肿瘤抑制剂mln4924在制备抗病毒药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了肿瘤抑制剂MLN4924在制备抗病毒药物中的应用。通过实验证明在抗肿瘤临床人体试验中有较好表现的小分子抑制剂MLN4924具有较强的抗病毒活性，通过抑制病毒辅助蛋白作用，能够达到大于80%的抑制病毒复制。由于该药物具有较长的前期实验性临床应用经验，药物作用效果强，可大规模生产，因而具有很大的潜力成为高效抗病毒药物。利用小分子药物抑制病毒蛋白主导的Neddylation激活下的泛素系统，检测肿瘤抑制剂MLN4924在制备抗病毒药物中的应用价值。
【专利说明】肿瘤抑制剂MLN4924在制备抗病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肿瘤抑制剂MLN4924的新用途。
【背景技术】
[0002]病毒作为危害人类健康的重要病原体，已成为全球性的公共卫生领域的难题，至今人们仍然没有找到非常有效的治疗药物和方法。不同病毒的传播以及在宿主体内的复制方式也存在着较大的差异。随着近二十年病毒与宿主间相互作用的研究，已经发现了一系列的天然抗病毒因子，诸如AP0BEC3G，BST-2, Trim5_a以及SAMHDl等。然而病毒不断的复制过程中也形成了各异的适应机制来逃避宿主免疫防御。其中，病毒利用所编码的病毒蛋白通过篡夺宿主泛素化系统来促进抗病毒因子的蛋白酶体依赖性降解是最为普遍的策略。
[0003]Cullin家族蛋白作为重要的泛素系统连接蛋白，直接参与泛素化过程的调控。前期国际多项研究揭示Cullin家族蛋白广泛涉及生物体发育、细胞周期调控、DNA损伤修复以及肿瘤发生等过程。然而，Cullin蛋白组成的泛素E3复合体也被许多病毒蛋白所劫持，特异性的促进宿主蛋白降解进而促进病毒复制与传播。病毒蛋白识别泛素E3复合体的现象普遍存在于DNA病毒和RNA病毒中，成为国际公认的新型抗病毒疫苗与药物研究靶点(表I)。
[0004]小分子抑制剂MLN4924能够特异性的结合Nedd8活化酶(NAE)，破坏Nedd8分子的正常传递，从而阻断了 Neddylation修饰激活Cullin蛋白参与的泛素复合体，抑制癌细胞的增生。该抑制剂被美国国家癌症研究中心(NCI)作为重要的候选抗肿瘤药物进行I和II/III 其月人^本Ife床试验石开究(http: //www.cancer, gov/drugdictionary?cdrid=596795),但至今尚未报道肿瘤抑制剂MLN4924对病毒有抑制作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种肿瘤抑制剂MLN4924在制备抗病毒药物中的应用。
[0006]本发明的技术方案概述如下:
[0007]肿瘤抑制剂MLN4924在制备抗病毒药物中的应用。
[0008]通过实验证明在抗肿瘤临床人体试验中有较好表现的小分子抑制剂MLN4924具有较强的抗病毒活性，通过抑制病毒辅助蛋白作用，能够达到大于80%的抑制病毒复制。由于该药物具有较长的前期实验性临床应用经验，药物作用效果强，可大规模生产，因而具有很大的潜力成为高效抗病毒药物。
[0009]利用小分子药物抑制病毒蛋白主导的Neddylation激活下的泛素系统，检测肿瘤抑制剂MLN4924在制备抗病毒药物中的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为MLN4924抑制宿主细胞内Cullin4A蛋白的正常Neddylation修饰。[0011]图2为MLN4924有效阻断病毒蛋白Vpx诱导宿主SAMHDl蛋白降解。
[0012]图3为细胞内高表达Neddylation介导蛋白UBE2M突变体有效抑制病毒蛋白Vpx功能。
[0013]图4A为腺病毒蛋白E4of6识别CRL5E3复合体降解P53蛋白示意图；
[0014]图4B为MLN4924有效抑制腺病毒E4of6蛋白诱导P53蛋白降解。
[0015]图5为MLN4924有效抑制慢病毒在PMA诱导后的巨噬细胞状态下THP-1细胞内复制。
