具有免疫调节活性的化合物的制作方法

专利名称：具有免疫调节活性的化合物的制作方法
具有免疫调节活性的化合物本发明涉及化合物治疗由细胞因子包括但不限于与NFkB活动 过强相关或不相关的肿瘤坏死因子(TNF)ou白介素(IL)lf3、 IL-10介 导的自身免疫疾病、'隄性炎症、免疫介导的疾病、病理性病症和可 经抑制细胞因子包括但不限于TNF-a、 TNF-(3、 IL-1(3和IL-10和/或 NFkB激活治疗或緩解的病理性病症的用途。发明背景对涉及自身免疫疾病、慢性炎症或其它免疫诱发的疾病的发作 的免疫致病途径的更好的了解，使得可确定细胞因子，例如，TNF-a、 TNF-p、 IL-ip、 IL-12、 IL-18和IFN-y在T-细胞诱发的自身免疫疾病中所起的关键:作用。尤其是，在类风湿性关节炎的发病机理中，预见到TKF-a的关键致病作用的实验证据已经作为特定的抑制剂被成 功地转化到临床阶段，即中和性单克隆抗体[英夫利昔单抗，Humana] 和TNF受体融合蛋白[Embrel]目前神支批准用于治疗RA患者。双盲临床研究已经证明，TNF的中和作用可完全消除初期的炎 症。与消炎的乙酰水杨酸相比，特定的TNF-a抑制剂可预防炎症。 首先，治疗患有晚期疾病的患者。 一旦药物治疗取得非常有益的成 功，医师就开始治疗早期疾病的患者。目前，正用抗-TNFoc药物治疗 其它自身免疫疾病，包括克罗恩氏病和银屑病。然而，特j定TNF-抑 制剂的制备是复杂和昂贵的。而且，抗-TNF抑制剂只能胃肠外给药， 且它们的长期使用可能涉及发展成肺结核的较大风险。为发现抑制内生TNF和可能的其它细胞因子，包括IFN卞IL-1、 IL-12、 IL-18或其它细胞因子的合成和/或作用的可口服小化合物，特异性TNF-抑制剂对类风湿性关节炎、克罗恩氏病和银屑病的有益 作用的示范已经产生效果。自身免疫疾病是免疫诱发的疾病，可根据被进攻的器官，根椐 被自身抗体或T-细胞诱发的进攻机理和往往被细胞因子介导的慢性 炎症过程的发展对其定义。累积的证据表明，自身免疫现象是动脉 粥样硬化、精神病学疾病精神分裂症、癫痫症、壳发、消化性溃疡 病和其它疾病的重要致病原因。自身免疫疾病可影响一切器官或组织。有影响神经系统的自身 免疫疾病，例如，多发性硬化。这种严重的疾病损坏大脑并导致麻 痹。影响神经系统的其它自身免疫疾病有重症肌无力和格-巴二氏综 合征。重症肌无力这种病的特征在于肌肉极其虚弱，其中从神经向 肌肉传送电脉冲的受体被坏。没有传送，就没有肌肉收缩，并因而 发展成肌肉虚弱。在感染或接种后，可能发生格-巴二氏综合征。有影响关节的的自身免疫疾病，例如，狼疮和导致关节畸形的 类风湿性关节炎。最终，有损坏心脏、肾和肺的自身免疫疾病。发明简述已经公开作为磷酸二酯酶型IV的抑制剂(US 5716967)、纤维蛋 白原受体拮抗剂(US 5849736)、 TNF释放抑制剂(US 6114367)和作为 巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)拮抗剂(WO 02A00332)的异嗨唑啉化合 物。目前已经发现，不同于US 5716967、US 5849736和WO 02/100332 中所公开的那些在苯环的对位无羟基或烷氧基的式I化合物抑制IL-1 p 、 TNF-a和IL-10合成和预防NFkB激活。