专利名称：鹅不食草挥发油在制备肿瘤生长和增殖的抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鹅不食草挥发油制备方法及其在制备肿瘤生长和增殖的抑制剂中的应用，特别涉及鹅不食草水蒸气蒸馏法和超临界二氧化碳萃取所制得的挥发油在制备肿瘤生长和增殖的抑制剂中的应用。
背景技术：
鹅不食草(Centipeda minima(L.)A.Br.etAschers.)系菊科石胡荽属植物，又名石胡荽、鸡肠草。鹅不食草始载于南唐《食性本草》，在我国著名的药典《本草纲目》中亦有记载，“鹅不食草可以通鼻气，利七窍，吐风痰，塞鼻息自落”。鹅不食草生长于海拔300～1900米的阴湿处，主产于我国浙江、湖北、江苏、广东等地。在国外主要分布于印度平原和锡兰岛。
鹅不食草主要成分包括有挥发性油类，甾体类，萜类化合物和黄酮类等主要有效成分。药理研究证明，它有广泛的药理作用，如抗炎，抗原生生物，抗菌抗过敏等作用。
萜类化合物是其的主要化学成分之一，很多萜类化合物具有重要的生理活性，比如，山金车内酯C和D具有相似的抗枯草杆菌作用，MIC值为150微克/毫升。鹅不食草挥发油0.05毫升/千克和0.01毫升/千克剂量组对小鼠急性炎症均有明显抑制作用。
有关鹅不食草的公开的专利和发表的文献大致可分为二类第一类是关于鹅不食草化学成分和质量分析的研究，Bohlmann F，Chen ZL.Newguaianolides from Centipeda minima.KeXue TongBao 1984；29(7)900-3。刘宇 杨艳芳吴和珍刘焱文.RP-HPLC法测定鹅不食草中短叶老鹳草素的含量，中药材2005，6(28)473-474报道鹅不食草中短叶老鹳草素的含量为3毫克/克。
第二类是关于鹅不食草生物活性的研究，在这些报道中鹅不食草具有抗过敏、抗原生虫(如疟原虫和阿米巴虫等)和治疗鼻炎的作用，Sharma P，Sharma J D.A Review of PlantSpecies Assessed in vitro for Antiamoebic Activity or both Antiamoebic andAntiplasmodial Properties.Phytother.Res.2001 15，1-17.覃仁安，陈敏.鹅不食草挥发油抗炎作用的初步实验报告.贵州医药，2001，25(10)909-910。余洪猛，文三立.鹅不食草治疗过敏性鼻炎的实验研究.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2001，9(5)220-224在国家知识产权局相关检索中并未发现关于鹅不食草挥发油水蒸气蒸馏法及超临界二氧化碳萃取的制备方法，同时未发现鹅不食草挥发油在制备肿瘤生长和增殖的抑制剂中的应用的专利。
当前，肿瘤化疗治疗领域急需解决的问题是寻找出新的低毒、高效抗癌药物资源，本项发明正与其相符合，因此，具有重要的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于针对肿瘤治疗领域急需解决的问题，寻找出新的低毒、高效抗癌药物资源。提供应用鹅不食草挥发油或其与药理学上允许的添加成分相组合而成的肿瘤生长和增殖抑制剂剂型；并提供鹅不食草挥发油水蒸气蒸馏法及超临界二氧化碳萃取的制备方法。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂为中药鹅不食草的挥发油，作为制备肿瘤生长和增殖抑制剂中的有效物质。
本发明提供的鹅不食草挥发油提取方法为水蒸气蒸馏法或超临界二氧化碳萃取法。
其中所说的水蒸气蒸馏法是指将鹅不食草置于蒸馏容器中，加入6～8倍量水，加热蒸馏4～6小时的提取方法。
所说的超临界二氧化碳萃取法是指将鹅不食草粉碎成粗粉，置超临界二氧化碳萃取仪中，以二氧化碳在萃取压力和萃取温度分别为15～25兆帕和35～45℃、分离压力和分离温度分别为5.2～7.2兆帕和30～35℃的条件下，萃取1～3小时的提取方法。
