专利名称：一种应用生物反应器生产人用疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及人用疫苗的生产，公开了应用生物反应器工业化生产人用纯化疫苗的方法。该工艺通过进行狂犬病毒适应的细胞传代扩增培养，应用特定生物反应器和微载体系统进行高密度的细胞培养，应用生物反应器进行高质量病毒连续灌流培养和收获，最后对收获的病毒培养液进行超滤浓缩、病毒灭活，通过柱层析工艺纯化灭活病毒，按照一定的条件稀释并分装成人用狂犬病疫苗。
背景技术：
狂犬病是一种人畜共患的病毒性传染病，人一旦被病畜咬伤发病，病死率为100％，及时注射疫苗及预防性接种是临床上可有效刺激机体产生抗狂犬病病毒抗体，防治狂犬病的唯一有效手段。我国自八十年代初应用地鼠肾细胞狂犬病疫苗，取得了一定的防治效果；1994年卫生部指示改为生产浓缩疫苗，1999年改进为纯化疫苗，但由于使用落后的传统转瓶生产工艺，有效病毒抗原表达含量低，超滤浓缩后杂质含量随抗原的提高而显著增加，最终使疫苗接种者的副反应发生率明显上升。
狂犬病疫苗的生产产量和质量取决于病毒株系、宿主细胞培养密度、以及最终的纯化方式。中国专利公开号为CN1274607A的专利申请，公开了一种使用转瓶工艺生产狂犬病疫苗的方法，病毒株为CTN株；中国专利公开号CN1651080的专利申请，公开了一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒双基因制备狂犬病活载体疫苗的方法；中国专利公开号CN1712068的专利申请，公开了应用二倍体细胞生产狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗，制备冻干及水针剂型，生产工艺为转瓶，病毒株为aG株和CTN株。中国专利公开号CN1616096的专利申请，公开了减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗培养方法，应用发酵罐技术生产脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，其中发酵罐为逐级放大的倒罐式操作。
以上文献资料都有不同程度的涉及狂犬病疫苗的生产工艺方法或应用生物反应器进行其它制品的生产，但是生产过程中手工操作密集，病毒株受限，细胞维持时间短，密度及活性低等问题，限制了产品产量、质量的提高和产生成本的降低，生产疫苗的产量、质量均不能达到很好的标准。但是，将特定的生物反应器技术应用到宿主细胞高密度培养上，并通过接种特定的狂犬病病毒株进行病毒连续培养和收获，用于制备疫苗，均未见报道。
发明内容
据此，本发明提供一种应用生物反应器工业化生产人用纯化疫苗的方法。与其它生产工艺相比，本生产工艺通过应用5-50L生物反应器(Cell-Lift-Bioflow 4500，NBS公司生产)和25g/L高密度微载体技术，改进培养系统的氧传递方式，以及减少剪切力，降低有害代谢废物浓度，大规模连续灌流培养高密度宿主细胞，可达到1.5×107/毫升的细胞密度，收获液病毒滴度达到7-8.5LD50/毫升以上，经连续柱层析纯化后，制备优质人用狂犬病疫苗。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现一种应用生物反应器生产人用疫苗的方法，其为工业化生产人用疫苗病毒原液的方法，采用适合的细胞系和病毒株，于生物反应器中进行连续的细胞培养、病毒感染、病毒连续收获、病毒浓缩灭活、病毒纯化和成品配制分装；1)进行狂犬病毒PV2061病毒株、CTN病毒株或AG病毒株(乙型脑炎病毒株、脊髓灰质炎病毒株)适应VERO细胞或BHK细胞传代扩增培养；2)应用Cell-Lift型生物反应器和Cytodex-1微载体系统进行高密度的细胞培养；3)应用生物反应器按照1∶200-1∶700感染量进行病毒感染；根据测定培养基中葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、谷氨酰胺、耗氧速率以及pH值指标来控制灌流速度，使细胞密度达到1-2×107/ml；4)培养、扩增病毒；连续灌流收获含有病毒的培养液；对收获的病毒培养液进行超滤浓缩和病毒灭活；感染病毒后，改变培养基和培养参数，应用生物反应器连续灌流培养和收获18-25天病毒原液，当细胞密度降低到1.0×106以下，病毒糖蛋白含量降低到0.5IU/ml，停止收获病毒液。