在式I中，IV5表示独立选自氢、硝基、氰基、C,-CV烷基、卣素、羧基、氨基、三氟代曱基、羟基、C广CV烷氧基的l-5个取代基， X是氢、卣代基、N3、 SH、 =0、 =CH2、任选被上述R^基团取 代的芳环(优选苯环)、氨基、单或双取代的氨基，其中取代基选自任 选被上述Rw基团取代的CVQ烷基、苯基或千基；Y是氢、烷基CVQp氨基或式-(CH2)^A的基团，其中A是任 选被上述Rw基团取代的芳环(优选苯环)；前提是，当X和Y是氢时，Rl5不能表示4-羟基或4-烷氧基。 某些式I化合物为已知的或可经已知方法制备。Synth. Comm., 1998, 28(13), 2457-2466和Synth. Comm., 1997, 27(16), 2733-2742已 经报导其中R和R'二者为氢和4,5-二氢异嘿唑啉环系统的化合物。因此，在本文献中所描述的发明涉及式I化合物在治疗可^f皮与 失调的活化NFkB有关或无关的TNFa、 TNF-p、 IL-lp和/或IL-10的 抑制所緩解的那些疾病的药物制备中的用途。优选的式I化合物是3-苯基-4,5-二氬-5-异嗯唑乙酸(下文称为GIT27)和3-苯基-5-异嚼唑乙 酸和它们的药学上可接受的盐，例如，钠、钾、钩盐等。特别优选 GIT27。本发明化合物特别用于治疗经与NFkB活化相关或无关的 TNFa、 TNF-P、 IL-ip和/或IL-10所介导的人疾病。所述疾病包括免 疫性炎症、自体免疫和感染性疾病包括类风湿性关节炎、克罗恩氏 病、银屑病和炎性皮肤病、l型糖尿病、HIV感染、癌症、缺血-再损伤、肝炎、多发性硬化、格-巴二氏综合征和急性移植物排斥的预防。因此，本发明还涉及药用组合物，它含有作为与适用载体或溶 媒混合的活性成分的式I化合物。发明详述已经在体外和体内广泛研究GIT-27的药理学活性。更具体地， 已经根据已知和充分确定的方法，进行下列实验-淋巴网状细胞增生、TNF-oc、干扰素(IFN)-y、 IL-1(3、 IL-10和 MIF合成/分泌；-人巨噬细胞中的NF-kB活化；-LPS诱发的小鼠致死率；-角叉菜胶诱发的小鼠胸膜炎；-II型胶原诱发的小鼠关节炎；-嚼唑酮-诱发的小鼠过敏；-经多种低剂量链脲霉素诱发的小鼠免疫炎性糖尿病；-化学诱发的小鼠结肠炎；下文总结进行这些上列实验所得的结果。GIT27对淋巴细胞的增殖和对通过巨噬细胞和淋巴细胞的 TNF、 IFN-y、 IL-10和MIF合成和分泌的体外作用自正常小鼠分离腹膜的巨噬细胞(PM)和脾的单核细胞(SMNC), 于营养培养基中培养并在无或有GIT27的情况下分别用LPS和/或 ConA刺激。结果明确表明，GIT27通过PM和SMNC显著抑制TNFcc 的生成，并通过PM抑制IL-ip、 IL-10的生成。GIT27对在任一细胞 类型中的MIF表达，对SMNC增殖和对经SMNC的IL-10和干扰素 (IFN) y生成完全没有影响。淋巴细胞和巨噬细胞的增殖和细胞因子合成能力分离自GIT27 处理过的小鼠。进行这些实验以研究用GIT27腹腔内(i.p.)或口服(p.o.)处理小鼠 是否会影响SMNC的增殖响应和来自经分离的PM和SMNC的IL画 1P、 IL-IO、 TNF-a、 IFN-y和MIF的生成。