包括活化半胱天冬酶-3酶原的癌细胞内选择性细胞凋亡诱导的制作方法

专利名称：：包括活化半胱天冬酶-3酶原的癌细胞内选择性细胞凋亡诱导的制作方法包括活化半胱天冬酶-3酶原的癌细胞内选择性细胞凋亡诱导相关申请的交叉引用依据35USC119(e)，本申请要求以2005年5月26日提交的系列号为60/684,807的美国临时申请和2006年3月28日提交的系列号为60743878的美国临时申请为优先权基础，这两份临时申请通过援引全文纳入本申请。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本发明是在由美国国家科学基金会所提供的NSF基金/合约CHE-0134779的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
：细胞凋亡或程序性细胞死亡对所有多细胞生物的发育和稳态起着极其重要的作用(ShiY,2002，MolecularCell9:459-470)。癌的常见标志是它对天然的细胞凋亡信号具有抗性。该抗性通常是由于细胞凋亡级联反应中关键蛋白的上调或下调所致，或者是由于编码这些蛋白的基因发生突变所致，这取决于癌的类型。这些变化均出现在内源性凋亡途径和外源性凋亡途径中，所述内源性凋亡途径通过线粒体和半胱天冬酶-9(caspase-9)得以实现，所述外源性凋亡途径涉及死亡受体和半胱天冬酶-8的作用。例如，在癌中观察到许多蛋白质例如p53、Bim、Bax、Apaf-l、FLIP等的适当水平发生改变。该改变可引起有缺陷的细胞凋亡级联反应，其中的一个缺陷是上游促凋亡信号并未被充分传送来活化执行者半胱天冬酶半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7。由于大部分凋亡途径最终都涉及半胱天冬酶-3酶原的活化，因此上游的遗传异常是凋亡回路中有效的"破坏份子"，由此使得这些细胞异常增殖。由于细胞凋亡在癌中具有极其重要的作用，已努力开发靶向于细胞凋亡级联反应中的特定蛋白的治疗方法。例如，同促进Apaf-l寡聚化的化合物一样，级联反应成员例如p53和Bcl家族的蛋白的肽结合物或小分子结合物或凋亡抑制蛋白(IAP)家族蛋白的肽结合物或小分子结合物也具有促凋亡活性。但是，由于这些化合物靶向于凋亡级联反应上的上游(或中上游)位置，因此在这些成员下游的蛋白发生突变的癌可能仍对这些化合物可能的有益作用具有抗性。就治疗目的而言，最好是鉴定直接活化细胞凋亡级联反应中最下游的促凋亡蛋白的小分子。本发明的方法涉及到级联反应中相对较低的位置，因此能杀死在其上游凋亡机制中具有突变的那些细胞。另外，如果该促凋亡蛋白在癌细胞中上调，那么本文7>开的治疗策略成功的几率更大。在本发明中，我们鉴定小分子的工作从靶向于细胞凋亡重要的下游效应蛋白半胱天冬酶-3酶原开始。半胱天冬酶-3酶原转化或活化为半胱天冬酶-3可产生具有活性的"执行者"半胱天冬酶形式，该半胱天冬酶形式随后催化水解大量蛋白质底物。活性半胱天冬酶-3是异二聚体的同型二聚体，通过半胱天冬酶-3酶原的蛋白水解产生。在体内，该蛋白水解活化通常通过半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9的作用发生。为确保该前酶或酶原不被过早活化，半胱天冬酶-3酶原具有防止接近蛋白水解的IETD位点(氨基酸序列，ile-glu-thr-asp)的12个氨基酸的"安全制动片"。参见Roy，Setal.;Maintenanceofcaspase-3proenzymedormancybyanintrinsic"safetycatch"regulatorytripeptide，proc.Natl.Acad.Sci.98，6132-6137(2001)。该安全制动片能使半胱天冬酶-3酶原对抗自体催化性活化和半胱天冬酶-9引起的蛋白水解。诱变研究表明三个连续的门冬氨酸残基似乎是安全制动片中的关键部分。安全制动片的位置对pH敏感；因此，一旦细胞酸化(发生在细胞凋亡期间)，那么就认为安全制动片允许接近蛋白水解位点，并且活性半胱天冬酶-3可通过半胱天冬酶-9的作用或通过自体活化机制产生。在特定的癌中，半胱天冬酶-3酶原的表达上调。对20名结肠癌患者的原代分离物的研究表明，平均而言，这些分离物中的半胱天冬酶-3酶原相对于相邻非癌组织升高六倍(Royetal.，2001)。另外，某些成神经细胞瘤、、淋巴瘤和肝癌中的半胱天冬酶-3酶原上调(Nakagawara，A.etal.，1997,CancerRes.57:4578-4584;Izban，K.F.etal"Am.J.Pathol.154:1439-1447;Persad，R.etal.，ModernPatholo.17:861-867)。此外，美国国家癌症研究所(NCI)开发治疗计划对用于癌症筛选的60种细胞系中的半胱天冬酶-3酶原水平进行了系统评估。评估结果表明，某些肺癌、黑素瘤、肾癌和乳腺癌表现出半胱天冬酶-3酶原的表达水平大大升高(Svingen，P.A.etal"Clin.CancerRes.10:6807-6820)。由于活性半胱天冬酶-3在实现细胞凋亡中的作用、某些癌细胞类型中半胱天冬酶-3酶原相对高的表达水平以及使人感兴趣的安全制动片介导的对其自体活化的抑制，我们认为可以鉴定能直接修饰半胱天冬酶-3酶原的小分子，并且这些分子在靶向癌症疗法中可能具有很好的应用前景。在本说明书中，我们公开了半胱天冬酶酶原的小分子修饰物，包括能将半胱天冬酶-3酶原转化为其效应物形式的具体活化物。此外，我们证实了某些小分子药物可直接快速地活化半胱天冬酶-3酶原，从而在体内实现对癌细胞的促凋亡作用。我们相信这是首次发现能直接活化半光天冬酶-3酶原的小分子。执行者半胱天冬酶的直接活化是新的且具有价值的抗癌策略。
发明内容通常，本文所使用的术语和短语具有其所在领域公认的含义，该含义可通过参考本领域技术人员所知的标准教科书、期刊参考文献和基础知识获知。可采用下面的缩写。IAP,凋亡抑制因子；PAC-1，半胱天冬酶酶原活化化合物l;PARP，聚(ADP-核糖)聚合酶。本发明主要提供与半胱天冬酶酶原的修饰物相关的化合物、治疗方法、化合物的筛选方法以及适合治疗的细胞和患者的筛选方法。在一个实施方案中，该修饰物为抑制剂或活化剂。在一个实施方案中，本发明提供了与半胱天冬酶-3酶原和半胱天冬酶-7酶原的活化剂相关的这类化合物和方法。在实施方案中，本发明可应用于多种癌病和癌细胞类型，例如乳腺、淋巴瘤、肾上腺、肾脏、黑素瘤、白血球过多症、成神经细胞瘤、肺、脑和其它本领域已知的癌症和癌细胞类型。作为进一步介绍，我们发现能活化酶的化合物，该酶通常在癌细胞内以其非活性形式过表达。所述化合物可诱导癌细胞(包括半胱天冬酶-3酶原上调的癌细胞)内的程序性细胞死亡(细胞凋亡)。癌是一个较大且正在发展的问题，并且现在是美国的第一号健康杀手。许多癌对常规化疗具有抗性。本发明的化合物可利用在癌细胞中上调的生物靶标，由此证明是有效的，甚至在其凋亡机制存在缺陷的细胞中也是有效的。这些化合物在耙向癌症疗法中也是成功的，所述扭向癌症疗法具有选择性杀伤癌细胞的优势，并且对具有较低水平半胱天冬酶-3酶原的非癌细胞具有相当弱的毒性。并不希望拘囿于具体理论，但还是认为本发明的化合物可能通过细胞凋亡或程序性细胞死亡的调控机制起作用，从而有效治疗癌细胞。在一个优选的实施方案中，通过对细胞凋亡的诱导实现细胞凋亡的调控。在另一个实施方案中，通过对细胞凋亡的抑制实现细胞凋亡的调控。在一个实施方案中，本发明提供了一种选择性诱导癌细胞的细胞凋亡的方法，包括(a)给予所述癌细胞一种能修饰所述癌细胞的半胱天冬酶-3酶原分子的化合物；并(b)修饰所述半胱天冬酶-3酶原分子，从而诱导细胞凋亡。在一个实施方案中，所述癌细胞在需要治疗的患者体内。在一个实施方案中，所述化合物具有式ZZ;其中n-l或2;R独立于其它R，为氢、卣素、烯丙基或短烷基；R2为氢、短烷基、酯或在生理条件下可除去的其它部分；R3为氢、卤素、烷基、卤代烷基、烯丙基、烯基、烯醇(alkenol)、烷醇(alkanol)或卤代烯基；R4和R5为N;或者R4为N且R5为C;或者R4和R5为C;并且A为氧或硫。在一个实施方案中，所述化合物选自式ZZ、PAC-1和结构5。在一个实施方案中，所述化合物为PAC-1。在一个实施方案中，该化合物选自具有式ZZ的那些化合物，其中R4和R5均为N，A为氧，其它可变基团如上所述。在一个实施方案中，该化合物选自具有式ZZ的那些化合物，其中R4和R5均为N，A为氧，R2为氢，其它可变基团如上所述。在一个实施方案中，该化合物选自具有式ZZ的那些化合物，其中R4和R5均为N，A为氧，R2为氬，R3为晞丙基，其它可变基团如上所述。在一个实施方案中，该方法进一步包括评估癌细胞中的半胱天冬酶-3酶原或半胱天冬酶-3的参数的步骤，其中所述参数为所述半胱天冬酶-3酶原或半胱天冬酶-3的半定量或定量的量、功能量和活性水平中的一个或多个。在一个实施方案中，本发明提供了一种在体外直接篩选能修饰半胱天冬酶-3酶原分子的化合物的方法，包括(a)提供一种测试化合物；(b)提供经纯化的半胱天冬酶-3酶原；(c)将所述测试化合物暴露于所述经纯化的半胱天冬酶-3酶原；(d)在暴露于所述测试化合物后测量半胱天冬酶-3酶原的活性；(e)通过将暴露于所述测试化合物的测试活性与未暴露于所述测试化合物的未修饰活性进行比较，鉴定修饰性化合物；由此篩选能修饰半胱天冬酶-3酶原分子的化合物。在一个实施方案中，该方法还其中所述参照活性是将半胱天冬酶-3酶原暴露于这样一种化合物得到的，该化合物选自结构式ZZ或该式化合物的亚类、PAC-1和结构5。在一个实施方案中，本发明提供了一种筛选能活化半胱天冬酶-3酶原的化合物的方法，包括a)提供半胱天冬酶-3酶原；提供测试化合物，优选小分子；b)使该半胱天冬酶-3酶原与所述测试化合物反应，由此推定形成半胱天冬酶-3;并c)测量半胱天冬酶-3的活性。在一个具体实施方案中，采用底物Ac-DEVD-pNA测量半胱天冬酶-3的活性。在一个具体实施方案中，所述测量使用约410nm的波长读出参数。在一个具体实施方案中，使用多种测试化合物平行进行该筛选。在一个实施方案中，本发明提供了一种筛选方法，该方法采用将半胱天冬酶-3酶原的亚基作为全长(无活性)半胱天冬酶-3酶原被加工为半胱天冬酶-3的指示剂的检测。在一个具体实施方案中，通过蛋白质凝胶迁移技术例如蛋白质印迹，测得所述亚基的分子量约为19kD。在一个实施方案中，本发明提供了一种在细胞内筛选能修饰半胱天冬酶-3酶原分子的化合物的方法，包括(a)提供一种测试化合物；(b)提供一种细胞，其中所述细胞被推定表达半胱天冬酶-3酶原；(c)将所述细胞暴露于所述测试化合物；(d)在暴露于所述测试化合物后测量细胞参数，其中所述参数包括细胞活性、凋亡指示剂和其它参数中的一种或多种；(e)通过将暴露于所述测试化合物的测试细胞的参数与未暴露于所述测试化合物的未改变细胞参数进行比较，来鉴定修饰性化合物；由此筛选能修饰半胱天冬酶-3酶原分子的化合物。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述改变的活性或所述未改变的活性与参照活性相比较，其中所述参照活性是通过暴露于这样一种化合物得到的，该化合物选自结构式ZZ或该式化合物的亚类、PAC-l和结构5。在一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定或判断癌细胞对于用半胱天冬酶酶原活化化合物处理的潜在敏感性的方法，包括(a)评估所述癌细胞中的半胱天冬酶酶原参数；并(b)测定所述参数是否可使得对于半胱天冬酶酶原的活化的敏感性升高。在一个实施方案中，所述半胱天冬酶参数是半胱天冬酶-3酶原水平，所述半胱天冬酶酶原为半胱天冬酶-3酶原。在一个实施方案中，所述半胱天冬酶参数是半胱天冬酶-7酶原水平，所述半胱天冬酶酶原为半胱天冬酶-7酶原。水平可为半定量或定量的量，或者功能量(例如基于活性的量，如标准化单位或国际单位)。在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗癌细胞的方法，包括(a)鉴定癌细胞对于用半胱天冬酶酶原活化化合物处理的潜在敏感性；并(b)将所述癌细胞暴露于有效量的所述半胱天冬酶酶原活化化合物。在一个实施方案中，所述半胱天冬酶酶原活化化合物选自式ZZ或该式化合物的亚类、PAC-1和结构5。在一个实施方案中，权利要求16的方法，其中所述半胱天冬酶酶原活化物能活化半胱天冬酶-3酶原、半胱天冬酶-7酶原，或者半胱天冬酶-3酶原和半胱天冬酶-7酶原两者。在一个实施方案中，本发明提供了一种合成PAC-1的方法，包括方案1的步骤。在一个实施方案中，本发明提供了一种合成化合物5的方法，包括作了合适改进的方案1的步骤。在一个实施方案中，本发明提供了一种合成本文所公开并被本领域理解为式ZZ的化合物。