专利名称：与作为基因的转录产物的rna相互补的寡核苷酸的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及与作为基因的转录产物的RNA相互补的寡核苷酸的应用。
背景技术：
在抗癌药剂的传统临床研究中，首先是在I期临床研究中确定该药剂的毒性概况和最大推荐剂量，然后在II期临床研究中应用肿瘤缩小率作为效力标准，根据反应率对该药剂作为药物进行评价。与此同时，随着近几年来癌生物学的研究进展，具有抑制细胞内信号转导系统和血管形成等新颖作用机理的药物正处于被积极地探索和开发的过程中。对于这些新颖的抗癌药剂，有可能不必要给予接近毒性剂量的最大推荐剂量。并且预计，通过应用与肿瘤生长抑制有关的QOL(生命质量)改善或生命延长而不是用肿瘤缩小作为指标，可以更恰当地判断药效。在这种情况下，为了更合理更明确地证实其药效，理想的是利用与肿瘤生长抑制机制密切相关的生物标志的改变作为一种替代性标志。
总的来说，在抗癌治疗的过程中，当给予一种抗癌药剂时，生命机体的反应性主要取决于作为药剂靶标的肿瘤细胞对该药剂的敏感性。肿瘤细胞对药物的这种敏感性，对于各种类型的肿瘤细胞通常都有明显的改变。这种敏感性的差异可归因于药物靶分子或与这些分子相关的因子的数量或者质量差异，以及药物抗性的获得等因素。考虑到这种基本情况，如果当作为靶标的肿瘤细胞表现出对某种药物的敏感性而特异性引起的肿瘤细胞改变，可以通过使用由活组织检查等方法得到的肿瘤组织来测定，将是非常有用的，因为通过应用这种改变作为替代性标志，使较早地确定药效、建立治疗方法或者选择新的治疗方法等成为可能。而且，如果在治疗前从按常规方式通过活组织检查等方法得到的肿瘤组织分离出肿瘤细胞，然后用药物处理，并根据上述替代性标志的改变确定这种肿瘤细胞是否对该药物敏感，这样就有可能初步预测使用该药物的治疗是否有效，这在临床实践中是十分有用的。重要的是这种替代性标志的改变对于抗肿瘤作用应该是特异性的，并且对这种改变足以进行高灵敏度的检测。更具体地说，定量测定对药物抗肿瘤作用具有特异性的基因表达改变，分析与基因表述改变同时发生的蛋白质量的改变，以及分析与这些改变相关的功能性改变等都可以被用作替代性标志。
E7070(N-(3-氯-7-吲哚基)-1，4-苯二磺酰胺)是一种以细胞周期G1期为靶标的，具有抗肿瘤作用的化合物，正在被临床开发研究中(Takashi Owa，Hiroshi Yoshino，Tatsuo Okauchi，KentaroYoshimatsu，Yoichi Ozawa，Naoko Hata Sugi，Takeshi Nagasu，Nozomu Koyanagi and Kyosuke Kitoh，医学化学杂志1999，42，3789-3799)。
这种化合物对不同肿瘤细胞生长抑制作用的强度频谱与任何现存的抗癌药剂都不同，预期这种化合物具有作为抗癌药剂的作用，并具有一种新颖的作用机制。为了加速对这种药物的临床开发研究并尽快地建立一种临床治疗方法，以及根据所确定的治疗方法，通过有效地促进治疗来帮助改善病人的QOL，期望发现和应用一种可以被特定地用于该药物给药的替代性标志。
在最近几年，已经建立了使用不同的DNA微阵列(microarrays)同时测定大量基因表达水平的方法并广泛地被应用(schena M，shalonD，Davis RW，Brown PO，科学1995，270，467-70；Lockhart，D.J.，Dong H.，Byren M.C.，Follettie M.T.，Gallo M.V.，Chee M.S.，Mittmann M.，Wang C.，Kobayashi，M.，Horton H.，Brown E.L.，自然生物技术，1996，14，1675-1680)。
