专利名称：：由植物物种制备葡糖胺的制作方法由植物物种制备葡糖胺本发明涉及制备葡糖胺含量等于或大于植物干物质的0.5%(wt)的粗制植物材料的方法。
背景技术：
：葡糖胺的用途在专利以及科学文献中广泛描述了纯葡糖胺在关节病治疗中的应用，其中所述纯葡糖胺通常与来自各种天然来源的其他化合物或提取物组合。纯葡糖胺作为葡糖胺盐酸盐或葡糖胺>5克酸盐加入，并来自有壳的水生动物水解。例如，WO2000/0074696描述了"herbalcompositionscomprisingglucosamineandTrypterygiumwilfordii，Ligustrumlucidumand/orErycibeschmidtii，fortreatinginflammationordegenerationofjointtissues,e.g.arthritis(用于治疗关节组织的炎症或退化的草本组合物，所述草本组合物包含葡糖胺和雷公藤、女贞和/或丁公藤的草本组合物)，，，其中将纯葡糖胺与植物制品混合。其他专利涉及作为饮食补充剂的植物糖类组合物(EP1172041或EP923382),其中葡糖胺源自壳多糖，即也来自有壳的水生动物水解。过去十年间已经深入研究了葡糖胺作为抗骨关节炎药的应用。葡糖胺被怀疑是针对关节病，例如骨关节炎的唯一活性化合物(仅仅到最近，才发现症状疗法，例如非类固醇抗炎药是有效的)。还已经表明葡糖胺通过抑制MMP(基质金属蛋白酶)，例如MMPl、MMP3和MMP13的生成来防止软骨退化。有趣地，葡糖胺也与皮肤的老化过程有关，其主要以所述皮肤弹性的连续丧失和滋润度的丧失为特征。皮肤老化体现为主结构改变和组成变化。最明显地，老化的皮肤与年轻皮肤相比具有较少胶原和葡糖胺基聚糖。皮肤产生的葡糖胺基聚糖分子包括透明质酸(聚d-葡糖醛酸-d-乙酰基-d-葡糖胺)、琉酸软骨素和硫酸皮肤素。皮肤细胞随剥落产生更大量的透明质酸。透明质酸具有大的水合能力。抑制MMP-1关系到多聚糖/胶原降解的抑制，并因此关系到皮肤老化MMP-1可以由紫外线豫导并被认为是皮肤老化的标志。在US2002/119107中，该发明基于MMP-1的选择性抑制，其要求保护用于保护人类皮肤避免胶原降解的局部组合物。US2004/037卯1要求保护抑制皮肤老化效应的负面迹象的方案，其包括抑制金属蛋白酶表达的来自迷迭香植物的提取物。已经表明葡糖胺显著改善了皮肤的干燥和剥落。葡糖胺提高皮肤的含湿量并改善光滑度。这些发现表明，葡糖胺的长期才聂取有效改善皮肤的含湿量和光滑度。已经表明，含有葡糖胺的口服补充剂在摄取该补充剂的女性组中造成可见皱紋数(34%)和细紋数(34%)的降低。含有葡糖胺、矿物质和各种抗氧化剂化合物的口服补充剂的使用可以改善可见铍紋和细紋的外观。US6413525描述了对皮肤充分去角质的方法。特别地，该发明涉及含有N-乙酰基葡糖胺形式的氨基糖的局部施用组合物在去角质后暴露出年轻皮肤细胞后，它们产生更大量的透明质酸，其是由交替重复的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺分子的链构成的葡糖胺基聚糖。已知N-乙酰基-D-葡糖胺是活细胞透明质酸生成中的速率限制性因素。葡糖胺的局部施用有助于透明质酸的持续生成。例如在JP59013708(软化和滋润皮肤)或美国专利No.5866142(用于皮肤去角质的组合物)中也公开了含有N-乙酰基-D-葡糖胺的其他局部施用《且合物。葡糖胺的来源葡糖胺——2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是果糖的天然形成衍生物并且是糖蛋白和蛋白多糖(许多真核蛋白的重要成分)的基本组分。这是粘多糖和壳多糖的基本组分。葡糖胺基聚糖(粘多糖)掺入结締组织、皮肤、腱、韧带和软骨中的大络合物。葡糖胺的工业来源工业葡糖胺是由来自有壳的水生动物的壳多糖(源自N-乙酰基-D-葡糖胺的复合糖)的酸性水解获得的纯化合物。例如，美国专利6486307描述了壳多糖酸性水解的改进方法通过将壳多糖研磨至极细尺寸并用浓盐酸将其煮解来由壳多糖制备葡糖胺盐酸盐的方法。葡糖胺也可以由有壳的水生动物的酶促水解制成。例如，美国专利5998173描述了利用酶的全体壳多糖酶家族，水解甲壳类贝壳的壳多糖以由壳多糖直接制备N-乙酰基-D-葡糖胺的新方法。