[0016]图6为抗肿瘤药物MLN4924抑制病毒泛素复合体功能示意图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。[0018]本发明通过整合细胞宿主泛素复合体调节机制，研究在病毒蛋白劫持下的泛素复合体激活机制，筛选和检验特异性高，机体毒害性小且可行性大的小分子抑制剂来阻断病毒辅助蛋白促进的病毒在巨噬细胞中复制，建立新型抗病毒药物研究的新靶标。选用了的小分子抑制剂 MLN4924(化学式:C21H25N504S，编号:M425100，厂商:T0R0NT0 RESEARCHCHEMICALS INC.)实施例1
[0019]利用MLN4924 能够有效的抑制 THP-1 细胞(2010 年从 NIH AIDS reagent program获得:https://www.aidsreagent.0rg/reagentdetai1.cfm?t=cell lines&id=142) 内Cullin4A蛋白与类泛素分子Nedd8的结合，从而有效的阻止了 CRLs泛素E3复合体的变构激活。(见图1)。实施例2
[0020]病毒蛋白诱导宿主蛋白泛素化降解检测系统:
[0021]本发明中，宿主基因SAMHDl和P53表达质粒均通过提取THP-1细胞的cDNA，利用PCR扩增目的基因构建进入哺乳细胞表达载体p⑶NA3.1 (Invitrogen:http: //tools,lifetechnologies.com/content/sfs/vectors/pcdna3.1+, pdf)中。再利用月旨质法转染将相应的宿主基因和病毒编码基因转入人胚胎肾细胞HEK293T (2010年购自ATCC:httD://www.atcc.0rg/Products/All/CRL-3216.aspx)中，48小时后，利用免疫印迹法检测相应蛋白的表达情况，所有实验结果均使用ImageJ软件进行定量分析(图2，图3，图4)。(I)MLN4924强效阻断了慢病毒(Lentivirus)病毒蛋白Vpx识别CRL4(DCAFl)复合体促进
[0022]抗病毒因子SAMHDl的降解(图2);平行的机制性研究再次证明了 Vpx_CRL4病毒复合
[0023]体受Nedd8修饰途径中直接由UBE2M参与Nedd8分子传递和调控。多途径干扰UBE2M
[0024]蛋白正常表达或者功能，均明显阻断Vpx诱导降解抗病毒蛋白SAMHDl (图3)；
[0025](2)MLN4924 有效阻断腺病毒(Adenovirus)病毒蛋白 E4of6 识别 CRL5 (ElonginB/C)复
[0026]合体促进重要调节蛋白P53的泛素化降解，恢复宿主细胞内的正常功能性调节(图4)。实施例3
[0027]病毒侵染试验系统:
[0028]选用50ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)刺激后的单核细胞系THP-1(购自ATCCMt为检测系统。病毒侵染前6小时加入MLN4924达到IOOnM浓度，对照组使用溶剂DMSO与细胞共孵育，之后分别加入30ul含有浓缩后的无细胞的类人猿免疫缺陷病毒SIV病毒上清(病毒侵染报告质粒来自于美国凯斯西储大学分子生物学和微生物学系Jacek Skowronski,相关文章已发表Hrecka，K.2011，Nature474，658-661)。72小时后，收细胞荧光显微镜观察后用流式细胞仪进行GFP阳性细胞筛选(病毒侵染阳性)，收获数据进行侵染性分析(图5)。
[0029]重复试验显示MLN4924阻断了病毒蛋白结合后的CRL E3泛素连接酶功能，对SIV在巨噬细胞内复制达到大于80%的抑制(图5和图6)。
[0030]图 6 中(NAE:neddy8 蛋白激活酶；UBE2M/UBE2F:Nedd8 蛋白结合酶；Rbxl/Rbx2:E3泛素连接酶蛋白；E2:泛素结合酶；Ubiquitin(Ub):泛素蛋白)
[0031]抗肿瘤药物MLN4924潜在抗病毒作用靶点见表1。
[0032]表1
[0033]
【权利要求】
1.肿瘤抑制剂MLN4924在制备抗病毒药物中的应用。
【文档编号】A61K31/519GK103520163SQ201310500094
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】于晓方, 魏伟, 郭浩然 申请人:天津大学