在癌症研究领域，应用此类DNA微阵列的研究也正在积极地进行。例如，在通过使用DNA微阵列的表达分析对扩散性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)进行的研究中，根据基因表述表观的差异，DLBCL已被分类成二种不同的类型，并且表明，这种分类可指导对预后的推测(Alizadeh AA，Eisen MB，Davis RE，Ma C，Lossos IS，RosenwaldA，Boldrick JC，Sabet H，Tran T，Yu X，Powell Ji，Yang 1，MartiGE，Moore T，Hudson J Jr，Lu L，Lewis DB，Tibshirani R，SherlockG，Chan WC，Greiner TC，Weisenburger DD，Armitage JO，WarnkeR，Staudt LM，等，自然，2000，403，503-11)。此外，在一篇报导中通过分析来自美国国家癌症研究所的60种类型癌细胞系的一种镶嵌板(panel)的基因表达表观，对这些细胞系作了重新分类，并且检测了它们的特征(Ross DT，Scherf U，Eisen MB，Perou CM，ReesC，Spellman P，Iyer V，Jeffrey SS，Van de Rijn M，Waltham M，Pergamenschikov A，Lee JC，Lashkari D，Shalon D，Myers TG，Weinstein JN，Botstein D，Brown PO，自然遗传，2000，24，227-35)，另一篇报导论述了这60种类型癌细胞系镶嵌板的基因表达表观的相互关系，以及每个细胞系对不同抗癌药剂的敏感性(Scherf U，Ross Dt，Waltham M，Smith LH，Lee JK，Tanabe L，Kohn KW，Reinhold WC，Myers TG，Andrews DT，Scudiero DA，Eisen MB，Sausville EA，Pommier Y，Botstein D，Brown PO，Weinstein JN，自然遗传，2000，24，236-44)，还有其它报导。
并且还有几篇报导，通过类似地使用一种DNA微阵列(部分是使用滤膜的大型阵列)检测了使抗癌药剂对肿瘤细胞起作用时出现的基因表达改变(Rhee CH，Ruan S，Chen S，Chenchik A，Levin VA，YungAW，Fuller GN，Zhang W，肿瘤学报导，1999，6，393-401；Zimmermann J，Erdmann D，Lalande，Grossenbacher R，NooraniM，Furst P，癌基因，2000，19，2913-20；Kudoh K，Ramanna M，Ravatn R，Elkahloun AG，Bittner ML，Meltzer PS，Trent JM，Dalton WS，Chin KV，癌研究，2000，4161-6)。这些报导表明，在比较二个或更多细胞群的特征时，以及在以分子水平综合研究药物治疗等因素引起的细胞生物学改变时，分析基因表达变异是非常有用的。
发明内容
本发明的目的是，在使E7070及其相关化合物对肿瘤细胞起作用的情况下，为这些化合物的抗肿瘤作用提供替代性标志。
本发明人借助于DNA微阵列法，分析了在使E7070及其相关化合物作用于对这些抗癌药剂敏感的肿瘤细胞时引起的基因表达改变，并发现了由这些抗癌药剂共同引起的基因表达改变。
进而他们还发现，在这些基因中，存在显示出三种癌共有的表达改变的基因，并发现这些基因的表达改变，可以为E7070及其相关化合物的抗肿瘤作用用作替代性标志，至此完成了本发明。
本发明提供了如下内容。
1.一种试验肿瘤细胞对于抗癌药剂敏感性的方法，它包括1)测定肿瘤细胞中选自列举于表3和表4中的一种或几种基因的表达水平，该肿瘤细胞是从以如下通式(I)表示的抗癌药剂治疗的癌症病人采集的 其中A代表单环或双环芳香族环，它可被取代，B代表6元不饱和烃环，或者是含有1个氮原子作为杂原子的6元不饱和杂环，此二种环都可被取代，C代表含有1个或2个氮原子的5元杂环，它可被取代，W代表一个单键或-CH-CH-，X代表-N(R1)-或氧原子，Y代表碳原子或氮原子，Z代表-N(R2)-或氮原子，以及R1和R2可以相同或者不同，各代表一个氢原子或低级烷基，以及2)与用该抗癌药剂治疗前从癌症病人采集的肿瘤细胞中基因的表达水平相比较，当列举于表3中的一种或几种基因的表达水平提高时，或者当列举于表4中的一种或几种基因的表达水平降低时，可确定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感的。
