使用连蛋白的拮抗剂防止胰细胞丢失或再生胰细胞的方法

专利名称：使用连蛋白的拮抗剂防止胰细胞丢失或再生胰细胞的方法
使用连蛋白的拮抗剂防止胰细胞丟失或再生胰细胞的方法 本发明的开发由马里兰巴尔的摩的马里兰大学支持。这里所描述的发明由来自国立卫生研究院(National Institutes of Health )的基金(DK 66630 和DK48373 )支持。政府拥有某些权利。发明领域本发明提供防止或减緩胰腺P-细胞丢失的材料和方法。进一步地，本 发明还提供再生细胞特别是胰腺(3-细胞的材料和方法。在某些方面，连蛋 白(zonulin)的拮抗剂(例如肽拮抗剂)可用于本发明的实施。发明背景I.肠紧密连接的功能和调节肠上皮代表了在外环境和内环境之间的最大界面(大于 2,000,000cm2 )。细胞间紧密连接("紧密连接，，)功能的保持会防止潜在有 害的环境因素如细菌、病毒、毒素、食物变应原和大分子穿越肠屏障。在 许多影响胃肠道的临床病症包括食物变态反应、肠道感染、吸收不良综 合征和炎症性肠病中，此功能都受到显著^5皮坏。紧密连接(tj)或闭锁小带(下文中称为"ZO")是吸收和分泌上皮 细胞的标志之一 (Madara, J!C7/"J"veW.，83:1089-1094(1989)和Madara, Tfex^ooA: o/&cre/oo^ Z)/a〃;zea， Eds. Lebenthal等人，第11章，第125-138 页(1990)X作为顶部和基底外侧隔室之间的屏障，它们选择性地调节离子 和水溶性溶质通过细胞旁路途径的被动扩散(Gumbiner， Jm.Ji^jw'o/., 253(CW/尸/^z'o/. 22): C749-C758 (1987))。此屏障保持所有的由与细胞间通 路相关的途径的活动而产生的梯度(Diamond, P/yw'o/og/W, 20:10-18(1977))。上皮间传导性的变化通常可归结于细月包间通路(paracellular pathway ) 的通透性的改变，因为肠细胞质膜的阻力相对较高(Mardara( 1989, 1990), wpra)。 ZO代表了该细胞旁路途径中的主要屏障，并且通过冷冻蚀刻电子显微镜观察，上皮组织的阻力似乎取决于跨膜蛋白链的数目及其在ZO中的复杂性(Madara等人，丄CW/101:2124-2133(1985))。有充分的证据表明，曾被认为是静止结构的ZO实际上是动态的且易 于适应各种发育环境(Magnuson等人，所o/., 67:214-224 (1978); Revd 等人，Co/d S/ n'wg //flr6or Sym尸.S/o/.， 40:443-455 (1976);和 Schneeberger等人，乂 Ce〃. Sc/. 32:307- 324 (1978))、生理学环境(GiMa 等人，Dev.说o/" 50:142-168 (1976); Madara等人， / Me附6K 5/o/， 100:149-164 (1987); Mazariegos等人， / 98:1865-1877 (1984);和Sardet等人，丄Ce//5/o/.， 80:96-117(1979 )和病理学环境(Milks等人，《/ CW/ 万/o/" 103:2729-2738 (986)， Nash等人,/"額/.， 59:531-537 (1988);和 Shasby等人，尸/2戸W, 255 (Ce〃尸一o/， 24:C781-C788 (1988))。作为 此适应性的基础的调节机理目前仍然不完全清楚。然而，4艮明显，ZO的 组装是在Ca2+的存在下的细胞相互作用的结果，所述相互作用引发最终导 致ZO成分的有组织的网络的形成和调节的生化事件的复杂级联，该网络 的组成仅被部分表征(Diamond,尸/z;w'o/og/W， 20:10-18 (l977))。最近鉴定 了用于跨膜蛋白链的 一个候选物——闭合蛋白(occluden) ( Furuse等人，乂 MewZ^ 5/o/， 87:141-150 (1985))。在膜接触下的细胞质膜下噬斑中，鉴定了6种蛋白质，但是它们的功 能仍然有待确定(Diamond, wpra )。 ZO-l和ZO-2与未表征的130kD的蛋 白(ZO-3)作为异源二聚体(Gumbiner等人，Proc. iVw/.」c^/. <SW, 88:3460-3464 (1991))存在于对去污剂稳定的复合物中。大部分免疫电镜研究都精确地将ZO-l定位于膜接触之下(Stevenson 等人,Mo/ec. Ce〃所oc&w., 83:129- 145 (1988))。另外两个蛋白，扣带蛋白 (cingulin ) ( Citi等人，淑脏(London), 333:272-275 (1988))和7H6抗原 (7H6 antigen ) ( Zhong等人，/ CW/所o/., 120:477- 483 (1993))被定位于 离膜更远的地方并且尚未被克隆。Rabl3， 一个小的GTP结合蛋白最近也 被定位于连接区(Zahraoui等人，/Ce〃说o/., 124:101-115 (1994))。已知其 它的小的GTP结合蛋白用于调控皮层细胞骨架，即，rho调控粘着斑中的 肌动蛋白 -膜黏附(Ridley等人,CW/， 70:389-399 (1992))，且rac调控生 长因子诱导的膜变皱运动(Ridley等人，O//, 70:401-410 (1992))。基于与 在被更好地表征的细胞连接、粘着斑(Guan等人，；\^/we， 358:690-692 (1992))和粘着连接(Tsukita等人，Ce〃所o/., 123:1049-1053 (1993))中的斑块蛋白的已知功能的类比，已经假定紧密连接相关性的斑块蛋白涉及 跨细胞膜指导的信号传导和调控与皮层肌动蛋白细胞骨架连接的信号传 导。为应付上皮细胞所受到的许多不同的生理学和病理学的^^战，zo必 须能够快速、协调地做出应答，这需要复杂调控系统的参与。zo的組装 及调控涉及的机制的准确表征是目前积极研究的领域。目前有大量证据表明，紧密连接的结构性和功能性的连接存在于肌动蛋白细胞骨架和吸收性细胞的紧密连接复合物之间(Gumbiner等人，w/ ra; Madara等人，swpra;以及Drenchahn等人，/ CW/ 5/o/.， 107:1037-1048 (1988))。肌动蛋白细胞骨架由复杂的微丝网状结构组成，该网状结构的精 密几何结构由肌动蛋白结合蛋白的大型骨架来调控。肌动蛋白结合蛋白的 磷酸化状态如何调控细胞骨架与细胞质膜连接的一个例子是豆蔻酰化的 富含丙氨酸C激酶底物(下文中称为"MARCKS")。 MARCKS是一种具 体的蛋白激酶C (下文中称为"PKC")底物，其与质膜的胞质面结合(Aderem, ￡/^Ww M (UK),第438-443页(1992))。在其未被磷酸 化的形式中，MARCKS交联于膜肌动蛋白。所以，经由MARCKS连接于 膜的肌动蛋白网络结构有可能是相对坚固的(Hartwig等人，A^we， 356:618-622 (1992))。活化的PKC使得从膜上释放的MARCKS磷酸化(Rosen等人， /五;cp. Med， 172:1211-1215 (1990);和Thelen等人，A^wm, 351:320-322 (1991))。结合于MARCKS的肌动蛋白有可能在空间上与膜分 开且更具可塑性。当MARCKS被去磷酸化时，它返回膜上重新与肌动蛋 白进行交联(Hartwig等人，和Thelen等人，，ra )。这些数据提示， F-肌动蛋白网络可能由一种涉及肌动蛋白结合蛋白(MARCKS为其中之 一)的PCK依赖性的磷酸化过程来重排。已经有多种细胞内调控因子显示出改变tj的功能和/或结构。两栖类动 物胆嚢(Duffey等人，Wafwe, 204:451-452 (1981))以及金鱼(Bakker等人,j附.《/ 尸/2w/0/.， 246:G213-G217 (1984))和鲽(Krasney等人，Prac.,42:1100 (1983))的肠的紧密连接在细胞内cAMp升高时都显示出增强的 对被动离子流的阻力。而且，将两栖类动物的胆嚢暴露在Ca^离子载体下 显示出可增强tj的阻力并诱导在tj结构中的变化(Palant等人， /尸/y^ 。/" 245:C203画C212 (1983))。