PM和SMNC分离自经 GIT27体内连续7天i.p. (0.5 mg/小鼠)或p.o. (2.5 mg/小鼠)处理过的 小鼠，或分离自接受GIT27溶々某(Na2HP(VH20)的对照动物，或未经 任何处理。在最后GIT27处理之后24小时，收集PM和SMNC,以 进一步体外刺激和分析。该活体外实验清楚表明，在对促分裂刺激表现出正常方式的認F 表达的同时，分离自GIT27处理过的小鼠的PM，s显示出IL-1(3、TNTFot 和IL-〗0的被削弱的合成。另一方面，经刺激，分离自GIT27处理过 的小鼠的SMNC表现出正常的增殖能力，正常生成TNF-ot、 IL-1(3、 IL-10和IFN-y的能力，和MIF表达的正常表达方式。从"体外"和"活体外"实验的结果一致表明，GIT27经PM下调IL-lp、 TNF-a和IL-lO的生成，而不改变SMNC生成IFN-y的能力， 也不影响经PM和SMNC的MIF表达。相反，"体夕卜"实验表明，GIT27 经SMNC减少TNF-a生成，尽管"活体外"实验并不支持这一证据。 在人巨噬细胞中，GIT27对NF-kB活化的作用 来自体外测试的结果表明，在单核细胞衍生的人巨噬细胞中， GIT27以剂量依赖方式有效地抑制LPS诱发的NF-kB的DNA结合。 这些结果为GIT27的作用机理提供证据，并暗示GIT27对IL-1(3、 TNF-a和IL-10的巨噬细胞合成所发挥的抑制作用可能次于NF-kB结 合到DNA的抑制作用。体内GIT27对LPS-诱发的致死率的作用该体内研究表明，给予小鼠治疗量的GIT27有效地降低LPS-诱 发的致死率。如所预料的，大部分未经处理或接受GIT27溶纟某的对照小鼠3 天内死于LPS-攻击。在该观察期之后，存活的小鼠的一周跟踪研究 显示出完全的临床疾愈。相反，经p. o.或i. p.以剂量依赖方式用GIT27处理使小鼠免受LPS的致命作用。p.o.给药时，在剂量为2.5 mg/ 小鼠时，GIT27是有效的，且所用剂量超出1.5-3 mg/小鼠。i. p.给药 时，GIT27表现出在剂量依赖免于LPS-诱发的致死率下的更宽的治 疗窗0.25-0.5 mg/小鼠。在预防方案(例如，先于LPS约24和约1小 时)下，经p.o.和i.p.以相同剂量给药时，GIT27也能显著降低LPS-诱 发的致死率。GIT27对角叉菜胶(CAR)诱发的胸膜炎的作用 GIT27有效抑制CAR-诱发的小鼠胸膜炎。用CAR攻击和未处 理或用GIT27溶J 某处理的所有小鼠都产生急性胸膜炎，在肺中产生 混浊的分泌物、PMNs浸润和髓过氧化物酶(MPO)活性积聚。相反， 用GIT27预防性治疗减少肺中的分泌物生成、PMNs浸润和髓过氧 化物酶(MPO)活性积聚，并发挥与有效的保护作用，它与采用用作阳 性对照药物的小鼠TNF-cx抗体处理下所实现的作用相当。 GIT27对II型胶原诱发的关节炎(CIA)的作用 为评估GIT27对关节炎的疗效，连续IO天处理患有II型CIA 的小鼠。在小鼠表现临床评分〉1时，开始处理。在相同的实验方案 下，用GIT27溶々某处理对照小鼠。随着关节炎临床评价的逐渐增加和严重后爪水肿，经溶^f某处理 的对照小鼠快速发展成II型CIA的完全的临床症状。如组织学评价 确定的逐渐增加的高关节炎组织学评分所显示的那样，严重的炎性 关节炎反映出这种临床图谱。相反，具有更低的临床和组织学关节 炎评分的GIT27处理过的小鼠比溶媒处理过的小鼠表现出明显更慢 的关节炎病的进程。