1)选择一个与靶区域邻近或重迭的寡核苷酸，(2)测定与靶基因结合的Gibbs自由能水平，(3)分析杂交熔解温度(Tm)，(4)进行序列库分析，以确定其靶位点所处区域，例如，5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和/或翻译终止区。优选的反义寡核苷酸一般邻近于翻译起始区或至少有一个核苷酸与翻译起始点重迭。在有些实例中这种重迭不少于三个核苷酸。
基于RNA的二级和高级结构特征，反义RNA或DNA的设计一般可选在5′端区域。在有些情况下，可选在3′端区域，或在RNA拼接点周围。
本发明的反义寡核苷酸可通过Gibbs自由能分析来确定其与靶RNA的结合强度。这一分析可通过计算机程序进行，常用的程序可在ftp://rna.chem.rochester.edu网站找到，并可参考Matthews等(J.Mol.Biol，1999，288，911-940和RNA，1999，5，1458-1469)。寡核苷酸与靶RNA杂交分子的Gibbs自由能一般≤-20kcal(37℃)，优选为≤-25kcal。对于一个12-14个单位的寡核苷酸，其自由能为≤-15kcal；15-17单位的寡核苷酸的杂交自由能为≤-20kcal；18-20单位的寡核苷酸的杂交自由能为≤-25kcal；21-23单位的寡核苷酸的杂交自由能为≤-30kcal；24-26个单位的寡核苷酸的杂交自由能为≤-35kcal。
因此，本发明所提供的寡核苷酸长度为7～75个核苷酸，优选长度为10～26个核苷酸；熔解温度(Tm)约为75℃～115℃(1毫摩尔浓度)，优选熔解温度40℃～85℃(1微微摩尔浓度)；互补于靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区或终止区。靶基因可以是表1中的任选基因，或其它基因，其表达的调节可对流感病毒感染相关的病症产生治疗效果。
本发明所述的一个反义寡核苷酸的长度可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或多于100个核苷酸。优选用长度为5～75个核苷酸，更优选长度为12～26个核苷酸。
反义寡核苷酸可利用在本技术领域熟知的方法，通过化学合成或酶连接的方式进行制备。另外，反义寡核苷酸还可以利用表达载体在生物体内产生。尽管在表3、4、5中所例举的反义寡核苷酸均为脱氧核糖核酸，其也可以是核糖核酸，例如，用尿嘧啶取代胸腺嘧啶，用核糖基代替脱氧核糖基。因此，本发明的寡核苷酸可以完全由脱氧核糖核酸组成，也可以完全由核糖核酸组成，或由脱氧核糖核酸和核糖核酸混合组成。
本发明所提供的反义寡核苷酸可以是完全同源于表2、3中所列举的序列，但也可以与所列序列的同源性≥60％，如具有百分之60，70，80，90，95或99的同源性。这种序列同源性分析可采用在本技术领域熟知的方法进行测定，例如，Fasta程序(OxfordMolecular Group lnc)，BLAST(WWW.ncbi.nlm.nih.gov)(Atschul等，1997，NucleicAcids Res，25，3389-3402)。程序的分析参数均采用程序推荐设制。
本发明的反义寡核苷酸的G∶C成份一般为大于35％，优选的比例为大于40％，最佳比例为大于45％。
B.核酸的化学修饰为了有效地在体内应用寡核苷酸，对其进行化学修饰可显著地增加寡核苷酸抗酸和抗酶降解的稳定性，例如，2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、交接式核酸(locked nucleic acids，LNA)和肽链核酸(peptide nucleic acids，PNA)。
本发明所提供的寡核苷酸可以用化学的方式进行修饰。所述修饰是在分子水平上对天然核酸分子结构进行一处或多处化学修饰。
