通过肌醇磷脂调节免疫系统的制作方法

专利名称：通过肌醇磷脂调节免疫系统的制作方法
通过肌醇磷脂调节免疫系统
本发明涉及免疫学领域。更具体而言，本发明涉及抑制免疫系统的组
合物和方法，特别是涉及包含磷脂的组合物，用于与抗原呈递分子和T细 胞激活相关或由抗原呈递分子和T细胞激活引起的疾病(例如哮喘和结肠 炎)的预防或治疗。
免疫系统保护机体免受被识别为异物的侵入物的攻击。该系统的核心 是识别称为抗原的物质并对其发生应答，无论它们是感染性抗原或机体的 一部分(自身抗原)。免疫系统产生细胞因子和其它体液因子，以在受到致 炎因子、微生物入侵或损伤的威胁时保护宿主。在大多数情况下，该复杂 防御网络成功地恢复正常的稳态，但在其它情况下，免疫介质可能事实上 证明对宿主有害。免疫疾病和免疫系统介导的损伤的一些例子包括过敏性 休克、自身免疫性疾病、和免疫复合物病。
大多数免疫系统细胞是白细胞，其中存在许多类型。淋巴细胞是白细 胞的一种类型，而两类主要的淋巴细胞是T细胞和B细胞。T细胞是关键 的免疫系统细胞，其有助于破坏被感染的细胞并协调总体免疫应答。T细 胞在其表面上携带T细胞受体(TCR)。该受体与抗原呈递分子例如MHC
(主要组织相容性复合物)分子相互作用。
MHC分子存在于机体的大多数其它细胞的表面上，并且辅助T细胞识 别肽抗原片段。MHC分子的主要免疫学功能是在细胞表面上结合并呈递抗 原肽，以被淋巴细胞的抗原特异性TCR所识别(结合)。I类和II类MHC 分子的差异细胞类型表达与不同类型的免疫细胞的特异化功能相关。I类 MHC表达广泛分布于几乎机体的每一个细胞上，与细胞毒性TC淋巴细胞 的保护功能一致，所述细胞毒性TC淋巴细胞连续地检查细胞表面并杀死 聚藏代谢上活跃的微生物的细胞。II类MHC表达限于抗原呈递细胞
(APC)。1类MHC和II类MHC分子的差异结构性质解释了它们在激活不 同的T细胞群中各自的作用。细胞毒性T细胞(CTL)结合由I类MHC分子 呈递的抗原肽。辅助Th淋巴細胞結合由II类MHC分子呈递的抗原肽。不同的抗原降解和加工途径产生MHC-肽复合物，其中"内源性"肽与I 类分子结合，而"外源性"肽与II类分子结合。I类MHC分子结合来源于由 细胞内源性合成的、蛋白水解降解的蛋白质的肽片段。小肽被运输入内质 网，在那里它们在通过高尔基体发送并展示在表面上进行CTL识别之前结 合新生I类MHC分子。相比之下，II类MHC分子结合来源于由"抗原呈递 细胞"内化的、蛋白水解降解的蛋白质的肽片段，所述"抗原呈递细胞"包括 巨噬细胞、树突细胞和B细胞。所得到的肽片段在内体中区室化，在那里 它们在被发送到细胞表面进行辅助TH淋巴细胞识别之前结合II类MHC分 子。
对于T细胞应答MHC上的外来抗原，抗原呈递细胞上的另一分子必 须向所述T细胞发送第二信号。在所述T细胞表面上的相应分子识别所述 第二信号。抗原呈递细胞和T细胞的这两种二级分子被称为共刺激分子。 存在若干不同的共刺激分子组，其可以参与抗原呈递细胞与T细胞的相互 作用。
除了肽抗原呈递MHC分子之外，存在CD1家族，其代表一组可向T 细胞呈递脂质抗原的抗原呈递分子。CD1家族包括I组CDla、 CDlb、和 CDlc蛋白以及II组CDld蛋白。在拓扑学上，它们类似于传统的肽抗原呈 递MHC分子，只是CD1的大的、全部非极性和疏水的抗原结合槽已进化 来向特异性T淋巴细胞呈递细胞性和病原体来源的脂质抗原。在不同家族 成员之间，疏水性槽在形状上不同，赋予独特的脂结合能力。大多数含有 结合疏水配体的表面CD1同种型可刺激T细胞上的特异性T细胞受体。关 于CD1的详细信息可在Brigl和Brenner的综述("CD1: antigen presentation and T cell fimction." Annu. Rev. Immunol. 2004; 22:817-90)以及其中引用的 参考文献中找到。CDld是特别有趣的家族成员，因为它是唯一在小鼠和人 中都被发现的CDl分子，并具有选择和刺激天然杀伤(NK)T细胞的能力。 NKT细胞是具有aP TCR的T细胞。然而，它们还表达NK细胞的一些细 胞表面分子——它们由此得名。它们在其ap TCR的极其有限的多样性方面 不同于大多数T细胞，并且它们应答由命名为CDld的细胞表面分子呈递 的糖脂质抗原(而不是应答MHC分子呈递的肽抗原)。NKT细胞能够分泌 大量的IFNi (—种Thl免疫应答的主要细胞因子)或者IL-4 (Th2应答的主要细胞因子)。除了防御一些传染剂之外，NKT细胞已经参与抵御自身 免疫性疾病、移植排斥和肿瘤。值得注意，NKT细胞也已经涉及诸如哮喘、 溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎的各种(自身免疫)疾病的发病机理。
一旦抗原呈递分子(如果它是肽-抗原呈递分子或脂-抗原呈递分子)和 T细胞受体相互作用，存在若干种T细胞可采取的可能途径。这些包括T 细胞激活、耐受或T细胞死亡。T细胞能够在MHC和T细胞受体的相互 作用以及共刺激分子的相互作用后发生应答的一种方式是分泌促炎细胞因 子和趋化因子。示例性的细胞因子包括TNF-a、干扰素-Y和其它白介素。
炎性应答因而在限制和控制病原性感染中发挥重要作用。促炎细胞因 子与若干其它相关分子一起介导与传染剂的免疫识别相关的炎性应答。然 而，升高水平的促炎细胞因子还与许多自身免疫的疾病相关，例如中毒性 休克综合征、类风湿性关节炎、骨关节炎、糖尿病和炎性肠病(Dinardlo， C. A.， etal., 1984, Rev. Infect. Disease 6 :51)。在这些疾病中，炎症的缓慢升高加 重或引起很多观察到的病理生理。例如，类风湿性滑膜组织被炎性细胞侵 入，这导致软骨和骨的破坏。 一种重要且被接受的潜在药物干预这些炎性 疾病的方法是减少促炎细胞因子，诸如TNFot和IL-13。许多抗细胞因子疗法 目前处于临床试验中。针对TNFa的单克隆抗体在许多自身免疫性疾病中已 经显示出功效，包括类风湿性关节炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗 (Rankin, E. C. C., et al.， 1997, British J. Rheum. 35 : 334画342和Stack, W. A., et al" 1997, Lancet 349 : 521-524)。
其它抗炎症治疗包括非类固醇抗炎药(NSAID)，其是通过减少各种促炎介质(诸如 细胞因子和前列腺素)的产生来减轻疼痛、肿胀、僵硬和炎症的药物。NSAID与许多副 作用相关。副作用的频率在药物间有所不同。最常见的副作用是恶心、呕吐、腹泻、 便秘、食欲下降、皮疹、头晕、头痛和困倦。NSAID还可引起液体潴留，导致水肿。 最严重的副作用是肾衰竭、肝衰竭、溃疡以及创伤或手术后出血延长。 一些个体对于 NSAID过敏，并在给予NSAID时可能发生呼吸急促。患有哮喘的人处于对NSAID发生 严重过敏反应的更高风险中。