2.一种试验肿瘤细胞对于抗癌药剂敏感性的方法，它包括1)使抗癌药剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞，该抗癌药剂可用如下通式(I)表示
其中A代表单环或双环芳香族环，它可被取代，B代表6元不饱和烃环，或者是含有1个氮原子作为杂原子的6元不饱和杂环，此二种环都可被取代，C代表含有1个或2个氮原子的5元杂环，它可被取代，W代表一个单键或-CH＝CH-，X代表-N(R1)-或氧原子，Y代表碳原子或氮原子，Z代表-N(R2)-或氮原子，以及R1和R2可以相同或者不同，备代表一个氢原子或低级烷基，2)测定肿瘤细胞中选自列举于表3和表4中的一种或几种基因的表达水平，以及3)与未被处理的肿瘤细胞的基因表达水平相比较，当列举于表3中的一种或几种基因的表达水平提高时，或者当列举于表4中的一种或几种基因的表达水平降低时，可确定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感的。
3.根据1或2的方法，其中是使用DNA微阵列，通过定量一种或几种RNA来测定一种或几种基因的表达水平，此RNA是该一种或几种基因的转录产物。
4.根据1或2的方法，其中是借助于定量PCR法，通过定量一种或几种RNA来测定一种或几种基因的表达水平，此RNA是该一种或几种基因的转录产物。
5.一种用于定量RNA的试剂，该RNA在4中规定的方法中使用，所述试剂包含与此RNA互补的寡核苷酸作为成分。
6.根据1或2的方法，其中是借助于免疫化学方法，通过定量一种或几种蛋白质来测定一种或几种基因的表达水平，此蛋白质是该一种或几种基因的基因产物。
7.根据6的方法，其中是借助于酶联免疫吸附测定法，通过定量一种或几种蛋白质来测定一种或几种基因的表达水平，此蛋白质是该一种或几种基因的基因产物。
8.根据6的方法，其中是借助于蛋白质印迹试验，通过定量一种或几种蛋白质来测定一种或几种基因的表达水平，此蛋白质是该一种或几种基因的基因产物。
9.一种用于在6中所规定方法的免疫检测试剂，它包含一种针对所述蛋白质的抗体作为成分。
10.根据1或2的方法，其中A代表可被取代的苯或吡啶，B代表可被取代的苯，C代表可被取代的吡咯，W代表一个单键，以及X和Z都代表-NH-。
附图简述
图1显示使用E7070得到的，细胞株HCT116-C9，HCT116-C9-C1，LX-1和LX-1-E2的细胞生长抑制曲线。
图2显示借助于定量PCR法对E7070敏感株HCT116-C9的基因表达变异的分析结果。
图3显示借助于定量PCR法对E7070敏感株LX-1的基因表达变异的分析结果。
图4显示借助于定量PCR法对E7070抗性株HCT116-C9-C1的基因表达变异的分析结果。
图5显示借助于定量PCR法对E7070抗性株LX-1-E2的基因表述变异的分析结果。
实施本发明的最佳方式随后将详细论述本发明的实施方案。
本发明的试验方法其特征在于，当肿瘤细胞以体内或体外试验被暴露于抗癌药剂时，将所引起的肿瘤细胞中基因的表达水平改变用作该肿瘤细胞对该抗癌药剂敏感性的指标。
因此，本发明第一个实施方案的试验方法包括如下步骤，1)测定选自列举于表3和表4中肿瘤细胞的一种或几种基因的表述水平，该肿瘤细胞是从以通式(I)表示的抗癌药剂治疗的癌症病人采集的，以及2)与用该抗癌药剂治疗前从癌症病人采集的肿瘤细胞的基因表达水平相比较，当列举于表3中的一种或几种基因的表达水平提高时，或者当列举于表4中的一种或几种基因的表达水平降低时，可确定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感的。