包括以下化学修饰1)对碱基、糖基及核苷酸之间的磷酸酯键的修饰，包括增加一些取代基，例如，二胺(diamine)、胆固醇或其它亲脂性基团。
2)末端保护在分子的末端加入保护基团，以防止分子的降解。这种保护可以是5′端，也可以是3′端，或是两端均被保护。
3)质子化当该分子溶于中性水时，会引起pH值的降低。质子化可通过将分子在酸性溶液中处理后完成。通过这一过程，寡核苷酸所带有的质子受体被质子结合，所述的质子受体存在于取代的或未取代的磷酸基团或存在于中心基团和末端保护基团上。许多核酸的主干结构在低pH下(例如pH1-3)均不稳定。本发明通过引入某些修饰，可使核酸在pH2～pH1的条件下，仍具有满意的稳定性，这些修饰包括2′-卤化物、2′-O-烷基、3′-O-烷基、2′-O-烷基-n(O-烷基)等。由于抗酸性的增加，使这些寡核苷酸更容易被制成药物组合物。
本发明还提供了抗核酸内解酶降解的核酸分子。这种抗酶特性可以通过多种化学修饰而获得，包括2′-O-甲基磷酸二酯键、2′-O-甲烷、2′-O-甲烷-n(O-甲烷)、2′-氟、杂合连接键及其它主干结构的修饰。另外，这些修饰还包括对碱基的修饰，例如，甲基化碱基、羟甲基化的碱基等。
本发明还提供了抗核酸外解酶降解的核酸分子。寡核苷酸可以通过对其5′端和/或3′端修饰而获得这种抗酶特性。这些末端修饰包括反向连接碱基，双脱氧核苷酸，甲磷酸基，烷基，芳基，cordycepin，cytosine arabanoside，2′-甲氧基、乙氧基核苷酸，phosphorothioate连接键，3′-O-甲基碱基，荧光素，肽键连接，二氮苯基，胆固醇，生物素，acridine，rhodamine psoralen，glyceryl，丁醇基，己醇基和3′-O-烷基。优选的丁醇基结构为-CH2CH2CH2CH2-OH。
修饰性核苷酸还包括对糖基的修饰，例如在2′位或3′位取代的核糖核酸或脱氧核糖核酸。核糖基和单核苷酸之间的连接键称为核酸的主干结构。对主干结构的修饰包括连接键以及其它可以增强稳定性和亲和性的修饰，例如，对糖结构的修饰。具体的例子有在碱基相对于天然右旋异构体糖为反向时，可使用左旋(L-)异构体脱氧核糖；或将糖基的2′-羟基团用2′-卤素元素，2′-O-烷基，2′-O-烷基-n(O-烷基)取代。对主干结构修饰的具体例子还包括但不限于2′-O-甲基磷酸二酯键，2′-O-乙基，2′-O-丙基，丁基，2′-O-烷基-n(烷基)，2′-甲氧乙氧基，2′-氟，2′-脱氧erythropentofuranosyl，3′-O-甲基，异丁基寡核苷酸，2′-O-(CH2CH2)XCH3以及丁炔连接键。本发明的寡核苷酸可具有部分修饰，或全部修饰，或是不同修饰的组合。
本发明优选修饰性寡核苷酸的连接键是非手性的(achiral)，可以含至少3～8个连续的非手性连接键，优选为7～12个连续的非手性连接键；最为优选的是全部的连接键为非手性的。在某些情况下，非手性连接键和手性连接性可以相间存在，例如，两个连续非手性连接键后接一个手性连接键，再跟二个连续非手性连接键；或三个连续的非手性键接一个手性连接键；或四个连续的非手性连接键跟二个手性连接键等。非手性连接键包括，但不限于，磷酸二酯键、硫代磷酸二酯键。
磷酸二酯键可以是5′至3′，5′至2′或5′至5′或以上方式的组合。这种连接键的修饰可以是分子内的(单一或重复)，也可以是在RNA或DNA的末端。
本发明所提供的药物组合物的功能效应可用本领域熟知的方法进行测定。这些方法包括体内和体外的，例如，在细胞培养系统中分析药物组合物对靶基因表达的影响和对细胞表型的影响；在体内模型和临床试验中，测定药物组合物的生物学效应，包括药效、药理、药剂、毒理等。体内模型包括建立的疾病动物模型和正常动物。
C.药物组合物的构成本发明提供的药物组合物含有抑制流感病毒复制和宿主相关基因表达的一种或一种以上的寡核苷酸。根据寡核苷酸的数量、类型、靶基因等，药物组合物中寡核苷酸可以有多种不同的组合方式。寡核苷酸的靶基因可从表1中选择。