另外，由佛波西旨(phorbol ester)导致的PK C活化同时增加了肾(Ellis等人，C. j附. /尸/z;^W, 263 (i ewa/ F/"W五/e"ra/;;fe尸/^w'o/J2):F293-F300 (1992))和肠(Stenson等人，C. Am. / i^拜'o/, 265 (Gastrointest.丄/鄉尸—'o/., 28):G955-G962 (1993))上皮细 胞系的细月包间通透性(paracelluar permeability)。 IL紧密连4妄毒素(Zonula Occludens Toxin)大多数通过缺失编码霍乱毒素(CT)的"xA基因来构建的霍乱疫苗 候选物都能引发抗体的高应答，但是超过半数的该疫苗仍会产生轻度腹泻 (Levine等人，/mmw"., 56(1):161國167 (1988))。考虑到在CT缺失的 情况下诱发腹泻的程度，假设霍乱菌广Kc/z/erae 产生其它产肠毒素因子， 该产肠毒素因子仍然存在于缺失ctxA序列的菌株中(Levine et al, w/ ra )。 因此，发现了另一种由霍乱菌产生的可导致残留腹泻(residual diarrhea ) 的毒素紧密连接毒素(下文中称为"ZOT，， )( Fasano等人，iVoc. A^/.爿c^/. Sc/., L^4, 88:5242-5246 (1991))。该zo/基因被定位于紧挨着cfcc基因。该 zw基因与ctx基因在霍乱菌林中高百分比的同时存在(Johnson等人，《/ C7/". M/cra6., 31(3):732-733 (1993);和Karasawa等人，F五^S Af/cro6/o/ogy 106:143-146 (1993))提示，在引发霍乱的典型急性脱水性腹泻中ZOT可 能起协同作用。最近，在其它的肠道病原体中也已经鉴定到了 ZOT基因 (Tschape, ^4s/aw-Pac折c *S>w/7asfww ow T^/zoW /ever of/ er5W麵e〃a^， 47 (Abstr.) (1994))。先前已经发现，当在兔回肠粘膜上测试时，ZOT通过调节细胞间tj 的结构来增加肠通透性(Fasano等人，w/ ra)。已经发现，作为4务饰细胞旁 路途径的一个结果，肠粘膜的通透性增加。还发现ZOT不影响Na+-葡萄 糖耦联的主动转运，无细胞毒性，且不能完全消除穿越上皮层的阻力 (transepithelial resistance ) ( Fasano等人,sw/ ra )。更近期，发现了 ZOT能够在肠粘膜中可逆地开放tj，并且因此，当将 ZOT与治疗试剂如胰岛素联合给药时，在用于肠药物递送如在糖尿病的治 疗中的口服剂量的组合物中，会实现所述治疗试剂的肠递送(WO 96/37196; 美国专利5,827,534;美国专利5，665，389;和Fasano等人，C7/". /騰"" 99:1158-1164 (1997):每一文献的全部内容均引入本文作为参考)。还发现 ZOT能够在鼻粘膜中可逆地开放tj,并且因此，当将ZOT与治疗试剂联 合给药时，能够增强治疗试剂的鼻吸收(美国专利5,908,825，该文献的全 部内容引入本文作为参考)。在以其全部内容引入本文作为参考的美国专利5,864,014中，已经从肠细胞系即CaCo2细胞中鉴定和纯化得到了 ZOT受体。进一步地，在以 其全部内容引入本文作为参考的美国专利5,912,323中，已经从人的肠、 心和脑组织中鉴定和纯化得到了 ZOT受体。该ZOT受体代表了涉及肠和 鼻的通透性调节的细胞旁路途径的第 一步。III. 连蛋白(Zonulin)在以其全部内容引入本文作为参考的美国专利5,945,510和5,948,629 中，已经鉴定和提纯得到了在免疫上和功能上与ZOT相关的哺乳动物蛋 白以及起到哺乳动物的紧密连接生理调节剂作用的哺乳动物蛋白。这些被 称为"连蛋白"的哺乳动物蛋白对于增强治疗试剂通过肠粘膜和鼻粘膜以 及穿过血脑屏障的紧密连接的吸收上是有用的。IV. 连蛋白的肽拮抗剂连蛋白的肽拮抗剂在1998年8月3日提交的未决美国专利申请No. 09/127,815中^^皮首次鉴定和描述，该申请以其全部内容引入本文作为参考， 其对应于WO 00/07609。连蛋白的肽拮抗剂可与ZOT受体结合，但并不起 到在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放的作用。所述肽拮抗剂竟争性地 抑制ZOT和连蛋白与ZOT受体的结合，从而抑制ZOT和连蛋白在生理上 调节哺乳动物紧密连接的开放的能力。V. 糖尿病I型糖尿病(TIDM )通常称为胰岛素依赖性糖尿病或青少年性糖尿病， 其是胰腺的自身免疫障碍。患者对负责产生胰岛素的胰腺P细胞产生免疫 应答。因为p细胞的损伤，胰腺不再能产生激素胰岛素。与糖尿病相关的发病率和死亡率是破坏性的。美国糖尿病个体的总数 为1570万人。其中，100%的I型糖尿病患者和40%的II型糖尿病患者依 赖于胰岛素的肠胃外给药。按年计，与糖尿病直接相关的医疗费用超过400 亿美元。另外有140亿美元与劳动能力丧失、失业和早夭相关。尽管口服胰岛素药物的递送策略是许多研究工作的焦点，但是，因为 小肠的生理特性妨碍大分子如胰岛素的吸收，其中的大部分都不成功。最近，美国专利公开说明书2005/0067074 Al公开了使用连蛋白的肽 拮抗剂来防止或延迟糖尿病的发作。该公开说明书提示，疾病发展的关键 和早期阶段在于细胞间通透性的改变，以及细胞间通透性的增加对于向糖 尿病的发展是必需的。阻断该内源性途径的连蛋白的肽拮抗剂显示出可防 止糖尿病的发展。尽管存在该公开说明书的公开内容，本领域中仍然有逆转该疾病病程的需要，例如通过再生所述的产生胰岛素的(3细胞。本发 明满足了该需要以及其它需要。发明概述在某些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的受试者中减緩胰(3 细胞丢失的方法。这样的方法可以包括给予所述受试者包含连蛋白拮抗剂 的组合物。连蛋白的拮抗剂可以是肽，例如包含Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly(SEQIDNO: 15)序列的肽。在减緩胰卩细胞丢失的方法中使用的組合 物可以包含除连蛋白拮抗剂外的一种或更多种成分。例如，组合物可以含 有一种或更多种增强细胞生长的因子。适宜的因子包括但不限于生长因维细胞生长因子-2(BFGF:2)、角质细、胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/ 扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-l(GLP-l)、胰高血糖素样肽的抑制剂 (exendin-4)、胰岛/十二指肠同源框-l(IDX-I)、卩-动物纤维素、激活蛋白 A、转化生长因子-a(TGF-a)、转化生长因子-P(TGF-(3)、胃泌素及其组合。 在某些实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者中再生胰卩细胞 的方法。这样的方法可以包括给予所述受试者连蛋白拮抗剂和细胞。连蛋 白的拮抗剂可以是肽，例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 15)的肽。能够促进卩细胞再生的任何类型的细胞均可使用。在某 些实施方案中，该细胞可以是分泌生长因子的细胞。在某些实施方案中， 该细胞可以是胰岛细胞例如卩细胞。在某些实施方案中，该细胞可以是祖知的方法来优化。在某些实施方案中，所述拮抗剂和所述细胞可以同时给 予，而在其它实施方案中，所述拮抗剂和所述细胞不同时给予，即所述拮 抗剂可以在给予所述细胞之前或之后给予。在一个实施方案中，将所述拮 抗剂在给予所述细胞之前及之后均进行给予。在有需要的受试者中再生胰卩细胞的方法包括向受试者给予连蛋白拮 抗剂和细胞，该方法可以进一步包括给药增强细胞生长的因子。适宜的因 子包含但不限于生长因子。