更进一步地，本发明第二实施方案的试验方法包括如下步骤，1)使以通式(I)表示的抗癌药剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞，2)测定肿瘤细胞中选自列举于表3和表4中的一种或几种基因的表达水平，以及3)与未被治疗的肿瘤细胞的基因表达水平相比较，当列举于表3中的一种或几种基因的表达水平提高时，或者当列举于表4中的一种或几种基因的表达水平降低时，可确定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感的。
用于本发明的抗癌药剂是一种以通式(I)表示的磺酰胺衍生物或磺酸酯衍生物。
通式(I)中，以A表示的“可被取代的单环或双环的芳香族环”是芳香烃环或者是含有至少一个氮、氧和硫原子的芳香杂环，其每种环上可有1-3个取代基。包含在环A中的这类芳香族环的实例包括吡咯、吡唑、咪唑、噻吩、呋喃、噻唑、唑、苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、萘、喹啉、异喹啉、2，3-二氮杂萘、1，5-二氮杂萘、喹喔啉、喹唑啉、内啉、吲哚、异吲哚、中氮茚、吲唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并咪唑、苯并吡唑、苯并噻唑等等。它们可有1-3个取代基。当存在二个以上取代基时，它们可以相同或不同。取代基的实例包括可被低级烷基或低级环烷基取代的氨基；低级烷基；低级烷氧基；羟基；硝基；巯基；氰基；低级硫代烷基；卤素；以化学式-a-b表示的基团[其中a代表单键，-(CH2)k-，-O-(CH2)k-，-S-(CH2)k-或-N(R3)-(CH2)k-(k是1-5的整数，R3代表一个氢原子或低级烷基)，b代表-CH2-d(其中d代表可被低级烷基取代的氨基，卤素，羟基，低级硫代烷基，氰基或低级烷氧基)]；以化学式-a-e-f表示的基团[其中a具有同上规定的含义，e代表-S(O)-或-S(O)2-，f代表可被低级烷基或低级烷氧基取代的氨基，低级烷基，三氟甲基，-(CH2)a-b或-N(R4)-(CH2)a-b(其中b具有同上规定的含义，R4代表一个氢原子或低级烷基，m是1-5的整数)]；以化学式-a-g-h表示的基团[其中a具有同上规定的含义，g代表-C(O)-或-C(S)-，h代表可被低级烷基取代的氨基，羟基，低级烷基，低级烷氧基，-(CH2)u-b或-N(R5)-(CH2)n-b(其中b具有同上规定的含义，R5代表一个氢原子或低级烷基，n是1-5的整数)]；以化学式-a-N(R6)-g-i表示的基团[其中a和g具有同上规定的含义，R6代表一个氢原子或低级烷基，i代表一个氢原子，低级烷氧基或f(f具有同上规定的含义)]；以化学式-a-N(R7)-e-f表示的基团(其中a，e和f具有同上规定的含义，R7代表一个氢原子或低级烷基)；以及以化学式-(CH2)p-j-(CH2)q-b表示的基团(其中j代表一个氧原子或硫原子，b具有同上规定的含义，p和q可以相同或不同，各代表1-5的整数)等等。
当取代基是一个以二个烷基取代的氨基时，此二个烷基可能结合形成5-或6-元环。并且，为A是带有羟基或巯基的含氮杂环时，这些基因通过共振可能以氧代基团或硫代基团的形式存在。
以B表示的“可被取代的6-元不饱和烃环或含有1个氮原子作杂原子的6-元不饱和杂环”，指的是可被部分氢化的苯或吡啶。在这种环上可有1个或2个取代基，当存在二个取代基时，它们可以相同或不同。
以C表示的“可被取代的含有1个或2个氮原子的5-元杂环”，指的是可被部分氢化的吡咯，吡唑或咪唑。在这种环上可有1个或2个取代基，当存在二个取代基时，它们可以相同或不同。
环B和C可能具有的取代基包括例如卤素；氰基；低级烷基；低级烷氧基；羟基；氧基；以化学式-C(O)-r表示的基团(其中r代表氢原子，可被低级烷基取代的氨基，低级烷基，低级烷氧基或羟基)；被低级烷基取代的氨基；以及三氟甲基等。