5)通过连续凝胶柱层析工艺纯化灭活病毒；稀释并分装成不含佐剂的液体和冻干人用狂犬病疫苗、灭活乙脑疫苗或灭活脊髓灰质炎疫苗。(对收获的病毒培养液进行超滤浓缩、病毒灭活，通过SepharoseFastFlow柱层析工艺纯化灭活病毒，按照一定的条件，不加佐剂，稀释并分装成液体和冻干人用狂犬病疫苗，采用乙型脑炎病毒株代替狂犬病毒株，生产乙脑疫苗；采用脊髓灰质炎病毒株代替狂犬病毒株，生产脊髓灰质炎疫苗)。
所述应用的Cell-Lift型生物反应器工作体积5L-50L和Cytodex-1微载体系统以连续灌流方式培养细胞，随细胞密度由1×106递增到1.1-1.5×107，培养基的灌流速度由每天0.5个工作体积连续增加到每天4个工作体积。应用病毒感染细胞的比例(MOI)为1∶200-700，病毒培养的温度控制在30-35℃之间，pH调节5-8，溶氧调节10-70％，通过调整培养基灌流速度在每天0.5-2个工作体积，降低血清的浓度至0.5％-0.05％，可提高病毒糖蛋白含量至3-8IU/ml，并进行病毒的连续收获。对收获的狂犬病毒液采用300KD、1000KD、0.1um的超滤膜包中的一种或组合进行超滤浓缩和β-丙内酯(1∶2000至1∶4000范围)灭活；对灭活的病毒采用连续的1-4次Sepharose FF凝胶层析纯化，调节PBS缓冲液pH7-8的条件下，加入1-5％的蔗糖，或以单纯原液保存。
本发明生产人用狂犬病疫苗总蛋白小于80ng/剂，DNA含量小于100pg/剂，效价大于4.5IU/剂。
本发明的优点是首次应用CellLift生物反应器和高密度Cytodex1微载体技术，选择抗原性好的PV2061系狂犬病毒株，对连续灌流式培养的高密度VERO细胞感染，使传统病毒收获期6-9天、5-7LD50/ml提高到收获18-25天、7-8.5LD50/ml，病毒含量提高5-10倍。这种成本低、易于操作的细胞能量代谢转移研究，为实现高密度、高产率的细胞培养优化工艺提供广阔的应用前景。选择0.1um大孔径超滤膜包进行浓缩为首次应用于狂犬病毒纯化中。选择具有低蛋白吸附性的Sepharose FastFlow介质并连续柱层析，在适宜的条件下，病毒抗原回收率大于85％，大大降低了工艺成本。最后制备的液体和冻干疫苗均不含佐剂，在临床应用中，比含有佐剂的疫苗使疫苗接种者产生抗体早，利于预防狂犬病。
图1为VERO细胞贴附生长在高密度Cytodex1微载体上的显微照片；细胞接种2天时微载体上的显微照片，细胞接种5天时微载体上的显微照片；图2为不同密度微载体培养的VERO细胞密度变化图；图3生物反应器灌流培养狂犬病毒滴度与其它工艺的比较图；图4连续凝胶层析纯化后收获的病毒蛋白图谱。
具体实施例方式
实施例1(1)选取适合的细胞系和病毒株病毒株为L-巴斯德PV2061系狂犬病毒株，适合的细胞系为非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)。按照细胞与病毒1∶200的感染量接种非VERO细胞，在一次性转瓶中，用含有1％胎牛血清的标准MEM培养基培养后收获病毒，采用小鼠脑内病毒滴定法测定病毒滴度大于7.0LD50后，表明病毒适应VERO细胞；按照上述方法连续进行细胞感染，病毒传代1-3代，病毒滴度在7.0-8.0LD50/ml内，即完成狂犬病毒适应VERO细胞的传代，可用于构建病毒工作种子。
(2)连续的细胞培养采用转瓶传代扩增VERO细胞，使细胞密度达到1×106/ml以上时，接种到装有浓度为25g/L的Cytodex1微载体的5L生物反应器中，采用含有3-10％牛血清的标准MEM培养基培养7天，培养温度设定为37℃，pH为7.0-7.8可调；溶氧为20-80％，搅拌速度20-100转/分，氧气、空气、二氧化碳、氮气通气量设定0.5-10/SLPM，连接BIOCOMMARD程序控制软件，通过计算机在线监控。细胞接种后按每24小时的时间点取样，根据测定培养基中葡萄糖浓度1-5mg范围、耗氧速率每分钟1-5L、pH值7.0-7.4、细胞密度1-15×106个/ml的指标来控制灌流速度0.5-5个工作体积递增、搅拌速度40-80rpm递增、pH值稳定在7.0-7.4、溶氧稳定在20-50％。灌流速度从0.5个罐体积到4个罐体积随细胞密度调整，最终的细胞密度可达到1-2×107个/ml。
