专利名称：一种内皮抑素结合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种血管生成抑制因子结合物及其制备方法，尤其涉及一种内皮抑素结合物及其制备方法，属于生物医药领域。
背景技术：
内皮抑素(Endostatin，ES)，又称作内皮抑制素，是近几年发现的一种内源性新生血管生成抑制因子，它是以抑制肿瘤新生血管形成从而阻断其营养供应为作用机制的新型抗肿瘤药物。由于内皮抑素是对血管内皮细胞有特异作用，对正常组织内的血管不会造成明显的影响，因此，与传统的治疗方法(如化疗、放疗等)相比较具有如不产生抗药性、没有细胞毒性等许多优点。然而，其I期临床试验研究结果表明，内皮抑素应用于人体的有效剂量是每天300mg/m2，此剂量对于一种基因工程药物来说是非常大的，如此大的剂量不但会对人体产生许多副作用，而且患者也难以承受巨额的用药费用，从而成为内皮抑素应用于临床的最大障碍。另外，内皮抑素体内半衰期短、稳定性差等缺点也都有碍于其在临床上的应用。
如果能够通过一定的手段增加内皮抑素的稳定性、延长其体内半衰期以减少给药剂量或延长给药周期，将会大大提高内皮抑素的治疗效果，降低用药费用，促进其在临床上的应用。经检索，利用肝素及其盐类或聚乙二醇及其衍生物修饰内皮抑素制备内皮抑素结合物，以减少给药剂量或延长给药周期，实现提高内皮抑素疗效的研究和应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于克服上述现有内皮抑素存在的对临床应用所不利的缺点，提出一种新的理想的内皮抑素结合物及其制备方法，以解决现有内皮抑素临床应用中所存在的问题。
本发明所述的内皮抑素结合物，由内皮抑素分子上的自由氨基结合肝素及其盐类或聚乙二醇及其衍生物构成，其特征是所述结合肝素及其盐类的内皮抑素分子上的自由氨基的修饰率是1.22％～54.13％；所述结合聚乙二醇及其衍生物的内皮抑素分子上的自由氨基的修饰率是23.78％～76.92％；且一个内皮抑素分子可以结合1～8个肝素及其盐类分子或聚乙二醇及其衍生物分子。
上述的内皮抑素结合物中所述内皮抑素分子的分子量为15000～30000道尔顿。
上述的内皮抑素结合物中所述肝素及其盐类的分子量为500～50000道尔顿。
其中所述肝素及其盐类的分子量优选为1500～30000道尔顿。
其中所述肝素及其盐类优选指肝素钠、肝素钙、低分子肝素钠及低分子肝素钙之一。
上述的内皮抑素结合物中所述聚乙二醇及其衍生物的分子量为400～20000道尔顿。
其中所述聚乙二醇及其衍生物的分子量优选为800～10000道尔顿。
其中所述聚乙二醇的衍生物优选为单甲氧基聚乙二醇。
本发明所述内皮抑素结合物的制备方法，由以下步骤组成(1)将质量百分比浓度为1％～10％的肝素及其盐类与质量百分比浓度为1％～13％的高碘酸钠、溴化氰、氰尿酰氯之一进行活化反应；或者，将聚乙二醇及其衍生物与溴化氰、氰尿酰氯之一进行活化反应；其中选用肝素及其盐类与高碘酸钠进行活化反应时，可使肝素及其盐类与高碘酸钠在pH4.0～7.0，温度0～4℃下，连续搅拌反应5～20小时，并用质量百分比浓度为2％～10％的亚硫酸氢钠溶液滴定至颜色由无色澄清→浑浊状紫红色→最终为无色澄清，得活化的肝素及其盐类溶液，待用；选用聚乙二醇及其衍生物与氰尿酰氯进行活化反应时，可使聚乙二醇及其衍生物与氰尿酰氯以重量比为(5～7)∶1的比例共同加入到无水苯中，常温下搅拌10～16小时，过滤，用无水乙醚沉淀出产物，再用无水苯溶解沉淀，如此反复多次，直至紫外扫描检测无氰尿酰氯吸收止，常规真空干燥，得白色固体粉末状活化的聚乙二醇及其衍生物，待用；(2)将纯化后的内皮抑素用碳酸盐缓冲液溶解，加入上述活化的肝素及其盐类溶液，在pH 