在一个实施方案中，本发明提供了式ZZ的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中11=1或2;R独立于其它R，为氢、卣素、烯丙基或短烷基；R2为氢、短烷基、酯或在生理条件下可除去的其它部分；R3为氢、卣素、烷基、卣代烷基、烯丙基、烯基、烯醇、烷醇或卣代烯基；R4和R5为N;或R4为N且R5为C;或者R4和R5为C;并且A为氧或硫。在一个实施方案中，本发明提供了不包括PAC-1的式ZZ的化合物，其中所述PAC-1的结构为PAC—1。在一个实施方案中，本发明提供了结构5的化合物，其中所述结构为在一个实施方案中，本发明的组合物为化疗剂。在一个实施方案中，本发明提供了化合物和方法，涉及所公开的结构式的有效浓度优选约10nM至约100MM。在另一个优选的实施方案中，该有效浓度为约200nM至约5yM。在一个实施方案中，该有效浓度被认为是例如在直接半胱天冬酶酶原活化分析、细胞凋亡诱导分析或动物临床治疗评估中的50%活性浓度的数值。在一个优选的实施方案中，该数值小于约200jiM。在一个优选的实施方案中，该数值小于约IOpM。那些化合物以及这些化合物的盐和酯,.优选包括可药用的盐和酯。^'在一个实施方案中，本发明提供了前药形式的组合物。本发明化合物的前药可用于本发明方法中。任何可在体内被转化而提供生物活性、药物活性或治疗活性形式的本发明化合物的化合物均为前药。前药的多种实例和形式为本领域所熟知。生物分子例如前体蛋白或前体核酸可为前药。前药的实例特另'J参见DesignofProdrugs,editedbyH.Bundgaard，(Elsevier,1985)，MethodsinEnzymology，Vol.42，atpp.309-396，editedbyK.Widder，et.al.(AcademicPress,1985);ATextbookofDrugDesignandDevelopment,editedbyKrosgaard-LarsenandH.Bundgaard，Chapter5，"DesignandApplicationofProdrugs,"byH-Bundgaard,atpp.113-191，1991);H.Bundgaard，AdvancedDrugDeliveryReviews,Vol.8，p.1-38(1992);H.Bundgaard,etal.，JournalofPharmaceuticalSciences,Vol.77，p.285(1988);andNogrady(1985)MedicinalChemistryABiochemicalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,pages388-392)。当本文公开一组取代基时，应理解的是，该组和所有亚组的各个成员(包括该组成员的同分异构体和对映异构体)均被分别公开。在本文中使用马库什组或其它组时，该组的所有单个成员和该组所有可能的组合和亚组合均意味着分别包含于公开内容中。如若需要，意欲将说明书中所提供的任何马库什组或列表的任何一个或多个成员排除在本发明之外。当本文描述了某种化合物，但是并未例如以式或化学名方式指明该化合物的某个具体同分异构体或对映异构体时，该说明书旨在包括分别或以任何组合方式描述的化合物的每种同分异构体和对应异构体。另夕卜，除非另外指明，否则公开内容旨在嚢括本文公开的化合物的所有同位素变体。例如，应理解的是，所公开分子中的任何一个或多个氢可由氘或氚置换。分子的同位素变体通常可用作分子分析和涉及分子或其用途的化学和生物学研究中的标准品。众所周知，本领域的技术人员可对相同化合物进行不同命名，因此化合物的具体名称旨在示例。本文公开的分子可包含一个或多个可以离子化的基团[可除去质子的基团(如-0H、-COOH等)或可加入质子的基团(如胺)，或可被季胺化的基团(如胺)]。本文的公开内容旨在分别包括这类分子所有可能的离子形式及其盐。关于本文的化合物的盐，本领域的普通技术人员可自多种现有的反荷离子选择，这些反荷离子适合制备具有指定用途的本发明盐。例如，通常可将任何阴离子用于形成本文化合物的盐，例如卤化物、硫酸盐、羧酸盐、醋酸盐、磷酸盐、硝酸盐、三氟乙酸盐、羟乙酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、对曱苯磺酸盐、水杨酸盐等等。本发明的化合物及其盐或酯可以其互变异构形式存在，其中氢原子被交换到该分子的其它部分，因此该分子的原子之间的化学键发生重排。应理解的是，所有可能存在的互变异构形式均包括在本发明内。另外，该化合物可具有顺式或反式异构体，并且可包括一个或多个手性中心，因此以对映体和非对映体形式存在。本发明可包括所有这类异构体、各个对映体，以及顺式和反式异构体的混合物、非对映体的混合物、对映体(光学异构体)的非内消旋和内消旋混合物，以及富含一种或多种形式的上述混合物，除本文另外说明。未特别提及化合物(或非对称碳)的构象(顺式、反式或R或S)时，那么包括任何一种异构体或一种以上异构体的混合物。制备方法可使用外消旋化合物、对映体或非对映体作为原材料。在制备对映体或非对映体产物时，它们可通过常规方法例如色谱结晶或分步结晶分离。本发明化合物可为游离形式或水合物形式。除非另外指明，本文所描述或举例示出的组分的每一种制剂或组合可用于实施本发明。本申请中描述某个范围例如温度范围、时间范围或者组合物或浓度范围时，旨在将所有中间范围和子范围以及所给出范围内包括的全部单个数值包括在4^>开内容之中。在某些情况下，本文公开的任何参考文献中的信息可指示例如至专利文件的有效提交日为止时的现有技术；如若需要，本文使用这些信息旨在排除在现有技术中实际存在的具体实施方案。例如，公开和/或要求包含某种化合物时，应理解的是，并不是意在将被视为本发明现有技术求保护的组合物之内。本文提供的某些参考文献通过援引的方式纳入，以提供关于本发明的原材料、其它原材料、其它试剂、其它合成方法、其它分析方法和其它用途的来源的详细信息。本领域的普通技术人员应当理解的是，基于本领域的知识且无需采用过多的实验，也可以将本文所示具体实例以外的其他各种原材料、试剂、固体底物、合成方法、纯化方法和分析方法用于实施本发明。在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗组合物，包括一种或多种化合物以及每种化合物其可药用的盐或酯，其中所述化合物存在于所述组合物中的量或组合量可有效获得所需疗效。任选地，本发明的治疗组合物还包括一种或多种可药用的组分，例如本领域已知的载体和赋形在一个实施方案中，本发明提供了具有式ZZ2的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中R1和R2各自独立地为氢、卣素、烷基、烯丙基、卣代烷基、烯基、烯醇、烷醇或卣代烯基。在一个实施方案中，R1和R2各自独立地为氢、囟素、烯丙基或短烷基。在一个实施方案中，本发明提供了一种选自PAC-1衍生物组合文库的化合物，所述组合文库包含与醛类化合物化合的酰肼类化合物。在一个实施方案中，酰肼类化合物选自由本文所述AX化合物形成的酰肼。在一个实施方案中，醛类化合物选自本文所述的BX化合物。在一个实施方案中，酰肼类化合物选自本文所述的AX化合物，且醛类化合物选自本文所述的BX化合物。在一个实施方案中，本发明提供了一种合成PAC-1衍生化合物的方法，包括提供一种酰肼类化合物，提供一种醛类化合物，并使所述酰肼类化合物和所述酪类化合物反应，由此合成PAC-1衍生化合物。在一个实施方案中，所述酰肼类化合物具有式ZZ3:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>在一个实施方案中所述醛类化合物具有式ZZ4:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>在一个实施方案中，所述酰肼类化合物具有式ZZ3，且所述醛类化合物具有式ZZ4。在一个实施方案中，本发明提供一种选自下列的化合物L01R06、L02R03、L02R06、L08R06、L09R03、L09R06和L09R08。在一个实施方案中，本发明提供了一种通过鉴定候选癌症患者体内半胱天冬酶酶原的升高水平来筛选可适于用半胱天冬酶酶原活化剂治疗的候选者的方法，所述方法包括从所述候选者获得细胞或组织测试样本，评估所述测试样本中半胱天冬酶酶原水平，并确定相对于参照水平所述测试样本中的半胱天冬酶酶原水平是否升高，由此筛选可能适于用半胱天冬酶酶原活化剂治疗的候选癌症患者。在一个实施方案中，所述半胱天冬酶酶原选自半胱天冬酶-2酶原、半胱天冬酶-3酶原、半胱天冬酶-6酶原、半胱天冬酶-7酶原、半胱天冬酶-8酶原和半胱天冬酶-9酶原。在一个具体实施方案中，所述半胱天冬酶酶原为半胱天冬酶-3酶原。在一个实施方案中，所述测试样本中的高水平是参照水平的至少约2倍。在一个实施方案中，所述测试样本中的高水平是参照水平的至少约4倍。在一个实施方案中，所述参照水平来自同一患者的另一测试样本。在一个实施方案中，所述参照水平来自正常细胞或组织样本。参照水平可来自细胞系，例如癌细胞系或正常细胞系。在一个实施方案中，所述参照水平可为绝对阈值量。参见Svingen，P.A.etal.，Clin.CancerRes.10:6807-6820，该文献描述了包括每个细胞内分子数目在内的半胱天冬酶酶原水平的多个量。在一个实施方案中，本发明提供了一种诱导癌细胞死亡的方法，包括给予所述癌细胞能活化所述癌细胞的半胱天冬酶酶原分子的化合物。在一个实施方案中，所述半胱天冬酶酶原为半胱天冬酶-3酶原和半胱天冬酶-7酶原的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述半胱天冬酶酶原为半胱天冬酶-3酶原。在一个实施方案中，所述化合物具有结构式ZZ。在一个实施方案中，所述化合物具有结构式ZZ2。应意识到，无论本文所认为或公开的任何机理解释或假说的最终正确性如何，本发明的实施方案都仍然是可操作的并且是有用的。图1.A)PAC-1引起的半胱天冬酶-3酶原和活性半胱天冬酶-3的体外活化。PAC-1活化半胱天冬酶-3酶原，EC5。=0.22^M。误差线表示平均值的标准偏差。B)由于PAC-1诱导，半胱天冬酶-3酶原被切割成活性半胱天冬酶-3。半胱天冬酶-3酶原在大肠杆菌中被重组表达为带有N端His-6标签并被纯化。用抗-His-6抗体进行免疫印迹。在不存在PAC-1时，没有观察到半胱天冬酶-3酶原的成熟。在存在100mMPAC-1时，在1小时内观察到形成p19片段的切割，并且在4小时后观察到>50%的切割。图2.A)PAC-1引起的半胱天冬酶-3酶原的"安全制动片"区域的突变体的活化。PAC-1对野生型半胱天冬酶-3酶原(DDD)的活化ECs。为0.22jiM,对某些突变体的相应ECs。值为2.77pM(DAD)、113pM(DDA)和131pM(ADD),B)PAC-1活化半胱天冬酶-7酶原，ECs。为4.5-。C)PAC-1活化半胱天冬酶-3酶原对pH的依赖性。pH较低时，安全制动片"关闭"，半胱天冬酶-3酶原基本最大程度被活化。误差线表示平均值的标准偏差。图3.PAC-1谦导HL-60细胞的细胞凋亡。A)用100pMPAC-1处理20小时后磷脂酰丝氨酸的暴露情况(通过膜联蛋白V染色测量)。B)在用100^PAC-1处理20小时后通过Hoescht染色后观察到的染色质凝聚。图4.A)用10pM依托泊苷(etoposide)处理的HL-60细胞中，线粒体膜的去极化(腿P)和半胱天冬酶-3样活性。B)用100jiMPAC-1处理的HL-60细胞中，线粒体膜的去极化(醒P)和半胱天冬酶-3样活性。C)PAC-1处理(100^M)在HL-60细胞中诱导细胞PARP活性快速下降，这与细胞的半胱天冬酶-3/-7的立即活化一致。相反，依托泊苷(10jiM)处理的细胞表现出在晚得多的时间点PARP活性才降低。D)PAC-1以半胱天冬酶-3酶原依赖方式诱导细胞死亡。对于多种不同的癌细胞系，确定半胱天冬酶-3酶原水平(通过流式细胞术)，并测量PAC-1的IC50(R2=0.9822)。在已知具有高水平半胱天冬酶-3酶原的NCI-H226肺癌细胞系中，PAC-l相当有效(IC,O.35，但是在来源于健康人类供体的骨髓的正常白细胞中，其效力显著要低。图5A示出几名患者的正常细胞和癌细胞中半胱天冬酶-3酶原的相对水平。图5B示出具有一系列半胱天冬酶-3酶原相对水平的各种细胞系中PAC-1的ICso水平。图5C示出用PAC-1治疗动物对肿瘤生长结果的影响。图5D示出用PAC-1口服治疗动物对肺瘤生长结果的影响。图5E示出对照、PAC-1和gefitiniMIressa,AstraZeneca)处理组的肺癌模型中癌症进展结果。通过i.v.给药将肿瘤细胞注射至小鼠体内；口月l给予100mg/kg的Iressa和PAC-1。图6A示出三名患者的正常细胞和癌细胞中半胱天冬酶-3酶原的相对水平。图6B示出患者3的正常细胞和癌细胞对PAC-l治疗的敏感性。图7示出在小鼠肺癌模型中通过自内方式给予PAC-1的结果。