本发明的一个目的是提供预防和治疗炎性疾病的可选的方法和组合 物。具体而言， 一个目的是提供能够预防或减轻与哮喘和炎性肠病 (IBD)例如溃疡性结肠炎——相关的症状。令人惊讶地，该目的组通过
6含肌醇的磷脂适合用于抑制T细胞激活这一发现而实现。以不同水平施加 观察到该抑制效应。第一水平是通过直接抑制，即在T细胞本身之上。除 非另外具体说明，术语"T细胞"意图包括带有T细胞受体的任何类型的细 胞。因此，还包括在内的是除了具有T细胞受体的传统T淋巴细胞之外的 细胞，例如NKT细胞。肌醇磷脂可抑制T细胞激活的第二水平是间接通 过调节抗原呈递的过程。发现，肌醇磷脂是通过抗原呈递细胞的抗原呈递 的有效抑制剂。该效应不限于特异性抗原或抗原类型。例如，由MHCI类、 II类和CD1分子进行的抗原呈递得到抑制。
本发明因此涉及用于预防或治疗与不需要的T细胞激活相关的病症的 组合物，其包含作为活性成分的肌醇磷脂——本文缩写为"IPL"。例如，所 述组合物是药物组合物或具有免疫调节特性的食品。在真核细胞中，肌醇 磷脂在量上较少，但却是具有关键结构、代谢和信号传导功能的膜脂的重 要成分。因此，相比于已知的免疫抑制剂，肌醇磷脂是机体的天然组成。 从而，相比于上述的"外源"免疫调解剂，本发明的组合物的不期望副作用的 风险较低。
本发明的其它方面涉及IPL在制备治疗与不期望的或过量的T细胞激活 相关的任何疾病的药物中的用途，所述疾病例如免疫疾病、变应性紊乱或 慢性炎性疾病。它还涉及抑制对象的免疫系统的方法，包括向所述对象施 用适当剂量的IPL。本发明对于哮喘、I型糖尿病、类风湿性关节炎(RA) 和炎性肠病(IBD)特别有用。而且，本发明提供具有免疫调节性的食品或食 品补充剂。
如本文所示，IPL能够阻断或改变通过肽-抗原呈递分子(例如，I类、 II类MHC)以及脂-抗原呈递分子(例如，CD1)的T细胞和NKT细胞的体外 激活(见图l)。而且，发现，IPL可直接抑制为模拟T细胞受体信号传导而 由佛波酯和钙离子载体诱导的T细胞激活以及通过T细胞受体-复合物 (CD3)和共刺激分子CD28的刺激而诱导的T细胞激活(图3B)。重要地， IPL的粘膜给药对于在建立的动物模型中减轻或预防与哮喘和溃疡性结肠 炎相关的症状非常有效。发现上述效果是剂量依赖性的。磷酸二酯桥和脂 部分的存在对于这些效果似乎是关键的，因为肌醇无显著的抑制效应(图 2)。因此，包含肌醇磷脂诸如PI的组合物适合用于抑制T细胞的激活并由此 抑制T细胞激活的不期望效应，尤其是细胞因子产生。组合物被有利地用于 与携带T细胞受体的细胞——如T淋巴细胞或NKT细胞——不期望激活(例 如过量激活)相关或由其引起的病症的治疗或预防。例如，与通过抗原呈 递分子——或者肽抗原呈递分子或者脂抗原呈递分子——的不期望T细胞 激活相关的病症可以通过用包含IPL的组合物治疗加以改善。在具体的实施 方式中，所述病症是MHC相关病症。II类MHC分子在包括哮喘、结节病、 超敏感性肺炎、和肺移植排斥在内的若干肺部疾病的病理生理中发挥主要 作用。其它MHC相关疾病包括I型糖尿病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风 湿性关节炎、多发性硬化症和实体器官移植排斥(例如肝脏和肾脏)。然而， 由下文描述的体外实验可知，IPL的免疫抑制效应不限于涉及抗原呈递分子 的过程。相反，它们延伸至下游T细胞信号传导的直接调节，包括诱导增殖 和细胞因子产生。在一个实施方式中，本发明提供包含IPL的组合物，用于 T细胞激活的抑制，其中所述组合物调节要求从头蛋白质合成的细胞内T细 胞事件。
体外研究表明IPL的多效抑制效应并非因为脂处理细胞的细胞存活的 总体损失。静息的或激活的细胞延长暴露于IPL不诱导细胞死亡(图3A)。 而且，发现IPL的抑制效应是可逆的，表明它不引起永久失活(数据未示出)。 因此，本发明提供在抗原呈递细胞水平以及T细胞水平(可逆)调节免疫系 统的方法。令人惊奇的是，肌醇磷脂可阻断或改变不同类型的抗原呈递分 子，即具有许多不同抗原的肽-抗原和脂-抗原呈递分子，所述不同抗原具有 相当大的结构变化。尽管不能被排除，但是因此不可能的是，本文公开的 效应仅仅基于肌醇磷脂对于抗原结合位点的竞争效应。不希望受限于任何 理论，可以理解，除了其它，肌醇磷脂的多效效应以不同的抗原加工分子 共同具有的水平施加，例如抗原呈递分子向细胞表面的细胞内运输。更具 体而言，在本文中假设，肌醇磷脂作用的一种模式基于对抗原荷载分子的
胞内运输的干扰。同此，本发明还提供调节分子向质膜运输的方法和组合 物，优选向质膜的内体运输，更优选向质膜的晚期内体运输。所述分子可 以是免疫调节分子，例如I类或II类MHC、 CD1家族成员，或者必须被运输到质膜的任何其它分子，例如跨膜蛋白或者与其物理相关的蛋白质或肽，
诸如Toll-样受体，例如TLR4。
IPL的效应对于肌醇首基具有特异性。相同剂量的磷脂酰丝氨酸 (PS)—也是一种酸性磷脂一不仅仅发现在抑制T细胞激活中无效，而且 甚至提高PMA/Ca诱导的IL-2产生(图3B)。更甚者，尽管PI—直到所测试的 最高剂量(100 ng/ml)都不影响细胞存活，但是PS以剂量依赖的方式表现出 对激活的T细胞的毒性(见图3A)。这和对酸性磷脂的免疫调节效应的早期 研究形成对比。例如，Ponzin等人(Immunopharmacology. 1989 Nov-Dec; 18(3): 167-76.)公开了在小鼠中静脉施用的PS囊泡的免疫抑制效 应。沿着相同的路线，Caselli等人(Immunopharmacology. 1992 May-Jun;23(3):205-213)报道了通过PS抑制激活的外周血细胞中的DNA合 成。因为PI仅仅是部分有效(并且甚至在低浓度下引起DNA合成的刺激)， 所以该效应被归因于磷酸丝氨酸首基。而且，仅含有不饱和脂肪酸酰基链 的PS类是活性的。
如本文所使用，术语"肌醇磷脂"(IPL)是指由磷酸二酯桥连接的脂部分 和D-肌醇(myo-D-inositol)的缀合物。肌醇(六羟基环己垸)部分可以被磷酸 化。脂质可以是甘油脂或鞘磷脂。甘油脂具有甘油部分作为骨架，而鞘磷 脂具有鞘氨脂碱基(sphingoid base)作为骨架。脂肪酰基链长度和不饱和程度 可以不同。它还指肌醇磷脂前体(进一步见下文)以及肌醇磷脂的可接受 的盐。
用于本发明的肌醇磷脂可从天然的、合成的或半合成的来源获得。富 含肌醇磷脂的动物(例如牛)器官(诸如大脑和肝脏)可被用作天然来源。 从天然来源分离肌醇磷脂的方法是本领域已知的。例如，新霉素亲和层析 可被使用。IPL可从商业上称为卵磷脂的复合磷脂混合物获得。重要的是注 意到该混合物事实上仅仅三分之一是真正的卵磷脂。从生物化学上讲，卵 磷脂属于已知为脂质(脂肪、油、蜡)的一组营养物，并且是一种被称为 磷脂酰胆碱的磷脂。商业卵磷脂的另外三分之二由其它磷脂组成，包括磷 脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)。
在另一个实施方式中，使用合成IPL。合成肌醇磷脂的方法是本领域已 知的(例如参见US6，737，536及养中引用的参考文献)。US 6,737,536公开了合成肌醇磷脂的方法，尤其是磷脂酰肌醇、神经酰胺-磷酸肌醇以及它们 的结构类似物和立体化学类似物的合成方法。该公布的方法适合用于实验 室规模制备以及大规模工业生产。