8～10、温度0～4℃条件下，缓慢搅拌进行修饰反应，反应10～24小时后，加甘氨酸终止修饰反应，得肝素及其盐类-内皮抑素结合物；其中，上述内皮抑素与活化的肝素及其盐类溶液以mg比mL计，按(14～16)∶1的量反应；或者，将上述活化后的聚乙二醇及其衍生物与纯化后的内皮抑素，按摩尔比(40±2)∶1的比例溶于四硼酸钠缓冲液中，在pH8～10、温度0～4℃条件下，缓慢搅拌进行修饰反应，反应10～24小时后，加甘氨酸终止修饰反应，得聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物；其中，上述内皮抑素以内皮抑素蛋白含量进行摩尔计算；(3)采用凝胶层析法分别对上述肝素及其盐类-内皮抑素结合物或聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物进行分离纯化，再经冷冻干燥，制得肝素及其盐类-内皮抑素结合物或聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物纯品。
上述内皮抑素结合物的制备方法中所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.1～0.3mol/L，优选浓度为0.3mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，所述四硼酸钠缓冲液的浓度为1～10mmol/L，优选浓度为10mmol/L的四硼酸钠缓冲液。
上述内皮抑素结合物的制备方法中所述凝胶层析法优选采用Sephadex G-50或Sephadex G-75柱对肝素及其盐类-内皮抑素结合物或聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物进行分离纯化。
本发明制得的低分子肝素及其盐类-内皮抑素结合物和聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物与天然内皮抑素相比，不仅保留了内皮抑素原有的抑制血管内皮细胞增殖的作用，而且还具有抗原性低、半衰期长、稳定性高等特性，能够更充分发挥其抑制肿瘤生长及其它抗血管生成作用，从而进一步促进了内皮抑素在临床上的应用。
经活性研究证明，修饰后的内皮抑素具有明显的抑制肿瘤生长、抑制血管内皮细胞增殖、抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管和碱烧伤诱导的兔角膜毛细血管增生的作用，且抑制效果明显优于未修饰的内皮抑素。
本发明的低分子肝素及其盐类-内皮抑素结合物和聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物在一定程度上克服了内皮抑素在治疗肿瘤的临床应用中存在的用量过大的问题，并且，还可用于治疗糖尿病视网膜毛细血管增生性疾病。
具体实施例方式
内皮抑素修饰物制备的关键是修饰剂的活化和修饰条件的控制。肝素和聚乙二醇及其衍生物活化的方法有多种，如高碘酸钠活化法、溴化氰活化法、氰脲酰氯活化法等。在此仅举以高碘酸钠、溴化氰活化肝素和氰尿酰氯活化聚乙二醇及其衍生物并进一步制备肝素-内皮抑素结合物和聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物的例子。
实施例1聚乙二醇-内皮抑素结合物的制备(1)聚乙二醇的活化将聚乙二醇(分子量为6000道尔顿)18g、无水碳酸钠2.2g、氰尿酰氯2.75g加入到无水苯75mL中，常温下搅拌过夜，过滤，用无水乙醚沉淀出产物，再用无水苯溶解，如此反复多次，直至紫外扫描检测无氰尿酰氯吸收止，真空干燥，得白色固体粉末，即为活化的聚乙二醇，置于4℃冰箱中密封保存。
(2)活化的聚乙二醇对内皮抑素的修饰将活化后的聚乙二醇与内皮抑素(以内皮抑素蛋白含量计)按摩尔比40∶1溶于pH9.0、10mmol/L的四硼酸钠缓冲液中，4℃缓慢搅拌反应，反应15小时后加一定量的甘氨酸终止修饰反应，得聚乙二醇-内皮抑素结合物。
(3)聚乙二醇-内皮抑素结合物的纯化对修饰反应物(聚乙二醇-内皮抑素结合物)用Sephadex G-50柱对其进行分离纯化，再冷冻干燥，即制得聚乙二醇-内皮抑素结合物纯品。
实施例2单甲氧基聚乙二醇-内皮抑素结合物的制备(1)单甲氧基聚乙二醇的活化单甲氧基聚乙二醇(分子量为5000道尔顿)50g、氰尿酰氯5.5g、无水无水碳酸钠10g、分子筛5A 5g溶于无水苯400mL中，常温下搅拌过夜，离心去除碳酸钠、分子筛5A等悬浮物，用无水乙醚沉淀出产物，再用无水苯400mL溶解。如此反复多次，直至紫外扫描无氰尿酰氯吸收。真空干燥，得白色固体粉末，即为活化的单甲氧基聚乙二醇，置于4℃冰箱中密封保存。