用GIT27预防性治疗对小鼠的II型CIA产生显 著的抗炎效果，引起与该疾病的发展相关的临床和组织学参数的明 显降低。GIT27的疗效比得上阳性对照药物地塞米松。 GIT27对螺唑酮诱发的皮炎的作用嚼唑酮诱发的过敏性是一种免疫介导的皮炎，它可经对嗨唑酮的 两次上表皮暴露诱发。虽然首次对小鼠使用嗯唑酮使小鼠敏感，但笫二次才引起过敏性反应。在上表皮第二次暴露于噁唑酮后，皮炎表现 出现18小时，耳厚度和重量明显并逐渐增加。计划用两套实验进行体内研究，以评估GIT27的药理学活性。在第一套中，在敏感阶段 期间或之前处理小鼠。该实验表明，经GIT27溶i某处理或未处理的 小鼠的耳厚度和重量明显且逐渐增加。相反，如耳厚度和重量的增 加所测出的那样的耳的炎性肿涨受到GIT27的显著抑制。在相同条 件中，地塞米松减少耳的厚度而不是耳的重量。为评价GIT27对噁唑酮诱发的皮炎的诱发阶段的作用，在第二 次上皮暴露于嚼、唑酮后，当免疫炎性响应进程开始时，用GIT27处 理1小时。在这种实验方案下，GIT27仅部分影响过敏性皮炎的发展。 与对照动物比较，经GIT27处理过的小鼠只表现出耳厚度而不是耳 重量的显著减少。在该实验方案中，地塞米松不影响耳厚度和重量 的增力口。该实验的结果表明，当按照预防性方案，即先于疾病的敏感阶 段给予GIT27时，用GIT27处理可成功地抑制经重复的上皮暴露于 嚼唑酮所诱发的皮炎。然而，如果第二次暴露于嗯唑酮后(诱发阶段)，对小鼠给药l小 时，在预防或阻止嗯唑酮诱发的皮炎发展方面，GIT27效果更差。但 是，筌于相同实验方案下所缺乏地塞米松的作用，这种作用得到药 理学关注。既然地塞米松是广泛且有效用于人的炎性皮肤病的局部 治疗的有效免疫抑制剂，因全身或局部用于治疗免疫介导的或1型 细胞因子依赖的皮肤病，例如，银屑病、某些形式的寻常性天疱疮 和移植物抗宿主病期间的皮肤脉管炎，GIT27表现出药理学潜力。GIT27对链脲霉素诱发的糖尿病的作用用GIT27 i.p和p.o.处理抑制CBA/H小鼠经多次低剂量链脲霉 素诱发的糖尿病的临床发展。在注射MLD-STZ后，CBA/H小鼠患 上持续超过2周时间的高血糖症。如所预料的，在注射MLD-STZ后, 用GIT27溶媒i.p.或p.o.处理过的CBA/H对照小鼠患上伴有持续超过2周时间的高血糖症糖尿病。相反，当用GIT27i.p处理小鼠时， MLD-STZ的致糖尿病作用显著减少。当p.o.给药时，该药物也能显 著减少高血糖症的发展。经i.p.或p.o.用GIT27预防处理成功抑制高血糖症的发展，这 种发展继发于连续5天注射STZ后的细胞诱发的p细胞免疫损害。当 i.p.或p.o.提供时，该药物是有效的。这些结果表明，GIT27具有药理 学性质，值得进一步考虑在早期治疗人1型糖尿病(T1D)及预防个体 疾病发展的风险方面，例如，T1D患者的那些一级旁系表现出与高 风险T1D发展有关的代谢(胰岛素分泌缺乏)和免疫参数(抗-P细胞自 身抗体，HLA单体型(haplotypes))的临床用途。GIT27对DNB诱发的结肠炎的作用在用二硝基^^黄酸(DNB)攻击后的5天内，小鼠患上结肠炎。根 据肉眼评分评估病的严重性。溶i 某处理过的对照小鼠和未处理小鼠 随着可预见的和逐渐的炎症和体重损失的增加，患上结肠炎。