在一个实施方式中，IPL是甘油磷脂，例如磷脂酰-肌斷缩写为Ptdlns 或PI)或它们的磷酸化衍生物，例如PIP、 PIP2或PIP3。磷脂酰肌醇是一种 重要的脂质，既作为关键的膜组分，又作为植物和动物中(以及一些细菌 中)必需代谢过程中的参与者。它是一种酸性(阴离子)磷脂，其主要由 磷脂酸骨架组成，该骨架通过磷酸酯基连接至肌醇。在大多数生物体中， 肌醇的立体化学形式是D-肌醇(具有一个轴羟基)，尽管其它形式(青蟹 肌醇和手性肌醇)已经偶尔在植物中发现。
优选地，IPL的肌醇部分处于1D-l-肌醇构型，而甘油部分处于sn-甘 油-3-磷酸构型。在甘油脂的甘油骨架的sn-l和sn-2位处的脂肪酰基链通常 是酯连接的。甘油残基可以用饱和长链脂肪酰基与统称为(多)不饱和脂肪酰 基的饱和脂肪酰基和多不饱和脂肪酰基之间的混合物酯化。组合物优选包 含至少一种二酰基磷脂酰肌醇。
来自天然来源的IPL通常是分子种类的复杂混合物，各自在它们的脂 肪酰基组成和/或甘油-1和-2位置之间的分布方面不同。磷脂酰肌醇的脂肪 酸组成相当独特。在动物组织中，特征是高含量的硬脂酸(C18:0)和花生四 烯酸(C20:4)。所有的硬脂酸被连接至位置sii-l，而所有的花生四烯酸被连 接至位置sn-2，并且多达80%的总脂质可以由单分子种类sn-l-硬脂酰-sn-2-花生四烯酰-甘油磷酸肌醇组成。在植物磷脂酰肌醇中，棕榈酸(C16:0)是主 要的饱和脂肪酸，而油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)是主要的不饱和成分。此 外，很多饱和脂肪酸处于位置sn-l，而不饱和脂肪酸处于位置sn-2。然而， sn-l-脂肪酰基残基也可以被O-垸基或O-烯基置换，以分别产生垸基-酰基 PI或烯基-酰基PI。还包括在内的是溶血肌醇磷脂，其缺乏2-脂肪酰基，从 而在甘油-2位具有游离的羟基。
在另一个实施方式中，组合物包含鞘磷脂神经酰胺-磷酸肌醇 (CerPhosIns)或其衍生物。优选地，鞘氨醇/神经酰胺残基具有如在天然存在 的CerPhosIns中的D-赤型立体化学构型。CerPhosIns在神经酰胺残基的两 个烷基基团中可含有不同的链长度和不饱和程度，并且可携带额外的不饱和基团、羟基基团或相关官能团。本发明还包括鞘氨苷-磷酸肌醇(鞘氨苷
-Phoslns)，其缺乏酰胺脂肪酰基并具有可被进一步衍生化的游离2-氨基。 组合物还可以包含两种或多种不同肌醇磷脂的组合。它可以例如包含在脂 骨架(例如，甘油或神经酰胺)、脂肪酰基组成、脂肪酰基键(例如酯或醚) 的类型、和/或肌醇首基(例如携带零个、 一个、两个或三个磷酸酯)方面 不同的IPL的混合物。而且，除了 IPL之夕卜，可以存在其它脂质——如果 它是磷脂或中性脂，如甘油二酯或固醇。在优选的实施方式中，IPL混合物 的IPL占所述组合物的总脂质含量的至少50%,优选至少75%，更优选至 少90%,最优选至少95%或甚至99或100%。
优选地，例如，出于经济原因，用于实践本发明的IPL来源于天然来 源，例如来自植物或动物组织。也可以使用其它生物体。组织来源的IPL 含有各种分子种类的肌醇磷脂的混合物，尤其是在脂肪酸组成方面不同。 在优选的实施方式中，在(组织来源的)肌醇磷脂中饱和/不饱和脂肪酸的 比率是至少l.O，更优选至少l.l。具有40。/。以上硬脂酰(C18:0)的脂肪酸含 量的IPL是优选的，任选地与至少10。/c的花生四烯酸(C20:4)结合。用于本 发明的IPL的一种非常良好的天然来源是哺乳动物肝脏，例如牛肝脏。其 它有用的来源包括心脏。
IPL的极性肌醇首基优选不缀合于除了一个或多个磷酸酯棊之外的部 分。例如，IPL优选不含有糖苷键连接于肌醇部分的糖，这与对于包括酰基 甘油基磷脂酰肌醇甘露-寡糖(PIM)在内的细菌细胞壁的免疫原成分所观察 到的不同。此外，对于具有治疗或预防价值的药物组合物，IPL不必须键合 或缀合于载体部分，例如如在US2004/0229842中所公开的生理上可接受的 单体、二聚体、寡聚物或聚合物。
将受益于包含IPL的组合物的病症包括其中期望抗原呈递分子和/或过 量或不需要的(天然杀伤)T细胞激活得到减少的任何病症。在一个实施方 式中，本发明的组合物被用于其中期望减少NKT或(自体反应)T细胞激活 的病症的治疗或预防。天然杀伤T (NKT)细胞是T细胞的亚型，其拥有天 然杀伤细胞和常规T细胞的性质。它们参与直接免疫应答、肿瘤排斥、免疫 监视和自身免疫性疾病的控制。大多数NKT细胞既表达不变的T细胞抗原受 体又表达NK细胞受体NKl.l，并且被称为不变的NKT细胞。该不变的T细胞受体受限于与非经典MHC——CDld呈递的糖脂相互作用。这些NKT细胞在 通过它们的TCR刺激后迅速产生高水平的白介素(IL)-2、干扰素-Y、 TNF-a 和IL-4。大多数还具有类似于NK细胞的细胞毒活性。NKT细胞参与许多病 理学状况，并已表明调节体内病毒感染，以及控制肿瘤生长。它们还可以 在某些自身免疫性疾病诸如糖尿病、狼疮、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎 和变应原诱导性哮喘的进展中既起保护作用又其有害作用。
优选地，通过肽抗原呈递——尤其是通过I类或II类MHC分子的肽抗原 呈递——的减少或抑制，所述病症得以改善。这样的病症可以例如是自身 免疫性疾病、变应性紊乱、移植排斥或(慢性)炎性疾病。优选地，与其 相关的疾病或症状允许用本发明的组合物进行局部治疗，更优选通过粘膜 给药。然而，含IPL的组合物的全身给药也可以考虑。
自身免疫性疾病起源于身体对正常存在于身体内的物质和组织的免疫 应答活动过度。自身免疫性疾病的例子为系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿 性关节炎(RA)、产后甲状腺功能不全、自身免疫性血小板减少、牛皮癣、 硬皮症、疱疹样皮炎、多发性肌炎、皮肌炎、寻常型天疱疮、脊椎关节病 例如强直性脊柱炎、白癜风、修格连氏综合征(Sj6gren's syndrome)、多发 性硬化症(MS)、克罗恩病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、自身免疫性神经 病例如格林-巴利综合征(Guillain-Barr6)、原发性胆汁性肝硬变、自身免 疫性肝炎、自身免疫性葡萄膜炎、1型或免疫介导的糖尿病(DM1)、自身免 疫性溶血性贫血、恶性贫血、葛累夫斯病、自身免疫性血小板减少、桥本 甲状腺炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、肾上腺的自身免疫性疾病、抗磷 脂综合征、血管炎例如韦格纳氏肉芽肿病和贝切特病。
