银杏叶标准提取物中的黄酮醇类β-分泌酶抑制剂、及其提取方法和用途的制作方法

专利名称：银杏叶标准提取物中的黄酮醇类β-分泌酶抑制剂、及其提取方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，具体涉及一种银杏叶标准提取物中的 黄酮醇类P-分泌酶抑制剂。该p-分泌酶抑制剂可用于治疗老年痴呆症
(Alzherimer，s Disease, AD )。 背景扶术
我国目前面临人口老龄化的严峻挑战，2000年全国60岁以上人口 约为2.7亿，预计到本世纪中叶将达到4.1亿。而流行病学研究发现超 过65岁的人群中老年痴呆的发病率呈指数形式增加；国家"九五"科技 攻关课题"老年性痴呆和帕金森氏病流行病学研究"表明目前，北京市 65岁以上老人的老年期患病率为7.3% ,其中每隔5年的年龄段老年性 痴呆的患病率增长约一倍，如70岁患病率为5.3%, 75岁为11%， 80 岁时高达22%;早已进入老龄化社会的上海，老年痴呆的患病人数也 日渐增长。在美国，阿尔茨海默病(AD)每年至少造成IOOOOO人死亡， 是仅次于心脏病、癌症、中风的第四位主要死亡原因。它也是引起老 年人痴呆的最常见原因。该病症以渐进性认知能力丧失和人格改变为 特征。常见症状有近期记忆障碍，常常伴有语言、视觉空间和注意力 问题。在确诊AD后，平均生存时间约8年，死亡常为间发疾病所致。 与其他退化性疾病一样，老年痴呆症除了对病人健康的损害外，其治 疗与护理对病人、家庭乃至整个社会都会产生巨大的社会和经济影响,
单就美国而言，每年花在老年痴呆症治疗上的相关费用估计高达
1000亿美元(MilliganC.E.，Ato. Mec/.,2000，6:385)。而且随着人口老龄 化程度的增加，这种趋势还会明显增加。
老年性痴呆可分为脑血管性(VD)、阿尔茨海默症(AD)和混 合型(BD)三种。其中AD是一种复杂的系统性疾病，关于它的研究 成果也更多。阿尔茨海默病(AD)俗称老年痴呆，是当今社会严重危 害老年人身心健康的一种神经系统退化性疾病(Vassar，R.等，5We"ce，
1999, 286: 735-741; Wouter， B.等，iVoto,"五jc/ mwzow
2002,26: 139-148.)。 AD的神经病理特征是在脑皮层有广泛的轴索细胞 缺失、大量老年斑和神经纤维缠结的堆积(Vassar， R.等，乂伤o/. C/iem.,
2000, 275: 37712-37717.)。在大脑形态学上出现皮质萎缩，伴有神经 原纤维缠结及老年斑,潜隐起病，病程呈进行性发展，最后导致痴呆 (Yan，R.等，Nature., 1999,402: 533-537.)。以緩慢出现的智能减退为主要 临床特征，包括记忆、思维、理解、判断、计算等功能的减退和不同 程度的人格改变，但没有意识障碍(Sinha,S.等，A^we, 1999， 402: 537-540.)。
目前，老年性痴呆的所有治疗，均为根据其病因学假说而采取的， 尚无特效，能中止或逆转疾病进展的疗法，故均为对症治疗。目前国 际上主要采取的治疗手l爻如下
1. 补充胆碱能神经元功能不足
2. 神经生长因子(NGF)增强剂保护基底前脑胆碱神经元 4. (3淀粉样蛋白酶抑制剂
5. 抗炎药物
6. 神经肽系统作用药物
7. 抗氧化剂
8. 改善脑循环和脑代谢
9. 钙离子拮抗剂
10. 作用与兴奋性氨基酸受体的激动剂