药物组合物中可以只含单一寡核苷酸，其靶基因可以是流感病毒复制基因，也可以是非流感病毒基因。
药物组合物中可以含一种以上的寡核苷酸，寡核苷酸的种类可以达100种以下，优选的为2～20种。
药物组合物中的寡核苷酸可以是靶向单一基因的，其可以是一种类型的寡核苷酸，例如反义寡核苷酸，靶向一个以上的靶位点，例如5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区、翻译终止区等。
药物组合物中的寡核苷酸也可以靶向多种基因，例如，二种以上的寡核苷酸，靶向流感病毒基因；二种以上的寡核苷酸靶向宿主相关基因；二种以上的寡核苷酸，混合靶向流感病毒和宿主相关基因。
药物组合物中寡核苷酸可以靶向人的基因，也可以靶向不同动物基因，例如鸡等禽类动物。
D.药用的寡核苷酸组合物本发明还进一步提供了药用的寡核苷酸组合物。
本发明包括的药物组合物至少含一种本发明所提供的寡核苷酸。在有些药物组合物中，可以含100种以下不同的寡核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75种。在有些药物组合物中，一种或多种寡核苷酸是修饰性寡核苷酸。在有些化合物中，含一种以上的反义寡核苷酸，其可以是部分或全部修饰的药物组合物。药物组合物中还含有适合于药用的赋形剂和其它辅剂。
本发明的靶向基因可以是单一的，也可以是多种基因的组合。靶向多种基因的药物组合物，可以对流感病毒复制过程不同基因和宿主细胞相关基因，例如细胞凋亡基因进行抑制，将比靶向单一基因的方法更为有效。另外，由于使用的多个寡核苷酸中的每个寡核苷酸的量相对比较低，因此会大大降低产生毒性的可能性。本发明使用的寡核苷酸为修饰性的，因此要比天然寡核苷酸更加稳定，且与目前常用的修饰方法相比，例如，硫代磷酸二酯键，本发明的寡核苷酸的毒性更低。
本发明的药物组合物可以采用非肠道的、口服或局部的给药方式。
本发明的药物组合物可按本技术领域熟知的技术进行制备。药用载体的选择可根据制剂类型和给药途径，例如，静脉注射、口服、局部、喷雾剂、栓剂、非肠道或骨髓注射等。赋形剂可含几种药用载体。另外，药物组合物中所含的稳定剂、防腐剂以及其它的成份一般为药物组合物重量的0.5％～2％。本技术领域的技术人员可确定出适当的给药方式和递药系统。
本发明的药物组合物可按要求制成不同的剂型，包括液体、片剂、药丸、粒状、粉末、软膏、乳剂、针剂或栓剂。任何药物可接受的介质和辅剂均可使用，例如，水、甘油、油类、乙醇、调味剂、防腐剂、食物染料等用于液体制剂，淀粉、糖、稀释剂、颗粒剂、润滑剂、粘合剂、分散剂等用于制备固体制剂。
注射用制剂为寡核苷酸的水溶液，溶剂为符合药用标准的水或生理盐水。注射用液体还以含适当的液体介质、悬浮剂、可以调节渗透压的制剂以及防腐剂等。实际制作方法和程序对于一个本领域的技术人员来说是熟知的。
局部用药剂型可以制成乳剂、敷料、凝胶、洗液、软膏、液体等。可以加入表面活性剂以增加药物的深层穿透。这些表面活性剂包括天然的，也可以是化学合成的，例如异丙十四烷酸盐。在有些情况下，药物组合物可采用化妆品用的制剂成分。
喷雾剂型的制备可采用将寡核苷酸溶于或悬浮于喷发剂或喷发剂与溶剂中，例如乙醇作为溶剂。在局部用药剂型和喷雾剂型中，药物比例(寡核苷酸)一般为总重量的0.001％～40％。
栓剂的制备可以将寡核苷酸与脂质介质混合而制成，例如theobroma油、可可奶油、甘油、明胶或聚氧乙烯二醇。
寡核苷酸还可以制成脂质体，以增加寡核苷酸在体内的半衰期。所用脂类包括，但不限于cardiolipin，dimyristoyl，dipalmitoyl，dioleoyl phosphatidyl choline，phosphatidyl glycerol，palmitoyloleoyl phosphatidyl choline或phosphatidylglycerol，phosphatidic acid，lysophosphatidic acid，phosphatidyl serine，phosphatidyl inositol，cholesterol。