本发明所说的水蒸气提取所得鹅不食草挥发油和超临界二氧化碳萃取所得鹅不食草挥发油在组成成分上有一定的差别，抗肿瘤效果有所不同，但均为抗肿瘤的有效物质。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，为鹅不食草挥发油与药理学上允许的添加成分相组合而成的剂型。所述抑制剂剂型为经口给药的固型制剂散剂，丸剂，片剂或胶囊剂，或为非经口给药的外用剂，软膏，贴敷剂，注射剂。
其中所说的鹅不食草挥发油为采用水蒸气蒸馏法或超临界二氧化碳萃取法提取所得。所说的肿瘤为医学上所属的各类肿瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤。而所说的恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，消化器官的肿瘤(胃癌，肠癌，肝癌，胆囊癌，胆道癌，胰腺癌)，肺癌，乳癌，睾丸癌，卵巢癌，子宫癌，前列腺癌，上颚癌，舌癌，口腔癌，咽喉癌，甲状腺癌，脑部肿瘤，各类肉瘤，骨肉瘤，白血病，神经系统肿瘤，膀胱肿瘤，皮肤癌，皮肤附属器官癌和皮肤转移癌。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，小剂量即产生抑制多种肿瘤细胞生长的作用且具有剂量依赖性，可将它们作为治疗肿瘤的药物，应用于肿瘤的化学治疗中。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，在低浓度的情况下具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，说明不仅具有杀灭肿瘤细胞的作用而且可以遏制肿瘤细胞的无限增殖能力，因而可以发挥更进一步更大程度治疗肿瘤的效果。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，对不同的人类癌细胞和人类正常细胞有不同的细胞毒性，尤其是对癌细胞的IC50要比正常细胞的IC50低很多，而且两者差异显著(p＜0.05)。
本发明的肿瘤生长和增殖的抑制剂，低毒，适合于人和哺乳类动物经口或非经口给药。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，在剂型方面无特定的限制，可作为经口给药的散剂，丸剂，片剂，胶囊剂等固型制剂，也可作为非经口给药的外用剂，软膏，贴敷剂，注射剂。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，通常能与不影响药理学作用的辅助料配合制成经口或非经口给药的制剂。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，可经水溶剂(如蒸馏水)，水溶性制剂(如生理盐水)，脂溶剂(如胡麻油)等溶剂用常规法调制。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，通常能与药理学上允许的稀释剂，着色剂，安定剂，界面活性剂，助溶剂，缓冲剂，矫味剂，香料，保存剂或糖衣剂相组合，用于经口或非经口剂型。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂，在剂型上通常能与药理学上允许的稀释成分和成型成分相组合，用于经口或非经口剂型。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂经口剂型，是指片剂，丸剂，颗粒剂，散剂或胶囊。非经口剂型是指静脉注射剂，肌肉注射剂，皮下注射剂，浴剂，直肠，肛门或阴道给药。
本发明的显著的优点和技术上的进步本发明提供的具有抑制多种人类肿瘤细胞生长和增殖作用的挥发油，克服了传统上中药全草入药服用剂量大及疗效不稳定的缺陷，用现代生物技术作为发明的手段，应用现代科学技术进行提取，用药剂量小，具有显著的抑制人类肿瘤细胞生长和增殖作用(体内和体外实验)，同时对人类正常细胞的细胞毒性较小，具有良好的应用前景。
表1为水蒸气蒸馏法提取鹅不食草挥发油试验结果。
表2为超临界二氧化碳萃取法提取鹅不食草挥发油试验结果。
表3为水蒸气蒸馏法和超临界二氧化碳萃取法提取鹅不食草挥发油质量分析结果。