在通式(I)，以R1和R2限定的低级烷基以及环A、B和C可具有的取代基，指的是具有1-6个碳原子的线性或支链烷基，其例子包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，新戊基，叔戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，1，2-二甲基丙基，正己基，异己基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基，以及1-乙基-2-甲基丙基等。其中优选的是甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基和异丁基，而最优选的是甲基，乙基，正丙基和异丙基。
在A环可能具有的取代基限定中所叙述的低级环烷基，指的是具有3-8个碳原子的环烷基，其实例包括环丙基，环戊基和环己基等。
在A，B和C环可能具有的取代基限定中所叙述的低级烷氧基，指的是从上述低级烷基衍生的烷氧基，例如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基和叔丁氧基。其中甲氧基和乙氧基是最优选的。低级硫代烷基指的是从上述低级烷基衍生的硫代烷基。此外，卤素的实例包括氟、氯和溴等。
以通式(I)表示的磺酰胺衍生物或磺酸酯衍生物可同酸或碱形成盐。用于本发明的抗癌药剂也包括以通式(I)表示的化合物的盐。与酸所形成盐的实例包括与无机酸的盐例如盐酸盐，氢溴酸盐和硫酸盐，与有机酸例如乙酸，乳酸，琥珀酸，富马酸，马来酸，柠檬酸，苯甲酸，甲磺酸和对甲苯磺酸的盐，与碱所形成盐的实例包括与无机碱的盐例如钠盐，钾盐和钙盐，以及与有机碱例如三乙胺，精氨酸和赖氨酸的盐。
不用说，该化合物包括这些化合物的水合物和光学异构体，如果它们存在。用于本发明的抗癌药剂显示出高度抗肿瘤活性，并且该抗癌药剂还包括在体内经过代谢作用如氧化，还原，水解和共轭结合而表现出抗肿瘤活性的化合物。此外，用于本发明的抗癌药剂还包括在体内经过代谢作用如氧化、还原和水解而形成以通式(I)所表示化合物的那些化合物。
测定其敏感性的肿瘤细胞并不特别局限，只要它们对以通式(I)表示的抗癌药剂是敏感的。其实例包括从如下肿瘤获得的肿瘤细胞结肠癌，肺癌，乳腺癌，白血病，胰腺癌，肾癌，黑素瘤，恶性淋巴瘤，头部和颈部癌，以及胃癌等。
从癌症病人采集的肿瘤细胞，包括包含在从该癌症病人分离出的癌组织中的肿瘤细胞。
在第一实施方案的试验方法中，从癌症病人采集的肿瘤细胞，可以是从用通式(I)表示的抗癌药剂治疗的癌症病人采集的肿瘤细胞，在此是用可以测定该肿瘤细胞敏感性的剂量进行治疗。通常使用从以100-1500mg剂量治疗1-14天的癌症病人采集的肿瘤细胞。
在第二实施方案的试验方法中，只要可以测定肿瘤细胞的敏感性，用于使通式(I)表示的抗癌药剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞的条件不受限制，通常在含有0.01-10μM浓度该抗癌药剂的培养基中实施培养6-72小时。
通过定量作为基因转录产物的RNA或者定量作为基因产物的蛋白质，可以测定基因表达水平。通常，通过从肿瘤细胞中提取RNA或蛋白质并定量测定提取物中的RNA或蛋白质，可以对此RNA或蛋白质作定量分析。随后，如下实例1.RNA或蛋白质的提取，2.RNA的定量，3.蛋白质的定量，将按此顺序加以详细说明。
1.RNA或蛋白质的提取1)从以通式(I)表示的抗癌药剂治疗的病人癌组织中提取RNA或蛋白质。
通过活组织检查或类似方法从以通式(I)表示的抗癌药剂治疗的病人采集癌组织，然后通过下述方法从癌组织中提取RNA或蛋白质。