图8A和8B示出PAC-1衍生物和组合文库的化合物结构。图9示出人半胱天冬酶-3、凋亡相关半胱氨酸肽酶(CASP3)、转录物变体a、mRM(编号No.NM—004346;2689bp;mRNA线性；获自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)的核普^y^歹'J。图10示出人半胱天冬酶-7、凋亡相关半胱氨酸肽酶(CASP7)、转录物变体ct、mRNA(编号No.NM_001227;2605bp;mRNA线性；获自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)的核苦^^歹寸。具体实施例方式提供下列定义来阐明其在本发明上下文中的具体应用。本文使用的术语"化疗剂"指任何能减少或预防一个癌细胞、一群癌细胞、肺瘤或其它恶性组织的生长、增殖或扩散的物质。该术语还旨在嚢括任何抗肿瘤剂或抗癌剂。本文所使用的术语"有效量"旨在嚢括上下文提及的量，例如药学有效量或治疗有效量。例如，在实施方案中，所述量能获得筛选分析中的有益状态、有益疗效、功能活性或者临床状况的改善。本文所使用的术语"癌细胞"旨在包括本领域广泛理解的定义。在一个实施方案中，该术语指在人或动物体内引起临床癌病的调节异常的细胞。在一个实施方案中，该术语指培养的细胞系或者人或动物体内或来源于其中的细胞。正如本领域所理解的那样，癌细胞可为各种类型的分化细胞、组织或器官。术语"烷基"指支链或直链的饱和烃链(优选具有1至22个碳原子)的单自由基，并且还指具有一个或多个环(具有3至22个碳原子)的环烷基基团。短烷基基团为具有1至6个碳原子的那些基团，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基基团(包括其全部异构体在内)。长烷基基团为具有8-22个碳原子的那些基团，优选具有12-22个碳原子的那些基团以及具有12-20个碳原子的那些基团和具有16-18个碳原子的那些基团。术语"环烷基"指具有一个环或多个稠环的3至22个碳原子的环形烷基基团。举例而言，环烷基基团包括单链结构如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基等，或多环结构如金刚烷基(adamantanyl)等等。术语"烯基"指支链或直链不饱和烃基(优选具有2至22个碳原子)的单自由基，并且还指具有一个或多个环(具有3至22个碳原子)的环烯基基团，其中至少一个环含有双键。烯基基团可含有一个或多个共轭的双键(CO。优选的烯基基团为具有1或2个双键的那些基团。短烯基基团为具有2至6个碳原子的那些基团，包括乙烯(乙烯基)、丙烯、丁烯、戊烯和己烯基团(包括其所有异构体在内)。长烯基基团为具有8-22个碳原子的那些基团，优选具有12-22个碳原子的那些基团以及具有12-20个碳原子的那些基团和具有16-18个碳原子的那些基团。术语"环烯基"指具有一个环或多个稠环的3至22个碳原子的环形烯基基团，其中至少一个环含有双键(C-C)。举例而言，环烯基基团包括单环结构例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环辛烯基、环辛二烯基(cylcooctadienyl)和环辛三烯基(cyclooctatrienyl)。术语"炔基"指不饱和烃的单自由基，优选具有2至22个碳原子并具有一个或多个三键(C^C)。炔基基团包括乙炔基、丙炔基等。短炔基基团为具有2至6个碳原子的那些基团(包括其全部异构体)。长炔基基团为具有8-22个碳原子的那些基团，优选具有12-22个碳原子的那些基团以及具有l2-20个碳原子的那些基团和具有16-18个碳原子的那些基团。术语"芳基"指这样一种基团它含有6至22个碳原子的不饱和芳香碳环基团，具有一个单环(如苯基)、一个或多个环(如联苯基)或多个稠环，其中至少一个环是芳香族环(如萘基、二氢菲基(dihydrophenanthrenyl)、药基(fluorenyl)或蒽基)。芳基包括苯基、萘基等。芳基除了含有一个或多个不饱和芳香环外，还可含有烷基、烯基或炔基部分。术语"烷芳基"指含有烷基部分的芳基基团，即-烯基-芳基和取代的烯基-亚芳基。这类烷芳基基团的实例有苯甲基、苯乙基等等。如本文所述，烷基、烯基、炔基和芳基基团任选地被取代(该术语可包括取代的变化形式)，可含有1-8个非氢取代基，这取决于基团中的碳原子数以及基团的不饱和程度。术语"亚烷基"指支链或直链饱和烃链的双自由基，优选具有1至IO个碳原子，更优选具有l-6个碳原子，更优选具有2-4个碳原子；该术语可包括取代的变化形式。该术语的实例有基团例如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、更通常为(CH2)n-，其中n为1-10或更优选1-6或n为2、3或4。亚烷基基团可具有支链。亚烷基基团任选可被取代。亚烷基基团的每个碳原子可具有最高达两个非氢取代基。优选的取代亚烷基具有1、2、3或4个非氢取代基。术语"亚芳基"指源自如上所述芳基(包括取代的芳基)的双自由基，其实例为1，2-亚苯基、1,3-亚苯基、1，4-亚苯基、1，2-亚萘基等。术语"氨基"指基团-NH2;或者指基团-NRR，在两个R不同时为氢的前提下，其中每个R独立选自氲、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、芳基，杂芳基和杂环。如上所述，烷基基团任选被取代，并且优选具有1-IO个取代基，这取决于烷基基团的大小。取代的烷基基团包括那些具有1至8个取代基、1至5个取代基、1至3个取代基和1或2个取代基的那些基团。"卣代烷基"指由本文所述的一个或多个卣素基团所取代的本文所述的烷基，所述卣素基团可相同，也可不同。举例而言，代表性卣代烷基基团包括三氟甲基、3-氟十二烷基、12，12,12-三氟十二烷基、2-溴辛基、3-溴-6-氯庚基等。术语"杂芳基"指2至22个碳原子的芳香基团，在至少一个环(若有一个以上的环)中具有选自氧、氮和硫的1至4个杂原子。杂芳基基团任选被取代。术语"杂环"或"杂环的"指饱和或不饱和基团的单自由基，具有含2-22个碳原子的一个环或多个稠合的环，并且在至少一个环内具有选自氮、硫、磷和/或氧的l至6个杂原子，优选1至4个杂原子。杂环基团可被取代。术语"酯"指本领域所理解的化学个体，具体而言包括(RCO-)形式的基团。对于含有一个或多个取代基的任一上述基团，可理解的是，这些基团并不含有任何在立体化学上不可实现和/或在合成上不可行的取代或取代形式。本发明的化合物包括通过所公开的化合物的取代而得到的所有新的立体化学异构体。本发明还可通过如下非限制性实施例得到进一步理解。实施例1.半胱天冬酶酶原活化化合物细胞凋亡级联反应中蛋白质的突变或异常表达是癌的常见标志。这些变化可阻止将促凋亡信号传递给执行者半胱天冬酶，由此阻止细胞凋亡引起的细胞死亡并允许细胞增殖。半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7是关键的执行者半胱天冬酶，以由上游信号活化的无活性酶原形式存在。重要的是，某些癌细胞中的半胱天冬酶-3酶原的表达水平比非癌对照细胞显著地高。我们在本文报道了直接将半胱天冬酶-3酶原活化为活性半胱天冬酶-3的小分子的鉴定。特定化合物PAC-1起到在体外活化的作用，ECs。的大约为220纳摩尔，并且该化合物可在多种癌细胞系中诱导凋亡。与许多已知的抗癌药物不同，用PAC-1处理的细胞表现出半胱天冬酶-3酶原被立即活化，并且PAC-1的毒性被证明是直接与细胞中所含有的半胱天冬酶-3酶原的量成比例。因此，PAC-1在体内直接将半胱天冬酶-3酶原活化为半胱天冬酶-3，使得即便是在细胞凋亡机制有缺陷的细胞内该化合物也可诱导细胞凋亡。PAC-1是已知的直接活化半胱天冬酶-3酶原的第一个小分子；执行者半胱天冬酶的直接活化是新的抗癌方法，该方法被证实对于多种癌症有效，包括其中半胱天冬酶-3酶原上调的许多癌在内。对一群约20，000个结构不同的小分子在体外活化半胱天冬酶-3酶原的能力进行了筛选。半胱天冬酶-3酶原在大肠杆菌中表达和纯化(Royetal.,2001)。将半胱天冬酶-3酶原(浓度为50ng/mL)加入384孔板的孔中，并加入化合物，使其终浓度为约40nM。然后将每块板在37n孵育两小时，随后加入半胱天冬酶-3肽底物Ac-Asp-Glu-Val-Asp-对-硝基苯胺(nitroanilide)(Ac-DEVD-pNa),使其浓度为200^M。在此后两小时的时间内于405nm追踪对硝基苯胺生色团的生成。在所评估的化合物中，有四种使得半胱天冬酶-3肽底物的水解相对于本底显著升高。这四种中有一种表现出对体外半胱天冬酶-3酶原活化有强的剂量依赖作用。如图1A所示，浓度为0.22pM的这第一种半胱天冬酶酶原活化化合物(PAC-1)获得半胱天冬酶-3酶原半最大活化。该化合物并不只是筒单地升高半胱天冬酶-3自身的活性，因为它对加工完全的半胱天冬酶-3酶的催化活性没有影响(图1A)。半胱天冬酶-3酶原具有N端前结构域(prodomain)(残基1-28)，随后为由亚基间接头(intersubunitlinker)分开的一个大亚基(17kDa)和一个小亚基(12kDa)(Popetal.，2003)。两个半胱天冬酶-3酶原单体在体内组装形成在无催化活性的同型二聚体，所述同型二聚体可通过在亚基间接头中的D175进行的切割而被活化。前结构域的准确作用尚不清楚，并且已表明仅亚基间区域的切割就足以获得完全的催化活性(Stennicke，H.R.etal.，1998)。尽管半胱天冬酶-3酶原是有催化能力的，但是由于存在12个氨基酸安全制动片(safetycatch),它对自体活化具有高度抗性；但是，安全制动片发生突变时，则可观察到半胱天冬酶-3酶原的明显的自体活化(Royetal.，2001)。与该重要调节区域或其它位置相互作用的化合物可使得半胱天冬酶-3酶原发生自体活化。为直接评估PAC-1催化半胱天冬酶-3酶原自体活化的能力，将半胱天冬酶-3酶原蛋白与100PAC-1—起孵育一至五个小时。如图1B蛋白质印迹所示，PAC-1以时间依赖方式诱导半胱天冬酶-3酶原的切割，在4小时后观察到加工>50%。相反，在緩冲液中孵育的半胱天冬酶-3酶原表现出在这一相同时段基本上并未发生自体活化。在尝试准确地找到与PAC-1相互作用的半胱天冬酶-3酶原区域的过程中，对安全制动片区域中的关键天门冬氨酸三联体残基Aspl79、Aspl80和Aspl81进行了丙氨酸置换。这些位置的突变全都显著降低了PAC-1活化半胱天冬酶-3酶原的能力，某些突变对PAC-1引起的半胱天冬酶-3酶原活化更为不利(图2A)。同半胱天冬酶-3—样，半胱天冬酶-7也以由蛋白水解活化的无活性酶原形式存在。半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7两者均为执行者半胱天冬酶，并且具有相当的序列和结构同源性(Denault，J.-B.etal.，2003)。半胱天冬酶-7酶原也具有相似的安全制动片区域，但是它在关键三联体(Asp-Thr-Asp)中仅有两个天门冬氨酸，而非三个。如图2数据所示，PAC-1也可活化半胱天冬酶-7酶原，但是较其对半胱天冬酶-3酶原的活化效率效率较低(EC5。为4.5nM,而半胱天冬酶-3酶原活化的EC5Q为0.22jiM)。PAC-1活化半胱天冬酶-7酶原的效力与其对半胱天冬酶-3酶原的Asp-Ala-Asp突变体的效果相当(EC5。=2.77jiM)。pH值较低时PAC-1的作用消失，这种情况下半胱天冬酶-3酶原进行快速自体活化(图2C)。对小分子活化半胱天冬酶-3酶原从而在人细胞系中诱导细胞凋亡的能力进行检测，并且发现PAC-1可在多种癌细胞系中诱导细胞凋亡。在HL-60细胞中，PAC-1的加入使得相当的磷脂酰丝氨酸从细胞膜上暴露出来，并伴有显著的染色质凝聚(图3A和3B)。另外，该化合物诱导PARP-1的切割(通过体内PARP活性分析评估；PuttKSetal.，2005)，并引起线粒体膜的去极化(见下文)。通过显微镜还观察到显著的细胞空泡(cellularblebbing)。此外，PAC-1的毒性在半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk存在的情况下可被消除(未给出数据；参见Sleeetal.，1996)。若PAC-1的确是通过直接活化半胱天冬酶-3酶原来诱导细胞凋亡，那么凋亡事件的时程相对于用标准促凋亡药剂(proapoptoticagent)的时程应有所改变。已知依托泊苷可通过内源性途径诱导细胞凋亡；因此，线粒体膜去极化之后，依托泊苷处理的细胞中半胱天冬酶-3酶原会^皮活化。事实上，在用10^M依托泊苷处理的HL-60细胞中，观察到线粒体膜的去极化，随后检测到半胱天冬酶-3样活性(图4A)。相反，用PAC-1处理细胞得到显著不同的结果。采用PAC-1，首先观察到的细胞凋亡的生物化学标志是半胱天冬酶-3样酶活性。