当免疫系统对暴露于环境中的抗原过度反应时变应性紊乱发生。引起 这类发作的物质(抗原)称为变应原。免疫应答可引起诸如肿胀、泪溢和 喷嚏的症状，甚至引起威胁生命的反应，称为过敏反应。服用称为抗组胺 类的药物可缓解大多数症状。变应性紊乱的一些例子是哮喘和湿疹。哮喘 是呼吸系统疾病，其可引起呼吸问题，经常包括肺部的变应性应答。如果 肺部对某些变应原(例如花粉、霉菌、动物皮屑或尘螨)过敏，它可触发 肺部的呼吸管变窄，导致气流减少并使人呼吸困难。湿疹是有鳞的、痒的 疹，也称为特应性皮炎。环境性变态反应(例如对尘螨)、季节性变态反应(例如枯草热)、药物性变态反应(对特定药剂或药物的反应)、食物 性变态反应(例如对坚果)、以及对毒素的变态反应(例如蜂螯伤)是人 们经常称为变态反应的常见病症。
本发明人研究了IPL在两种不同动物模型中的体内抗炎效应半抗原诱 导的结肠炎模型、以及卵清蛋白诱导的哮喘模型，其分别代表人炎性肠病 和人变应性哮喘的有效鼠模型系统。
噁唑酮结肠炎模型(Boirivant, Exp. Med., Volume 188, Number 10, November 16， 1998 1929-1939)在SJL/J小鼠中通过半抗原化剂(haptenating agent)——噁唑酮——的直肠滴注进行诱导，并且其特征在于迅速发展的 结肠炎限于结肠的远侧的那一半；它由混合的中性粒细胞/淋巴细胞浸润组 成，所述浸润限于与溃疡形成相关的粘膜表层。噁唑酮结肠炎是2型T辅助 细胞(Th2)-介导的过程，这是因为来自损伤组织的受刺激的T细胞产生显著 增加量的白介素(IL)-4和IL-5 (参见Nieuwenhuis et al. "Disruption of T helper 2画immune responses in Epstein國Barr virus-induced gene 3-deficient mice". Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Dec 24;99(26): 16951-6;以及Heller et al. '，Oxazolone colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13-producing NK-T cells." Immunity. 2002 Nov;17(5):629-38)。噁唑酮结肠炎的组织学特征和分布具有类似于IBD的特 征，尤其是溃疡性结肠炎(UC)，从而明显地区分该模型与许多其它模型， 例如在大鼠中醋酸诱导的结肠炎，其被认为是不依赖T细胞的损伤模型。
在噁唑酮结肠炎——一种溃疡性结肠炎(一种炎性肠病(IBD))的小鼠 模型—中研究肌醇磷脂的体内免疫抑制作用。细节见实施例2A。简言之， 用噁唑酮皮下致敏的小鼠通过噁唑酮连同不同剂量的肌醇磷脂一起进行直 肠给药而激发。令人惊奇地，已经接受IPL的小鼠表现出更高的早期存活率 (图4)。而且，肠T细胞经先体外后体内激活后的细胞因子产生在从IPL治 疗的小鼠获得的细胞中被强烈抑制(图5)。
本发明人使用的人变应性哮喘的鼠OVA吸入模型也已经被很好地建 立，并且描述于例如Hessel等人(Eur J Pharmacol. 1995 Dec 7;293(4):401-12) 和Hofstra等人(J. Immunol. 161:5054)。简述之，BALB/c小鼠通过腹膜内(IP) 注射对卵清蛋白(OVA)致敏，并随后用雾化的OVA激发(第13和14天)。
13在进行OVA气溶胶激发之前，使用气溶胶喷雾器，对一些小鼠用0、 200或 2000pg/mlIPL进行气管内暴露。对照组仅暴露于OVA。之后，小鼠被处死。 如在下文中更加详细地例证(实施例2B)，包含作为活性剂成分的至 少一种IPL的组合物在哮喘动物模型中显示出显著的免疫抑制效应。染色的 肺切片的组织学分析表明,PI治疗预防了与哮喘相关的典型组织病理学变化 (图6)。
一方面，本发明提供了包含作为活性成分的至少一种IPL的药物组合 物，所述组合物适于或配制用于肺部施用。还提供了IPL~~尤其是PI—— 在制备用于治疗或预防动物——优选人对象——哮喘病症的药物中的用 途。包括IPL在内的磷脂以前已经被应用于肺部组合物中，以促进活性剂的 输送。通常，该脂质被掺入脂质体或允许蛋白质性质的活性剂的输送和分 散的其它类型的脂质体。例如，WO2005/055994公开了包含表面活性剂混 合物的组合物，所述表面活性剂混合物包含磷脂和肺部表面活性剂多肽， 所述多肽具有使其与肺泡的相互作用最大化的特异氨基酸序列。相比之下， 本发明的抗哮喘组合物包含IPL作为活性剂，而不是肺部表面活性剂多肽作 为活性剂。因此，在一个实施方式中，用于IPL的肺部施用的组合物不含有 肺部表面活性剂多肽或者其它类型的蛋白质性质的治疗分子。
令人惊奇地，OVA-激发的小鼠的支气管肺泡灌洗(BAL)分析揭示了PI 对嗜酸粒细胞增多的强抑制效应(图7)。嗜酸粒细胞增多是指其中在血液 或身体组织中发现异常高含量的嗜酸粒细胞的病症。嗜酸粒细胞增多在很 多病症中发生，包括变应性疾病，例如哮喘、枯草热和嗜酸粒细胞性食管 炎。因此，本发明还涉及预防或治疗嗜酸粒细胞增多的方法和组合物。
世界范围内嗜酸粒细胞增多的主要原因是寄生虫感染。它也可与常见 皮肤疾病、药物反应和寄生虫感染有关而发生。数量增加的嗜酸粒细胞与 变应性疾病或寄生虫感染有关。这在对抗寄生虫感染中是有帮助的，但在 变应性疾病的情况下则没有，因为它们在组织中累积并引起损伤。例如， 在哮喘中，嗜酸粒细胞引起肺部气道损伤。
IPL在哮喘小鼠模型中发挥其抑制效应的确切机理目前尚不清楚。最可 能的是，它是对抗原呈递例如通过MHC和CD1分子的抗原呈递以及对阻断 下游TCR信号传导本身而不考虑TCR如何被触发的联合作用。已经提出，CD1在哮喘中发挥重要的作用，这是因为缺乏CDld或NKT细胞的小鼠当通 过OVA抗原的吸入暴露而激发时表现出免疫应答降低(Akbari et al. Nature Med.2003 May;9(5):582-8.)。然而，如本文所公开的IPL的观察到的免疫抑制 效应比在CDld缺陷小鼠中观察到的强得多。这些数据表明，不能(仅仅) 通过经由CDl的脂质-抗原呈递功能异常来解释肌醇磷脂的效应，而是在于 肌醇磷脂具有宽得多的作用谱。树突细胞(DC)是主要的抗原呈递细胞 (APC)，其负责气道中变应原的捕获以及加工后的变应原向引流淋巴结的穿 梭，抗原呈递和T细胞激活在引流淋巴结发生。在一个实施方式中，本发明 提供了肌醇磷脂用于抑制通过DC的抗原呈递的用途。
包含肌醇磷脂或其药学上可接受的盐(例如，钠盐或铵盐)的药物组 合物可以是胶囊、片剂、锭剂、灌肠剂、糖锭剂、丸剂、小滴、栓剂、粉 末、喷雾剂、疫苗、膏剂、糊剂、乳剂、吸入剂、贴剂、气溶胶等等。其 中所用的药学上可接受的盐可以是，例如，无机酸盐例如氢氯化物、氢溴 化物、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二 酸盐、苯甲酸盐等等。在Remington ' s Pharmaceutical Sciences中可以获得 药学上可接受的赋形剂的全面论述。(Mack Pub. Co.， N丄1991).