本发明的药物组合物的给药剂量为每公斤体重0.01～100mg所述寡核苷酸。优选的剂量为每公斤0.01mg～10mg。
当口服给药时，每1～10天可给药一个剂量单位，或每天给药，每天1～10个剂量单位，直到治愈，或症状得到减轻。在有些情况下，用药剂量为每天1～4次。在有些情况下，病人按医嘱每天用药2～3个剂量单位。
II本发明的方法本发明进一步提供了使用本发明提供的药物组合物治疗流感病毒感染相关疾病的方法。这些方法包括应用该药物组合物抑制流感病毒复制和调节细胞内基因表达的方法；用该药物组合物治疗流感病毒感染及相关疾病的方法用于预防流感病毒感染的方法；以及使用本药物组合物辅助其它治疗的方法。
A.流感病毒感染及相关疾病人的流感病毒主要是通过空气飞沫和人类呼吸道传播的，潜伏期短，且流感病毒每年都会发生部分变异，因此人群对其普遍易感，尤以新生儿、年老体虚者易感。在人群集中的公共场所极易暴发或流行。流感的传染性很强，发病快，病情除具有普通感冒症状外，还有明显的怕冷、发热甚至高烧、剧烈咳嗽、头痛、全身肌肉酸痛等病征。更严重的是，它极易引起支气管炎、肺炎、心肌炎、中枢神经系统并发症等疾病，孕妇发生流感还可能导致胎儿死亡。
高致病性禽流感发病率和死亡率都很高，危害极大。禽流感是由流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)传染病，被高致病性禽流感感染后，禽类出现较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率极高。许多家禽和野禽、鸟类都对禽流感病毒敏感，可从体内分离出病毒。家禽中火鸡、鸡、鸭是自然条件下最常受感染的禽种。其他包括珍珠鸡、家鹅、鹌鹑、雉鸡、鸽、鹧鸪、鹦鹉、虎皮鹦鹉等，以及野禽和野生水禽，如鹅、燕鸥、野鸭、鹱、海岸鸟和海鸟等。
人类直接接触受感染的家禽及其粪便或病毒本身都会受到感染，此外，接触飞沫及呼吸道分泌物也可能受到传染。而一旦禽流感病毒与人类病毒重组，从理论上说，就有可能通过人与人传播。人类患上禽流感后，早期症状与其它流感非常相似，主要表现为发热、流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、全身不适，部分患者可有恶心、腹泻、腹痛、稀水样便等消化道症状，有些患者可见眼结膜炎，体温大多持续在39℃以上，一些患者胸部X线还会显示单侧或双侧肺炎，少数患者伴胸腔积液。在免疫力低下的人群、治疗过迟的患者病情会迅速发展成进行性肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾衰竭、败血症休克等多种并发症而死亡。
B.治疗用的靶基因用于治疗的靶基因已列入表1，但不仅限于表中所列。有关基因的详细描述如下流感病毒基因病毒吸附在细胞表面含唾液酸的糖蛋白受体上，然后通过受体介导的细胞内吞作用，病毒进入细胞。这包括暴露于核内体内的低pH，导致HA的构象改变与介导膜融合。这样，核衣壳便进入胞浆并移向胞核。流感病毒利用独特的机理转录。启动转录时，病毒的核酸内切酶从宿主细胞的mRNA上切下5′帽子结构，并以此作为病毒转录酶进行转录的引物。产生出6个单顺反子的mRNA，并转译成HA、NA、NP和三种聚合酶(PB1、PB2和PA)。NS和M基因的mRNA进行拼接，每一个产生出两个mRNA，依不同阅读框架进行转译，产生NS1、NS2、M1和M2蛋白。HA和NA在粗面内质网内糖基化，在高尔基体内修饰，然后转运到表面，植入细胞膜中，HA需要宿主细胞蛋白酶将其裂解成HA1和HA2，但两者仍以二硫键相连，这种裂解可生成传染性病毒，并以出芽方式从质膜排出细胞。
RNA聚合酶基因(PB2，PB1，PA)此三个基因分别定位于流感病毒基因组中的节段1、2和3。基因表达的产物(PB2，PB1和PA)以非共价的方式形成一种复合体参与病毒的复制和转录。