适宜的生长因子的例子包含但不限于表皮生长 因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子 (KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-l(GLP-l)、 毒封斤外泌肽-4 (exendin-4)、胰岛/十二指肠同源框-l(IDX-l)、卩-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-a(TGF-a)、转化生长因子-p(TGF-(3)、胃 泌素及其组合。在某些实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中再生胰P细胞的 方法，该方法包括在允许卩细胞复制的条件下向受试者给药连蛋白的拮抗 剂。连蛋白的拮抗剂可以是肽例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly(SEQIDNO: 15)的肽。这样的方法可以进一步包括给予增强细胞生长 的因子。适宜的因子包含但不限于生长因子。适宜的生长因子的例子包括 但不限于表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角 质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素 样肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4 ( exendin-4 )、胰岛/十二指肠同源框 -l(IDX-l)、 (3-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子-a(TGF-a)、转化生 长因子-(3(TGF-p)、胃泌素及其组合。在某些实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中再生胰P细胞的 方法，该方法包括向受试者给予连蛋白拮抗剂并向受试者植入细胞。连蛋 白拮抗剂可以是肽，例如包含序列Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID在某些实施方案;，'这些细胞可以包含分泌生长因子的细胞。在U些实施 方案中，所述细胞可以是胰岛细胞，例如所述细胞可以包括卩细胞。在某 些实施方案中，所述细胞可以包括祖细胞例如干细胞。给予拮抗剂和植入 细胞的时间可以使用本领域技术人员所熟知的方法进行优化。在某些实施 方案中，可在同一时间给予拮抗剂并植入细胞，而在其它实施例中，给予 拮抗剂和植入细胞不同时进行，即所述拮抗剂可以在所述细胞植入之前或 之后给予。在一个实施方案中，将所述拮抗剂在细胞植入之前和之后均给 予。在某些实施方案中，在有需要的受试者中再生胰(3细胞的方法包括向 受试者给予连蛋白拮抗剂并在所述受试者中植入细胞，该方法可以进一步 包括给予增强细胞生长的因子。适宜的因子包含但不限于生长因子。适宜长因子-2(BFGF-2)、角质细、胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子/扩散因子 (HGF/SF)、胰高血糖素样肽-l(GLP-I)、毒蜥外泌肽-4 (exendin-4)、胰岛/ 十二指肠同源框-l(IDX-I)、 p-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因子 -a(TGF-a)、转化生长因子-(3(TGF-p)、胃泌素及其组合。在某些实施方案中，可给予因子并同时植入细胞，而在其它实施方案中，给予因子和植入 细胞不同时进行，即所述因子可以在所述细胞才直入之前或之后给予。在一 个实施方案中，将所述因子在细胞植入之前和之后均给予。本发明提供通过给药化合物来治疗自身免疫疾病的方法，所述化合物 防止解剖学屏障通透性的增加。防止解剖学屏障通透性增加的化合物可以 是增加解剖学屏障通透性的常规生理化合物的拮抗剂。用于治疗自身免疫疾病的适宜化合物的一个例子为连蛋白拮抗剂。可以用一种防止解剖学屏 泻、原发性胆汁性肝硬化、IgA肾病、韦格纳肉芽肿病、多发性硬化症、I型糖尿病、类风湿性关节炎、克罗恩病(Crohn's disease )、红斑狼疮、桥 本曱状腺炎(曱状腺功能减退)、格雷夫斯氏病(Graves'disease,曱状腺功能 亢进)、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、大疱性类天疱疮、视神经脊 髓炎(德维奇综合征，Devic's syndrome)、古德帕斯丘综合征、兰-伊月几无 力综合征症(LEMS)、自身免疫性淋巴增生性综合征(ALPS)、副癌综合征、 多腺体自身免疫综合征(polyglandular autoimmune syndromes, PGA)和斑 秃。从下文提供的本发明的详细描述来看，本发明的这些目的以及其它目 的将是明显的。附图的简要说明

图1显示从多种人体组织和IgM重链中纯化得到的连蛋白的N端序 列与ZOT的生物活性片段(氨基酸288-399)的N端序列的比较。图2显示与阴性对照相比，将ZOT、连蛋白i、连蛋白h单独使用(以 填充柱(closed bars)表示)或者与肽拮抗剂FZI/O联合使用(以无遮盖 的柱(open bars )表示)联合或者与FZI/1联合使用(以阴影柱(shaded bars ) 表示)，对安》文于尤斯室(Ussing chamber)中的兔回肠组织阻力(tissue resistance ) ( Rt)的作用。N等于3-5;承表示p〈0.01。图3显示在糖尿病易感性和糖尿病抗性的大鼠腔内连蛋白的浓度 (ng/ml),该浓度是使用夹心ELISA分析来测定的。样本是通过使用生理 盐水灌洗肠道来得到的。每一情形中的第一个柱表示糖尿病抗性大鼠 (DR)，第二个柱表示糖尿病易感性动物(DP),第三个柱表示慢性糖尿病大 鼠(CD)。 <9%的糖尿病易感性大鼠未患糖尿病，且大约9%的糖尿病抗性的大鼠发展成糖尿病。图4显示了用于本研究的发展为糖尿病的大鼠的百分数。图5显示了使用夹心ELISA分析测定的在患糖尿病大鼠中的腔内连蛋 白的浓度(ng/ml)。图6显示了糖尿病抗性(DR)大鼠、在尤斯室中测定的未经治疗的糖尿 病易感性大鼠(DR-未治疗，第二个柱)和以连蛋白肽拮抗剂治疗的糖尿病 易感性大鼠(DR-治疗，第三个柱)的体外肠通透性。承表示p0.05， **表示 p<0.05且与DR-治疗相比pO.OOOl。图7显示已发展为糖尿病或未发展为糖尿病的未经治疗的糖尿病易 感性大鼠的小肠的体外肠通透性。*表示p<0.4。图8是显示异常的紧密连接的通透性如何在I型糖尿病的发生和发展 中起作用的示意图。图9显示了未使用连蛋白抑制剂AT1001治疗或使用连蛋白抑制剂 AT1001治疗的BBDP大鼠的经苏木精和曙红染色的胰腺切片。对于从未 经治疗的发生I型糖尿病(T1D)的大鼠(上方组)和经AT1001治疗的未发 生T1D的大鼠(下方组)分离的胰腺均进行组织学分析。在左方组(10 倍放大)中由箭头指示的胰岛细胞在右方组中被显示为更高的放大倍数 (40倍)。未经治疗的动物显示出I型糖尿病(T1D)的典型末期胰岛损 伤，而经过治疗的动物显示出无胰岛炎的血管周围炎症迹象。图10显示了未使用连蛋白抑制剂ATIOOI治疗和使用连蛋白抑制剂 ATIOOI治疗的BBDP大鼠的胰岛染色。对于从未经治疗的发生T1D的 BBDP大鼠(上方组)和以ATIOOI治疗的未发生T1D的大鼠(下方组) 分离的胰腺进行免疫组织学分析。发生T1D的大鼠的胰岛显示出典型的无 胰岛素染色的塌陷面(collapsed aspect) (A)以及被保存的产生胰高血糖 素的5细胞群(B)。与之相反，经ATIOOI治疗的动物显示出被保存的胰 岛，在该胰岛的核心处有可检测到的产生胰岛素的(3细胞(C),且在其边 缘处有产生胰高血糖素的5细胞(D)。然而，5细胞的染色未显示出一致 性，偶尔会出现多细胞层(见箭头)。IO倍放大。图11显示了分离自未经治疗的发生了 T1D的BBDP大鼠(A组和B 组)以及经ATIOOI治疗的未发生T1D的大鼠(C-F组)的胰l^的免疫组 织化学信息。来自于发生了 TID的大鼠的胰岛显示出典型的无胰岛素染色 的塌陷面(collapsed aspect) (A)以及被保存的产生胰高血糖素的5细胞群(B)。