也已经提交了保护微生物发酵法的专利，其中培育的微生物生物合成葡糖胺。例如，US6372457描述了使用遗传修饰的微生物通过发酵制备葡糖胺的方法和材料。所有这些方法都涉及与有壳的水生动物提取物竟争的纯的提取的葡糖胺的制备。在WO2005/053710中，已经发现，葡糖胺可以由数种粗制植物材料遵循特殊干燥方法形成，因此获得每千克干重150至1000毫克的葡糖胺含量。发明概述在第一方面中，本发明描迷了通过在收获植物材料后和在加热过程之前或之中加入葡糖胺前体来从植物中获得葡糖胺，从而获得葡糖胺含量高于干物质0.5%(5克/千克干重)的植物原材料的新方法。本发明因此能够在植物材料中实现比现有技术之前描述的(例如WO2005/053710反映的)高得多的葡糖胺含量。因此达到文献中所述的葡糖胺活性剂量需要更少的粗制植物材料或植物提取物。因此，该方法在工业规模下更合用。可以在获取新鲜或预先干燥的植物材料或在衍生的植物提取物后,在植物材料或衍生的植物提取物的加热过程中，或在由植物材料制备含水提取物的过程中，加入上述前体。发明详述在本说明书中，词语"加热"(和f汴生词"加热过的")必须理解为在70-110。C加热超过10小时，优选少于l周的加热法。这种加热法可以描迷为干燥法。该加热法也可以包括在相同温度和时间条件下发生的液体浸渍，以代替千燥法。在本说明书中，"游离葡糖胺"必须理解为是非聚合葡糖胺。在本说明书中，"大量葡糖胺"必须理解为葡糖胺的量高于葡糖胺痕量，大于相应新鲜(未干燥)材料中的量并高于文献或专利中所述的任何含量。其应该理解为葡糖胺以高于5克/千克植物原材料干物质，优选高于20克/每千克植物原材料干物质，最优选高于40克/千克植物原材料干物质的量存在。在本说明书中，"植物"和"植物材料，，被认为是同义词。"植物"、"植物材料"或"植物提取物"必须理解为是能够根据本发明的加热方法生成葡糖胺的任何植物材料，和任何类型的植物提取物，其由能够根据本发明的加热方法生成葡糖胺的所述植物材料，通过本领域技术人员已知的任何提取程序获得。例如，包含一定量的葡糖胺的植物可以是经过本发明的方法的干燥或复水植物材料。包含一定量的葡糖胺的植物提取物可以是从经过本发明的方法的所述植物提取的水溶液。对于本发明的第一个目的，根据本发明加工植物或植物提取物以含有大量的天然游离葡糖胺。在优选实施方案中，植物或植物提取物来自植物的任何部分，例如叶子、块茎、果实、种子、根、谷粒(grain)或细胞培养物。在植物原材料的受控加热过程后，植物或植物提取物可以根据植物或新鲜植物的来源，是叶子、根和/或果实的干燥的冻干提取物或富含葡糖胺的馏分形式。根据其通过本发明的方法生成游离葡糖胺的能力选择植物或植物提取物；特别地，其可以选自含有蔗糖、果糖或菊粉的植物物种，例如菊苣属(Cichorium)、胡萝卜属(Daucus)、向曰葵属(Helianthus)、甜菜属(Beta)。在最优选的实施方案中，植物材料或植物提取物可以例如来自菊苣(菊苣(Cichoriumintybus)根、胡萝卜(胡萝卜(Daucuscarota)、菊芋(Helianthustuberosum)块茎、甜菜(甜菜(BetaVulgais)根。在一个实施方案中，新鲜植物材料或植物材料可以首先完全或部分干燥，然后复水，在这两个步骤后可以根据该新发明加工以获得具有高葡糖胺含量的植物材料。在优选实施方案中，使用新鲜植物材料。如WO2005/053710中所公开，所述干燥方法是在植物中获得大量葡糖胺的一种方式使用WO2005/053710中所述的干燥方法，可以获得每千克菊苣根干物质大约500毫克，每千克胡萝卜根干物质100毫克，或每千克菊芋块茎或甜菜根干物质50毫克的含量。根据植物物种和植物器官，使用液体浸渍或干燥方法在低于110°C,优选70至110°C，最优选70至91'C或更低温度下加热新鲜或干燥或复水的植物原材料超过IO小时，优选少于l周，优选10至120小时，例如12至50小时。如果温度和/或加热时间太低和/或太短，葡糖胺的生成不有效或非常低，这产生经济上不可行的方法。相反，如果温度和/或加热时间太高和/或太长，会生成葡糖胺，但随后逐渐降解。因此，选择温度和时间以获得经过加热方法的每千克相应植物材料干物质至少5克葡糖胺的葡糖胺含量。