(3)连续收获感染病毒当细胞密度达到1-2×107个/ml后，按照病毒和细胞比例为1∶200到1∶700的感染量向生物反应器中接种狂犬病毒，采用含有1-5％牛血清的标准MEM培养基培养25天，培养温度设定为32-35℃之间，pH为7.3-7.8可调；溶氧为20-80％，搅拌速度20-100转/分，氧气、空气、二氧化碳、通气量设定0.5-5/SLPM，连接BIOCOMMARD程序控制软件，通过计算机在线监控。病毒接种后按每24小时的时间点取样，根据测定培养基中葡萄糖浓度1-5mg范围、耗氧速率每分钟1-5L、pH值7.0-7.4、细胞密度15-1×106个/ml递减、病毒糖蛋白含量8-1IU/ml的递减，来控制灌流速度50-0.5递减、搅拌速度80-40rpm递减、pH值稳定在7.0-7.4、溶氧稳定在20-50％。同时按照每天从2个罐体积到0.5个罐体积进行病毒液连续收获，随细胞密度调整，最终细胞密度降到1×106个/ml以下，检测样品中病毒糖蛋白含量小于0.5IU/ml后，停止收获病毒液。病毒滴度在LD507-8.5/ml之间。
(4)病毒浓缩灭活收获病毒液采用0.45-1.0um滤芯澄清，再用300KD-0.1um超滤膜包浓缩15到30倍，而后加入浓度为1∶4000的β-丙内酯在4℃下灭活病毒24-48小时，将灭活后的病毒置于37℃水浴中彻底降解β-丙内酯。
(5)病毒纯化采用AKTA-PILOT设备，对病毒连续多次进行凝胶层析，采用吸附效率较低的Sepharose FastFlow凝胶填料，PBS-蔗糖缓冲液(pH7.2-8.0可调)。采用连续柱层析的纯化方法，使病毒连续1-4次通过体积为40L，高度为60cm的凝胶柱，层析结果为病毒抗原回收率达到85％以上，而杂蛋白去除率达到99.5％，残余DNA含量小于100pg/ml。
(6)成品配制分装纯化的灭活狂犬病毒，加入1-4％人血白蛋白进行保护，以柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液为稀释剂，不添加任何佐剂，制备液体疫苗成品；纯化的灭活狂犬病毒，加入1-4％人血白蛋白进行保护，再加入2-5％右旋糖苷，经冻干后可制成冻干粉针疫苗。
权利要求
1.一种应用生物反应器生产人用疫苗的方法，其为工业化生产人用疫苗病毒原液的方法，采用适合的细胞系和病毒株，于生物反应器中进行连续的细胞培养、病毒感染、病毒连续收获、病毒浓缩灭活、病毒纯化和成品配制分装；其特征在于1)进行狂犬病毒PV2061病毒株、CTN病毒株或AG病毒株适应VERO细胞或BHK细胞传代扩增培养；2)应用Cell-Lift型生物反应器和Cytodex-1微载体系统进行高密度的细胞培养；3)应用生物反应器按照1∶200-1∶700感染量进行病毒感染；4)培养、扩增病毒；5)连续灌流收获含有病毒的培养液；6)对收获的病毒培养液进行超滤浓缩和病毒灭活；7)通过连续凝胶柱层析工艺纯化灭活病毒；8)稀释并分装成不含佐剂的液体和冻干人用狂犬病疫苗、灭活乙脑疫苗或灭活脊髓灰质炎疫苗。
2.根据权利要求1所述应用生物反应器生产人用疫苗的方法，其特征在于所述应用的Cell-Lift型生物反应器工作体积5L-50L和Cytodex-1微载体系统以连续灌流方式培养细胞，随细胞密度由1×106递增到1.1-1.5×107，培养基的灌流速度由每天0.5个工作体积连续增加到每天4个工作体积。
3.根据权利要求1所述应用生物反应器生产人用疫苗的方法，其特征在于应用病毒感染细胞的比例(MOI)为1∶200-700，病毒培养的温度控制在30-35℃之间，pH调节5-8，溶氧调节10-70％，通过调整培养基灌流速度在每天0.5-2个工作体积，降低血清的浓度至0.5％-0.05％，可提高病毒糖蛋白含量至3-8IU/ml，并进行病毒的连续收获。
4.根据权利要求1所述应用生物反应器生产人用疫苗的方法，其特征在于是对收获的狂犬病毒液采用300KD、1000KD、0.1um的超滤膜包中的一种或组合进行超滤浓缩和β-丙内酯灭活。
5.根据权利要求1所述应用生物反应器生产人用疫苗的方法，其特征在于对灭活的病毒采用连续的1-4次Sepharose FF凝胶层析纯化，调节PBS缓冲液pH7-8的条件下，加入1-5％的蔗糖，或以单纯原液保存。
全文摘要
一种应用生物反应器生产人用疫苗的方法(1)进行病毒适应的细胞传代扩增培养，(2)应用特定生物反应器和微载体系统进行高密度的细胞培养，(3)应用生物反应器进行病毒感染，(4)特定的条件培养、扩增病毒，(5)连续收获含有病毒的培养液，(6)对收获的病毒培养液进行超滤浓缩和病毒灭活，(7)通过连续柱层析工艺纯化灭活病毒，(8)按照一定的条件稀释并分装成人用疫苗。
文档编号A61K39/13GK101028514SQ200610047088
公开日2007年9月5日 申请日期2006年6月30日 优先权日2006年6月30日
发明者杨旭, 高军, 袁德明, 白珠穆, 李旭, 杨俊伟, 侯剑英, 李庆岸 申请人:辽宁成大生物股份有限公司