与之相反，经AT1001治疗的动物显示出其胰岛或者未受损伤(C 和D)或是从特征在于产生胰岛素的细胞和产生胰高血糖素的细胞(E和 F)之间边界不规则性的胰岛炎损伤中恢复的现象。这些发现与正在发生 的胰岛炎的异常终止是相一致的。IO倍放大。图12显示了分离自经AT1001治疗的未发生T1D的大鼠的胰腺的免 疫组织化学信息。该胰岛出现了由显示出不规则轮廓的胰岛内和胰岛周围 的症痕造成的扭曲。可以看到从胰岛炎损伤中恢复的迹象，且所述迹象的 特征在于，在胰岛素(A和C)与胰高血糖素(B和D)产生性细胞(E 和F)之间边界的不规则性。这些发现与正在发生的胰岛炎的异常终止相 一致。图13显示了以AT-1001治疗自身免疫性糖尿病的研究结果。图13是 将未经治疗的动物(》)相对于经治疗的动物O)进行比较的以非糖尿病动物 的百分比相对于时间的函数来描绘的无糖尿病存活率图。使用BB/worDP 大鼠，在血清转化后开始治疗。60%的未经治疗的大鼠发生了 T1D,而仅 有35%的经AT1001治疗的动物发展为T1D。安慰剂组的T1D平均发病年 龄为85.4±10.4天，而治疗组为86.0± 10.3天。起始研究阶段用T0表示， 从第120天起用Tl表示。图14A和14B显示了以AT-1001治疗自身免疫性糖尿病的研究结果。 图14A和14B是显示在治疗期间内自身抗体变化的柱形图。图14A显示 发生了 T1D的动物中的抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体。图14B显示发生 了 T1D的动物中的抗GAD抗体。图15A和15B显示以AT-1001治疗自身免疫性糖尿病的研究结果。 图15A和15B是显示在治疗期间内血清连蛋白水平变化的柱形图。图15A 显示发生了 T1D的动物中的连蛋白水平。图15B显示发生了 T1D的动物中 的连蛋白水平。发明详述如上面所讨论的，在各种实施方案中，本发明提供在有需要的受试者 中减緩胰P -细胞的丢失、防止胰P -细胞的丢失和/或再生胰|3 -细胞的材料 和方法，所述材料和方法是通过，尤其是，向需要减緩胰P-细胞的丟失、 防止胰P -细胞的丟失和/或再生胰P -细胞的受试者给予药学有效量的连 蛋白拮抗剂。 一般地，适合用于本发明的拮抗剂能与紧密连接毒素(ZOT)受体结合，但是并不能在生理上调节哺乳动物紧密连接的开放。在某些实 施方案中，所述连蛋白拮抗剂可以是肽。将术语"拮抗剂，，定义为一种防 止、抑制、减少或逆转由激动剂(即连蛋白)引起的应答的化合物。在一 个实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中减緩胰P-细胞的丟失、防 止胰P -细胞的丟失和/或再生胰P -细胞的材料和方法，所述材料和方法是 通过，尤其是，给予需要减緩胰P-细胞的丟失、防止胰P-细胞的丟失和/ 或再生胰P-细胞的受试者以药学有效量的连蛋白拮抗剂，其中，所述拮抗 剂能与紧密连接毒素(ZOT)受体结合，但是不能在生理上调节哺乳动物 紧密连接的开放。这里使用的再生胰(3 -细胞是指增加胰(3 -细胞的数目。再生可能需要 将一种或多种细胞引入(如植入)受试者中。细胞(如l3-细胞、干细胞等) 的移植在本领域中是已知的。例如，美国专利No.6,703，017 (在此具体地 将该专利引入本文作为参考，尤其是实施例1-3)公开了移植胰岛生成性 干细胞、胰岛祖细胞和胰岛样结构。Soon-Shiong等人(/VocA^/A^fi^cz-aS^. 90(12):5843-7， (1993))描述了通过注射经免疫保护的胰岛来长期逆转 糖尿病。干细胞的分离在本领域中是已知的。例如，在美国专利申请公开了朗格汉斯(langerhans )胰岛干细胞的分离及其在治疗糖尿病中的用 途。再生胰P -细胞还可以包括提供使得已存在于胰腺中的|3 -细胞可以复 制的条件。例如，已经证明，成人胰P-细胞保留了明显的在体内增殖的能 力，因此，通过提供促进增殖的条件，可以使胰(3-细胞再生(Dor等人， 胸群，429:41 -46 (2002》。在本文中使用的受试者是接受本发明拮抗剂的任何动物如哺乳动物。 受试者包括但不限于人。本实验已经证明，自身免疫疾病例如I型糖尿病的发生是基于3个因 素1)遗传易感性；2)渗漏的解剖学屏障；和3)反复的环境损害。使用 本发明的材料和方法有可能通过给予一种或更多种降低一种或更多种解 剖学屏障通透性的化合物来治疗自身免疫性疾病。如下所示，拮抗能增强 解剖学屏障通透性的常规生理学化合物活性的化合物的给药可以用于治疗自身免疫性疾病。例如连蛋白是增强解剖学屏障肠上皮的通透性的常规 生理学化合物。通过给予连蛋白拮抗剂，可以维持或降低解剖学屏障的通 透性，从而防止或治疗自身免疫性疾病I型糖尿病。渗漏的解剖学屏障导致疾病发生的自身免疫性疾病的例子是I型糖尿 病。不希望束缚于理论，相信异常的肠通透性在I型糖尿病的发病机理中 起重要作用。参考图8，非自身抗原(正方形和三角形)存在于连蛋白系统(圆圏=连蛋白，细胞上的T形结构为连蛋白受体)失调的受试者的肠 腔(l)中并穿过tj屏障(2-3)。抗原肽结合到存在于APC表面上的HLA 受体(4)。这些肽又被呈递到T淋巴细胞(5)。在遗传易感性的个体中， 异常的免疫应答(包括体液免疫应答和细胞介导的免疫应答)(6)导致主 要标靶于带有I型糖尿病典型的后续性胰岛素缺乏的朗格汉斯 (Langherans )胰岛(7 )的自身免疫过程。下文提出的证据证明了通过控 制解剖学屏障的通透性，有可能逆转疾病进程和再生受损害的胰岛。因此，本发明提供了通过给予防止解剖学屏障通透性增加的化合物来治疗自身免疫性疾病的方法。防止解剖学屏障通透性增加的化合物可以是 增加解剖学屏障通透性的正常生理化合物的拮抗剂。适宜的用于治疗自身免疫性疾病的化合物的一个例子是连蛋白拮抗剂。可将连蛋白的任何拮抗剂用于本发明的实施。这里使用的连蛋白拮抗 剂是可与连蛋白受体结合并且防止、抑制、减少或逆转由连蛋白引发的应 答的任何化合物。例如，本发明的拮抗剂可以包括连蛋白的肽拮抗剂。肽 拮抗剂的例子包括但不限于包含选自如下的氨基酸序列的肽Gly Arg Val Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:l),Gly Arg Val Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:2),Gly Arg Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:3)，Gly Arg Val Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO :4),Gly Arg Leu Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:5),Gly Arg Leu Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:6),Gly Arg Leu Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:7),Gly Arg Leu Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:8),Gly Arg Gly Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:9),Gly Arg Gly Cys Val Gin Asp Gly (SEQ IDNO: 10),Gly Arg Gly Leu Val Gin Pro Gly (SEQ IDNO: 11),Gly Arg Gly Leu Val Gin Asp Gly (SEQ IDNO: 12),Gly Gly Val Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 13),Gly Gly Val Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO: 14),Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 