表4和表5为不同提取方法所得鹅不食草挥发油在不同浓度下对A375(人黑色素瘤细胞)，A431(人表皮鳞癌细胞)，95D(人肺腺癌高转移株细胞)，MKN45(人胃癌细胞)，BEL-7402(人肝癌细胞)，LoVo(人结肠癌细胞)细胞的抑制作用。
表6为不同提取方法所得鹅不食草挥发油在不同浓度下对293(人胚肾细胞)，LO2(正常肝细胞)细胞的细胞毒性作用。
图1为水蒸气蒸馏提取法所得鹅不食草挥发油在不同浓度下抑制C57小鼠体内肿瘤生长的比较。
图2为超临界二氧化碳萃取法提取所得鹅不食草挥发油在不同浓度下抑制C57小鼠体内肿瘤生长的比较。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明内容作进一步说明。所举之例并不限制本发明的保护范围实施例1取鹅不食草适量置于蒸馏容器中，加入6～8倍量水，采用水蒸气蒸馏法，加热蒸馏4～6小时，收集挥发油。实验结果如表1所示表1水蒸气蒸馏法提取鹅不食草挥发油试验结果
以上实施例说明，水蒸气蒸馏法能较好的提取鹅不食草挥发油，且在加入量为6～8倍量，加热蒸馏时间为4～6小时，挥发油收率相差不大。
实施例2将鹅不食草粉碎过20目筛，置于超临界二氧化碳萃取仪中，以二氧化碳萃取，萃取压力为15～25兆帕，萃取温度为35～45℃、分离压力为5.2～7.2兆帕，分离温度为30～40℃，萃取时间为1～3小时。试验结果如表2所示表2超临界二氧化碳萃取法提取鹅不食草挥发油试验结果
以上实施例说明，超临界二氧化碳萃取法能较好的提取鹅不食草挥发油，在萃取压力和萃取温度分别为15～25兆帕和35～45℃、分离压力和分离温度分别为5.2～7.2兆帕和30～40℃，萃取时间为1～3小时，挥发油收率相差不大，但收率明显高于水蒸气蒸馏法。
实施例3水蒸气蒸馏法和超临界二氧化碳提取法所得鹅不食草挥发油质量分析以乙醚分别将水蒸气蒸馏和超临界二氧化碳提取所得鹅不食草挥发油分别配成每毫升含生药量为14。6克的供试品溶液，各取1微升注入Thermo Finnigan气质联用仪，在载气为氦气，分流比55∶1，柱前压46千帕，载气流速为每分钟1毫升，进样口温度300℃，柱温100℃，检测器温度310℃，电离能量为70电子伏特，倍增电压200伏特的条件下测定，测定结果如表3所示表3不同制备方法所得鹅不食草挥发油质量分析结果
实施例3鹅不食草挥发油对肿瘤细胞的毒性作用鹅不食草挥发油分别为采用水蒸气蒸馏法、超临界二氧化碳萃取法，从鹅不食草中提取分离得到的提取物，用DMEM(杜氏改良依格培养基，Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)培养液稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定鹅不食草挥发油对A375，A431，95D，MKN45，BEL-7402，LoVo细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106个细胞/毫升接种于96孔培养板，每孔0.2毫升，分别加入设定浓度的鹅不食草挥发油处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5毫克/毫升MTT 10微升，培养结束后每孔加入0.04当量二甲基亚砜(DMSO)，每孔150微升，振荡10分钟，待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550纳米为实验波长，655纳米为参照波长测定其吸收度，计算肿瘤细胞的抑制率和药物对细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的抑制率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC50)。实验结果如下表4和表5所示。
表4不同的鹅不食草挥发油对A375，A431，95D细胞的抑制作用
表5不同的鹅不食草挥发油对MKN45，BEL-7402，LoVo细胞的抑制作用
以上实施例说明，鹅不食草挥发油对不同种类的肿瘤细胞均具有良好的杀灭作用，而且这种抑制效果还具有剂量依赖性。