作为药学上可接受的载体，可以使用最适于特定剂型并且与肌醇磷脂
相容的任何溶剂、稀释剂或其它的液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性 剂、等渗剂(isotonic agent)、增稠剂或乳化剂、防腐剂、包胶剂、固体粘 合剂或润滑剂。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可以含有液体，例如水、盐水、 甘油和乙醇。优选盐水。另外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲 物质等等可以存在于这样的载体中。 一般地，所述治疗组合物制备为注射 剂，或者为液体溶液或者为悬浮液;也可以制备注射前适于液体载体溶液或 液体载体悬浮液的固体形式。
对于治疗性处理，肌醇磷脂被施用于需要其的对象。可通过任何合适 的途径向对象施用肌醇磷脂，优选以适于这类途径的药物组合物的形式以 及以对目的治疗有效的剂量施用。优选粘膜施用途径，例如直肠内粘膜施 用或气管内粘膜施用，因为相比于全身给药，这降低了有害副作用的风险。 例如通过使用动物模型，本领域技术人员可以容易地确定治疗所述疾病所需的肌醇磷脂的治疗有效剂量，治疗所述疾病如预防和/或治疗人类或动物 对象体内的选自哮喘、类风湿性关节炎、糖尿病和炎性肠病的疾病。当
然，IPL也可以与一种或多种本领域已知的免疫抑制剂或抗炎(药物)治疗 (包括皮质类固醇和非甾体抗炎药(NSAID))联合使用。
本文中所用的术语"治疗有效量"是指用于降低或防止不需要的或过度 的T细胞激活、或者表现出可检测的治疗或预防效果的IPL的量。可以通 过，例如测量细胞因子的产生或通过评价炎性反应的进展或严重性的任何 其它适当方法来检测所述效果，这些方法本身是本领域技术人员已知的。 对象的精确的有效量将取决于所述对象的大小和健康状况、病症的性质和 程度以及所选的用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。因此，预先指定精确 的有效量是没有用处的。然而，可以通过常规实验确定给定情况的有效 量，并且所述有效量在临床医生或实验者的判断之内。具体而言，本发明 的组合物可用于降低或预防哮喘或溃疡性结肠炎(UC)和/或伴随的生物学表 现或生理表现。允许临床医生建立初始剂量的方法是本领域已知的。待施 用的剂量必须是安全而有效的。
为了本发明的目的，有效日剂量将是所施用的个体中约0.01ng肌醇磷 脂/kg至l g肌醇磷脂/kg、并优选约0.5jxg肌醇磷脂/kg至约400 mg肌醇磷脂 /kg。
在又一可选实施方案中，可以自所述对象体内插入的控释或缓释基质 施用本发明的肌醇磷脂或组合物。
发现其中所述至少一种IPL占低于50%、优选低于30%、更优选低于
25%的组合物干重的组合物有效地降低或防止炎性症状。鉴于本文中所披 露的肌醇磷脂的广谱免疫调节作用，本发明还涉及包含IPL的食品、食品 补充剂或食品添加剂。所述食品可以是固体或液体食品。所述食品添加剂 定义为可以用于制备(功能性)食品的组合物。食品补充剂定义为除了正常的 食物摄入之外可以消费的组合物，所述组合物包含不存在于正常饮食或仅 以小量存在于正常饮食中的元素或组分，并且其充分的或提高的消费是期 望的。食品的组成不必要与食品补充剂或食品添加剂的组成有很大差异。
对于本发明的食品组成，关于IPL的类型存在同样的偏好。如上所述 的富含IPL的食品或食品补充剂可以适当地包含0.01至99.9we/。的肌醇磷
16脂。在优选实施方案中，所述食品或食品补充剂包含0.01至50 wt.%、优 选0.01至10wt.。/。、更优选0.01至5 wt。/。的肌醇磷脂、其前体或其可接受 的盐。
为了制备包含适于人类或动物消费的提高量的IPL的食品或食品补充 剂，可以通过向所述食品或补充剂添加各种化合物来改进营养价值、质地、 味道或气味。本领域技术人员公知可用于本发明的食品或食品补充剂的不 同来源的蛋白质、碳水化合物和脂肪以及不同来源的可能的增甜剂、维生 素、矿物质、电解质、着色剂、芳香剂、调味剂、香料、填料、乳化剂、 稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、食物纤维、及可以加入所述食品来提高其营 养价值、味道、或质地的食品的其它组分。这类组分的选择是配方、设计 和偏爱的问题。可以加入的这类组分和物质的量是本领域技术人员已知的， 其中所述选择可以例如通过对于儿童和成人以及动物每日建议摄取剂量 (RDA剂量)来进行指导。
用于食品或食品补充剂摄入的份量在大小方面可以不同，并且不限于 相应于所推荐的剂量的数值。术语"食品补充剂"在本文中不意于限于特定 的重量或剂量。
如上所述的食品或食品补充剂的组合物原则上可以采取适于人或动物 消费的任何形式。在一个实施方式中，所述组合物是可被悬浮、分散、乳 化或溶解在含水液体诸如水、咖啡、茶、牛奶、酸奶、原汤或果汁以及酒 精饮料中的干粉形式。为了这个目的，可以单位剂型提供所述粉末。
在可选的优选实施方案中，干粉形式的含IPL的组合物被制成片剂。 为了这个目的，本发明的食品补充剂的组合物可非常合适地与填料例如微 晶纤维素(MCC)和甘露醇、粘合剂例如羟丙基纤维素(HPC)、和润滑剂例如 硬脂酸或其它赋形剂一起提供。
如上所述的食品或食品补充剂的组合物也可以液体制剂的形式提供， 其中固体在含水液体中悬浮、分散或乳化。这类组合物可以直接混合入食 品中，或者可以例如被挤出并加工成颗粒或其它形状。
在可选的实施方案中，食品或食品补充剂可具有固体、半固体或液体 食品的形状，例如面包、长条面包(bar)、曲奇饼或三明治，或者作为涂 抹料、沙司、黄油、人造黄油、乳制品等等。优选地，IPL用于乳制品例如黄油或人造黄油、蛋奶冻、酸奶、干酪、涂抹料、饮料、或布丁或其它甜
点。优选地，所述食品是饮料，因为这种方式可容易地估量脂质摄入。IPL 也可用在用于油炸和烘焙的黄油或脂肪中，因为它们在高温下相对耐降解。 这个特点也使得IPL能够用于经受巴斯德杀菌或灭菌处理的食品或食品补 充剂。含EPL的饮食或低淀粉制品也构成本发明的食品或食品补充剂的优 选实施方式。
如果本发明的食品被用作动物饲料，则所述食品可例如被制备成粉末、 颗粒、华夫饼、粥、硬块、浆、糊、薄片、煮品(cook)、悬液或糖浆的形 式。