20世纪90年代以来AD治疗药物不断涌现，市售的一些用于治 疗AD的药物大多只能緩解AD的一些症状，暂时改善AD病人的记 忆力和注意力(Kahana，J.等，7)w^Ce〃所o/., 2001,11: 192.),如使用某 些乙胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE )抑制剂如石杉碱曱 (Huperzine A),可以逆转胆碱功能损伤动物的学习、记忆缺陷，并对 少数老年痴呆症病人的症状有一定的改善。然而，由于老年痴呆症发 病的机理极其复杂，目前使用的这些药物并不能从根本上改善疾病状 态，所以，近来的研究多集中在从分子生物学的角度寻找新的基因作 为新药研究的靶点。其中分泌酶(secretase)就是近来在老年痴呆症 研究方面的一个热点(Selkoe， D丄，Sde"ce, 1997， 275: 630-1; Hardy， J.， 7Vw/.<SW. a5*.A， 1997, 94: 2095-7; Schenk， D.等，A^ww, 1999， 400: 173-177; Morgan, D.,等，A^ww， 2000, 408: 982-985.)。因此， 到目前为止，AD的临床治疗仍然是一个亟待攻破的世界性难题。
最近的科研成果表明，患AD的病人引起痴呆的原因是由于人脑 区域中因高水平的"老年板块"和"神经纤维紊乱，，而造成的神经元细胞 的死亡。"p-淀粉样蛋白(AP)的异常产生和沉积，，认为是导致神经元 损伤和丢失的主要原因之一。研究结果表明脑中A|3的沉积是AD发
病机理的关键所在。
A卩是由5定4分前体蛋白APP ( Amyloid precursor protein) 4皮p和y-分 泌酶催化水解而成。A(3含有39-42个氨基酸残基，根据氨基酸残基的 长短，A(3可分为A卩4o和Ap42。研究结杲显示A|342的产生是AD发病 早期的最为关^^建的因素。在AD发病早期，Ap42的过量产生会直接引 发其病理上的层叠，而过量的A(^很难被清除，所以在一些聚集因素 的作用下A卩42会沉积下来。A(3与痴呆的关系如

图1所示。
A卩的前体蛋白APP为含有大约700个氨基酸残基的大分子，它通 过分泌途径移至细胞表面再移向内涵体，在移向细胞表面的过程中， 两个不同的蛋白酶，ct-分泌酶和(3-分泌酶分别切割APP的不同部位以起 催化水解作用(Fiona, G丄.等说o/. Ctem.， 2002, 277: 4687-4693.)。 APP的催化水解可沿两条主要途径进行a-分泌酶途径和p-分泌酶途 径。在a-分泌酶途径中，a-分泌酶将APP催化水解成可溶性的APP片 段a-APPs和C83肽，后者在，分泌酶的作用下被代谢为p34o和 p342(William,D.等，Mo/尸/wmwco/， 2001， 59: 619-626.)。在j3-分泌酶途径 中，p-分泌酶将APP催化水解成可溶性的APP片段(3-APPs和C99肽， 后者则在"分泌酶的作用下被代谢为A&o和Ap42(Vinod S.等， ￡xpreM/o" 户wn:/k;o^o"， 2004， 34: 1卯一196.),如图2所示。由此可 见，p-分泌酶的抑制剂可抑制p-APPs和C99的生成；Y-分泌酶抑制剂 可抑制p3和Ap的生成，完全抑制P和Y-分泌酶的活性即可全部控制AP 的生成以达到治疗AD的目的。
人脑细胞中的p-分泌酶是一个I型跨膜区域蛋白，它含有1个氨基 末端前肽，2个由天冬氨酸残基组成的活化位点以及3个分子内的二硫 键(Anja， C.等，J所o/.C7iem" 2002， 277: 5637-5643.)。 p-分泌酶和(3-分泌
酶-2是目前唯一已知的膜连天冬氨酸蛋白酶。P-分泌酶蛋白由信号肽、 前体、成熟酶、跨膜区和胞质区构成(Regina， F.等，J所o/.C7zem., 2003， 278:5531-5538.)。迄今为止，有关，分泌酶的结构和特性不如P-分泌酶 明了 ，这给以y-分泌酶为靶点所进行的药物设计及筛选工作带来许多不 利因素。近两年来，以(3-分泌酶为靶点的一些p-分泌酶抑制剂被相继设 计合成，这一研究所取得的成果为治疗AD的新型药物的开发提供了 极为重要的理论线索。然而，这些化合物尽管是(3-分泌酶的抑制剂， 但其结构复杂、分子庞大，限制了它们的药用价值的进一步探索。