在经 GIT27 (p < O.OOl)处理过的那些动物中，炎性结肠炎的进程明显变'R。 与对照组比较，GIT27处理过的动物在体重损失方面表现出明显的降 低。与这些数据相一致，当与对照组比较时，随着DNB诱发的结肠 炎的发展，用GIT27处理过的小鼠的结肠重量的增加显著降低。取出对照小鼠和GIT27处理过的小鼠的结肠，切片，固定并用 苏木精和曙红着色。DNB诱发结肠炎前用GIT27处理过的动物中， 观察到在炎性细胞浸润、粘膜和肌肉损害及壁增厚方面的减少。组 织学明确显示，与对照小鼠相比，经GIT27处理的小鼠的组织损害 显著减轻。这些数据确认GIT27在结肠炎中的抗炎功效。组织髓过 氧化物酶活性是评估炎性细胞(主要是中性粒细胞)浸润的充分确立的 指标。在从GIT27处理过的小鼠和从对照小鼠收集的结肠组织中所 测定的髓过氧化物酶活性明确表明，诱发结肠炎后5日，与对照组(p〈 0.0001)相比，GIT27处理过的小鼠显示出炎性细胞浸润的显著降低。 该结果类似于中性粒细胞浸润相同的组织学标本的减少。在DNB-诱发的动物中，我们计算出平均值8.9 ± 1.2 (均值± SD)细胞/高效区域 (high-power field),而在经GIT27 (p < 0.0001)预处理过的DNB-诱发 的动物中，只有3.37土0.8细胞/高效区域。这些数据证实，用GIT27 处理有效地保护测试动物不患经给予DNB所诱发的结肠炎。该数据 表明，该药物有希望可用于治疗人IBD。GIT27对免疫诱发的疾病如自身免疫疾病和慢性炎症的作用 采用GIT27所得到的体外和体内结果表明，为治疗经免疫机制 介导的那些疾病，例如，自身免疫疾病和慢性炎症和某些皮肤病和 内分泌疾病，该分子具有成为一种重要药物的药理学潜力。 一般说 来，在被IL-1(3、 TNF或其它细胞因子介导的那些疾病的治疗方面， GIT27具有潜力。由于IL-10抗炎性质(World J. Gastroenterol., 10: 620, 2004)， GIT27疫炎性疾病方面的该药物的用途不一致。但是，在不同的啮齿动物 模型，例如，内毒素诱发的眼色素层炎(J. Immunol., 1995, 155: 4090-4)、 1型糖尿病(J. Immunol. 2000, 165:2841-9)、系统性红斑狼疮 (Arthritis Rheum. 2000， 43:1790-800.)和实验性自身免疫睾丸炎 (Cytokine. 2003, 22:50-3.)中，已经使IL-10表现出发挥促炎效果。因 此，可能在某些情况下，IL-10合成的减少会实际上增加药物的抗炎 效果。这也与为治疗自身免疫疾病而广泛用于临床情况下的环孢菌 素A也体外下调IL-10合成(J. Exp Med. 199317:551-5)的事实相一致。 此外，既然IL-10的过度生成已经被认为在某些癌症(Immunol Rev. 2004 Dec; 202:223-36.; Br J Haematol. 2003, 122:927-33)和HIV感 染(Blood. 2003, 101:2514-20.)中起到致病作用，针对这些疾病中这种 药物的潜在的研究，GIT27下调这种细胞因子合成的能力是潜在的 基本原理。出于治疗用途的考虑，将以根据已知方法制备的、与常规载体 或赋形剂混合的适用组合物的形式，经口、胃肠外、透皮或透粘膜途径给予式I化合物。