血凝素基因(HA)HA位于流感病毒基因组中的节段4。该基因产物是由3条糖基化多肽分子以非共价形式聚合而成的三聚体，其C末端有一疏水区插入病毒囊膜的双层脂质膜中，是HA与病毒囊膜的结合部位。N末端有一疏水区，具有膜融合活性，对病毒侵入宿主细胞是必须的。
核心蛋白基因(NP)NP基因位于流感病毒基因组中的节段5。该基因产物为病毒核心蛋白，主要参与病毒RNA的合成。
神经氨酸酶基因(NA)NA基因位于流感病毒基因组的节段6。其产物神经氨酸酶是由4条相同的糖基化多肽所组成的蘑菇状四聚体，具有酶活性，可水解宿主细胞表面糖蛋白末端的N乙酰神经氨酸，有利于成熟病毒的释放(抗神经氨酸酶抗体能抑制病毒从细胞释放，但没有中和作用)。神经氨酸酶的抗原结构较易发生变异，它是流感病毒亚型的划分依据之一。
非结构蛋白基因(NS1，NS2)NS基因位于流感病毒基因组的节段8。其产物包括NS1和NS2非结构蛋白，主要功能包括调节病毒复制和转录，以及病毒与宿主细胞的相互作用。
宿主细胞基因流感病毒侵染细胞后诱导产生许多细胞因子，导致细胞发生细胞凋亡。这种细胞凋亡是流感病毒造成细胞和组织病变的生物学基础。研究表明，许多细胞凋亡相关基因均参与流感病毒的感染过程(Cherry-Schultz S和Krug RM，Induction of Apoptosis byInfluenza Virus，Seminars in Virology，8491-495，1998).这些基因包括Fas(细胞凋亡受体)、Fas-L(细胞凋亡配体)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和TACE(肿瘤坏死因子-α转换酶)等。另外，最新研究显示，许多炎症性细胞因子(cytokines)和化学因子(chemokines)在流感病毒的侵染过程起着非常重要的作用，例如CXCL1基因产物。
综上所述，本发明提供的方法是利用本发明的药物在细胞内调节一种或多个基因的表达，这些基因均与流感病毒感染和复制有关，代表性靶基因列于表1中。
本发明中所指的疗效是治愈、缓解和预防所对应的症状。对于预防性效果，本发明的药物组合物可用于有潜在易受流感病毒感染可能的人，如老人、幼儿或免疫力低下者。因此，本发明的治疗方法包括对动物和人的任何治疗，包括以下内容(1)防止尚未诊断出，但有可能出现的症状；(2)抑制症状发展；(3)减轻或逆转症状。
用于人和动物的寡核苷酸药物组合物的剂量取决于所治疗的症状，给药途径，受治个体的生理状况。
在表4中举例列举了单一或组合靶基因，用以制备不同寡核苷酸组合物。表中不同基因的组合中，每个基因之间用“/”分开，例如A/B/C，表示寡核苷酸靶基因A、B、C的组合。
本发明的药物组合物还可用于治疗一些动物，例如，鸟类、禽类。在药物组合物中寡核苷酸对应的靶基因序列为种属特异的。
表1.代表性流感病毒和宿主相关基因
表2.代表性靶向流感病毒基因的反义寡核苷酸
表3.代表性靶向宿主相关基因的反义寡核苷酸
表4.举例说明混合使用反义寡核苷酸的靶基因
具体实施例方式
以下实施例的列出是为了详细说明本发明，并不对发明的内容加以限制，如表2、3中所列的反义寡核苷酸序列为代表性的分子，任何其它可以对流感病毒感染产生疗效的反义寡核苷酸，均可用于本发明的药物组合物中。
实施例1RNA寡核甘酸对禽流感病毒在细胞内的抑制效应一.实验目的本实验为在细胞水平验证RNA寡核甘酸对流感病毒复制的抑制作用，并筛选出活性较强的分子。
二.实验材料细胞取9～10日龄SPF鸡胚常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，进行细胞计数。
RNA寡核甘酸2′-O-methyl修饰的3′-端封闭的寡核甘酸。其序列详细见下表表5.实验用寡核苷酸序列