如前所述，由于A(3在老年痴呆症发病过程中所起的重要作用，所 以通过对p-分泌酶(BACE)和，分泌酶的抑制，降低或部分降低A卩 的产生应该可以阻止老年痴呆症病情的进一步恶化。这一观点已被最 新研究成果证实，约翰霍普金斯大学的DonaldPrice研究小组和西北大 学医学院的Ribert Vassar研究小组已分别成功得到|3-分泌酶基因敲除 小鼠，无论是该小鼠还是来源于该小鼠的神经细胞均不能产生 A(X Luo， Y.，等，淑"re A^磨sc/.， 4: 231-232; Cai， H"等，胸, Afe薩c/" 4: 233-234.)。而且，该小鼠身体健康、有生殖力，从解剖学、 组织学、血液学和临床化学角度分析，也都是正常的。因此，P-分泌 酶已经明确成为治疗老年痴呆症的一个新靶点，对它的抑制不仅有效 而且安全。目前，国外许多大制药公司和研究机构正在寻找其特异性 抑制剂。
到目前为止文献报道的P-分泌酶抑制剂仅仅局限于一些含有7-8 个氨基酸的肽类、肽化合物以及一些杂环化合物(武田药品工业抹式 会社，PCT/JP01/04144)，例如基于(3-分泌酶对APP水解的过渡态设计 的抑制剂OM99-l(1)， OM99-2(2)和3 (Ghosh， A. K.，等，J C/2ew.
Soc., 2000， 122: 3522.)(如下式表示)，这些无疑为我们从中草药中寻找 新的小分子非肽类有机化合物作为(3-分泌酶抑制剂提供了机遇。
银杏提取物对早期和中期AD和MID (血管性痴呆)的临床研究 报道始于1986年，至今已有多篇综述。Ernst详细总结了 1998年以前 GBE的临床工作，9项研究中7项用EGb761， 2项用LI1370;观察 时间有1年、24周、12周、6周、4周不等；剂量每天120-240 mg 不等。大体统计，2/3的实验服药组比对照组有显著改善。认为大部 分试验数据支持GBE对痴呆病人推迟临床症状恶化或改善综合症状 有一定效果。
银杏叶的化学成分已研究得比较清楚，已证实的化学成分有200 多种。其主要成分为黄酮苷类和内酯类。这两类成分的含量也已成为 银杏叶标准提取物的质量指标性成分。银杏叶提取物已被临床及药理 实验证明具有一定的改善老年痴呆的症状，也有研究涉及与抑制分泌 酶的活性有关(Colciaghi F.等，A^wra6/o/ogy o/ ofoease， 2004， 16: 454-460),但未见何种成分是P-分泌酶的抑制剂。根据黄酮苷类化合物 的代谢研究，被吸收的成分主要是黄酮醇类成分和及其羧酸类降解成 分。所以我们对标准提取物进行酸水解、柱层析提取了 4个主要的黄
酮醇类成分槲皮素、山奈酚、异鼠李素和5，-羟基槲皮素；标准提取 物直接柱层析制备了银杏内酯A、 B、 C和白果内酯。然后对获得的8 个化合物进行了体外的p-分泌酶抑制活性测试，发现银杏黄酮醇类成 分是强的P-分泌酶抑制剂，进而完成了本发明。

发明内容
本发明目的是提供一种可作为P-分泌酶抑制剂的银杏叶标准提取 物酸水解产物黄酮醇类化合物。
本发明的另 一 目的是提供该p-分泌酶抑制剂的提取方法。
本发明的再一 目的是提供该P-分泌酶抑制剂在制备用于治疗老年 痴呆症药物中的应用。
本发明的再一 目的是提供一种包含该P-分泌酶抑制剂作为活性物 质的药物。
本发明的优点在于本发明所提取的黄酮醇类化合物为一类全新结 构的P-分泌酶抑制剂，与现在已知的P-分泌酶抑制剂相比，它们是来源 于天然产物的水解产物。筛选过程中，发明人发现银杏黄酮醇类化合 显示较好的抑制p-分泌酶的活性。
本发明所述的一类黄酮醇苷元P-分泌酶抑制剂具有如下结构
其中R，、 R2和R3分别独立地为H、 -OH或-OCH:
本发明得到的化合物为具有如下通式结构的四个化合物。经波谱