15),Gly Gly Val Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO: 16),Gly Gly Leu Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 17),Gly Gly Leu Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO: 18),Gly Gly Leu Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 19),Gly Gly Leu Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:20)，Gly Gly Gly Cys Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:21),Gly Gly Gly Cys Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:22),Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO:23),和Gly Gly Gly Leu Val Gin Asp Gly (SEQ ID NO:24)当拮抗剂为肽时，可使用任何长度的肽。通常，肽拮抗剂的氨基酸长 度的大小范围可以是约6到约100、约6到约90、约6到约80、约6到 约70、约6到约60、约6到约50、约6到约40、约6到约30、约6到约 25、约6到约20、约6到约15、约6到约14、约6到约13、约6到约12、 约6到约11、约6到约10、约6到约9或约6到约8。本发明的肽拮抗剂 的大小可以是氨基酸长度为约8到约100、约8到约90、约8到约80、约 8到约70、约8到约60、约8到约50、约8到约40、约8到约30、约8 到约25、约8到约20、约8到约15、约8到约14、约8到约13、约8到 约12、约8到约11个或约8到约10个氨基酸。本发明的肽拮抗剂的氨基 酸长度可以是约10到约100、约10到约90、约10到约80、约10到约 70、约10到约60、约10到约50、约10到约40、约10到约30、约10 到约25、约10到约20、约10到约15、约10到14、约10到约13或约 10到约12。本发明的肽拮抗剂的氨基酸长度可以是约12到约100、约12 到约90、约12到约80、约12到约70、约12到约60、约12到约50、约 12到约40、约12到约30、约12到约25、约12到约20、约12到约15 或约10到约14。本发明的肽拮抗剂的氨基酸长度可以是约15到约100、 约15到约90、约15到约80、约15到约70、约15到约60、约15到约 50、约15到约40、约15到约30、约15到约25、约15到约20、约19 到约15、约15到约18或约17到约15个氨基酸。该公4口的^支术例^口4葛述于///g/z尸er/or附a"ce Zi《m'(i C7zrawatograp/z_y o/ 户印"'cfes朋d /Voto7w: iSe戸ra"o"爿加/戸、Co"/b，a"o"， Eds. Mant等人，C.R.C. Press (1991)中的技术，所述的肽合成仪例如Symphony (Protein Technologies, Inc)，或通过使用DNA重组体技术获得所述的肽拮抗剂，即 将编码所述肽的核苷酸序列插入到适宜的表达载体如大肠杆菌或酵母表 达载体中，在各自的宿主细胞中表达并且使用公知的技术从其中纯化。可以将所述拮抗剂(如肽拮抗剂)以用于小肠递送的口服剂型组合物 进行给药。这样的用于小肠递送的口服剂型组合物在本领域中是公知的， 并且通常包括胃耐受性的(gastroresistent )片剂或胶嚢(i em/"gtow'j ■P/jormaceWca/ 5Wewc&s,第16版,Eds. Osol, Mack Publishing Co.,第89 章(1980); Digenis等人，乂尸/z麵.5W.， 83:915-921 (1994); Vantini等人, C7/"/<%z rera; ew"ca, 145:445-451 (1993); Yoshitomi等人，CTze附.5w〃" 40:1902-1卯5 (1992); Thoma等人，尸/wrmaz&, 46:331-336 (1991); Morishita 等人，Z>Mg Z)&s/g" Z)Wveo;, 7:309-319 (1991);以及Lin等人，户W應固"ca/細.，8:919-924 (1991),每一文献均全文引入本文作为参 考)。本发明的胃耐受性的片剂或胶嚢优选在肠液中溶解。通过添加如醋酸邻苯二曱酸纤维素或醋酸对苯二曱酸纤维素，可制成 胃耐受性的片剂。术语"胃耐受性的"是指一种组合物，其在pH小于5 的胃液或者pH小于5的模拟胃液中于60分钟内释放的连蛋白效应物小于 该组合物中连蛋白效应物总重的30%。胶嚢是固体剂型，其中所述拮抗剂(如肽拮抗剂)被包封于硬的或软 的可溶性容器或明胶外壳中。用于制造胶嚢的明胶是从胶原材料通过水解 获得的。有两种类型的明胶A型，通过酸处理来源于猪皮；和B型，通 过碱处理获得自骨头和动物皮肤。硬明胶胶嚢的使用允许在认为对个体受 试者最佳的精确剂量水平下，在使用单独的拮抗剂(例如肽拮抗剂)或其 组合间进行选择。石更明胶月交嚢由两个部分组成，其中一部分套在(slipping over)另一部分上，因此完全包围着所述的拮抗剂(例如肽拮抗剂)。这些 胶嚢是通过下述方法填充的将所述拮抗剂(如肽拮抗剂)或含有所述拮 抗剂(如肽拮抗剂)的胃耐受性的珠粒引入所述胶嚢的较长端，而后盖上 盖子。硬明胶胶嚢大部分由明胶、FD&C着色剂制成，有时会加入不透明 剂如二氧化钛。美国药典(USP )允许用于此目的的明胶含有0.15% ( w/v ) 的二氧化硫从而防止在制造过程中的分解。在本发明的上下文中，用于小肠递送的口月良剂型组合物还包括液体组 合物，该液体组合物中含有防止所述拮抗剂(如肽拮抗剂)在胃中被胃液严重失活的水性緩冲试剂，从而使拮抗剂(如肽拮抗剂)以活性形式到达 小肠。可以用于本发明的这种水性緩冲试剂的例子包括碳酸氬盐緩冲剂(pH为5.5-8.7,优选约pH7.4 )。当所述口服剂型组合物为液体组合物时，优选将所述组合物刚好在给 药前制备从而将稳定性问题最小化。在此情况下，可以通过将冻干的拮抗 剂(如肽拮抗剂)溶解于水性的緩沖剂中来制备所述液体组合物。一般地，这里使用的含有连蛋白拮抗剂(如肽拮抗剂)的组合物包含 药学上有效量的拮抗剂。拮抗剂(如肽拮抗剂)的药学有效量可以根据例 如个体的病况、年龄、性别和体重的因素而变化。可以调整给药方案以提 供最佳的治疗反应。例如，可以单个丸剂给药，可以若千分开的剂量按时 间给药或将所述剂量根据治疗状况的紧急需要的指示来按比例地减少或 增加。特别有利的是，以剂量单位形式来配制肠胃外组合物，从而使给药 简化及剂量均一。这里使用的剂量单位形式是指适合作为用于被治疗的哺 乳动物受试者的均一剂量的物理上离散的单位，每个单位均含有与所需要 的药物载体相结合的经计算以产生所期望的治疗效果的预定量的活性化 合物。本发明的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于(a)所述活性 化合物的独特性质及所要取得的特定的治疗效果，和(b)在配合这样的 活性化合物的技术领域中对于个体中的敏感性治疗的固有局限性。通常，本发明中使用的拮抗剂化合物的量(例如用于减緩胰P -细胞的 丢失、用于防止胰|3 -细胞的丟失和/或用于再生胰P -细胞)是在约7.5 jiM 到7.5 mM范围内，优选为约7.5 到0.75 mM。为了在例如肠道或血 液中获得这样的最终浓度，在本发明的单一剂量组合物中拮抗剂(例如肽 拮抗剂)的量一般为按每千克受试者体重计约50ng到约10pg、约250 ng 到约10pg、约500ng到约10吗、约lpg到约10pg、约2pg到约10吗、 约3jig到约10jag、约4pg到约10pg、约5pg到约10lig、约50ng到约5jig、 约250ng到约5pg、约500ng到约5pg、约lpg到约5jig、约2pg到约5吗、 约3吗到约5pg、约4吗到约5吗、约50ng到约3pg、约250 ng到约3pg、 约500ng到约3pg、约ljig到约3]ug或约2pg到约3pg。