该活性在加入化合物的数分钟内出现，并且50%的活化正好在2小时内且在任何显著线粒体膜去极化之前发生(图4B)。另外，在PAC-1处理的细胞中PARP活性快速减少，而该减少在依托泊苷处理的细胞中于较晚的时间点观察到(图4C)。对照实验表明PAC-1并不能直接抑制PARP-1的酶活性。在典型的凋亡事件顺序中，线粒体膜去极化，半胱天冬酶被活化，并且半胱天冬酶底物(如PARP-1)被切割。PAC-1处理的细胞表现出半胱天冬酶-3/-7的快速活化(在线粒体膜去极化前)和半胱天冬酶底物的快速切割，这一观察结果表明，该化合物是通过直接活化半胱天冬酶-3酶原展现其细胞毒性的。为进一步确定PAC-1的效力，对该化合物在具有不同水平半胱天冬酶-3酶原的细胞系中诱导细胞死亡的能力进行了评估。对存在于多种癌细胞系(白血病、淋巴瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌和肾癌)和自健康供体的骨髓分离得到的白细胞中的半胱天冬酶-3酶原的量进行了测定。在这些细胞中获得了PAC-1的细胞死亡诱导ICs。值。结合起来的数据表明细胞的半胱天冬酶-3酶原浓度与对PAC-1的敏感性之间有着很强的相关性(图4D)。值得注意的是，来源于健康人供体骨髓的白细胞属于半胱天冬酶-3酶原的量最少的那些细胞，对这些细胞具有较低的毒性。PAC-1对肺癌细胞系NCI-H226的效力最大，ICs。为0.35一。根据文献(Svingenetal.，2004)中的数据，我们发现该细胞系具有的半胱天冬酶-3酶原的浓度比非癌对照的高五倍。与采用PAC-1的这些实验相反，依托泊苷在细胞培养物的效力和半胱天冬酶-3酶原的细胞水平之间并未表现出这种相关性。例如，依托泊苷在诱导三种黑素瘤细胞系(UACC-62、CRL-1872和B16-F10)、乳腺癌细胞系(Hs578t)和肺癌细胞系(NCI-H226)的死亡方面是无效的(IC5。>50一)；这些细胞系的半胱天冬酶-3酶原水平分别为1.0、2.4、1.9、3.7和5.3。依托泊苷对于HL-60、U-937、SK-N-SH和PC-12是有效的(IC5。<1juM)，这些细胞系的半胱天冬酶-3酶原水平分别为4.3、4.0、4.7和4.4。因此，总的来说，半胱天冬酶-3酶原水平和依托泊苦的ICs。之间没有相关性。由于细胞凋亡级联反应中各种蛋白质分配的异常表达或突变，癌细胞对促凋亡信号的敏感性通常有所降低。因此，很多类型的癌不仅对于凋亡性细胞死亡的内源性信号具有显著的抗性，而且也对通过相似机理起作用的化疗药剂具有显著的抗性。半胱天冬酶-3酶原的表达水平在某些癌中的异常上调提供了使用该现有的细胞内蛋白库来直接诱导细胞凋亡的机会，从而避开级联反应通常没有功能或受到损害的上游部分。尽管众所周知，半胱天冬酶-3相对不能进行自体活化，但这取决于使其处于无活性状态的12个氨基酸的安全制动片。PAC-1在体外诱导半胱天冬酶-3酶原的自体活化，并且该活化由于安全制动片的关键三天门冬氨酸区域的突变大大减少。该数据与这一观念是一致的PAC-1直接干扰安全制动片维持半胱天冬酶-3酶原处于休眠状态的能力。在细胞培养物中，PAC-1处理快速诱导了半胱天冬酶-3样活性。然后，半胱天冬酶-3介导的抗凋亡蛋白(Bel-2、Bcl-XL等)的切割可能诱导线粒体膜的去极化并放大细胞凋亡。另夕卜，PAC-1对各种细胞系的效力直接与细胞中的半胱天冬酶-3酶原的浓度成比例。值得注意的是，PAC-1对其有效的几种细胞系具有使其可对抗细胞凋亡的错误凋亡途径；例如，Apaf-l表达在SK-MEL-5细胞中显著降低，Bc卜2在NCI-H226肺癌细胞系中过表达。本文给出的数据充分支持这一理念半胱天冬酶-3酶原活化化合物对于常见癌极其有效。这种有效性在半胱天冬酶-3酶原水平异常高的情对癌活检组织中半胱天冬酶-3酶原水平的评估简单快速；因此，化合物例如PAC-1的潜在有效性可通过具有高度准确性的先验(priori)进行评估。本文的半胱天冬酶-3酶原活化物和方法由此提供了个性化医学策略，所述个性化医学策略优于抗癌治疗领域依赖普通细胞毒素的疗法。材料和方法材料Ni-NTA树脂和抗PentaHisAlexaFluor647抗体购自Qiagen(Valencia,CA)。Bradford染料购自Bio-Rad(Hercules,CA)。针式转移装置购自V&PScientific(SanDiego，CA)。试剂z-vad-fmk购自Calbiochem(SanDiego,CA)。Rosetta大肠杆菌购自Novagen(Madison,WI)。抗半胱天冬酶-3抗体购自Sigma(St.Louis,MO)。膜联蛋白VAlexaFluor488缀合物、JC-9和硤化丙咬购自MolecularProbes(Eugene,OR)。IPTG和MTS/PMSCellTiter96CellProliferationAssay试剂购自Promega(Madison,WI)。胎牛血清购自Biomeda(FosterCity,CA)。96孔孩i量滴定板和384孔微量滴定板、显微镜用载玻片、显微镜用盖玻片、马血清和全部其它药剂购自Fisher(Chicago,IL)。方法细胞培养条件。U-937、HL-60、CRL-1872、ACHN、NCI-H226、SK-MEL-5和UACC-62细胞在添加有10%FBS的RPMI1640培养基中培养。SK-N-SH、B16-F10和Hs578t细胞在含有Earle，sBSS、1.5g/L碳酸氢钠和添加有10%FBS的Eagle，s最小必需培养基中培养。PC-12细胞在添加有5%FBS和10%马血清的RPMI1640培养基中培养。人骨髓在添加有40%FBS的I函EM中培养。所有细胞系均于37。C在5%C02、95°/。空气气氛中培养。根据需要，U-937和HL-60细胞每二至三天传代。人骨髓由冻存储料解冻，并立即稀释用于实验。所有其它细胞在其达到约80%汇合时传代。蛋白表达和纯化。将1mL含有半胱天冬酶-3酶原或半胱天冬酶-7酶原表达质粒的Rosetta大肠杆菌的过夜培养物接种于1L含有合适抗生素的LB培养基中。细胞用1mMIPTG诱导30分钟。然后将细胞离心，并重悬于NTA结合緩冲液(150mMNaCl、50mMTris、10mM咪唑，pH7.9)中。通过使细胞通过French细胞压破碎仪两次来裂解细胞。然后将细胞裂解物以14,000xg离心30分钟。倒出上清并加入1mL镍-NTA树脂。液洗涤，然后用10mLNTA洗涤緩沖液(150mMNaCl、50raMTris、20mM咪唑，pH7.9)洗涤。用10mLNTA洗脱緩冲液(150mMNaCl、50mMTris、250mM咪唑，pH7.9)洗脱蛋白，每lmL体积收集一个级分。收集含有蛋白质的级分并用Bradford分析确定蛋白的量。文库筛选。将分离得到的半胱天冬酶-3酶原用半胱天冬酶分析緩冲液(50mMHEPES、100mMNaCl、10mMDTT、0.lmMEDTA、0.l'/。CHAPS和10%甘油，pH7.4)稀释为50ng/mL。将45^L半胱天冬酶-3酶原溶液加入Nunc384孔平底微量滴定板的每个孔中。对约20000种化合物进行了筛选。在伊利诺斯州大学化学系从各种来源收集了约6000种化合物；其结构可见http://www.scs.uiuc.edu/~phgroup/comcollections,html。其它约14000种化合物购自Che迈bridgeCorporation(SanDiego，California)。PAC-1为购自ChembridgeCorporation的一种化合物。将这些化合物(在DMS0中配制为10mM储存溶液)用转移0.2化合物的384-针转移装置转移至孔中。这使得化合物的终浓度为约40一。进行了对照实验，其中仅有DMS0(不含化合物)被针转移。然后将这些板在37t:孵育2小时。将5溶于半胱天冬酶分析緩冲液的2mMAc-DEVD-pNA(N-乙酰基-ASP-Glu-Val-Asp-p-硝基苯胺)溶液加入各个孔中。然后在SpectraMaxPlus384平板读取器(MolecularDevices,SunnyvaleCA)上于405nm每两分钟读一次板，持续2小时。每个孔线性部分的斜率用于确定半胱天冬酶-3的活性。活化曲线。半胱天冬酶-3酶原活化物的剂量依赖性通过加入不同浓度的化合物至96孔板中来确定，所述96孔板中含有溶于半胱天冬酶分析緩冲液的9050ng/mL半胱天冬酶-3酶原、活性半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7酶原或活性半胱天冬酶-7。然后将平板于37t:醉育12小时。然后将10jiL溶于半胱天冬酶分析緩冲液的2mMAc-DEVD-pNA溶液加入各孔。在SpectraMaxPlus384孔平板读取器上于405nm每两分钟读一次板，持续2小时。确定各孔线性部分的斜率，并计算相对于未处理对照孔的活化升高倍数。PAC-1活化凝胶。如上所述表达和分离半胱天冬酶-3酶原。将半胱天冬酶-3酶原用半胱天冬酶分析緩冲液稀释为约50jig/mL。然后将半胱l小时。将该树脂上柱，用10mLNTA结合緩沖天冬酶-3酶原在100mMPAC-1存在或不存在的情况下于37匸孵育不同时间。在此孵育后，将等体积上样緩冲液(loadbuffer)(150mMNaCl、50mMTris、2%SDS、20%甘油，pH8.0)加至每个半胱天冬酶-3酶原样本。然后将所有样本保存在-8Q"C,直至时程结束。然后将所有样本于95"孵育5分钟，并在12%SDS-PAGE凝胶上进行电泳。然后将蛋白质过夜转移至硝酸纤维素膜。印迹物在TTBS(150mMNaCl、50mMTris、0.1%Tween-20，pH7.4)中洗涤，并用10%乳溶液封闭2小时。然后将印迹物与1:5000稀释的抗-PentaHisAlexaFluor647抗体一起孵育2小时。然后将印迹物用TTBS洗涤，并在Typhoon荧光扫描仪(AmershamBiosciences,SunnyValeCA)上扫描。安全制动片突变。分别使用采用以下引物的quickchange法，将DDD半胱天冬酶-3酶原安全制动片(SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:9)突变为ADD(SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:10)、DAD(SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQIDNO:ll)和DDA(SEQIDNO:7，SEQIDNO:8,SEQIDNO:12):gacagacagtggtgttg^gatgacatggcgtgtcataaaatacc(SEQIDN(hl3)、gacagacagtggtgttgatggtgacatggcgtgtcataaaatacc(SEQIDN0:14)和gacagacagtggtgttgatgatggcatggcgtgtcataaaatacc(SEQIDNO:15)。也可参见图9和图10。突变的威基带有下划线并大写表示。对所有突变质粒进行测序以确保整个基因序列的正确。所有突变质粒的表达与上述野生型半胱天冬酶-3酶原一致。PAC-1活化每个半胱天冬酶-3酶原突变体的能力通过将不同浓度的PAC-1加至96孔板中溶于半胱天冬酶分析緩冲液的90jiL50ng/mL野生型半胱天冬酶-3酶原和突变体半胱天冬酶-3酶原来确定。然后将平板在37r孵育12小时。然后将溶于半胱天冬酶分析緩冲液的10pi2mMAc-DEVD-pNA溶液加入各孔。在SpectraMaxPlus384孔平板读取器上于405nm每两分钟读一次板，持续2小时。确定各孔线性部分的斜率，并计算各个突变体活性升高倍数。pH对PAC-1活化半胱天冬酶-3酶原的影响。pH对PAC-1活化半胱天冬酶-3酶原的影响通过用pH半胱天冬酶分析緩冲液(25mMMES、25mMTris、25mMHEPES、25mMPIPES、100mMNaCl、10mMDTT、O,lmMEDTA、0.1%CHAPS和10%甘油)将半胱天冬酶-3酶原稀释为浓度50ng/mL来确定。然后将緩冲液改变成不同的pH值，并将90加入96孔板的各孔中。加入PA(KM吏其浓度为100^M，或者加入DMSO来作为各个pH值的对照。然后将板在37TC孵育12小时。然后将10^L溶于半胱天冬酶分析緩沖液的2mMAc-DEVD-pM溶液加入各孔。在SpectraMaxPlus384孑L平板读取器(MolecularDevices,SunnyvaleCA)上于405nm每两分钟读一次板，持续2小时。确定各孔线性部分的斜率，并计算各pH的活化升高倍数。膜联蛋白V染色。将500jiL含200PAC-1或仅有DMSO(作为对照)的培养基加入24孔板的孔内。然后将500jliL浓度为2x10fi细胞/mL的HL-60细胞加入24孔板。将板在37C孵育20小时。通过离心收集细胞并用PBS洗涤两次。