剂量将取决于几个因素，例如，病理学严重性、 患者种类(年龄、性别和体重)，总之将被熟练的从业医师根据该药物 的毒理学和药物动力学性质容易地确定。GIT27的制备使苯曱醛(l, 32.8 mmol)和羟胺盐酸盐(33 mmol)溶解于甲醇(100 ml),随后加入碳酸钠(65 mmol)。彻夜反应得到95%的肟衍生物(2, 30.4 mmol)。用DMF (100 ml)中的N-氯代琥珀酰亚胺(31.6 mmol)氯 化肟定量提供氯代肟(3)。再使化合物3溶解于THF/H20 (*0/20)中， 用3-丁烯酸酯(24.5 mmol)和碳酸钠(73.6mmol)处理。完成后(12h), 用乙酸乙酯萃取产物，用盐水洗涤有机萃取物，经硫酸镁干燥。从 乙酸乙酉旨/庚烷混合物中结晶GIT-27。经1H-NMR, 13 C-NMR和质谱 确定结构。日剂量方案大概会在例如0.1-10 mg/kg体重的大范围内变 化。
权利要求
1.式I化合物在治疗可经抑制白介素-10(IL-10)治疗或缓解的、肿瘤坏死因子介导的免疫病理学病症和疾病中的用途I中，R1-5表示独立选自氢、硝基、氰基、C1-C3-烷基、卤素、羧基、氨基、三氟代甲基、羟基、C1-C3-烷氧基的1-5个取代基，X是氢、卤代基、N3、SH、＝O、＝CH2、任选被上述R1-5基团取代的芳环(优选苯环)、氨基、单或双取代的氨基，其中取代基选自任选被上述R1-5基团取代的C1-C4烷基、苯基或苄基；Y是氢、C1-C4烷基、氨基或式-(CH2)0-1A的基团，其中A是任选被上述R1-5基团所取代的芳环优选苯环，前提是，当X和Y是氢时，R1-5不能表示4-羟基或4-烷氧基。
2. 根据权利要求1的3-苯基-4,5-二氢-5-异嗯唑乙酸和3-苯基-5-异噁唑乙酸或它们的药学上可接受的盐的用途。
3. 根据权利要求1的3-苯基-4，5-二氢-5-异嗯唑乙酸或其药学上 可接受的盐的用途。
4. 根据权利要求1-3的用途，其中所述疾病选自包括人的免疫 性炎症、自身免疫性和感染性疾病，包括类风湿性关节炎、克罗恩 氏病、银屑病和炎性皮力夫病、l型糖尿病、HIV感染、癌症、缺血-再灌注、肝炎、多发性硬化、格-巴二氏综合征和^f方急性移植物排斥。
5. 药用组合物，它含有作为活性成分的式I化合物或其无毒盐。6.根据权利要求5的药用组合物，其中的活性成分是3-苯基-4二氢-5-异嗯唑乙酸。
全文摘要
式I化合物用于治疗肿瘤坏死因子介导的、可经抑制白介素-10(IL-10)治疗或缓解的免疫病理学病症和疾病，I中，R_1-5表示1-5个独立选自氢、硝基、氰基、C₁-C₃-烷基、卤素、羧基、氨基、三氟代甲基、羟基、C₁-C₃-烷氧基的取代基，X是氢、卤代基、N₃、SH、＝O、＝CH₂、任选被上述R_1-5取代的芳环(优选苯环)、氨基、单或双取代氨基，其中的取代基选自任选被上述R_1-5基团取代的C₁-C₄烷基、苯基或苄基，Y是氢、烷基C₁-C₄、氨基或式-(CH₂)_0-1A基团，其中A是任选被上述R_1-5个基团取代的芳环优选苯环，前提是当X和Y是氢是，R_1-5不能表示4-羟基或4-烷氧基。
文档编号A61K31/42GK101217953SQ200680016135
公开日2008年7月9日 申请日期2006年3月14日 优先权日2005年3月15日
发明者F·尼科莱蒂 申请人:加尼亚尔免疫治疗公司