数据分析证明它们依次为槲皮素，异鼠李素，山奈酚，5-羟基槲皮素
其中，槲皮素R产OH，RfH;
异鼠李素R产OCH3， R2=H;
山奈酚R产R产H;和
5，-羟基槲皮素R产R2-OH。 本发明的化合物的提取方法如下
将银杏叶的标准乙醇提取物先用适量的曱醇溶解，然后加入2%的 H2S04水溶液加热回流1小时，冷却后，减压浓缩得到无醇混合物， 然后用氯仿和水分配，得到氯仿相。氯仿相浓缩后，用少量氯仿甲醇 溶解后上葡聚糖层析柱，用1:1氯仿-甲醇洗脱得到槲皮素、异鼠李素、 山奈酚和5'-羟基槲皮素。虽然银杏黄酮苷种类很多，但它们的苷元基 本上为这4种。通过酸水解后，柱层析非常容易得到它们。
本发明的p-分泌酶抑制剂化合物可用于制备治疗老年痴呆病症的 药物。
上述药物除了包含作为活性物质的本发明的p-分泌酶抑制剂外，还 可以包含如赋形剂等的其他助剂，助剂的选择对本领于技术人员而言 是公知常识的。
附困说明
图1表示p-淀粉样蛋白(A(3)的异常产生和沉积与老年痴呆的关系； 图2为APP的水解途径示意图； 图3为p-分泌酶测活原理示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，^旦不限制本发明。
H-NMR用Varian Mercury AMX300型仪测定；MS用VG ZAB-HS 或VG-7070型仪测定，除注明外均为El源(70ev);产品的纯化除说明 外均使用硅胶(200-300mesh)的柱色谦法；所使用的硅胶，包括200-300 目和GF254为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。
实施例1:四种p-分泌酶抑制剂化合物的提取
将银杏叶2.0kg,用5L乙醇浸泡72h后，过滤掉滤液。滤渣加 5L乙醇在64。C-65。C下回流3次，每次45 min，其中每次回流完，冷 却至室温，滤掉滤液，滤渣加相同体积的乙醇继续回流(这样做是为 了提取更完全)。合并所有的提取液并静置过夜。倾析，抽滤，滤液 浓缩成深褐色稠膏(500mL),分散在2L水中，用石油醚(体积比-l : 1) 萃取4次，萃取液烘干得膏状物。膏状物用200mL95。/。的乙醇溶解， 抽滤除去不溶物，得红棕色滤液，冷藏过夜。再次抽滤除去不溶物,将 滤液减压蒸千。浸膏用适量的曱醇溶解，然后加入2。/。的H2S04水溶液 加热回流l小时，冷却后，减压浓缩得到无醇混合物，然后用氯仿和 水分配，得到氯仿相。氯仿相浓缩后，用少量氯仿甲醇溶解后用葡聚 糖层析柱分离，用1: 1氯仿-甲醇洗脱得到四种化合物，经波语数据分 析证明它们依次为槲皮素，异鼠李素，山奈酚，5，-羟基槲皮素。
它们的波i普数据如下
槲皮素黄色结晶，C15H10O7; Mp 313-314。； UV (EtOH) 4^(1og 258 (4.32)， 375 (4.32) nm; 丽R (CDC13， 300 MHz)(外6.19 (1H, d, J =1.8 Hz， 6邻，6.37 (1H， s, 8-H)， 7.52 (1H， d， 《/= 2.1 Hz， 2，邻，6.89 (1H， d，《/= 8.4 Hz, 5,邻，7.48 (1H， eld,/- 8.4， 1.6 Hz, 6，-H); 13C NMR(CDC13, 75.0 MHz) & 146.9 (C-2), 135.8 (C-3)， 175.9 (C-4)， 156.2 (C-5), 98.3 (C-6)， 164.0 (C曙7)， 93.5 (C-8)， 160.8 (C-9), 103.1 (C-IO)， 122.1 (C-l')， 115.2 (C-2')， 145.1 (C-3'), 147.7 (C-4')， 115.7 (C-5'), 120.1 (C-6')。