细胞然后用膜联蛋白V结合緩沖液(IOmMHEPES、140mMNaCl、2.5mMCaCl2，pH7.4)洗涤，并重悬于100膜联蛋白V结合緩冲液。加入5jiL膜联蛋白V、AlexaFluor488缀合物，并将这些试管在室温下避光孵育15分钟。然后加入400pL膜联蛋白V结合緩冲液，之后再加入ljiL1mg/mL橫化丙咬溶液。每个细胞的荧光强度由流式细胞仪在525nm(绿色通道)和675nm(红色通道)确定。每个实验中对至少50，000个细胞进行了分析。凝聚染色质染色。将500jiL含200PAC-1或仅有DMSO(作为对照)的培养基加入24孔板的孔内。然后将500浓度为2x106细胞/mL的HL-60细胞加入24孔板。将细胞孵育20小时，并通过离心收集。然后，细胞用PBS緩冲液洗涤，之后加入水冷的100%乙醇。细胞在4°C过夜固定。固定后的细胞与2pg/mLHoechst-33258在室温下孵育30分钟。然后将一滴细胞加入显微镜用载玻片，并用No.1厚度的盖玻片盖片。凝聚染色质在ZeissAxiovert100显微镜下以400倍方文大倍数观察。z-vad-fmk引起的细胞死亡抑制。将100浓度为5x1()5细胞/mL的HL-60细胞加入96孔板的孔内。然后将细胞在存在或不存在100z-vad-fmk(细胞通透性广镨半胱天冬酶抑制剂)的情况下孵育1小时。然后加入不同浓度的PAC-l,并将细胞再孵育24小时。通过将20jiLMTS/PMSCellTiter96CellProliferationAssay试剂加入各个孔内来对细胞死亡进行定量。将平板在37X:孵育约45分钟直至形成有色产物。然后在SpectraMaxPlus384平板读取器(MolecularDevices,SunnyvaleCA)上于490nm测量吸光度。体内测定线粒体膜电位。将lml浓度为lxi(f细胞/mL的HL-60细胞加入24孔板的孔内。然后加入至浓度为100pM，或者仅加入DMSO作为对照。将细胞孵育不同时间，然后通过离心收集细胞。细胞用PBS洗涤，并用1mLPBS重悬。加入10pgJC-9染料，并将细胞在室温下避光孵育IO分钟。然后细胞用PBS洗涤两次，并在500jiLPBS中孵育。每个细胞的荧光强度由流式细胞仪在525nm(绿色通道)和675nm(红色通道)确定。每个实验中对50，000个细胞进行了分析。然后将红色通道的移位(shift)用于确定线粒体膜去极化的量。体内测定半胱天冬酶-3样活性。半胱天冬酶-3样蛋白酶活性的量通过细胞裂解物每分钟切割的Ac-DEVD-pM(N-乙酰基-ASP-Glu-Val-Asp-对-硝基苯胺)的量来确定。为完成这一测试，将50jiL含不同浓度PAC-l的培养基加入96孔板的孔中。将浓度为5x1()S细胞/mL的HL-60细胞加入平板中，并孵育不同时间。孵育之后，将平板以1000xg离心5分钟以沉淀细胞。然后，细胞用100jiLPBS洗涤，并重悬于150^L冰冷的半胱天冬酶分析緩冲液中。然后对各孔进行超声以裂解细胞。将90jiL细胞裂解物从各孔转移至新的平板中。将Ac-DEVD-pNA加入各孔，获得的终浓度为200^M。然后在SpectraMaxPlus384平板读取器(MolecularDevices,SunnyvaleCA)上于405nm每两分钟读一次板,持续2小时。确定各孔线性部分的斜率，并计算每分钟切割的Ac-DEVD-pNA的量。体内测定PARP切割。PARP切割的量通过使用体内PARP活性测定法确定。为完成该测试，将50pL含200jiMNAD+的培养基加入96孔板的对照孔内。然后将50jiL含200nMPAC-1和200NAD+的培养基加入实验孔内。然后将25pL浓度为5x106细胞/mL的HL-60细胞加入各孔。将细胞孵育不同时间，然后以1000xg离心5分钟。弃去细胞培养基并换上50jliL含25mM11202的裂解用PARP緩冲液(50mMTris、10mMMgCh、pH8.0、1%TritonX-IOO)。然后将平板在37X:孵育60分钟。为确定仍然存在的MD+的量，将20jiL2MK0H和2020%(v/v)苯乙酮(溶于乙醇)溶液加入96孔板的各孔中。然后将平板在4t:孵育IO分钟。将9088%(v/v)甲酸溶液加入96孔板的各孔中。然后将平板在设置为110。C的烘箱中孵育5分钟。冷却平板，然后在CriterionAnalystAD(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上读数，激发波长为360nm，发射波长为445訓，截止(cutoff)分色镜为400nm。荧光团使用1000W连续光谱灯激发1.6xi()5ps，对每个孔进行五次读数。然后计算每分钟切割的NAD+的摩尔数，并确定与对照孔相比剩下的PARP活性。不同细胞系中半胱天冬酶-3酶原的相对浓度。通过离心收集U-937、HL-60和人骨髓细胞，而所有其它细胞系首先通过胰蛋白酶消化来释放细胞，然后通过离心收集。所有的细胞均用PBS洗涤，并重悬于lmL冰冷的100%乙醇中。细胞在4r过夜固定。细胞以1000xg离心5分钟，用PBS洗涤，然后加入100pL用PBS1:1000稀释的抗半胱天冬酶-3抗体。细胞在室温下孵育2小时，然后用PBS洗涤五次。然后将细胞重悬于1mL含1:10，000稀释的抗小鼠AbCy3标记的抗体的溶液中，并在室温下避光孵育2小时。细胞用PBS洗涤五次，并重悬于500jiLPBS。每个细胞的荧光强度通过流式细胞仪在675nm(红色通道)确定。每个实验中对至少20，000个细胞进行了分析。细胞群的中值用于确定每个细胞系中半胱天冬酶-3酶原的相对浓度。不同细胞系中ICs。值的确定。将50jiL含不同浓度的PAC-1或依托泊苷的培养基加入96孔板除对照孔外的各孔中，对照孔仅含有DMSO。U-937、HL-60和人骨髓细胞通过离心收集，而全部其它细胞系在离心之前先用胰蛋白酶消化。然后细胞重悬于培养基中，并稀释为lxl(T细胞/mL(对于U-937、HL-60和人骨髓细胞)或50，000个细胞/mL(对于所有其它细胞系)。然后将50jiL细胞溶液加入各孔，并将平板分别孵育24小时(依托泊苷)或72小时(PAC-1)。细胞死亡通过加入20jiLMTS/PMSCellTiter96CellProliferationAssay试剂至各孔来定量。然后将平板在37r孵育约一个小时，直至形成有色产物。在SpectraMaxPlus384平板读取器(MolecularDevices,SunnyvaleCA)上于490mn测量吸光度。数据分析所有流式细胞术实验的数据使用SummitSoftware(Cytomation，FortCollinsC0)进4亍分析。所有的图4吏用TableCurve2D分析。RonaldHoffman教授(伊利诺州大学-芝加哥癌症中心)提供了人骨髓。GuySalvesen教授(Burnham研究所)提供了半胱天冬酶-3酶原和半胱天冬酶-7酶原表达载体。序列表-附件A的参考信息。单独附带的序列表信息(称为附件A)将被认为是本说明书的一部分，并且纳入本说明书。表l.序列表信息的总体情况。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实施例2.半胱天冬酶酶原活化化合物的合成。根据以下方案如方案1和/或方案2制备PAC-1和其它化合物。其它的变体可根据本领域已知的方法制备。买施例3.PAC-1的类似物。制备了PAC-1的类似化合物，并对其在体外直接活化纯化的半胱天冬酶-3酶原的能力进行了评估。表2.PAC-1和类似化合物的活性。在一个具体的实例中，依据方案2制备PAC-1:回汰闺波90S柳MH2NH2￡湖闺汰浅NH2N1H2BOH83%41f%T9<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例4.药物学实施方案下面描述了与药物学和药理学实施方案相关的信息，并可由本领域普通技术人员可获知的信息进一步补充。确切的制剂、给药途径和剂量由各个医生才艮据患者的病症来选择(参见例如Finglet.al.，inThePharmacologicalBasisofTherapeutics,1975，Ch.1p.1)。应注意到，主治医生知道根据毒性或根据器官功能障碍等情况如何以及何时终止、中断或调节给药。相反的是，若临床反应并不充分(考虑或不考虑毒性方面)，主治医生还知道将治疗调整为较高水平。治疗所研究疾病的给药剂量强度(magnitude)随待治疗病症的严重程度以及给药途径而变。例如，病症的严重程度部分地可通过标准的预后评价法来地评估。另外，剂量和可能的给药频率也可随情况(例如各个患者的年龄、体重和反应性)而变化。与上述方案相当的方案也可用于兽医学。根据待治疗的具体病症和所选择的靶向方法，可制备这些药剂并将其进行全身给药或局部给药。制备和给药技术可参见AlfonsoandGennaro(1995)以及本领域的其它文献。合适的途径包括例如口腔给药、直肠给药、经皮肤给药、阴道给药、经粘膜给药或肠内给药，肠胃外送递包括肌内注射、皮下注射或髓内注射，以及眼内给药、鞘内给药、静脉内给药或J^M内给药。对于注射或其它途径而言，本发明的药剂可在水溶液中制备，优选在生理相容的緩冲液例如Hanks'溶液、Ringeds溶液、注射用水、生理盐水緩沖液或其它溶液中制备。对于经粘膜给药，可在制剂中使用合适待穿透屏障的穿透剂。这些穿透剂通常为本领域所知。使用可药用载体来将本文公开的用于实施本发明的化合物制备成为适合全身给药或其它给药的剂型也落入本发明的范围内。通过选择合适的载体以及合适的制备方法，本发明的组合物(尤其是制备为溶液的那些组合物)可以胃肠外方式例如通过静脉内注射或其它途径给药。使用本领域已知的可药用栽体，合适的组合物容易被制备成为适合口腔给药的剂型。这类载体能将本发明的组合物制备成为待治疗患者口服的片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液、酏剂、溶液、悬液等形式。对于其它途径，制剂可被制备为膏剂、软膏、洗剂等。欲通过细胞内给药的药剂可使用本领域普通技术人员已知的技术给药。例如，这类药剂可被包裹至脂质体内、其它有助于膜转位的部分或其它靶向部分，然后以上述方式给药。脂质体可包括内部含水的球形脂质双层。脂质体形成时存在于水溶液中的全部分子可被掺入水性内部。脂质体内容物与外界微环境隔绝，并且由于脂质体与细胞膜融合，因此脂质体内容物可被有效送递至细胞质内。另外，由于疏水性，小的有机分子可通过细胞内方式直接给药。适合用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量活性成分的组合物，所述有效量可实现预期目的。有效量的确定在本领域的普通技术人员的能力范围之内，尤其在参考本文提供的公开内容和本领域的其它信息后o除了活性成分，这些药物组合物可包含包括赋形剂和辅剂在内的合适的可药用载体，所述可药用载体有助于将活性化合物加工成为可药用的制剂。所制备的口服制剂可为片剂、糖锭剂、胶嚢或溶液形式，包括制备用于緩释或仅在药物到达小肠或大肠时被释放的那些形式。本发明的药物组合物可通过其自身已知的方式制备，例如通过常规混合、溶解、混悬(suspending)、粒化、糖锭剂制备、悬浮(levitating)、乳化、胶嚢化、包裹(entra卯ing)、冻干和其它方法制备。胃肠外给药的药物制剂包括水溶形式活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬液可制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或运载体包括脂肪油例如麻油，或者合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬液可含有提高悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬液还含有合适的稳定剂或提高化合物溶解度从而可制备高浓度溶液的药剂。口服药物制剂可通过如下方法获得将活性化合物与固体赋形剂混合，任选碾磨所得到的混合物，如若需要，在加入合适的辅剂之后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖锭剂心。具体而言，合适的赋形剂为填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基曱基纤维素、羧曱基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如若需要，可添加崩解剂如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。任选地，为糖锭剂心提供有合适的糖衣。