本发明的组合物可以包含一种或更多种药学上可接受的载体。这里使 用的"药学上可接受的载体"包含任何及所有生理相容性的溶剂、分散介 质、包衣、抗菌剂和抗真菌试、等渗和吸收延迟剂等。在一个实施方案中， 所述载体适合用于肠胃外给药。载体可以适合给药至中枢神经系统(例如脊柱内或脑内)。可选择地，所述载体可以适合静脉内、腹腔内或月几肉内 给药。在另一个实施方案中，所述载体适合口服给药。药学上可接受的载 体包括无菌水溶液或分散体和用于临时配制无菌可注射溶液或分散体的 无菌粉末。这种用于药学上活性物质的介质和试剂的使用在本领域中是众 所周知的。除非任何常规介质或试剂与所述活性化合物不相容，其在本发 明药物组合物中的使用是被期待的。补充的活性化合物也可以掺入组合物 中。以下的实施例仅仅为说明的目的而提供，并且不以任何方式意在限制 本发明的范围。实施例1连蛋白的肽拮抗剂考虑到ZOT、人肠内连蛋白(连蛋白i)和人心脏连蛋白(连蛋白h)均作用 于肠(Fasano等人，G"Wrae"化ra/ogy, 112:839 (1997); Fasano等人，乂 C7/". /"ve" 96:710 (1995)和内皮tj,并且所有这三者都具有相似的局部作用 (Fasano等人，(1997),这符合ZOT受体在肠内的分布(Fasano等人，(1997)， 和Fasano等人，(1995), wpra),在1998年8月3日提交的序列号为 09/127,815的美国专利申请中假设这三种分子与相同的受体结合位点相互 作用。因此，对ZOT和人连蛋白的一级氨基酸结构进行了比较从而提供 对涉及肠tj调节的受体-配体相互作用对绝对结构要求的认识。这些分子N 端的分析显示存在如下共同基序(图1中框出的氨基酸残基8-15):非极 性的(肠中为Gly,脑中为Val)、可变的、非极性的、可变的、非极性的、 极性的、可变的、才及性的(Gly)。 8位的Gly、 12位的Val及13位的Gln, 所有这些在ZOT、连蛋白和连蛋白h中是高度保守的(见图1),这被认为 对于在肠中受体结合功能是关键性的。为了证实上述结论，化学合成了合 成八肽Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly (SEQ ID NO: 15)(将其命名为 FZI/O,对应于人胎儿连蛋白的第8-15位氨基酸残基)。接下来，如下所述，将安放于尤斯室中的兔回肠单独地暴露于100昭的 FZI/O (SEQ ID NO:15)、 100昭的FZI/1 (SEQ ID NO:29)、 1.0昭的 6xHis-ZOT(如在1998年8月3日提交的序列号为09/127,815的美国专利 申请的实施例1中所述的那样获得)、l.O):ig的连蛋白j(如在1998年8月 3日提交的序列号为09/127,815的美国专利申请的实施例3中所述的那样获得)或1.0昭的连蛋白h (如在1998年8月3日提交的序列号为 09/127,815的美国专利申请的实施例3中所述的那样获得)；或者预先将其 暴露于100吗的FZI/O或FZI/1中20分钟，此时加入1.0吗的 6xHis-ZOT、 1.0昭的连蛋白j或1.0吗的连蛋白h。由Rt-PD/Isc计算得 出ARt，其中PD-电位差，Isc-短路电流。结果在图2中示出。如图2所示，FZI/O未诱发Rt的任何显著变化(与阴性对照相比为 0.5% )(见填充柱)。与此相反，以FZI/O预先处理20分钟分别4吏得ZOT、 连蛋白i、连蛋白h对Rt的作用降低了 75%、 97°/。和100%(见未遮盖柱)。 同样如图2所示，当使用第二种合成肽(FZI/1, SEQ ID NO:29)时，这种抑 制作用被完全消除(见阴影柱)，所述第二种合成肽是通过将8位的Gly、 12位的Val和13位Gln (参照连蛋白；)用连蛋白b的相应氨基酸残基(分 别为Val、 Gly和Arg,见SEQ ID NO: 30 )改变来化学合成的。以上结果 证明，在ZOT与连蛋白家族的N末端的8位和15位残基间存在一种区域 跨越(region spanning ),此种区域跨越对于与耙受体的结合是关键性的， 并且在8、 12和13位上的氨基酸残基决定了这种结合的组织特异性。实施例2糖尿病大鼠模型肠通透性的改变已经显示出是与糖尿病的发病相关的前期生理变化 之一(Meddings, Jm. J! i^;w'o/， 276:G951-957 (1999))。细胞间转运和肠通透 性是由细胞内tj经由尚未完全阐明的机制来调节的。连蛋白及其原核细胞类似物ZOT 二者均通过调节tj改变肠通透性。 在此实施例中，首次证实了连蛋白相关的tj损伤涉及糖尿病的发病机理； 以及通过给予连蛋白的肽拮抗剂来预防糖尿病或延緩糖尿病的发病。最初，评估了两种遗传品种，即BB/Wor糖尿病易感性(DP)大鼠和 糖尿病抗性(DR)大鼠(Haber等人，J! C"". /騰W" 95:832-837 (1993))，以 确定它们是否呈现出连蛋白腔内分泌和肠通透性的显著改变。更具体地，处死年龄匹配的DP和DR大鼠(年龄为20，50,75,和>100 天)。将所述大鼠处死后，将25G的针置于回肠腔内，使用林格溶液来进 行灌洗肠道以确定腔内连蛋白的存在。连蛋白浓度是使用如下的夹心酶联 免疫吸附测定法(ELISA)来评估的将塑料樣i量滴定才反(Costar, Cambridge, MA )以多克隆兔抗ZOT抗体(如在1998年8月3日提交的序列号为09/127,815的美国专利申请的实 施例2中所述的那样获得)(稀释度1:100 )包被，于4。C过夜，用含有0.05% (v/v)吐温20的PBS洗涤3次，然后在室温下用300 pl含有0.1% (v/v)吐 温20的PBS孵育15分钟来阻断。接下来，将纯化的人肠连蛋白(如在 1998年8月3曰4是交的序列号为09/127,815的美国专利申请的实施例3 中所述的那样获得)包被于平板上。通过将连蛋白在含有0.05% (v/v)吐温20的PBS中稀释至不同浓度来 得到标准曲线，所述的不同浓度为0.78 ng/ml， 1.56 ng/ml， 3.125 ng/ml， 6.25 ng/ml， 12.5 ng/ml, 25 ng/ml和50 ng/ml。将每一标准浓度的样本各100 pl或100 (il肠道灌洗样本用吸量管转移 至孔中，使用平板摇床在室温下孵育1小时。使用PBS洗去未被结合的连 蛋白，将所述孔于室温下与10(^1用碱性磷酸酯偶联的抗ZOT抗体孵育1 小时。用PBS洗掉未结合的偶联物，并通过下述方法进行显色反应首先 加入在0.1 M Tris-HCl (pH 7.3)、 1.0 mM MgCl2、 1.0% (w/v) BSA中1/20000 稀释的Extra-Avidin (SIGMA, St. Louis， MO) 100^1经过15分钟，然后将每 一孔用IOOjliI含有1.0 mg/ml对硝基苯基磷酸酯底物(SIGMA, St Louis, MO)的溶液于37。C下孵育30分钟。使用酶免疫分析读出器(enzyme immunoassay reader )在405nm处读耳又吸光度。为了评估ELISA夹心法的批内和批间的精确性，使用来自于含有不同 浓度连蛋白的两个样本的连续三天的三个重复数据来计算出变异系数 (CV)。 ELISA夹心法的批间测试得到的CV值为9.8%。批内测试的CV值 为第一天4.2%,第二天3.3%和第三天2.9%。将在肠道灌洗中检测的连蛋白浓度以ng/mg蛋白表示，并通过暴露表 面积(mm2)来标准化。结果显示于图3。如图3所示，首先观察到在糖尿病易感性大鼠(年龄为50天)中腔 内连蛋白的4倍增长(第二个柱)。发现腔内连蛋白的增加与肠通透性的 增加相关。这种腔内连蛋白的增加在糖尿病易感大鼠中保持在高水平，且 发现其与向完全的糖尿病的发展相关。值得注意的是，糖尿病易感性大鼠 (年龄为IOO天)的腔内连蛋白没有增加。这是值得注意的，因为该大鼠 未发展为糖尿病。该大鼠的血糖水平正常。因此，连蛋白与I型糖尿病的 发病机理相关的通透性变化有关。