为了向人施用，本发明的食品可非常适合地制备成食品补充剂的形式。 本发明进一步涉及制备本发明的食品或食品补充剂的方法，包括使食 品或食品补充剂富含肌醇磷脂、其前体、或其可接受的盐。
在一个实施方式中，本发明提供制备富含IPL的食品或食品补充剂的 方法，包括将食品或食品补充剂中的肌醇磷脂加工至优选0.01至99.9 wt.% 的量、更优选0.01至50wt。/。的量、甚至更优选O.Ol至10wt。/。的量、以及 最优选0.O1至5 wt。/。的量。掺入本发明的食品中的IPL的实际量取决于脂 质的类型以及其用途，并且本领域技术人员在本公开内容的情况下能够确 定该量。
在制备本发明的食品的方法中，所述食品首先被单独制备，然后与IPL 结合，提供本发明的食品，其中所述磷脂被掺入所述食品中。所述食品通 过诸如混合、烘焙、油炸、烹饪、汽蒸或水煮的常规方法进行单独制备， 并且如果需要，可以在与IPL结合之前进行冷却。根据另一个合适的实施 方式，IPL在所述食品的制备过程中作为所述食品的成分而被掺入。
本发明的食品或食品补充剂可非常合适地定义为营养品组合物。营养 品可定义为用于通过增加重要营养素的总饮食摄入而补充饮食的天然产 品。该定义包括营养补充剂，例如维生素、矿物质、植物提取物、抗氧化 齐IJ、氨基酸、和蛋白质补充剂。营养品符合1994年的Dietary Supplement Act 中由F.D.A制定的"饮食补充剂"的新建立的产品目录。该法案具体规定了 饮食补充剂包括维生素、矿物质、草药或其它植物性药材、抗氧化剂、 氨基酸或用于通过总日摄入而补充饮食的其它饮食物质。200680055563.4
"营养品组合物"在本文中定义为用能够产生健康益处的成分加强的食 品组合物。本发明中的这类组合物也可以被描述为特殊饮食用途的食品； 医疗食品；和饮食补充剂。本发明的食品和/或食品补充剂是营养品组合物， 因为它用本发明的IPL加强，并且因为它能够治疗或预防与过量的或不需 要的T细胞激活相关的疾病或病症。例如，所述食品或补充剂可帮助预防 或减轻与诸如变态反应(例如枯草热)等炎性病症相关的症状。
对于药物组合物，IPL在食品或食品添加剂中的量将取决于若干因素。 所述食品一般包含一定浓度的IPL，其在消费常规(例如每日)份量的所述 食品后足以为消费者提供有效量的脂质。例如，所述食品可以是一般以 200-ml份量消费的饮料，其中肌醇磷脂以0.0005至2 mg/升的量存在，优 选等等。在另一个实施方式中，本发明提供包含IPL的涂抹料。
本领域技术人员将认识到，实现本文描述的药物组合物、食品或食品 补充剂的治疗效应的单独剂量的最适量和间隔可由普通技术人员容易地确 定。它们将通过所治疗的病症的性质和程度，以及通过给药形式、途径和 部位、以及接受治疗的具体个体加以确定，并且这类最适值可通过常规技 术确定。通常，所述治疗将包括以每24小时每千克体重大约0.001至1克、优 选0.005至0.5克、更优选0.01至0.1克的量施用肌醇磷脂。本领域普通技术人 员还将理解，最适给药方案即剂量数可使用本领域已知的常规的疗程确定 试验加以确定。本发明人观察到，静脉内接受200]alPI2mg/ml(即400吗) 的小鼠在给药后3小时的观察期内不表现出任何症状或不利迹象。 一般而 言，治疗给药方案将包括至少每日一次、优选每日一至四次施用选择的包 含肌醇磷脂的剂型，例如PI气溶胶喷雾剂，直到症状消退。或者在缓和时给 予，以防止疾病加剧(恶化)。为了本发明的目的，在将施用的个体中，有 效剂量将为大约0.01-5%的干食品重量，意味着对于成人而言，日剂量将在 大约0.04和35 mg的肌醇磷脂之间。
优选地，配制药物组合物，使得它适于向有需要的对象例如患有免疫 疾病的人或动物对象进行局部粘膜施用。药物递送的粘膜途径包括鼻腔、 直肠腔、阴道腔、很腔和口腔的粘膜衬(mucosal lining)。局部粘膜施用的 部位包括气道(例如，鼻递送或气管内递送)和胃肠道。在一个实施方式
19中，本发明提供包含肌醇磷脂的喷雾剂。具体而言，它提供了包含肌醇磷 脂例如PI的气溶胶喷雾剂用于治疗或预防与哮喘相关的症状的用途。
在另一个实施方式中，本发明提供包含肌醇磷脂的直肠灌肠剂或栓剂。 这些在治疗或控制炎性肠病中特别有用。炎性肠病的两个主要种类是溃疡 性结肠炎和克罗恩病。溃疡性结肠炎的特征在于与肠感染无关的大肠粘膜 层炎症的复发。所述炎症涉及直肠，并可以近似连续的方式延伸。克罗恩 病的特征在于肠的任何部分——从入口到肛门一一的化脓炎症的复发。该 炎症是透壁的，并可导致狭窄、微穿孔和瘘管。所述炎症是非相邻的，从 而可在整个肠内产生跳跃性病变。用于炎性肠病治疗的包含肌醇磷脂的本 发明的组合物也当然还可以含有一种或多种治疗物质和常用的赋形剂。例
如，它可含有其它抗炎药，例如氨基水杨酸盐(例如5-ASA)或(皮质)类固醇。 在又一个实施方式中，它通过包含IPL的软膏剂。这些在治疗或控制皮肤的 炎性疾病例如牛皮癣中特别有用。
如果脂质在食物或药物组合物中，与向对象施用脂质有关的一个已知 问题是它们可以被代谢，例如被一般性或特异性脂酶代谢。这对于磷脂在 消化道中的应用特别有关。此外，在本发明中，向对象施用的IPL的代谢 (例如分解或转化)可能在脂质到达其作用位点(例如APC和/或T细胞) 之前发生。这个问题可通过以所谓的前体化合物单独或联合施用IPL或其 药学上可接受的盐加以解决，所述前体化合物包含某些取代基，结果IPL 可不再被代谢或者仅以降低的速率代谢。这些前体优选在消化道的上面的 部分(例如，口、胃)中耐水解，而例如在消化道的下面的部分(例如， 盲囊、结肠)相对容易分解，如果IPL应当特别在那里发挥其作用的话。 优选地，当前体的摄入是经口途径时，完整的或代谢过的前体被吸收入血 流中并运输至靶位点，在那里它们可以被激活，以发挥其有益效应。因此， 当所述化合物已经从消化道被吸收时——即在血液或肝脏中——发生激活 是可能的。结果，所述化合物的量在其中鞘磷脂发挥其作用的那些位置处 得到增加。例如，可使用这样的IPL前体，其可通过合适的酶在体内分解 或激活，以便释放可抑制对象中T细胞激活的IPL。
出于预防或治疗的原因，肌醇磷脂或其前体或其药学上可接受的盐可 向有需要的对象提供。肌醇磷脂或其前体或其药学上可接受的盐可以食品或者以药物制剂的形式向有需要的对象提供，所有这