为此，可使用浓缩的糖溶液，所述糖溶液任选含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、抹剂溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加至片剂或糖锭剂糖衣，从而鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。可口服的药物制剂包括由明胶制备的推压配合式胶嚢，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制备的无缝软胶嚢。推压配合式胶嚢可含有活性成分，并混有填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)，并任选混有稳定剂。在软胶嚢中，活性化合物可溶解或悬浮于合适的液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，还可添加稳定剂。实施例5.用半胱天冬酶-3酶原的小分子活化物直接诱导癌细胞的细胞凋亡。摘要细胞凋亡级联反应中蛋白质的异常表达或突变是癌的标志。这些变化可阻止将促凋亡信号传递给执行者半胱天冬酶，由此阻止细胞凋亡引起的细胞死亡并允许细胞增殖。半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7是关键的执行者半胱天冬酶，以由上游信号活化的无活性酶原形式存在。重要的是，某些癌细胞中的半胱天冬酶-3酶原的水平相对于非癌对照要显著地高。我们在本文报道了小分子(PAC-1)的鉴定方法，所述小分子在体外直接将半胱天冬酶-3酶原活化为活性半胱天冬酶-3(ECs。为220纳摩尔)，并且会在多种细胞系中诱导细胞凋亡。与很多已知的抗癌药物不同，用PAC-1处理的细胞表现为半胱天冬酶-3酶原被立即活化，并且PAC-1的效力被证明是与细胞中含有的半胱天冬酶-3酶原的量成比例。在体外不能活化半胱天冬酶-3酶原的PAC-1衍生物也没有促凋亡活性。从原发性结肠肿瘤分离得到的癌细胞对于PAC-1的凋亡诱导比同一患者相邻非癌组织的细胞明显更敏感；这些癌细胞所含有的半胱天冬酶-3酶原比相邻非癌基本(primary)组织的细胞所含有的半胱天冬酶-3酶原平均多7倍。另外，结肠癌肿瘤的原代细胞对PAC-1的敏感性与半胱天冬酶-3酶原靶标的水平密切相关。最后，PAC-1作为单一实体，在三种不同的小鼠模型(包括其中PAC-1通过口服给药的两种模型在内)中表现出具有延緩肿瘤生长的活性。因此，PAC-1可在体内将半胱天冬酶-3酶原直接活化为半胱天冬酶-3,藉此，即便是在凋亡机制有缺陷的细胞中，该化合物也可诱导细胞凋亡。PAC-1是已知可直接活化半胱天冬酶-3酶原的第一种小分子；执行者半胱天冬酶的直接活化是一种被证实在其中半胱天冬酶-3酶原水平升高的很多癌中是有效的抗癌策略。引言。癌的标志是其对天然细胞凋亡信号的抗性。该抗性通常是由于细胞凋亡级联反应中关键蛋白的上调或下调所致，或者是由于编码这些蛋白的基因突变所致，这取决于癌的类型。这些变化均可出现在内源性凋亡途径(通过线粒体和半胱天冬酶-9得以实现)和外源性凋亡途径(涉及死亡受体和半胱天冬酶-8的作用)中。例如，已在癌中观察到合适水平的p53、Bim、Bax、Apaf-1、FLIP等发生改变，该改变可引起有缺陷的细胞凋亡级联反应，其中的一个缺陷是上游促凋亡信号并未被恰当传送来活化执行者半胱天冬酶半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7。由于大部分凋亡途径最终都涉及半胱天冬酶-3酶原的活化，因此这些遗传异常是凋亡回路中有效的"破坏份子"，由此使得这些细胞增殖失控。由于细胞凋亡在癌中具有极其重要的作用，已努力开发靶向细胞凋亡级联反应中的特定蛋白的治疗方法。例如，同促进Apaf-l寡聚化的化合物一样，p53、Bcl家族的蛋白的肽结合物或小分子结合物，或IAP的肽结合物或小分子结合物也具有促活性。但是，由于这其中的4艮多化合物均把向于凋亡级联反应上的上游位置或中间位置，因此下游蛋白发生突变的癌可能对它们的作用具有抗性。就治疗目的而言，理想的是鉴定直接活化细胞凋亡级联反应中最下游的促凋亡蛋白的小分子。另夕卜，如果该促凋亡蛋白的水平在癌细胞中升高，那么这种治疗策略成功的几率更大。半胱天冬酶-3酶原转化为半胱天冬酶-3可产生具有活性的"执行者"半胱天冬酶，该半胱天冬酶随后催化水解大量蛋白质底物。活性半胱天冬酶-3是异二聚体的同型二聚体，通过半胱天冬酶-3酶原的蛋白水解产生。在体内，该蛋白水解活化通常通过半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9的作用发生。为确保该酶原不被过早活化，半胱天冬酶-3酶原具有防止接近蛋白水解的IETD位点的三天门冬氨酸"安全制动片"。该安全制动片能使半胱天冬酶-3酶原对抗自体催化性活化和半胱天冬酶-9引起的蛋白水解。安全制动片的位置对pH敏感；因此，一旦细胞酸化(发生在细胞凋亡期间)，那么就认为安全制动片允许接近蛋白水解位点，并且活性半胱天冬酶-3可通过半胱天冬酶-9的作用或通过自体活化机制产生。某些类型的癌组织的细胞具有水平升高的半胱天冬酶-3酶原。对20名结肠癌患者原代分离物的研究表明，平均而言，这些分离物中的半胱天冬酶-3酶原相对于相邻非癌组织升高六倍。另外，某些成神经细胞瘤、淋巴瘤和肝癌中的半胱天冬酶-3酶原水平升高。事实上，NCI使用的60种细胞系中半胱天冬酶-3酶原水平的系统评估表明，特定肺癌、黑素瘤、肾癌和乳腺癌表现出半胱天冬酶-3酶原的水平大大升高。考虑到活性半胱天冬酶-3对于成功的细胞凋亡的重要作用、某些癌细胞类型中半胱天冬酶-3酶原的高水平以及使人感兴趣的安全制动片介导的对其自体活化的抑制，我们认为可鉴定直接活化半胱天冬酶-3酶原的小分子，并且这些分子在靶向的癌症疗法中可能具有很好的应用前景。在本说明书中，我们报道了在体外鉴定半胱天冬酶-3酶原的小分子活化物PAC-1。PAC-1在癌细胞系中具有强有力的促细胞凋亡作用，其作用方式与半胱天冬酶38-3酶原水平成比例。其促凋亡作用是由于其对半胱天冬酶-3酶原的直接快速活化，并且它对于原代结肠癌分离物且在三种不同的小鼠癌模型中是有效的。对大约20,500种结构不同的小分子在体外活化半胱天冬酶-3酶原的能力进行了筛选。根据标准方法在大肠杆菌中表达和纯化半胱天冬酶-3酶原。将半胱天冬酶-3酶原加入384孔板的孔中，并加入化合物，使其终浓度为约40jiM(半胱天冬酶-3酶原的终浓度为50ng/mL)。然后将各板在371C孵育两个小时，之后加入半胱天冬酶-3肽底物Ac-Asp-Glu-Val-Asp-对-硝基苯胺(Ac-DEVD-pNa)，使其浓度为200^M。在此后两小时的时间内于405nm追踪对硝基苯胺生色团。在所评估的大约20，500种化合物中，有四种使得半胱天冬酶-3肽底物的水解相对于本底显著升高。这四种中有一种表现出对体外半胱天冬酶-3酶原活化有强的剂量依赖作用。如图1A所示，浓度为0.22jiM的这第一种半胱天冬酶酶原活化化合物(PAC-1)获得半胱天冬酶-3酶原半最大活化。该化合物并不只是简单地升高半胱天冬酶-3自身的活性，原因在于它对加工完全的半胱天冬酶-3酶的催化活性没有影响(图1A)。半胱天冬酶-3具酶原由N端前结构域(残基l-28)、随后为由亚基间接头分开的一个大亚基(17kDa)和一个小亚基(12kDa)组成22。两个半胱天冬酶-3酶原单体在体内组装形成同型二聚体，所述同型二聚体通过在亚基间接头中的D175进行的切割而被活化。前结构域的准确作用尚不清楚，并且已表明仅亚基间区域的切割就足以获得完全的催化活性。尽管半胱天冬酶-3酶原具有足够的催化活性来驱动自身的蛋白水解成熟，但是由于存在3个氨基酸安全制动片，它对自体活化具有高度抗性；但是，安全制动片突变时，则可观察到半胱天冬酶-3酶原显著的自体活化。为直接评估PAC-1催化半胱天冬酶-3酶原成熟为活性半胱天冬酶-3的能力，将半胱天冬酶-3酶原蛋白与100一PAC-1—起孵育一至五小时。如图1B的蛋白质印迹所示，PAC-1以时间依赖方式诱导切割半胱天冬酶-3酶原，在4小时后观察到加工>50%。相反，在緩沖液中孵育的半胱天冬酶-3酶原表现为在这一相同时段基本上并未发生自体活化。在该分析中，浓度为5jiM的PAC-1也是有效的。然后对半胱天冬酶-3酶原的安全制动片区域中的关键天门冬氨酸三联体残基Asp179、Aspl80和Aspl81进行了丙氨酸置换。这些位置的突变全都显著降低了PAC-1活化半胱天冬酶-3酶原的能力，某些突变对PAC-1引起的半胱天冬酶-3酶原活化更为不利(图2A)。同半胱天冬酶-3一样，半胱天冬酶-7也以由蛋白水解活化的无活性酶原形式存在。半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7两者均为执行者半胱天冬酶，并且具有相当的结构同源性。尽管半胱天冬酶-7酶原在关键三联体(Asp-Thr-Asp)中仅有两个天门冬氨酸，而非三个，但是预计它也具有相似的安全制动片区域。如图2B数据所示，PAC-l也可活化半胱天冬酶-7酶原，但是较其对半胱天冬酶-3酶原的活化效率效率较低(EC5。为4.5mM，半胱天冬酶-3酶原活化的为EC5。0.22fiM)。PAC-1活化半胱天冬酶-7酶原的效力与其对半胱天冬酶-3酶原的Asp-Ala-Asp突变体的效果相当(EC5。=2.77jiM)。正如所预料的那样，pH值较低时PAC-1的作用消失，这种情况下半胱天冬酶-3酶原进行快速自体活化(图2C)。已发现PAC-1可在多种癌细胞系中诱导细胞凋亡。在HL-60细胞中，PAC-1的加入致使相当的磷脂酰丝氨酸从细胞膜上暴露出来，并伴有显著的染色质凝聚(图3A、3B)。另外，该化合物诱导半胱天冬酶底物PARP-1的切割(通过体内PARP活性分析评估)，并引起线粒体膜的去极化(见下文)。通过显孩i镜还;f见察到PAC-1处理的细胞有显著的细胞空泡。此外，PAC-1的毒性在半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk存在的情况下可被消除。若PAC-1的确是通过直接活化半胱天冬酶-3酶原来诱导细胞凋亡，那么凋亡事件的时程相对于用标准促凋亡药剂观察到的时程应有所改变。已知依托泊苷可通过内源性途径诱导细胞凋亡；因此，线粒体膜去极化之后，依托泊普处理的细胞中半胱天冬酶-3酶原会被活化。事实上，在用10jiM依托泊苷处理的HL-60细胞中，观察到线粒体膜的去极化，随后检测到半胱天冬酶-3样活性(图4A)。相反，用PAC-l处理细胞得到显著不同的结果。采用该化合物，首先观察到的细胞凋亡的生物化学标志是半胱天冬酶-3样酶活性，该活性在加入化合物的数分钟内出现，并且50%的活化正好在2小时内且在任何显著线粒体膜去极化之前发生(图4B)。另外，在PAC-1处理的细胞中PARP活性快速减少，而该减少在依托泊苷处理的细胞中于较晚的时间点观察到(图4C)。对照实验表明PAC-1并不能直接抑制PARP-1的酶活性。在典型的凋亡事件顺序中，线粒体膜去极化，半胱天冬酶被活化，并且半胱天冬酶底物(如PARP-1)被切割。PAC-1处理的细胞表现出半胱天冬酶-3/-7的快速活化(在线粒体膜去极化前)和半胱天冬酶底物(PARP-1)的快速切割，这一观察结果表明，该PAC-1是通过直接活化半胱天冬酶-3酶原展现其细胞毒性的。为进一步确定PAC-1的效力，对该化合物在具有不同水平半胱天冬酶-3酶原的癌细胞系中诱导细胞死亡的能力进行了评估。首先对存在于多种癌细胞系(白血病、淋巴瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、肾上腺癌和肾癌)的半胱天冬酶-3酶原的水平进行了测定。获得了PAC-1对这些细胞系的细胞死亡诱导ICs。值。结合起来的数据表明细胞的半胱天冬酶-3酶原浓度与对PAC-1的敏感性之间有着很强的相关性(图4D、4E)。PAC-1对肺癌细胞系NCI-H226的效力最大，ICs。为0.35;iM。我们发现该细胞系具有的半胱天冬酶-3酶原的浓度比基线水平的高五倍。重要的是，已知有一种癌细胞系(MCF-7，乳腺癌细胞)并不表达半胱天冬酶-3酶原。PAC-l对MCF-7细胞基本没有影响，IC5。>75jiM才能诱导死亡。相反，依托泊苷在细胞培养物中的效力和半胱天冬酶-3酶原的细胞水平效力之间并未表现出这种相关性。例如，依托泊苦在诱导三种黑素瘤细胞系(UACC-62、CRL-1872和B16-FIO)、乳腺癌细胞系(Hs578t)和肺癌细胞系(NCI-H226)的死亡方面是无效的(IC5。>50^M);这些细胞系的半胱天冬酶-3酶原水平分别为1.0、2.4、1.9、3.7和5.3。依托泊香对于HL-60、U-937、SK-N-SH和PC-12是有效的(IC5。<1，这些细胞系的半胱天冬酶-3酶原水平分别为4.3、4.0、4.7和4.4。因此，总的来说，半胱天冬酶-3酶原水平和依托泊苷的IC5。之间没有相关性。合成了几种PAC-1的衍生物，并就其半胱天冬酶-3酶原活化性质及其对细胞培养物中的癌细胞的作用对其进行了评估(表3)。