最优选的例子包括在烘箱中以85X:干燥48至72小时。根据本发明，使用相同方法，但差别在于植物材料或植物提取物首先与葡糖胺前体接触。结果在于，葡糖胺的所得量比WO2005/053710中高得多。实际上，根据本发明，植物的葡糖胺含量高于10克/千克菊苣^1干物质，高于15克/千克胡萝卜根或甜菜根干物质。根据本发明使用的葡糖胺的前体是使糖-氮化合物缩合能够发生的化合物，所述糖-氮化合物缩合是形成葡糖胺所需的。它们优选由铵盐组成。这类铵盐的例子是硝酸铵、硫酸铵、乙酸铵、二氩磷酸铵或谷氨酰胺等。葡糖胺的优选前体是硫酸铵和硝酸铵，它们已经在本发明的方法中表现出令人惊讶的好结果。在优选实施方案中，在加热过程前不久在新鲜收获的材料上加入前体。本领域技术人员会知道如何选定植物材料或植物提取物上的葡糖胺前体的量，但是在最优选实施方案中，疏酸铵的最终量为植物原材料新鲜重量的1至8%,优选4%。在最优选实施方案中，在植物材料或植物提取物中加入作为通过喷涂或通过浸泡施加的溶液的葡糖胺前体。例如，在5至30分钟喷涂200毫升水溶液(4M)或在相同溶液中浸泡数分钟至数小时。这些例子不视为以任何方式限制本发明。也就是说，本领域技术人员会认识到该例子中的许多变动以覆盖宽范围的加工和混合物，从而针对各种应用合理调整本发明的化合物的天然产量。对于导致葡糖胺生成的最终方法，在WO2005/053710中描述了在不加入前体的情况下制备植物材料的合适方法收获植物材料，切割并根据植物物种和植物器官在烘箱中或在工业干燥器中在低于IIO'C，优选80至105°C，最优选9rC或更低的温度下干燥超过10小时，并优选少于l周，优选10至120小时，例如12至50小时尽管不希望受制于理论，我们相信，优选将植物材料例如切成薄片或方块，优选具有5毫米的最大宽度。本发明人确实相信，这对于本发明是重要的以实现最佳热力学交换。收获之后，在加热过程之前或之中，葡糖胺前体的加入能够明显提高上述反应，从没有前体时的数百毫克葡糖胺/千克干重到至少5克葡糖胺/千克相应植物材料干物质。本发明的方法直接产生游离形式的葡糖胺。不希望受制于理论，相信通过所述方法制成的至少一半的葡糖胺祐L认为是游离形式的，甚至生成的几乎所有葡糖胺都是游离形式。实际上，根据本发明的方法，相信至少50%,至少70%,甚至至少90%的葡糖胺被认为以游离形式生成。这是本发明与用于制备葡糖胺的已知技术相比的另一优点，在已知技术中，水解步骤是强制性的以从络合物分子，例如壳多糖、糖蛋白或蛋白多糖中释放出游离葡糖胺。在加热处理之前用硫酸铵预提取原材料产生更富含葡糖胺的提取物(实施例8)。可以首先从植物材料中单独或与其他化合物，例如菊粉或低聚果糖(FOS)结合提取葡糖胺。实施例下列实施例是落在本发明范围内的一些产品及其制备方法的举例说明。它们不被视为以任何方式限制本发明。可以对本发明进行修改和变动。也就是说，本领域技术人员会认识到这些实施例中的许多变化以覆盖宽范围的配方、成分、加工和混合物以针对各种应用合理调节本发明化合物的天然产量。实施例1:新鲜糖甜菜干燥在收获之后，将200克(新鲜重量)甜菜(甜菜(5e似vw/gflr&))根切成lxixi厘米的方块。在方块的所有表面上喷涂25毫升硫酸铵(NBU)2S04溶液，4M(Prolabo目录号21332.293)，然后将方块在烘箱中以91匸千燥56小时。分析葡糖胺的提取用20毫升水在室温下提取2克研磨和专门干燥的甜菜根1分钟。将该溶液在过滤器Schleicher&Schultz(n。597)上过滤，或离心。使用阳离子交换柱(OasiscartridgeWATERS,MCX型，目录号186000776)进行溶液的提纯步骤。将捕获在基质上的碱性化合物用MeOH/NH4OH2%(v/v)洗脱。在过滤之后，使用等分试样直接注射在LC系统(DIONEX)上。分离使用离子交换PA1柱(4*250毫米)以及DIONEXDX500装置，用HPAE/PED系统进行分析。