该连蛋白分泌的增加是年龄相关性的， 并可引致糖尿病的发病。接下来，为了证实糖尿病可以通过给药连蛋白的肽拮抗剂来预防，将获得自Biomedical Research Models, Inc. (Rutland, MA)的BB/Wor大鼠(年 龄21-26天)随机分为两组(每组n = 5),即治疗组和对照组。两组都维 持使用大鼠祠料的标准食语(standard diet of rat chow) (Harlan Teklab Diet #7012)。所有的食物和水都预先进行高压灭菌。每天供给100ml清水，并 测量日饮水量。治疗组接受添加在饮水中的10吗/ml连蛋白肽拮抗剂 (SEQIDNO : 15)。将大鼠装在高效空气过滤器(hepa-filter)笼里。对所述大鼠中的糖尿病诊断如下将大鼠每周称重两次。每周使用 OneTouch⑧葡萄糖监测系统(Johnson & Johnson)来测定血糖。每周使用验 尿试纸条来监测葡萄糖(Diastix⑧)和酮类(Ketositx⑧)(Bayer)。将血糖>250 mg/dl的大鼠禁食过夜，并且将血糖水平>200 mg/dl的大鼠认为是糖尿病 患者。这些规范与由Biomedical Research Models Inc.提供的数据一致。结 果示于图4。如图4所示，80%的对照组大鼠(4/5)和40%的经连蛋白肽拮抗剂治 疗的大鼠(2/5)在年龄为80天时发生了糖尿病。连蛋白分泌的变化与糖 尿病的发病平4亍。在糖尿病临床症状出现后，将大鼠如下处死用盐酸氯苯胺麻醉大鼠， 并切割能够进入心脏的正中切口。将18G针置于心脏，并通过》文血来致死。 然后，如上所述进行连蛋白分析。至于未出现糖尿病的大鼠，所述研究在 年龄为80天时截止。才艮据生物医学研究模型7>司(Biomedical Research Models, Inc.), 80%的糖尿病易感性大鼠在年龄为80天时出现糖尿病。连 蛋白分析的结果示于图5。如图5所示，观察到未用连蛋白肽拮抗剂治疗的患糖尿病大鼠的腔内 连蛋白增加，这与图3中示出的结果一致。进而，与未发生糖尿病的糖尿 病易感性大鼠(DP-treated)和对照(DP-untreated)大鼠相比，发生糖尿病的 大鼠(DR)的腔内连蛋白增加了 2到4倍。未发生糖尿病的非糖尿病对照 大鼠的连蛋白水平可以忽略，与图3中示出的连蛋白水平一致。此外，两 只尽管经过连蛋白肽拮抗剂治疗却发生糖尿病的糖尿病易感性大鼠显示 出明显高于:f皮成功治疗的大鼠和未经治疗的对照大鼠的腔内连蛋白水平。 该连蛋白水平已足以引发发展为糖尿病所需的通透性变化，但是ZOT/连 蛋白受体已净皮肽拮抗剂有效地阻断。在糖尿病临床症状出现后，还将处死大鼠的肠组织安放于尤斯室中以评价体外通透性的变化。更具体地，从处死的大鼠中分离得到空肠和回肠的切片(sections), 并将肠内容物清洗干净。制备每一胁段的6个切片，并置入有机玻璃尤斯 室(0.33cm2开口 )中，连接至电压钳装置(EVC 4000; World Precision Instruments, Saratosa, FL),以新鲜配制的含有53 mM NaCl、 5.0 mM KCl、 30.5 mM Na2S04、 30.5 mM甘露醇、1.69 mM Na2P04、 0.3 mM NaHP04、 1.25 mM CaCl2、 1.1 mM MgCl2和25 mM NaHC03 (pH 7.4)的緩冲液浴洗。 使用连接于恒温循环泵的水夹套储器(water-jacketed reservoir)将浴洗溶 液保持在37。C,并向其中通入含95%02和5。/。C02的气体。测量电位差， 使用如Fasano等人，Prac. iVa". Jcad 5W.， USA, 88:5242-5246 (1991)所描述 的方法来计算短路电流和组织阻力。结果显示于图6-7。如体外尤斯室通透性研究所证实的以及图6所显示的，所有发展为糖 尿病的大鼠都有肠通透性的增加。糖尿病抗性(DR)大鼠在细胞间通透性 上没有可察觉到的变化(第一个柱)。未经治疗的糖尿病易感性大鼠(DP-未治疗的；第二个柱)具有空肠和回肠的细胞间通透性的显著增加。更重要 的是，使用连蛋白肽拮抗剂治疗的糖尿病易感性大鼠(DP-经治疗的；第三 个柱)在小肠仅限于空肠的部分，细胞间通透性显著增加。然而，如图6与发病机理相关的细胞间通透性的变化限于回肠。而且，如图6所示，结 肠的通透性无显著变化，这与连蛋白受体分布的区域性分布一致。通过发生了 (DP-D)或未发生(DP-N)糖尿病的未经治疗的糖尿病易感 性大鼠的小肠体外肠通透性的比较，进一步确认了这些结果(图7)。尽管 未观察到在DP-D和DP-N大鼠之间的空肠Rt的显著变化，但是与DP-N 大鼠相比，观察到DP-D大鼠的回肠粘膜的Rt明显更低(图7)。因此，可以得出如下结论(1)所述肽拮抗剂能够有效地阻断糖尿病 发生所需的通透性变化；且(2)在那些用所述肽拮抗剂治疗的大鼠中， 腔内连蛋白水平比经过治疗而未患糖尿病的大鼠高3倍。在经过治疗却发 生了糖尿病的大鼠当中，肽拮抗剂的量可能不足以阻断足够数目的、防止 糖尿病必需的ZOT/连蛋白受体。60%的经治疗的大鼠未发生糖尿病。在这些大鼠中，所述连蛋白肽拮 抗剂有效地防止了糖尿病发病必需的肠通透性的增加。如图5所示，经治 疗的大鼠的肠连蛋白水平与未治疗的对照大鼠是相当的，但是因为连蛋白肽拮抗剂的存在，其小肠的整体通透性不足以改变至引发发展为糖尿病必 需的病理生理变化。有趣的是，如图5所示， 一只未发生糖尿病的对照动 物具有可以忽略不计的连蛋白水平，进一步支持了连蛋白在糖尿病发病机 理中的作用。因此，BB/Wor大鼠糖尿病发病机理的早期事件涉及连蛋白介导的肠 细胞间通透性的改变。此外，使用连蛋白的肽拮抗剂来抑制连蛋白信号系 统防止了或至少延緩了糖尿病的发病。实施例3J3-细胞的再生使用连蛋白肽拮抗剂AT1001(SEQ ID NO: 15)来治疗52-54日龄的糖 尿病易感性大鼠试验组，同时对与其年龄相当的对照组不予治疗。在此时 给予所述拮抗剂，因为这些大鼠在40天时显示出连蛋白水平的升高且在 50天时可检测到自身免疫性抗体。这样，治疗开始于糖尿病发病之后。将曰龄为52-54的BBDP动物分为两组。组1 (11=20)每天在饮用水+ HC03中摄入AT-1001。组2(n-10)摄入饮用水十HC03。在治疗阶段T0期 内以盲选方式(in a blinded fashion)随机地选择动物，使其或接受安慰剂 或在饮水供应中以合成的连蛋白肽抑制剂AT-1001(SEQIDNO: 15)进4亍治 疗。在此疾病的末期(空腹血糖> 250 mg/dl )，将发生了 T1D的BBDP大 鼠(安慰剂组中的发病率为60%,平均日龄110天)处死，收集其血液和 组织样本。将未发生T1D的经AT-1001治疗的大鼠在日龄为120天时重新 随机分为两组a)停药阶段(drug withdrawal arm), b)继续用AT-1001治 疗；在治疗阶段Tl ( during treatment arm Tl)中另外的100天里对其继续 观察。在研究的开始和结束时检测血清连蛋白和自身抗体的水平。每天监 测水的摄入，同时每周检查体重增加和血清葡萄糖水平。空腹血糖> 250 mg/dl的大鼠被认为患糖尿病并且将其在达到糖尿病患病状态的24小时内 处死。在未经治疗的对照组中，10只大鼠中的6只发生了糖尿病而治疗组中 的20只大鼠中只有7只发生了糖尿病(图13)。 120天后，对一半未发生 糖尿病的治疗组大鼠停止治疗。有1/3的停止治疗动物发生了糖尿病，而 继续治疗的动物则无一发生糖尿病。胰腺样品取自在第52-54天开始治疗的动物并进行检验。在图9中示出了组织学检验的结果，并且在图10中示出了免疫组织学检验的结果。在发生了糖尿病的动物中，组织学检验显示(3-细胞已经被破坏(图9，上 方图片)。相反，来自于未发生糖尿病的动物的样本中含有(3-细胞，且观 察到P-细胞再生的迹象(图9,下方图片)。为了证实在组织学分析中观察到的所述细胞的一致性，进行了免疫组 织学检验。用特异于胰高血糖素产生性(glucon-producing) 5细胞的抗胰 高血糖素抗体或用特异于胰岛素产生性(3细胞的抗胰岛素抗体对胰腺进行 顺序染色。该分析的结果示于图10。当使用抗胰岛素抗体来染色未经治疗 的胰腺时，未^r测到信号。