缺少烯丙基基团的PAC-1衍生物(脱烯丙基PAC-1)能以与PAC-1相当的水平诱导半胱天冬酶-3酶原活化和细胞死亡。但是，在任何一种分析中，所有其它衍生物并没有表现出活性。因此，尽管似乎烯丙基对生物学活性无关紧要，但是酚羟基和芳环全都对PAC-1活性至关重要。这一数据也与预测的PAC-1作用机理相一致；在体外不能活化半胱天冬酶-3酶原的化合物对培养物中的癌细胞没有促凋亡作用。为在临床癌分离物中检测这一直接的、小分子介导的半胱天冬酶-3酶原活化方法，我们获得了来自卡里基金医院(CarleFoundationHospital,Urbana，IL)的18名患者的新切除的结肠肿瘤(以及相邻非癌组织)。分离癌组织和非癌组织，并对来源于这些组织的细胞的半胱天冬酶-3酶原水平及其对PAC-1的敏感性进行了评估。如图5A所示，在所有病例中，相对于来自同一患者的相邻非癌组织的细胞，癌细胞具有升高的半胱天冬酶-3酶原水平(升高1.7-至17.2倍，平均为7.6倍)。另外，这些癌细胞对PAC-1的死亡诱导相当敏感。在原代癌细胞中，PAC-1以0.007-1.41jiM的ICs。值诱导细胞死亡，而在相邻非癌组织中，PAC-1以5.02-9.98的ICs。值诱导细胞死亡(图5B和表4)。半胱天冬酶-3酶原水平升高的癌组织对PAC-1极其敏感。例如，在患者17的癌组织中，PAC以7nM的ICs。诱导死亡，并且这些细胞对PAC-1的敏感性比相邻正常组织的细胞的高出700倍。还参见图6A,该图示出在约54天的一段时间内患者1、2和3的正常组织和癌组织中的相对半胱天冬酶-3酶原浓度。图6B显示癌组织中的细胞对PAC-1的敏感性与正常组织的细胞相比高出约80倍。除了来自18名患者的非癌组织的细胞外，还针对以下四种其它非癌组织类型对PAC-1进行了评估自健康供体的骨髓分离得到的白细胞、Hs888Lu(肺成纤维细胞)、MCF-IOA(乳腺成纤维细胞)和Hs578Bst(乳腺上皮细胞)。值得注意的是，非癌细胞类型属于具有最低量半胱天冬酶-3酶原的那些细胞类型，并且相比较而言，PAC-1在这些细胞中诱导死亡的能力较弱，ICs。值为3.2-8.5jiM(图5B,绿色菱形)。由图5B显而易见的是，PAC-1在多种细胞类型(非癌细胞系、非癌原代细胞、癌细胞系、原代癌细胞)中诱导死亡，其方式与半胱天冬酶-3酶原的水平直接相关。癌细胞中半胱天冬酶-3酶原的升高使得PAC-1可在这些细胞类型中选择性诱导死亡。使用緩释模式的药物送递，在小鼠异种移植模型中对PAC-1进行评估。在该模型中，使用ACHN(肾癌)细胞系在切除卵巢的雌性无胸腺BALB/c小鼠(棵鼠)中形成皮下肿瘤。一旦测得肿瘤大于约30mm2，则通过植入提供緩慢而稳定的化合物释放水平的PAC-1和胆固醇的丸剂来给药。使用了三组小鼠，丸剂含有0mg、1mg和5mgPAC-1，每组六只小鼠，每只小鼠有四个紳瘤。对肺瘤大小监控了约8周。如图5C所示，在植入含5mgPAC-1的丸剂的小鼠中，胂瘤生长被显著延緩。在实验最后一周的摄食评估表明，三组小鼠之间食物消耗水平没有差异。处死小鼠之后，从每只小鼠收集血浆样本，并分析每个样本的PAC-1含量。对于接受5mg的PAC-1丸剂的小鼠而言，该分析表明，在54天实验之后血浆中存在的PAC-1的浓度为5nM。在另一小鼠异种移植模型中对PAC-1进行了评估，该模型使用口服给药作为药物送递模式。在该模型中，使用NCI-H226(肺癌)细胞系在雄性无胸腺BALB/c-"w/力i/小鼠(5周龄，SLC，Hamamaysu，日本)中形成了皮下异种移植肿瘤，每组八只小鼠，每只小鼠三个肿瘤。在小鼠体内形成肿瘤之后，用浓度为0、50或100mg/kg的PAC-1通过口腔管祠法处理小鼠，每天一次，共进行21天，一周之后处死。如图5D清楚所示，PAC-1的口服给药以剂量依赖方式显著延緩了肺瘤生长。最后，在小鼠模型中对PAC-1进行了评估，其中NCI-H226细胞通过尾静脉注射被注射至雄性无胸腺BALB/c-i:///"小鼠体内。整个实验持续了28天；通过口腔管饲法在第1-4天和第7-11天用PAC-1(100mg/kg)处理小鼠，每天一次。在其它日子里小鼠并未被给予PAC-1。第二组小鼠仅接受载体。28天之后处死小鼠，并对其肺进行检测。如图5E所示，对照小鼠的肺(具有明显的灰色肿瘤块)和PAC-1处理小鼠的肺之间有着明显的差异。还显示了用gefitinib(IressaTM;AstraZeneca)处理的动物的结果。由于细胞凋亡级联反应中各种蛋白质分配的异常表达或突变，癌细胞对促凋亡信号的敏感性通常有所降低。因此，很多类型的癌不仅对于凋亡性细胞死亡的内源性信号具有显著的抗性，而且也对通过相似机理起作用的化疗药剂具有显著的抗性。半胱天冬酶-3酶原的水平在某些癌中的异常上升提供了使用该现有的细胞内蛋白库来直接诱导细胞凋亡的机会，从而避开级联反应通常没有功能的上游部分。PAC-1在体外诱导半胱天冬酶-3酶原的自体活化。在细胞培养物中，PAC-1处理快速诱导了半胱天冬酶-3样活性。然后，半胱天冬酶-3介导的抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bel-XL等)的切割可能诱导线粒体膜的去极化并放大细胞凋亡。另外，PAC-1对各种癌细胞类型和非癌细胞类型的效力与细胞中的半胱天冬酶-3酶原的浓度成比例。由于从切除的结肠肿瘤分离的原代癌细胞具有的升高半胱天冬酶-3酶原水平，因此这些细胞较相邻非癌组织的细胞对PAC-1敏感地多。值得注意的是，PAC-1对其有效的几种细胞系具有使其可对抗细胞凋亡的错误凋亡途径；例如，Apaf-l表达在SK-MEL-5细胞中显著降低，Bcl-2在NCI-H226肺癌细胞系中it^达。最后，PAC-1在三种不同的小鼠癌模型(包括其中PAC-1是通过口服给药的两种模型)中是有效的。本文给出的数据支持这一理念半胱天冬酶-3酶原活^f匕化合物对于常见癌症极其有效，在所述常见癌症中半胱天冬酶-3酶原水平异常高。对癌活检组织中半胱天冬酶-3酶原水平的评估简单而快速；因此，化合物例如PAC-1的潜在有效性可通过具有高度准确性的先验进行评估。这类个性化医学疗法优于依赖普通细胞毒素的疗法，并且在抗癌疗法中是有价值的。GuySalvesen教授(Burnham研究所)提供了半胱天冬酶-3酶原和半胱天冬酶-7酶原表达栽体。图1和2.PAC-1的结构示于说明书的其它地方。图1A)PAC-1引起的半胱天冬酶-3酶原和活性半胱天冬酶-3的体外活化。PAC-1活化半胱天冬酶-3酶原，EC5。=0.22-。图1B)由于PAC-1诱导，半胱天冬酶-3酶原被切割成为活性半胱天冬酶-3。半胱天冬酶-3酶原在大肠杆菌中;故重组表达为带有N端His-6标签并净皮纯化。用抗-His-6抗体进行免疫印迹。在不存在PAC-l时，没有观察到半胱天冬酶-3酶原的成熟。在存在100PAC-1时，在1小时内观察到形成p19片段的切割，并且在4小时后观察到>50%的切割。在该分析中，5]nM的PAC-1也是有效的。图2A)PAC-1引起的半胱天冬酶-3酶原的"安全制动片"区域的突变体的活化。PAC-l对野生型半胱天冬酶-3酶原(DDD)的活化ECs。为0.22jiM，对突变体的EC5。值为2.77jiM(DAD)、113(DDA)和131(ADD)。图2B)PAC-1活化半胱天冬酶-7酶原，ECs。为4.5nM。图2C)PAC-1活化半胱天冬酶-3酶原对pH的依赖性。pH较低时，安全制动片关闭，半胱天冬酶-3酶原基本最大程度被活化。误差线表示平均值的标准偏差。图3和4.PAC-1在HL-60细胞中诱导细胞凋亡。图3A)用100^iMPAC-1处理20小时后磷脂酰丝氨酸的暴露情况(通过膜联蛋白V染色测量)。在该分析中，5MM的PAC-1也是有效的(参见支持图2)。图3B)在用100PAC-1处理20小时后通过Hoescht染色后观察到的染色质凝聚。图4A)用10jiM依托泊苷处理的HL-60细胞中，线粒体膜的去极化(固P)和半胱天冬酶-3样活性。图4B)用100PAC-1处理的HL-60细胞中，线粒体膜的去极化(MMP)和半胱天冬酶-3样活性。图4C)PAC-l处理(IOOfiM)在HL-60细胞中诱导细胞PARP活性快速下降，这与细胞的半胱天冬酶-3/-7的立即活化一致。相反，依托泊苦(IOnM)处理的细胞表现出在晚得多的时间点PARP活性才降^f氐。图4D和图4E)PAC-1以半胱天冬酶-3酶原依赖方式诱导细胞死亡。对于多种不同的癌细胞系，确定半胱天冬酶-3酶原水平(通过采用抗半胱天冬酶-3酶原抗体的流式细胞术)，并测量PAC-1的ICs。(通过用一系列的PAC-1浓度处理72小时，并用MTS分析定量)。在已知具有高水平半胱天冬酶-3酶原的NCI-H226肺癌细胞系中，PAC-l相当有效(ICfO.35^M)。误差线表示平均值的标准偏差。表3.PAC-1和脱烯丙基PAC-1在体外活化半胱天冬酶-3酶原，并在细胞培养物中的癌细胞中诱导死亡，但是其它结构类似物并没有半胱天冬酶-3酶原的体外活化作用，也不能在细胞培养物中诱导死亡。图5.图5A)半胱天冬酶-3酶原水平在来源于新切除的结肠癌组织的细胞中升高。新切除的原发性结肠肿瘤(以及相邻非癌组织)获自18名不同的患者，分离癌组织和非癌组织，并使用抗半胱天冬酶-3酶原抗体和流式细胞术测量每一个的半胱天冬酶-3酶原水平。平均而言，与来源于同一患者的相邻非癌组织的细胞相比，癌组织的细胞具有的半胱天冬酶-3酶原升高7.6倍。图5B)PAC-1以与半胱天冬酶-3酶原的细胞水平成比例的方式诱导细胞死亡。红色圆圏表示来自18个结肠肿瘤的原代癌细胞。黑色三角代表图4D所示的相同癌细胞系。绿色菱形为四种非癌细胞类型Hs888Lu(肺成纤维细胞)、MCF-10A(乳腺成纤维细胞)、Hs578Bst(乳腺上皮细胞)和自健康供体的骨髓分离得到的白细胞。蓝色方块为自18名患者的肿瘤边缘分离得到的原代非癌细胞。表4)来源于原发性结肠癌组织的细胞对于PAC-1的死亡诱导比来源于同一患者的相邻非癌组织的细胞敏感得多。图5C)PAC-1在异种移植的癌症模型中减少肿瘤的生长。使用ACHN(肾癌)细胞系，通过皮下注射形成肿瘤，每组六只小鼠，每只小鼠四个肿瘤。一旦肿瘤长到约30mm2,则将胆固醇丸剂形式的PAC-1植入。误差线表示平均值的标准误差。图5D)在小鼠的异种移植^i型中，PAC-1的口服给药显著延緩了肿瘤生长。使用NCI-H226(肺癌)细胞系，通过皮下注射形成肿瘤，每组八只小鼠，每只小鼠三个肺瘤。在第1-21天通过口腔管饲法给予PAC-1或载体，每天一次。误差线表示平均值的标准误。图5E)在静脉内注射模型中，PAC-1的口服给药显著延緩了肿瘤生长。通过静脉内注射给小鼠注射NCI-H226(肺癌)细胞系。按照文本中描述的方案，通过口腔管饲法用PAC-1(100mg/kg)处理小鼠。图像示出小鼠的肺，没有接受PAC-1的小鼠的肺上具有大量灰色肿瘤块。相反，接受PAC-1的小鼠基本上没有可观察到的灰色物质。表3.表现出活性水平的选定化合物化合物半胱天冬酶HL-60细胞中-3酶原活化死亡诱导的的EC5",IC50((iM)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>表4.患者体内PAC-1活性的浓度水平<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>实施例6.在小鼠的肺癌模型中测试PAC-1采用使用NCI-H226(肺癌)细胞的异种移植模型。以10mg/kg通过腹膜内方式(i.p.)给予PAC-1。用40mg/kg的gefitinib(IressaTM;AstraZeneca，Wilmington,Delaware)(使用每组五只小鼠)进行效力的比较。结果示于图7，表明PAC-1引起肿瘤体积的生长减緩。实施例7.组合矛汴生物、合成及治疗用途制备了很多作为PAC-1结构衍生物的化合物。酰肼基团与醛基反应，产生衍生化合物的组合文库。3皮命名为L1-L20的酰肼前体群组(AX)中的任一个都可用来形成肼类，所述肼类与被命名为1-28的醛基群组(BX)中的任一个进行反应，由此产生560种PAC-1衍生化合物。使用本文所述方法并根据本领域已有的知识合成衍生化合物。除了图8A和8B外，还参见下面的方案和组分结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>赵25262728在一个实施方案中，这些衍生化合物可被进一步修饰，例如用以改变性质如活性、可溶性、毒性、稳定性和/或其它与药物应用有关的性质。衍生化合物可用作抗癌药剂。通过是否具有抗肺瘤活性、能否进4亍细胞凋亡调节和/或半胱天冬酶-3酶原活化来确认化合物。例如，可使用新取出的结肠癌原代分离物来评估半胱天冬酶-3酶原水平以及细胞对测试化合物水平的敏感性，其中测试化合物为PAC-1或衍生化合物。根据化合物在癌细胞和正常细胞中诱导细胞死亡的倾向对化合物进行分类。在进一步评估衍生化合物时，进行体外和体内测试。通过暴露于肝微体测试了稳定性。实施例8.