程序洗脱(％)<table><row><column>时间(分钟)</column><column>H20</column><column>0.1MNaOH</column><column>0.25NaOH</column><column>评述</column></row><row><column>0</column><column>85</column><column>15</column><column>0</column><column>平衡</column></row><row><column>60</column><column>85</column><column>15</column><column>0</column></row><row><column>60.1</column><column>0</column><column>0</column><column>100</column><column>洗涤</column></row><row><column>70</column><column>0</column><column>0</column><column>100</column></row><row><column>70.1</column><column>85</column><column>15</column><column>0</column><column>平衡</column></row><row><column>90</column><column>85</column><column>15</column><column>0</column></row><table>流速l毫升/分钟。注射体积20微升。标准来自Sigma的葡糖胺(目录号G4875)在这些条件下，葡糖胺具有大约11分钟的保持时间并容易检测以在适当加工的甜菜提取物中进一步量化。在本实施例中通过该方法定量16克/千克干重的浓度，而非无前体时的小于300毫克/千克，和无加热过程时的小于l毫克/千克。葡糖胺存在的确认为了确认甜莱植物提取物中葡糖胺的存在，已经评测了三种不同的量化技术。薄层色镨法(TLC)在HPTLC(高效薄层色镨法)硅胶板(Merck，目录号1.05642)上用乙酸乙酯/MeOH/水(50/50/10;V/V/V)作为洗脱剂，分析纯葡糖胺和植物提取物。在洗脱后，用含有酮1%茚三酮的乙酸溶液喷涂该板，并在120℃加热10分钟。对于参照物和提取物，在相同速率系数(Rf)下，显示出一个粉色/蓝色的点。℃化学降解在茚三酮的存在下，用葡糖胺进行氧化脱氨作用，这导致释放出容易通过常规糖LC分析检出的阿拉伯糖。明确证实对照和菊苣提取物中阿拉伯糖的存在。℃葡糖胺的衍化(derivatization)℃如Zhongming等人所述"Determinationofnutraceuticals，glucosaminehydrochlorideinrawmaterials,dosageformandplasmausingpre-columnderivationwithUVHPLC.InJ.ofPharmaceut.andBiomed.Analysis,1999(20)，807-814"，对纯化合物和植物提取物使用反相色谱法，其使用用异硫氰酸苯酯和紫外线检测U-254纳米)的预置柱衍化。在菊苣提取物中检测衍化的葡糖胺以及纯化合物的相应峰。质谱分析通过电喷雾质谦法以正电离模式分析植物提取物以证实葡糖胺的存在。质镨仪是飞行时间仪器(来自Micromass的具有Z-喷雾界面的LCT)。标准葡糖胺在m/z180.0887下产生离子。在受分析的植物提取物中找到这种离子片段。实施例2:新鲜胡萝卜(胡萝卜(Daucuscarota))根将200克(新鲜重量)胡萝卜根切成lxlxl厘米方块，然后喷涂实施例1中的硫酸铵溶液。然后将方块在烘箱中以9rC干燥37小时。如实施例1中那样进行提取和分析，从而产生15克/千克干重的葡糖胺浓度，而非无前体时小于190毫克/千克干重和无加热过程时小于1毫克/千克。实施例3:新鲜菊苣(菊苣(CicAoWwwi/wO^附))根将200克(新鲜重量)菊苣根切成0.5x0.5x0.5厘米方块。将方块在硫酸铵溶液(4M)中浸泡30分钟，或喷涂硫酸铵溶液，或将方块在85C下与硫酸铵溶液混合8小时。然后将方块在烘箱中以91'C干燥40小时。如实施例1中那样进行提取和分析，从而产生43克/千克干重的葡糖胺浓度，而非无前体时小于900毫克/千克干重和无加热过程时或在商业干燥菊苣根中小于10毫克/千克。