三.实验方法1)、禽流感病毒(AIV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的适应1、取9～10日龄SPF鸡胚常规方法制备CEF，进行细胞计数。
2、用MEM培养液将细胞浓度调整为1.5×105个/ml，25ml细胞瓶内加5ml细胞悬液，置CO2培养箱37℃培养。
3、待细胞长成单层后，用PBS洗3次，加入0.5ml的AIV，37℃孵育1h后，倒掉病毒液，加入1％的MEM维持液37℃继续培养，同时设立不攻毒的正常CEF对照。
4、待细胞出现80％～90％病变后，将细胞反复冻融3次，收获病毒。
5、检测收获病毒液的血凝效价(HA Titer)。
6、用新收获病毒，重复进行传代，直至病毒产生稳定的细胞病变。
2)、细胞转染与攻毒1、转染细胞的准备①取9～10日龄SPF鸡胚常规方法制备CEF，进行细胞计数。
②将24孔细胞培养板每孔加入1.5～3×105个细胞，每孔0.5ml。
③置CO2培养箱37℃培养24h细胞长成单层。
2、寡核苷酸样品的准备①对于每个寡核苷酸样品准备A、B两个无菌EP管。
②A管100μl Opti-MEM1+2μl LF-2000(需要摸索最佳条件)；B管100μl Opti-MEM1+xμl寡核苷酸(使寡核苷酸终浓度为2μM)。
③将A、B管分别混匀后，室温下放置5分钟。
④将A、B管的液体混合，轻轻混匀一下，室温静置20分钟。
3、细胞转染①从培养箱内取出CEF已长成单层的24孔细胞培养板。
②吸去孔内含有血清的培养基，用PBS洗2次。
③将混合后的A、B管的200μl液体加到孔板中，轻轻混匀，37℃继续培养4h。
注每种寡核苷酸设三个重复孔，制备转染混合物时可在准备寡核苷酸样品时将设计体积扩大三倍，然后分别将1/3混合物加入各孔。
4、细胞攻毒①培养4h后，轻轻吸弃孔内液体，用PBS洗3次。
②每孔加入103TCID50的AIV，置CO2培养箱37℃培养，同时设正常CEF对照、寡核苷酸样品对照以及病毒对照。
③随时观察细胞病变(CPE)情况。
④当病毒对照细胞出现80％～90％病变时，分别收获各孔细胞液。
⑤进行HA检测，分析试验结果。
四.实验结果抗禽流感病毒(H5N1)RNA寡核甘酸转染进入鸡胚成纤维细胞(2μM)，再作病毒侵染(5TCID50)，38小时后取样测定HA滴度。从表6中可见，七种RNA寡核甘酸均呈现出不同程度的抗病毒效应，其中OE1、OE2、OE3及OE5的抑制效应最为显著。
表6.七种RNA寡核苷酸细胞内的抗病毒效应
#HA单位由平均Log2eLD50换算得到。
*与病毒对照相比获得。
实施例2单一和组合型RNA寡核甘酸对禽流感病毒在细胞内的抑制效应一.实验目的本实验在单一寡核甘酸筛选实验的基础上，选出活性较强的分子进行不同组合，以测定多种寡核甘酸组合物是否具有更强的抗病毒效应。
二.实验材料1)细胞取9至11日龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF，铺于24孔板每板，设计3个重复。
2)RNA寡核甘酸OE1，OE2，OE3，OE5，OE6(见实施例1表5)。
3)转染制剂Lipofectamine 2000(LF2000)(Invitrogen公司)三.实验方法1).转染过程使用前将LF-2000管轻轻混匀一下。
1、每个寡核苷酸样品根据需要计算出其所需量，按100μl Opti-MEM1+4μl寡核苷酸混合物(最终浓度为2μM)配好(共6管)。
2、计算出LF-2000总量，按100μl Opti-MEM1+2μl LF-2000的比例配好。
3、分别混匀后，室温下放置5分钟。
4、5分钟后，将寡核苷酸各管分别取出800μl与800μl LF-2000稀释液混合，轻轻混匀一下，室温静置20-30分钟，不能超过30分钟。
5、处理细胞取出培养细胞的24孔板，吸去有血清的培养基，用PBS洗1-2遍，20-30分钟后，将混合后的液体的液体加到24孔板中，每组6个孔，每孔200μl，轻轻混匀，37℃培养4小时。