某些衍生物相对于PAC-1的活性在HL-60细胞系中测试了PAC-1和某些衍生物，并测定了ICs。值。结果示于表5(其中L一和R—标记分别指上文AX和BX系列中示出的结构)。几种PAC-l衍生物展现出的活性水平通常比PAC-l化合物的活性水平高出大约一个数量级。表5.<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>关于通过援引的参考文献和变化方案的声明整个申请中的全部参考文献例如专利文件(包括授权的专利或等同物、专利申请公开文本、未7>开的专利申请)和非专利文献或其它来源材料，均通过援引全文纳入本文，就如同通过援引分别引入一样，到每篇参考文献至少部分与本申请的公开内容一致的程度(例如，部分不一致的参考文献可通过援引纳入本文，除了参考文献部分不一致的部分外)本申请的任何一个或多个附件通过援引纳入作为说明书和/或附图的一部分。在本文使用术语"包括"、"包含"、"包含有"或"含有"的情况下，它们被解释为说明所提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但是并不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、组分或其组的存在或加入。还旨在嚢括本发明的不同实施方案，其中术语"包括"、"包含"或"包含有"任选地由在语法上相似的术语代替，例如"由……构成"或"基本由……组成"，由此描述没有必要共同存在的其他实施方案。为清楚起见，本文所使用的"含有"是"具有"、"包括"、"含有"或"其特征在于"的同义词，并且是嚢括性的或开放式的，并不排除其他并未提及的要素或方法步骤。本文所使用的"由……组成"排除了未在权利要求书中具体提及的任何要素、步骤、组成或成分。本文所使用的"基本由......组成"并不排除基本上不影响权利要求的基本的和新的特征(如不影响活性成分)的材料或步骤。在本文的每个实例中，术语"含有"、"基本由……组成"和"由……组成"中的任何一个可用其他两个术语中的任何一个何一个或多个要素、」个i多个限制不存在的情况下实施。^'参照各个具体的和优选的实施方案和技术对本发明进行了描述。但是，应理解的是，可在维持在本发明的精神和范围内做出很多改变和改进。本领域的普通技术人员可理解的是，并未在说明书中具体描述的那些组合物、方法、装置、装置元件、材料、任选的特征、步骤和技术也可被应用来实施本文广义公开的发明，而无需求助于过多的实验。本发明旨在嚢括本文所描述的组合物、方法、装置、装置元件、材料、步骤和技术的全部本领域已知的功能性等价物及其部分。但凡公开某一范围，则旨在嚢括所有小范围和各个数值。本发明不限于所公开的实施方案，包括在附图中示出的或在说明书中举例说明的那些实施方案，这些实施方案以举例或示例方式而非限制方式给出。本发明的范围仅受限于权利要求。参考文献下列申请通过援引全文具体纳入Hergenrother等人于2003年10月30日提交的美国临时专利申请No.60/516556;Hergenrother等人于2004年8月20日提交的美国临时专利申请No.60/603246;Hergenrother等乂、于2004年10月27日提交的U.S.10/976,186。以及US6,762,045,关于来源于膜的半胱天冬酶-3，包含该酶的组合物及其使用方法；US6,534,267，关于编码半胱天冬酶的活化物的多核苷酸；US6，403，765，关于截短型Apaf-l及其使用方法；Choong等人的于2005年4月12日授权的6，878，743和US6,303,329;WangXiaodong等人的于2004年4月22日公开的US20040077542;ShiYigong的于2004年9月16日公开的US20040180828。SleeEAetal.，Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe)fluoromethylketone(Z-VAD.FMK)inhibitsapoptosisbyblockingtheprocessingofCPP32,BiochemJ.1996Apr1;315(Pt1):21-4.1.Hanahan，D.&Weinberg,R，A.Thehallmarksofcancer.Cell100，57-70(2000).2.Okada，H.&Mak，T.Pathwaysofapoptoticandnon-apoptoticdeathintumourcells.NatureRev.Cancer4，592—603(2004).3.Roy,S.etal.Maintenanceofcaspase-3proenzymedormancybyanintrinsic"safetycatch"regulatorytripeptide.Proc.Natl.Acad.Sci.98,6132-6137(2001).4.Svingen,P.A.etal.ComponentsofthecelldeathmachineanddrugsensitivityoftheNationalCancerInstituteCellLinePanel.Clin.CancerRes.10，6807-6820(2004).5.Lowe,S.W.，Cepero，E.&Evan,G.Intrinsictumorsuppression.Nature432，307-315(2004).6.Vogelstein,B.￡Kinzler，K.W.Achilles'heelofcancer.Nature412，865-866(2001).7.Traven，A.,Huang,D.C.&Lithgow，T.Proteinhijacking:keyproteinsheldcaptiveagainsttheirwill.CancerCell5，107—108(2004).8.Soengas,M.S.etal.InactivationoftheapoptosiseffectorApaf-linmalignantmelanoma.Nature409，207-211(2001).9.Wajant，H.TargetingtheFUCEinhibitoryprotein(FLIP)incancertherapy.Mol.Interv.3，124—127(2003).10.Denicourt，C,&Dowdy,S.F.Targetingapoptoticpathwaysincancercells.Science305,1411-1413(2004).11.Vassilev，L.T.etal.Invivoactivationofthep53pathwaybysmal卜moleculeantagonistsof隱2.Science303，844-848(2004).12.Degterev,A，etal.Identificationofsmall—moleculeinhibitorsofinteractionbetweentheBH3domainandBcl-XL.NatureCellBiol.3,173-182(2001).13.Becattini，B.etal.Rationaldesignandrealtime,in-celldetectionoftheproapoptoticactivityofanovelcompoundtargetingBel—XL.Chem.Biol.11，389-395(2004).14.Wang,J.-L.etal.Structure-baseddiscoveryofanorganiccompoundthatbindsBcl-2proteinandinducesapoptosisoftumorcells.Proc.Natl.Acad.Sci.97，7124-7129(2000).15.Li，L.etal.AsmallmoleculeSmacmimicpotentiatesTRAIL-andTNFa-mediatedcelldeath.Science305,1471—1474(2004).16.Nguyen,J.T.&Wells,J.A.Directactivationoftheapoptosismachineryasamechanismtotargetcancercells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，7533-7538(2003).17.Jiang,X.etal.DistincitiverolesofPHAPproteinsandprothymosin-ocinadeathregulatorypathway.Science299，223-226(2003).18.Boatright，K.M.&Salvesen，G.S.Mechanismsofcaspaseactivation.Curr.Opin.Cell.Biol.15，725-731(2003).19.Nakagawara，A.etal.Highlevelsofexpressionandnuclearlocalizationofinterleukin-lPconvertingenzyme(ICE)andCPP32infavorablehumanneuroblastomas.CancerRes.57，4578-4584(1997).20.Izban，K.F-etaLCharacterizationoftheinterleukin-lP-convertingenzyme/Ced-3-familyprotease,caspase-3/CPP32，inHodgkin'sdisease.Am.J.Pathol.154，1439-1447(1999).21-Persad，R.etal.Overexpressionofcaspase-3inhepatocellularcarcinomas.ModernPatholo.17，861-867(2004).22.Pop,C.，Feeney，B.，Tripathy,A.&Clark，A.C.Mutationsintheprocaspase-3dimerinterfaceaffecttheactivityofthezymogen.Biochemistry42，12311-12320(2003).23.Stennicke，H.R.etal.J.Biol.Chem'273，27084-27090(1998).24.Denault，J--B.&Salvesen,G.S.Humancaspase-7activityandregulationbyitsN-terminalpeptide.J.Biol.Chem.278,34042-24050(2003).25.Putt，K.S.,Beilman，G.J.&Hergenrother,P.J.DirectquantitationofPoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)activityasameanstodistinguishnecroticandapoptoticdeathincellandtissuesamples.ChemBioChem6，53-55(2005).26.Liang，Y.，Nylander,K.D.，Yan，C.&Schor，N.F.Roleofcaspase3—dependentBcl-2cleavageinpotentiationofapoptosisbyBcl-2.Mol.Pharmacol.61，142-149(2002).27.Fujita，N.，Nagahshi,A"Nagashima,K.，Rokudai，S.&Tsuruo，T.AccelerationofapoptoticcelldeathafterthecleavageofBcl-XLproteinbycaspase-3-1ikeproteases.Oncogene17，1295-1304(1998).28.Earnshaw,W.C"Martin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细胞凋亡的治疗方法中的用途。公开了用于修饰半胱天冬酶酶原如半胱天冬酶-3酶原的化合物，并且具体的实施方案能将半胱天冬酶-3酶原和半胱天冬酶-7酶原直接活化为效应物形式的半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7。癌细胞类型中的半胱天冬酶-3酶原水平不同；几种类型具有相对较高的水平，并具有对于采用本文所述化合物和方法的化疗法的较高敏感性。治疗应用可适用于各种癌症病症和细胞类型，例如乳腺、肺、脑、结肠、肾、肾上腺、黑素瘤等等。文档编号A61K31/4965GK101184491SQ200680018292公开日2008年5月21日申请日期2006年5月26日优先权日2005年5月26日发明者G·W·陈,J·M·皮尔森,K·S·帕特,P·J·赫甘罗斯尔申请人:伊利诺伊大学评议会