这与T1D中p-细胞的损伤一致。这些细胞用 抗胰高血糖素抗体染色，鉴定了胰高血糖素产生性的5细胞。正常胰岛为 条形结构，具有包含5细胞的胰岛外侧和含有(3-细胞的胰岛内侧。5细胞 的染色图像表明胰岛因为P-细胞的损伤而发生塌陷(图IOA和B)。相反， 来自于经治疗动物的胰腺显示出胰岛素产生性细胞的存在(图IOC)。图 IOD的抗胰高血糖素抗体染色图像表明该胰岛的结构更为正常。图11和12提供了 (3-细胞再生的证据。图11示出了对分离自发生了 T1D的未经治疗的BBDP大鼠(图片A和B )和未发生T1D的经AT-1001 治疗的大鼠(图片C-F)的胰腺进行免疫组织化学分析的结果。来自于发 生了 T1D的大鼠的胰岛显示出典型的无胰岛素染色的塌陷面(A)和保留 下来的胰高血糖素产生性5细胞群(B)。相反，经AT1001治疗的动物显 示出其胰岛或者未被损伤(C和D)或是显示出从特征在于在胰岛素和胰 高血糖素产生性细胞之间的边界不规则性的胰岛炎损伤中恢复的迹象(E 和F)。图12显示了更高放大倍数的图IIE和IIF。由于损伤后(3-细胞的 再生，发生5细胞对胰岛的渗入(图12D)。在临床前自身免疫阶段，对BBDP大鼠连蛋白途径的阻断显著降低了 T1D的发展，最长至日龄205天(治疗后150天)。T1D发病率的这种降 低是与经AT1001治疗后抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体的显著降低相关的 (图14)。在研究期间，AT1001治疗不影响血清连蛋白水平(图15)。停 止AT1001治疗后，33。/。的动物T1D发病。与显示出T1D典型的末期^1夷岛 损伤的未经治疗的大鼠相比，经AT1001治疗的BBDP大鼠显示出正常的 胰岛组织学或者其胰岛显示出从胰岛炎中恢复的迹象。总之，这些数据提 示，即使自身免疫过程已经开始，AT1001仍然能够中止和恢复BBDP大 鼠中的胰岛损伤。虽然已经参照具体的实施方式详细地描述了本发明，但对于本领域的 普通技术人员而言显而易见的是，可对本发明做出各种变化和修改而不背 离本发明的精神和范围。
权利要求
1. 一种在有需要的受试者中减缓胰β-细胞的丢失的方法，该方法包括向所述受试者给予含有连蛋白拮抗剂的组合物。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述组合物进一步含有增强细胞生 长的因子。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述因子为生长因子。
4. 根据权利要求2的方法，其中所述因子选自表皮生长因子(EGF)、 ^喊性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞 生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4、 胰岛/十二指肠同源框-l(IDX-l)、 P-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因 子-a(TGF-a)、转化生长因子-(3(TGF-(3)、胃泌素及其组合。
5. —种在有需要的受试者中再生胰P-细胞的方法，该方法包括向 所述受试者给予连蛋白拮抗剂和细胞。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述细胞为胰岛细胞。
7. 根据权利要求5的方法，其中所述细胞为(3-细胞。
8. 根据权利要求5的方法，其中所述细胞为干细胞。
9. 根据权利要求5的方法，其中将所述拮抗剂和所述细胞同时给予。
10. 根据权利要求5的方法，其中将所述拮抗剂和所述细胞不同时给予。
11. 根据权利要求5的方法，该方法进一步包括给予增强细胞生长的 因子。
12. 根据权利要求11的方法，其中所述因子为生长因子。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述因子选自表皮生长因子(EGF)、 碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞 生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4、 胰岛/十二指肠同源框-l(IDX-l)、 (3-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因 子-a(TGF-a)、转化生长因子-卩(TGF-p)、胃泌素及其组合。
14. 一种在有需要的受试者中再生胰(3-细胞的方法，该方法包括在 允许P-细胞复制的条件下，给予所述受试者连蛋白拮抗剂。
15. 根据权利要求14的方法，该方法进一步包括给予增强细胞生长的因子。
16. 根据权利要求14的方法，其中所述因子为生长因子。
17. 根据权利要求14的方法，其中所述因子选自表皮生长因子(EGF)、 碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞 生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4、 胰岛/十二指肠同源框-l(IDX-l)、 (3-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因 子-a(TGF-a)、转化生长因子-(3(TGF-(3)、胃泌素及其组合。
18. —种在有需要的受试者中再生胰e-细胞的方法，该方法包括向 所述受试者给予连蛋白拮抗剂和向所述受试者中植入细胞。
19. 根据权利要求18的方法，其中所述细胞为胰岛细胞。
20. 根据权利要求18的方法，其中所述细胞为(3 -细胞。
21. 根据权利要求18的方法，其中所述细胞为干细胞。
22. 根据权利要求18的方法，其中将所述拮抗剂在植入所述细胞之前 给予所述受试者。
23. 根据权利要求18的方法，其中将所述拮抗剂在植入所述细胞之后 给予所述受试者。
24. 根据权利要求18的方法，其中将所述拮抗剂在植入所述细胞之前 和之后均给予所述受试者。
25. 根据权利要求18的方法，该方法进一步包括给予增强细胞生长的 因子。
26. 根据权利要求18的方法，其中所述因子为生长因子。
27. 根据权利要求18的方法，其中所述因子选自表皮生长因子(EGF)、 碱性成纤维细胞生长因子-2(BFGF-2)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞 生长因子/扩散因子(HGF/SF)、胰高血糖素样肽-l(GLP-l)、毒蜥外泌肽-4、 胰岛/十二指肠同源框-l(IDX-l)、 (3-动物纤维素、激活蛋白A、转化生长因 子-a(TGF-a)、转化生长因子-卩(TGF-卩)、胃泌素及其组合。
28. 根据权利要求25的方法，其中将所述因子在植入所述细胞之前给 予所述受试者。
29. 根据权利要求25的方法，其中将所述因子在植入所述细胞之后给 予所述受试者。
30. 根据权利要求25的方法，其中将所述因子在植入所述细胞之前和 之后均给予所述受试者。
31. —种治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括给予防止解剖学 屏障的通透性增加的化合物。
32. 根据权利要求31的方法，其中所述防止解剖学屏障的通透性增加 的化合物是增加解剖学屏障通透性的正常的生理学化合物的拮抗剂。
33. 根据权利要求31的方法，其中所述化合物是连蛋白拮抗剂。
34. 根据权利要求33的方法，其中所述连蛋白拮抗剂包括SEQ ID NO:15。
35. 根据权利要求31的方法，其中所述化合物选自SEQ IDs 1-24。
全文摘要
本发明提供用于治疗糖尿病的材料和方法。使用本发明的材料和方法，可以减缓和/或防止胰β-细胞的丢失。而且，可以将本发明的材料和方法用于再生胰β-细胞。
文档编号A61K38/00GK101242851SQ200680029544
公开日2008年8月13日 申请日期2006年6月9日 优先权日2005年6月9日
发明者A·法萨诺, A·萨博恩, B·佩特森 申请人:马里兰巴尔的摩大学;Alba治疗公司