类施用形式都能够预防不需要的T细胞激活的发展和/或减轻不需要的T细 胞激活的症状。具体而言，考虑了哮喘、糖尿病和炎性肠病的发展和/或严 重性。
IPL或其前体或其药学上可接受的盐可用于食品或食品补充剂。食品补 充剂定义为除了正常的食物摄入之外可以消费的组合物，所述组合物包含 不存在于正常饮食或仅以小量存在于正常饮食中的元素或组分，并且其充 分的或提高的消费是期望的。食品的组成不必要与食品补充剂的组成有很 大差异。
本文公开的食品或食品补充剂包含一定量的肌醇磷脂，其高于正常情 况下或无人为干涉的情况下存在于所述食品或食品补充剂或在其中发现的 量。肌醇磷脂的该升高量可源于向食品具体加入所述鞘磷脂，即通过使所 述食品富含所述磷脂，所述食品正常情况下不含所述升高量的所述鞘磷脂。 可选地，遗传工程可用于产生包含升高量的所述IPL的食品，例如通过工 程改造在用于食品生产的植物、酵母或其它微生物中这类IPL产生的生物 合成途径，以使所述IPL在所述生物体中以升高量产生的方式进行。
含有提高水平的肌醇磷脂、或其前体或衍生物的食品或食品补充剂被 有利地用于炎性疾病的预防和/或治疗，尤其是变应性哮喘或溃疡性结肠炎 的预防和/或治疗。所述食品或食品补充剂也可用于治疗和/或预防炎性疾病 尤其是变应性哮喘或溃疡性结肠炎的饮食。因此，本发明提供免疫抑制性 食品或食品补充剂，其包含提高的IPL水平，例如外部加入的PI，优选哺 乳动物PI，更优选牛肝脏PI或其合成类似物。
本文还提供了在健康对象中预防炎性疾病尤其是变应性哮喘或溃疡性 结肠炎的发生的方法，包括向所述对象提供具有提高水平的肌醇磷脂或其 前体、衍生物或药学上可接受的盐的饮食。可选地，或者此外，所述对象 可被施用(例如，通过粘膜途径)本发明的药物组合物。而且，本发明还 提供本发明的药物组合物用于预防和/或治疗炎性疾病尤其是变应性哮喘 或炎性肠病的用途。
进一步的方面涉及治疗患有炎性疾病尤其是变应性哮喘或炎性肠病 (诸如溃疡性结肠炎)的对象的方法，所述方法包括向有需要的对象施用
21治疗有效量的本发明的药物组合物。


图1: PI对CDld限制性NKT细胞激活的剂量依赖性抑制。CDld转 染的上皮细胞系T84D用a-半乳糖基神经酰胺脉冲，并与不同浓度的PI共 培养。通过测量上清液中存在的IL-2测定NKT细胞激活。
图2:磷脂酰-肌醇而不是肌醇阻断CDld依赖性NKT细胞激活。CDld 转染的上皮细胞系T84D用(x-半乳糖基神经酰胺脉冲，并与溶剂对照、PI 或肌醇共培养。通过测量上清液中存在的IL-2测定NKT细胞激活。
图3: PI和PS对细胞存活力和免疫抑制的差异效应。T细胞以106个 细胞/ml悬浮于24-孔板中(每孔1 ml悬浮液)。细胞或者未处理(PMAO Cal 0) 或在所示浓度(以pg/ml表示)的PI或PS存在下用5 ng/ml PMA+ 0.1 pg/ml 钙离子载体A23187(PMA5ng/mlCal0.1ug/ml)激活。图A:在所示脂质和 刺激物存在下温育24小时后利用7-AAD染色细胞的流式细胞术检测来测 量细胞存活力。PI不显著影响细胞存活力，而PS以剂量依赖方式对激活的 细胞产生毒性。图B: PI对通过IL-2细胞因子产生测量的T细胞激活的抑 制效应对PS对通过IL-2细胞因子产生测量的T细胞激活的刺激效应。
图4: IPL强烈影响噁唑酮结肠炎模型的早期存活。实验细节参见实施 例2A。
图5:经IPL直肠内处理噁唑酮结肠炎小鼠后对肠T细胞产生IL-2的 抑制。在用噁唑酮激发来诱导结肠炎之前，小鼠用盐水(A组)或PI (B 组)处理二十分钟。处死小鼠，并分析肠T细胞经aCD3/aCD28刺激48小 时(图A)或72小时(图B)后的IL-2产生。ALN=腋窝(axillair) LN; MLN=纵隔LN; ILN=髂骨(iliacal) LN。进一步的细节参见实施例2A。
图6:用IPL (非脂质体气溶胶)处理预防了与哮喘小鼠模型相关的典 型组织病理学变化。实验细节参见实施例2B。
图7:用IPL (气溶胶)处理预防了与哮喘小鼠模型相关的嗜酸粒细胞 增多。实验细节参见实施例2B。
实验部分下文的实施例1和2证明了肌醇磷脂在体外条件下的免疫抑制效应，而 实施例3描述了IPL在免疫疾病的动物模型中的体内效应。所有体内实验都 根据荷兰鹿特丹Erasmus University的实验动物委员会(Experimental Animal Committee)制定的伦理规范进行。所用的材料包括从Sigma (Bovine liver PI; Sigma目录号P 8443)获得的磷脂酰肌醇(PI)、从Becton Dickinson获得的I-肌醇/肌醇
实施例l:通过CDld脂抗原呈递的NKT细胞激活
在第0天，T84D细胞(一种用CDld转染的人上皮细胞系)与aGalCer (10 mg/ml)—起温育过夜。在不同时间点向T84D细胞加入不同剂量的PI。 接下来，用PBS洗涤T84D细胞一次，并加入DN32细胞(鼠1.1阳性NKT 细胞系)(T84D:DN32-1:10)，共培养24小时。收集上清液，并通过ELISA 测定DN32产生的IL-2细胞因子(反映T细胞激活)。结果示于图l中。
实施例2:粘膜施用的肌醇磷脂的体内效应 用于粘膜施用PI的组合物的制备
2 mg牛肝脏PI (Avanti Polar Lipids;目录号830042)在氮流下干燥，并 通过上下吸液若干次而悬浮于1 ml生理盐水(0.9 % NaCl)中。该2 mg/ml 储存液以10倍稀释于生理盐水中，获得0.2 mg/ml的悬浮液。
实施例2A:结肠炎的动物模型
在第0天，7-10周龄的雄性野生型black/6小鼠(Charles Rivers)用150 pl 在100%乙醇中的3% 4-乙氧基亚甲基-2-苯基-噁唑啉-5-酮(噁唑酮；Sigma) 表皮致敏。在第5天，在氯胺酮(80 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)麻醉下， 通过直肠施用100 ^11在含水乙醇(50%)中的2%噁唑酮，激发小鼠。在激发 前二十分钟，小鼠用100 ^盐水(对照)或PI(2mg/ml)进行直肠内处理。所 有三组都含有8只小鼠。在第5、 6、 7和8天进行称重，并在第8天处死。