6、加5TCID50病毒液100μl，37度孵育1小时后，补1％的Opti-MEM1 400μl，37℃培养至病毒对照出现病变。冻融一次后，收集各孔细胞液，测血凝效价。
2).寡核甘酸的准备共设5组寡核甘酸组合，分别为1)OE12)OE53)OE1+OE54)OE1+OE2+OE3+OE55)OE1+OE2+OE3+OE5+OE66)DNA对照7)病毒对照8)细胞对照各种组合的寡核甘酸终浓度相同，即每种组合在细胞培养孔中的浓度均为2μM。
四.实验结果表7总结了本实验的结果。很显然，组合型寡核甘酸的抗病毒效应要好于单一寡核甘酸，从而验证了采取针对多靶位点的策略是一种更为有效的抗病毒手段。
表7.单一和组合型RNA寡核苷酸细胞内的抗病毒效应
#HA单位由平均Log2eLD50换算得到。
*与病毒对照相比获得。
实施例3混合型RNA寡聚核甘酸在动物体内对禽流感病毒的抑制作用一、实验目的根据细胞实验的结果，下列实验将不同RNA寡核甘酸进行组合，观察其在禽类动物中对流感病毒的作用，以证实混合型RNA寡核甘酸的抗流感病毒的预防和治疗效应。
二、实验材料实验动物 10日龄SPF鸡。每组含9只鸡。
转染制剂Lipofectamine 2000(LF2000)(Invitrogen公司)RNA寡核甘酸2′-O-methyl修饰和3′-端封闭寡聚核甘酸，序列见下实施例1的寡核甘酸表(表5)。本实验所用组合型寡核甘酸包括OE1+OE2+OE3+OE5+OE6。
三、实验步骤
1、取10日龄SPF鸡以点眼、滴鼻的方式接种RNA寡核苷酸(寡核苷酸30μl+PBS70μl)；2、24h后，以点眼、滴鼻的方式接种寡核苷酸+LF2000+病毒的混合物。混合物制备方法如下1)22.5μl LF2000和22.5μl的PBS混合(共45μl)，1mM的寡核苷酸置室温。
2)室温放置5-10分钟。
3)将LF2000的上述稀释液和1mM的寡核苷酸以3∶2的比例混合，即45μl+30μl寡核苷酸，室温放置20-30分钟。
4)上述75μl混合液与25μl病毒液混合(10000ELD50)。
5)以点眼、滴鼻的方式接种SPF鸡。
3、接毒后24h，每组随机取出3只鸡，无菌取肺，-80℃储存留做蚀斑试验。
4、然后每隔6小时观察鸡的状态及死亡情况，并做记录。
四、实验结果从以下结果可见，本发明所提供的RNA寡聚核甘酸组合可在动物体内抑制禽流感病毒的复制，增强感染动物的存活率。
表8.累计死亡情况统计结果
备注DNA对照为无关寡核甘酸对照；试验组为五种RNA寡核甘酸的组合。
序列表<110>奥林格斯技术有限公司<120>防治流感病毒感染的寡核苷酸药物<130>JSP060001<160>43<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212> DNA<213>人工序列<400>1cauuucgaau caguaccugc20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2ucccuucucc uucgugac 18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3cagcacugcc auaacuau 18<210>4<211>18<212>DNA<13>人工序列<400>4
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权利要求