实施例4鹅不食草挥发油对正常LO2细胞的毒性作用鹅不食草挥发油为从鹅不食草中采用水蒸气蒸馏和超临界二氧化碳萃取得到的提取物，用DMEM培养液稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定短叶老鹳草素对LO2细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106细胞/毫升)接种于96孔培养板，每孔0.2毫升，分别加入设定浓度的鹅不食草挥发油处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养4天，实验终止前4小时每孔加入5毫克/毫升MTT 10微升，培养结束后每孔加入0.04当量二甲基亚砜(DMSO)，每孔150微升，振荡10分钟待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550纳米为实验波长，655纳米为参照波长测定其吸收度，计算肿瘤细胞的抑制率和药物对细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的抑制率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC50)。实验结果如下表6所示。
表6不同的鹅不食草挥发油对293，LO2细胞的细胞毒性
以上实施例说明，两种方法提取所得鹅不食草挥发油对人类肿瘤细胞的细胞毒性较大，对正常细胞的细胞毒性较弱，对某些人类肿瘤细胞具有一定的靶向抑制作用。
实施例5鹅不食草挥发油抑制C57小鼠体内肿瘤生长活性的比较鹅不食草挥发油为从鹅不食草中采用水蒸气蒸馏和超临界二氧化碳萃取得到的提取物，雄性荷瘤C57小鼠两只，剥离小鼠的实体瘤，剪碎并用酸磷缓冲液(pH 7.4)研磨，80目筛网过滤。配成细胞悬浮液备用。雄性C57按体重随机分组，前肢腋下注射肿瘤细胞悬浮液(1×106个/毫升)，在接种同时不同的药物腹腔每日注射，阴性对照为生理盐水。以抗癌药物为阳性对照，给药8天，后处死，剥离小鼠的实体瘤称重。与对照比较计算抑制率。药物的不同浓度对肿瘤的抑制率的影响的实验结果如图1、图2所示。
以上实施例说明，鹅不食草挥发油在体内也能抑制肿瘤的生长，同时也具有剂
权利要求
1.鹅不食草挥发油在制备肿瘤生长和增殖的抑制剂中的应用，其特征在于，采用水蒸气蒸馏法或超临界二氧化碳萃取法制备的鹅不食草挥发油，用作制备肿瘤生长和增殖抑制剂中的有效物质；所说的水蒸气蒸馏法是指将鹅不食草置于蒸馏容器中，加入6～8倍量水，加热蒸馏4～6小时的提取方法；所说的超临界二氧化碳萃取法是指将鹅不食草粉碎成粗粉，置超临界二氧化碳萃取仪中，以二氧化碳在萃取压力15～25兆帕和萃取温度为35～45℃、分离压力为5.2～7.2兆帕和分离温度为30～35℃的条件下，萃取1～3小时的提取方法。
2.如权利1所说的鹅不食草挥发油在制备肿瘤生长和增殖的抑制剂中的应用，其特征在于，鹅不食草挥发油或其与药理学上允许的添加成分相组合制备成肿瘤生长和增殖抑制剂，所述抑制剂剂型为经口给药的固型制剂散剂，丸剂，片剂或胶囊剂，或为非经口给药的外用剂，软膏，贴敷剂，注射剂。
全文摘要
本发明公开了鹅不食草挥发油在制备肿瘤生长和增殖的抑制剂中的应用。用作制备肿瘤生长和增殖抑制剂中的有效物质；鹅不食草挥发油采用水蒸气蒸馏法或超临界二氧化碳萃取法进行制备。所说的水蒸气蒸馏法是指将鹅不食草置于蒸馏容器中，加入6～8倍量水，加热蒸馏4～6小时的提取方法；所说的超临界二氧化碳萃取法是指将鹅不食草粉碎成粗粉，置超临界二氧化碳萃取仪中，以二氧化碳在萃取压力15～25兆帕和萃取温度为35～45℃、分离压力为5.2～7.2兆帕和分离温度为30～35℃的条件下，萃取1～3小时的提取方法。体内和体外实验证明鹅不食草挥发油具有显著的抑制人类肿瘤细胞生长或增殖作用，同时对正常细胞的毒性较小，具有良好的应用前景。
文档编号A61K9/00GK1907312SQ20061002002
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月22日 优先权日2006年8月22日
发明者吴和珍, 刘建文, 刘焱文, 杨艳芳, 李长龙 申请人:湖北中医学院