(2)活化的单甲氧基聚乙二醇对内皮抑素的修饰将活化后的单甲氧基聚乙二醇与内皮抑素(以内皮抑素蛋白含量计)按摩尔比40∶1溶于pH9.0、10mmol/L的四硼酸钠缓冲液中，4℃缓慢搅拌反应，反应15小时后加一定量的甘氨酸终止修饰反应，得单甲氧基聚乙二醇-内皮抑素结合物。
(3)单甲氧基聚乙二醇-内皮抑素的纯化对修饰反应物(单甲氧基聚乙二醇-内皮抑素结合物)用Sephadex G-50柱对其进行分离纯化，再冷冻干燥，即制得单甲氧基聚乙二醇-内皮抑素结合物纯品。
实施例3肝素-内皮抑素结合物的制备(1)肝素的活化(高碘酸钠活化法)称取肝素(平均分子量为15000道尔顿)0.3g溶于双蒸水4.5mL中，轻微搅拌下滴加12％的高碘酸钠溶液0.5mL。此时测得溶液的pH值为5.40左右，用0.1mol/L的盐酸调溶液的pH为5.0左右，4℃暗处缓慢搅拌活化20小时。
将活化反应20h的溶液自暗处取出，缓慢搅拌下滴加5％亚硫酸氢钠溶液终止低分子肝素的活化反应，终止反应过程中溶液颜色变化为无色澄清→浑浊状紫红色→无色澄清，然后用2mol/L的碳酸钠溶液调节该溶液的pH为9.0±0.2。
(2)活化的肝素对内皮抑素的修饰称取纯化后的内皮抑素90mg，用pH9.5、0.3mol/L的碳酸盐缓冲液1mL溶解，加入pH 9.0±0.2的活化的肝素溶液6mL，4℃缓慢搅拌反应，反应18小时后，加一定量的甘氨酸终止修饰反应，得肝素-内皮抑素结合物。
在修饰过程中通过不同修饰反应时间的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、不同修饰反应时间自由氨基数变化测定、不同修饰反应时间内皮抑素活性变化测定来监测其修饰反应。
(3)肝素-内皮抑素结合物的纯化对修饰反应物(肝素-内皮抑素结合物)用Sephadex G-50柱对其进行分离纯化，再冷冻干燥，即制得肝素-内皮抑素结合物纯品。
实施例4低分子肝素-内皮抑素结合物的制备(1)低分子肝素的活化(溴化氰活化法)称取低分子肝素(平均分子量为5000道尔顿)4g，溶于预冷的pH9.0、0.1mol/L的碳酸盐缓冲液20mL中，加入溶有溴化氰1.60g冷的同种缓冲液20mL中，冰浴搅拌反应10min，反应期间加4mol/L氢氧化钠保持pH10.4～10.8，将反应液倾入冷丙酮100mL中迅速沉淀，抽滤，用冷丙酮充分洗涤，抽干。收集沉淀于25mL小烧杯加上述缓冲液7～8mL溶解，然后用2mol/L的碳酸钠溶液调节该溶液的pH为9.0±0.2。
(2)活化的低分子肝素对内皮抑素的修饰称取纯化后的内皮抑素90mg，用pH9.5、0.3mol/L的碳酸盐缓冲液1mL溶解，加入pH 9.0±0.2的活化的低分子肝素溶液6mL，4℃缓慢搅拌反应，反应17小时后，加一定量的甘氨酸终止修饰反应，得低分子肝素-内皮抑素结合物。
在修饰过程中通过不同修饰反应时间的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、不同修饰反应时间自由氨基数变化测定、不同修饰反应时间内皮抑素活性变化测定来监测其修饰反应。
(3)低分子肝素-内皮抑素结合物的纯化对修饰反应物(低分子肝素-内皮抑素结合物)用Sephadex G-75柱对其进行分离纯化，再冷冻干燥，即制得低分子肝素-内皮抑素结合物纯品。
权利要求
1.一种内皮抑素结合物，由内皮抑素分子上的自由氨基结合肝素及其盐类或聚乙二醇及其衍生物构成，其特征是所述结合肝素及其盐类的内皮抑素分子上的自由氨基的修饰率是1.22％～54.13％；所述结合聚乙二醇及其衍生物的内皮抑素分子上的自由氨基的修饰率是23.78％～76.92％；且一个内皮抑素分子可以结合1～8个肝素及其盐类分子或聚乙二醇及其衍生物分子。
2.如权利要求1所述的内皮抑素结合物，其特征是所述内皮抑素分子的分子量为15000～30000道尔顿。
3.如权利要求1所述的内皮抑素结合物，其特征是所述肝素及其盐类的分子量为500～50000道尔顿。