1.一种抑制流感病毒感染的寡核苷酸，特征是(1)含有7～75个核苷酸；(2)含有通过非手性5′到3′磷酸核苷间键连接的7～75个邻接的核糖基团；(3)互补于与流感病毒或宿主细胞相关靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和/或翻译终止区；(4)具有75℃～115℃的熔解温度(Tm，1毫摩尔浓度)。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于该寡核苷酸由10～26个核苷酸组成，具有40℃～85℃的熔解温度(Tm，1微微摩尔浓度)。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于该寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脱氧核糖寡核苷酸。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于该寡核苷酸是经化学修饰的修饰性寡核苷酸。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸，其特征在于所述修饰性寡核苷酸是在糖基2′位上带有取代基团的，所述取代基团选自氧、甲氧基、丙氧基、甲氧-乙氧基、氟、氯、溴、碘。
6.如权利要求4所述的寡核苷酸，其特征在于所述修饰性寡核苷酸在3′端和/或5′端带有保护基团。
7.如权利要求4所述的寡核苷酸，其特征在于所述修饰性寡核苷酸是3′末端封闭和/或5′末端封闭的。
8.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于该寡核苷酸是反义寡核苷酸。
9.如权利要求8所述的寡核苷酸，其特征在于所述反义寡核苷酸包括靶向流感病毒基因的反义寡核苷酸序列和靶向宿主细胞基因的反义寡核苷酸序列。
10.如权利要求9所述的寡核苷酸，其特征在于所述反义寡核苷酸的序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO43。
11.一种防治流感病毒感染的寡核苷酸组合物，含有权利要求1-10中任一权利要求所述的寡核苷酸中的一种或多种。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于当使用多种寡核苷酸时，这几种寡核苷酸将各自与相同或不同的靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和/或翻译终止区的不同区域互补，所述靶基因包括流感病毒基因和宿主细胞基因。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述靶基因选自流感病毒基因PA、PB1、PB2、HA、NP、NA、M和NS1，人细胞调亡基因Fas、Fas-L、TACE、TNF-R1、TNF-α和Caspase-3，人炎症细胞因子基因及鸡细胞调亡基因Caspase-3、Fas、Fas-L、TNF-α和TACE。
14.如权利要求1-13中任一权利要求所述的寡核苷酸或其组合物制备防治人或动物流感病毒感染制剂的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述的动物是禽类。
全文摘要
本发明涉及防治流感病毒感染的寡核苷酸药物。所述寡核苷酸含有7～75个核苷酸；含有通过非手性5′到3′磷酸核苷间键连接的7～75个邻接的核糖基团；互补于与流感病毒或宿主细胞相关靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和/或翻译终止区；具有75℃～115℃的熔解温度(Tm，1毫摩尔浓度)。所述的寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脱氧核糖寡核苷酸，并可经化学修饰。本发明的寡核苷酸可用于制备防治动物或人流感的制剂。
文档编号A61K31/7088GK1840203SQ200610000900
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月17日 优先权日2006年1月17日
发明者罗德瑞克·M·K·戴尔, 孙仑泉 申请人:奥林格斯技术有限公司