实施例4:干燥菊苣根将新鲜菊苣根切成方块(lxlxl厘米)，使用现有程序(在流化床干燥器中，入口空气115。C，2小时)干燥，然后储存在室温下。当需要葡糖胺生成时，将干燥的方块在硫酸钠溶液(4M)中浸泡l小时，将方块复水并引入前体。然后将方块在烘箱中以85。C下干燥43小时。如实施例1中那样进行提取和分析，从而产生11克/千克干重的葡糖胺浓度，而非无前体时小于190毫克/千克干重和无加热过程时小于1毫克/千克。因此可以将本发明用于在千燥形式下经过长期储存的植物材料。实施例5:干燥粉末菊苣根将1.5克干燥粉末在Erlenmeyer烧瓶中用100毫升硫酸铵(3M)悬浮，剧烈振荡并在80'C温育30分钟。然后将该溶液在烘箱中以85'C干燥50小时。如实施例1中那样进行提取和分析，从而产生110克/千克干重的葡糖胺浓度。这是因此可以将本发明用于在干燥形式下经过长期储存的植物材料的另一例子。实施例6:完整干燥菊苣根将新鲜收获的10个完整菊苣根在环境温度下储存三天。然后将整个根浸泡在石克酸铵溶液(4M)中24小时。然后将该根切成0.5x0.5x0.5厘米的方块，然后如实施例3中那样加工(干燥)，从而产生44克/千克干重的葡糖胺浓度。实施例7:在液体介质中处理的新鲜菊苣根方块将100克新鲜菊苣根切成方块(0.5x0.5x0.5厘米)，用200毫升硫酸铵(4M)悬浮在开放或用纤维素塞子塞住的Erlenmeyer烧瓶中并剧烈振荡。然后将溶液在烘箱中以85℃加热60小时。如实施例1中那样进行提取和分析，从而产生30克/千克新鲜重量的葡糖胺浓度。因此还可以在湿加热条件下应用本发明。实施例8:富含葡糖胺的提取物将100克新鲜菊苣才艮切成方块(0.5x0.5x0.5厘米)，用200毫升硫酸铵(4M)悬浮在Erlenmeyer烧瓶中并剧烈振荡。然后过滤溶液并将所得洗脱物在烘箱中以85℃干燥60小时。如实施例1中那样进行提取和分析，从而产生100克/千克干重的葡糖胺浓度。权利要求1.由植物产生葡糖胺的方法，其中将新鲜植物材料、复水的干燥植物材料或植物提取物在70至110℃之间的温度加热超过10小时，其特征在于向所述植物材料、复水植物材料或植物提取物加入葡糖胺前体。2.根据权利要求1的方法，其中葡糖胺前体是使糖-氮化合物缩合能够发生的化合物，所糖-氮化合物缩合是形成葡糖胺所需的，并且优选是铵盐。3.根据权利要求1或2的方法，其中在加热步骤之前加入葡糖胺前体。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中加入葡糖胺前体，或在加热步骤中也加入葡糖胺前体。5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中植物物种属于菊苣属、胡萝卜属、向日葵属或甜菜属。6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中植物是菊苣(Cichoriumintybus)、古月萝卜(Daucuscarota)、菊宇(Helianthustuberosum)和/或甜菜(Betavulgaris)。7.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中植物或植物提取物包含至少5克葡糖胺/千克植物材料干重，优选高于20克/千克干物质，并且最优选高于40克/千克干物质。8.植物或植物提取物，其包含至少5克葡糖胺/千克植物材料(干重)，更优选至少15克/千克植物材料(干重)。9.根据权利要求8的植物或植物提取物，其中至少部分葡糖胺是游离形式，优选至少一半葡糖胺是游离形式。10.根据权利要求8或权利要求9的植物或植物提取物，其中植物属于菊苣属、胡萝卜属、向日葵属或甜菜属。全文摘要本发明涉及由植物产生葡糖胺的方法，其中新鲜植物材料、复水的干燥植物材料或植物提取物在70至110℃加热超过10小时，其特征在于在所述植物材料、复水植物材料或植物提取物中加入葡糖胺前体。文档编号A61K31/7008GK101175502SQ200680016575公开日2008年5月7日申请日期2006年5月12日优先权日2005年5月13日发明者D·库尔图瓦,E·古卢瓦,S·米肖申请人:雀巢技术公司