4.如权利要求3所述的内皮抑素结合物，其特征是所述肝素及其盐类的分子量为1500～30000道尔顿。
5.如权利要求3或4所述的内皮抑素结合物，其特征是所述肝素及其盐类是指肝素钠、肝素钙、低分子肝素钠及低分子肝素钙之一。
6.如权利要求1所述的内皮抑素结合物，其特征是所述聚乙二醇及其衍生物的分子量为400～20000道尔顿。
7.如权利要求6所述的内皮抑素结合物，其特征是所述聚乙二醇及其衍生物的分子量为800～10000道尔顿。
8.如权利要求6或7所述的内皮抑素结合物，其特征是所述聚乙二醇衍生物为单甲氧基聚乙二醇。
9.权利要求1所述内皮抑素结合物的制备方法，由以下步骤组成(1)将质量百分比浓度为1％～10％的肝素及其盐类与质量百分比浓度为1％～13％的高碘酸钠、溴化氰、氰尿酰氯之一进行活化反应；或者，将聚乙二醇及其衍生物与溴化氰、氰尿酰氯之一进行活化反应；其中选用肝素及其盐类与高碘酸钠进行活化反应时，可使肝素及其盐类与高碘酸钠在pH4.0～7.0，温度0～4℃下，连续搅拌反应5～20小时，并用质量百分比浓度为2％～10％的亚硫酸氢钠溶液滴定至颜色由无色澄清→浑浊状紫红色→最终为无色澄清，得活化的肝素及其盐类溶液，待用；选用聚乙二醇及其衍生物与氰尿酰氯进行活化反应时，可使聚乙二醇及其衍生物与氰尿酰氯以重量比为(5～7)∶1的比例共同加入到无水苯中，常温下搅拌10～16小时，过滤，用无水乙醚沉淀出产物，再用无水苯溶解沉淀，如此反复多次，直至紫外扫描检测无氰尿酰氯吸收止，常规真空干燥，得白色固体粉末状活化的聚乙二醇及其衍生物，待用；(2)将纯化后的内皮抑素用碳酸盐缓冲液溶解，加入上述活化的肝素及其盐类溶液，在pH 8～10、温度0～4℃条件下，缓慢搅拌进行修饰反应，反应10～24小时后，加甘氨酸终止修饰反应，得肝素及其盐类-内皮抑素结合物；其中，上述内皮抑素与活化的肝素及其盐类溶液以mg比mL计，按(14～16)∶1的量反应；或者，将上述活化后的聚乙二醇及其衍生物与纯化后的内皮抑素，按摩尔比(40±2)∶1的比例溶于四硼酸钠缓冲液中，在pH 8～10、温度0～4℃条件下，缓慢搅拌进行修饰反应，反应10～24小时后，加甘氨酸终止修饰反应，得聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物；其中，上述内皮抑素以内皮抑素蛋白含量进行摩尔计算；(3)采用凝胶层析法分别对上述肝素及其盐类-内皮抑素结合物或聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物进行分离纯化，再经冷冻干燥，制得肝素及其盐类-内皮抑素结合物或聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物纯品。
10.如权利要求9所述内皮抑素结合物的制备方法，其特征是所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.1～0.3mol/L；所述四硼酸钠缓冲液的浓度为1～10mmol/L；所述凝胶层析法采用Sephadex G-50或Sephadex G-75柱对肝素及其盐类-内皮抑素结合物或聚乙二醇及其衍生物-内皮抑素结合物进行分离纯化。
全文摘要
本发明公开了一种内皮抑素结合物及其制备方法，由内皮抑素分子上的自由氨基结合肝素及其盐类或聚乙二醇及其衍生物构成，其中所述结合肝素及其盐类的内皮抑素分子上的自由氨基的修饰率是1.22％～54.13％；所述结合聚乙二醇及其衍生物的内皮抑素分子上的自由氨基的修饰率是23.78％～76.92％；且一个内皮抑素分子可以结合1～8个肝素及其盐类分子或聚乙二醇及其衍生物分子。本发明的内皮抑素结合物与天然内皮抑素相比，不仅保留了内皮抑素原有的抑制血管内皮细胞增殖的作用，而且具有抗原性低、半衰期长、稳定性高等特性，能够更充分发挥其抑制肿瘤生长及其它抗血管生成作用，便于其在临床上的应用。
文档编号A61P3/10GK1876186SQ20061004387
公开日2006年12月13日 申请日期2006年4月26日 优先权日2006年4月26日
发明者王凤山, 杨盛林, 王晓燕, 曹吉超, 马春红, 孙汶生, 谭海宁 申请人:山东大学