山奈酚黄色针晶，C15H10O6; Mp 276-278°; UV (EtOH) lax: 265， 365 nm; 'H画R (CDC13， 300 MHz)(《6.17 (1H, d， /= 1.8 Hz, 6-H)， 6.36 (1H, d, /= 1.5 Hz， 8-H)， 7.92 (2H, d， 《/= 8.7 Hz, 2,-H, 6，-H), 6.89 (2H, d, 9.0 Hz， 3，-H， 5,-H); 13C NMR (CDC13， 75.0 MHz) & 146.1 (C國2), 135.5 (C-3), 175.7 (C-4)， 156.0 (C-5)， 98.2 (C-6)， 163.8 (C-7), 93.4 (C-8)， 160.5 (C-9), 102.9 (C-10), 121,6 (C-l')， 129.3 (C-2), 115.3 (C-3')， 159.0 (C-4'), 115.3 (C-5), 129.3 (C-6')。
异鼠李素黄绿色结晶，C16H1207; Mp 305°; 'H NMR (CDC13, 300 MHz)(外6.18 (1H， d， J= 1.8 Hz， 6-H), 6.39 (1H， d， /= 1.7 Hz， 8-H)， 7.53 (IH， d, /= 2.0 Hz, 2，-H)， 6.87 (1H, d， /= 8.7 Hz, 5, -H)， 7.51 (1H, dd， /= 8.6， 1.8 Hz, 6，-H)， 3.76(3H， s, OCH3); 13C NMR (CDC13， 75.0 MHz) & 146.7 (C-2)， 136.1 (C-3), 175.5 (C-4)， 156.0 (C-5)， 98.5 (C-6)， 163.8 (C-7)， 93.8 (C-8), 161.1 (C-9)， 102,8 (C-10), 121.8(C-1')， 115.5 (C陽2'), 151.3 (C-3')， 147.3 (C-4')， 116.1 (C-5), 118.7 (C-6')， OCH3 (56,1)。
5，-羟基槲皮素亮黄色针晶，C15H10O8; Mp 357-360°; UV (EtOH) >Ux: 255， 375 nm; 'H NMR (CDC13, 300 MHz)(外6.19 (1H， d， 《/ = 2.0 Hz6-H)， 6.37 (1H， d， 1.8 Hz， 8-H), 7.12 (2H， s, 2,-H， 6,-H); "C丽R (CDC13， 75.0 MHz) & 147.1 (C-2), 136.1 (C-3)， 176.0 (C-4)， 161.0 (C-5), 98.5 (C-6)， 164.2 (C-7), 93.5 (C-8)， 156.4 (C-9), 103.3 (C-IO)， 121.2 (C-l'), 107.5 (C-2')， 146.0 (C-3')， 136.1 (C-4'), 146.0 (C-5')， 136.1 (C陽6')。
实施例2: p-分泌酶抑制活性测试
1、 p-分泌酶的克隆
通过PCR (聚合,反应技术)扩增表达P-分泌酶1-454氨基酸 的cDNA序列，然后将扩增序列克隆到昆虫细胞表达栽体pFastBac-l 上，在扩增序列的C末端加上了 6*扭343§便于后来P-分泌酶的进一步 純化，将重组的pFastBacl转化到感受态DH10Bac E.coli细胞中。通过 蓝白斑鉴定出阳性克隆，PCR进一步确证，得到重组杆状病毒DNA，基 因测序最终确认克隆的正确性。
2、 j3-分泌酶的表达纯化
将重组杆状病毒DNA转染到TN昆虫细胞中表达，27t恒温培养 72小时后收集培养基得到重组病毒。将重组病毒与脂质体混合