结肠组织用4%天然缓冲福尔马林溶液固定，包埋入石蜡中，切成5 pm 组织切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色。使用以前对于噁唑酮结肠炎已经描述过的评分(REF)，检查染色切片的结肠炎证据。分离脾脏、腋窝淋 巴结(ALN)、肠系膜淋巴结(MLN)和髂骨淋巴结(ILN)，并用PBS (对照) 或用在IMDM培养基中的aCD3/aCD28 (各自100 |xl， 2 pg/ml)先体外后体 内刺激。在48和72小时后，通过ELISA (Beckton & Dickinson)测量IL-2
的产生。
结果
在小鼠中半抗原诱导的结肠炎的诱导之前通过结肠施用PI的局部治疗 导致体重损失减少以及存活率增加。如图5所示，用IPL进行小鼠的直肠 内治疗抑制了肠T细胞先体外后体内刺激后的IL-2产生。这些数据表明， IPL可用于人炎性肠病例如溃疡性结肠炎的预防或治疗。
实施例2B:哮喘的动物模型
在第一天和第八天，7-10周龄的雄性野生型Balb/c小鼠(Charies Rivers) 通过腹膜内(i.p.)注射乳化在2.25 mg明矾(Alumlmuject; Pierce)中的20吗 OVA(Sigma)进行致敏。在第15、 16和17天，使小鼠服用镇静剂，并使其 气管内(i.t)接受80 的三种PI溶液(0 |xg/ml、 200吗/ml或2 mg/ml)之一。 随后，小鼠通过吸入暴露于60 pl的含OVA的气溶胶(1%，盐水中)20分钟 而进行激发。所有三组都含有8只小鼠。在第18天处死小鼠。
用3 ml盐水冲洗肺，并通过FACS分析鉴定和量化该支气管肺泡灌洗 (BAL)中的细胞。随后，所述肺被冷冻固定，切成5 pm组织切片并用 May-Grunwald-Giemsa (MGG)染色。检查染色切片中炎性细胞浸润例如嗜 酸粒细胞的存在。
结果
该气道高反应性模型表明，气管内PI治疗强烈抑制与哮喘有关的嗜酸 粒细胞的典型内向通量。肺部分析确认，PI减少了组织病理学变化，而该 组织病理学变化是这种模型的特征。这些数据表明，IPL适合用于人哮喘的 预防或治疗。
权利要求
1. 一种适于粘膜施用的药物组合物，其包含作为活性成分的肌醇磷脂(IPL)和药学上可接受的载体或稀释剂。
2. 权利要求l所述的组合物，其中所述IPL的肌醇首基不与除了磷 酸酯基之外的部分缀合。
3. 权利要求1或2所述的组合物，其中所述IPL是天然来源的。
4. 权利要求1至3任一项所述的组合物，其中所述IPL是二酰基甘油 磷脂酰肌醇。
5. 权利要求1至4任一项所述的组合物，其中所述IPL中存在的饱和 脂肪酸与不饱和脂肪酸的比率为至少1.0，优选至少1.1。
6. 权利要求1至5任一项所述的组合物，其中所述IPL来源于哺乳动 物组织，优选肝脏，更优选牛肝脏。
7. 上述权利要求任一项所述的组合物，其中所述组合物是非脂质 体组合物。
8. 上述权利要求任一项所述的组合物，其中所述至少一种IPL以在 生理学上可接受的含水载体中、优选在生理盐水中的悬浮形式存在于所述 组合物中。
9. 上述权利要求任一项所述的组合物，其中所述至少一种IPL占所 述组合物干重的低于50%、优选低于30%、更优选低于25%。
10. 上述权利要求任一项所述的组合物，其中所述组合物适于直肠 施用。
11. 权利要求1至9任一项所述的组合物，其中所述组合物适于肺部 施用，例如以喷雾剂或气溶胶的形式。
12. 权利要求ll所述的组合物，其不包含肺部表面活性剂多肽。
13. —种制备包含作为活性成分的至少一种IPL的药物组合物的方 法，所述方法包括在含水生理学可接受的载体中、优选在盐水中制备所述 至少一种IPL的非脂质体悬浮液。
14. IPL用于制备治疗或预防哺乳动物的哮喘病症的药物的用途。
15. 权利要求13所述的用途，其中所述药物不包含肺表面活性剂多肽。
16. IPL用于制备治疗哺乳动物的炎性肠病、优选溃疡性结肠炎的 药物的用途。
17. —种食品或食品补充剂，其富含至少一种IPL、优选PI、更优选 二酰基甘油PI。
18. IPL用于制备能够预防炎性疾病、尤其是变应性哮喘或溃疡性 结肠炎的食品或食品补充剂的用途。
19. 一种预防健康对象发生炎性疾病、尤其是变应性哮喘或溃疡性 结肠炎的方法，所述方法包括为所述对象提供具有提高水平的IPL或其前 体、衍生物或药学上可接受的盐的饮食。
20. —种预防健康对象发生炎性疾病、尤其是变应性哮喘或溃疡性 结肠炎的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求1至12任一项所述的 药物组合物。
21. —种治疗患有炎性疾病、尤其是变应性哮喘或溃疡性结肠炎的 对象的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的权利要求l至 12任一项所述的药物组合物。
22. 具有提高水平的IPL、或其前体或衍生物的食品用于预防和/或治 疗炎性疾病、尤其是变应性哮喘或溃疡性结肠炎的用途。
23. 具有提高水平的IPL、或其前体或衍生物的食品在用于治疗和/ 或预防炎性疾病、尤其是变应性哮喘或溃疡性结肠炎的饮食中的用途。
24. 权利要求l至12任一项所述的药物组合物用于预防和/或治疗炎 性疾病、尤其是变应性哮喘或溃疡性结肠炎的用途。
全文摘要
本发明涉及免疫学领域。更具体而言，本发明涉及尤其通过干扰抗原呈递分子和T细胞激活来抑制免疫系统的组合物和方法。本发明提供了预防或治疗其中期望抑制T细胞激活的病症的组合物，所述组合物包含作为活性成分的肌醇磷脂或其药学上可接受的盐。所述病症可以是自身免疫性疾病、变应性紊乱或慢性炎性疾病，例如哮喘、I型糖尿病、类风湿性关节炎(RA)或炎性肠病(IBD)。本发明还提供了具有免疫调节性质的食品或食品补充剂，其包含有效量的肌醇磷脂。
文档编号A61K31/683GK101505763SQ200680055563
公开日2009年8月12日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者E·E·S·尼乌文赫伊斯, G·J·布鲁伊宁, J·N·桑瑟姆 申请人:鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心