(MOI=5)感染TN昆虫细胞，27。C恒温培养72小时，收集上清。然 后将收集的上清透析到PBS(pH8.0)溶液中，透析6次，每6小时换 液一次。透析后的上清过Ni-NTA柱层析，收集洗脱液，经SDS-PAGE 电泳检测和Western Blot 4企测确证无误后，大量表达，纯化后并浓缩
(Ultra-15),测定蛋白浓度后，保存于4。C,留待测活。
3、 p-分泌酶的测活及筛药
测试原理如图3所示，测活底物是Rhodamine-EVNLDAEFK -Quencher,当没有光激发时，整个底物处于一种荧光共振能量平衡状
态。加入p-分泌酶以后，底物被酶水解，在535nm的光激发下，在585nm 处荧光基团发射出荧光，通过TECAN(GENios)机器检测。
'歸药标准检测化合物的浓度为100pm时对酶活性的百分抑制率, 抑制活性高于80%时，进一步做一系列浓度梯度，得到对应浓度下对 酶的百分抑制率，从而算出每个化合物的IC50。
银杏提取物中主要成分抑制P-分泌酶活性数据
化合物化学结构ic50,
槲皮素OH 0H 05.2
异鼠李素\〇 0H 014.3
山奈酚OH 04.8
5，-羟基槲皮素OH OH 08.2
p-分泌酶是一种在老年痴呆中起着非常重要作用的酶。近年来对 它的研究也4艮热门。针对该酶设计出来的抑制剂很多，但大多数是分
子量较大的多肽类化合物，小分子抑制剂的报道相对较少。多肽类化 合物虽然在酶的筛选中表现出了很好的活性，但由于其分子量较大， 结构复杂，制备的成本很高，口服生物利用度较差，迄今为止，还没 有一个化合物上市。我们发现的这种黄酮醇类的抑制剂虽然在酶的活 性上不是特别的强，但由于其结构简单，易于制备，为进一步的开发 活性更好的此类小分子抑制剂提供了一个很好的先导化合物。中药银 杏很多文献报道具有抗老年痴呆活性，但长期以来机制不是很明确， 这类黄酮醇类化合物的P-分泌酶抑制活性的发现为阐明其机制提供了 一个思路。
权利要求
1、一类具有如下通式表示的结构的黄酮醇类β-分泌酶抑制剂其中R1、R2和R3分别独立地为H、-OH或-OCH3。
2、如权利要求1所述的黄酮醇类p-分泌酶抑制剂，其可以为以下 的化合物1)槲皮素<formula>formula see original document page 2</formula>2)异鼠李素<formula>formula see original document page 2</formula>3)山奈酚 <formula>formula see original document page 3</formula>
3、 一种提取权利要求1所述黄酮醇类p-分泌酶抑制剂的方法，其 特征在于将银杏叶的标准乙醇提取物用甲醇溶解，然后加入HbS04水溶液 加热回流，冷却后，减压浓缩得到无醇混合物，然后用氯仿和水分配， 得到氯仿相。氯仿相浓缩后，用氯仿曱醇溶解后再用葡聚糖层析柱分 离，用1:1氯仿-曱醇洗脱得到终产物。
4、 如权利要求1或2所述的黄酮醇类P-分泌酶抑制剂在制备治疗 老年痴呆药物中应用。
5、 如权利要求4所述的应用，其中治疗老年痴呆药物包括作为活 性物质的黄酮醇类P-分泌酶抑制剂和助剂。
6、 一种用于治疗老年痴呆症的药物组合物，其特征在于该药物组 合物包括作为活性物质的权利要求1或2中所述的黄酮醇类P-分泌酶 抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一类新型的具有如下通式所示结构的黄酮醇类β-分泌酶抑制剂，其中R₁、R₂、R₃分别独立地为H、-OH或-OCH₃。并且还公开了包含该β-分泌酶抑制剂作为活性成分的药物，该药物可用于治疗老年痴呆症。
文档编号A61K31/352GK101104612SQ20061002882
公开日2008年1月16日 申请日期2006年7月11日 优先权日2006年7月11日
发明者杨正毅, 旭 沈, 胡立宏, 蒋华良, 黎陈静 申请人:中国科学院上海药物研究所