可按照通常的RNA提取法提取RNA。例如，可通过使用TRIZOL试剂(东方生命技术公司)或类似试剂，按照所附的操作手册进行提取。具体地说，以每50-100mg癌组织/1ml TRIZOL试剂，用Teflon匀浆器将癌组织作成匀浆。离心此混合液(4℃，12000xg，10分钟)，将所得到的上清液在室温下放置5分钟，然后对每1ml所使用的TRIZOL试剂加入氯仿0.2ml。通过震摇强烈地搅拌所形成的溶液15秒，在室温下放置2-3分钟，然后离心(4℃，12000xg，15分钟)。离心之后将含水层转移至另一试管，并对每1ml所使用的TRIZOL试剂加入异丙醇0.5ml。将此混合液在室温下放置10分钟后离心(4℃，12000xg，10分钟)。用75％乙醇洗涤所得到的沉淀物，空气干燥后可作为总RNA用于随后的操作。
可按照在如下著作中所叙述的方法从癌组织中提取蛋白质Bollag.D.M.，Rozycki，M.D，Edelstein S.J，蛋白质方法，1996，Wiley-Liss，公司New York，U.S.A；Walker，J.M，蛋白质手册，1996，Humana出版社，New Jersey，USA，；以及其它。
2)从存在通式(I)所表示的抗癌药剂时培养的癌细胞中提取RNA或蛋白质。
按常规方法通过活组织检查或类似途径从病人获得的癌组织中分离出癌细胞(肿癌细胞)。例如，按照Hamburger等的方法(HamburgerA，Salmon S.E，Kim M.B，Trent J.m，Soehnlen B.J，Alberts D.S和Schmidt H.T.癌研究38，3438-3443，1978)，先无菌绞碎获得的组织，然后通过使用不锈钢网，注射针，尼龙网等制备细胞悬液。将获得的细胞在适当的培养基(例如含有10-15％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640，MEM，McCoy培养基等)中培养。在5％CO2的条件下，在有通式(I)所表示的抗癌药剂存在时，将获得的癌细胞37℃培养适当的时间，优选的是3，6，12或24小时，更优选的是12小时，然后通过下述方法提取RNA或蛋白质。并且还可以通过采用软琼脂培养法，只从借助活组织检查或类似途径获得的组织中特异性地分离出癌细胞供使用(Hamburger A，和Salmon S.E.科学197，461-463，1977；Hamburger A，和Salmon S.E.临床研究杂志60，84 6-854，1977；VonHoff D.D.和Johnson.G.E，美国癌症研究协会报告20，51，1979)。
可以按照通常的RNA提取法，像从癌组织中提取RNA一样从癌细胞中提取RNA。例如，当使用TRIZOL试剂(东方生命技术公司)时，可按照所附的操作手册进行提取。具体地说，每5-10×106个癌细胞加入1ml TRIZOL试剂，然后可以像从癌组织中提取RNA一样进行同样的操作。
也可以按照文献中所述的方法，像从癌组织中提取一样实施从癌细胞中提取蛋白质。
2.RNA的定量借助于RNA印迹分析，DNA微阵列分析，RT-PCR和定量PCR等技术可对RNA作定量分析。优选的是使用DNA微阵列或定量PCR。下面将对这些技术进行说明，但是本发明并不局限于这些技术。
按如下所述通过使用DNA微阵列进行定量。首先，通过使用所获得的RNA作模板，并使用SuperScript选择系(东方生命技术公司)和T7-d(T)24引物合成双链cDNA。随后，通过使用此cDNA作模板合成生物素化的cRNA。
更具体地说，首先通过使用T7-d(T)24引物从所获得的RNA合成单链DNA。然后对其加入dNTP，DNA连接酶，DNA聚合酶I和RNA酶H，使它们起反应，并且对其再加入T4 DNA聚合酶I以便完成双链cDNA的合成。先纯化所获得的cDNA，然后通过使用RNA转录标记试剂盒(Enzo诊断试剂)加入生物素化的UTP和CTP，使之进行标记反应。纯化此反应产物，在200mM Tris/乙酸(PH8.1)，150mM乙酸镁，50mM乙酸钾内94℃加热35分钟，以便获得成为片段的cRNA。
使此成为片段的cRNA与Gene Chip(基因芯片)Hu6800(Affymetrix)或更新产物杂交，例如，在100mM MES，1M钠盐，20mM EDTA，0.01％吐温20内45℃杂交16小时。杂交之后，洗涤此基因芯片并按照联接在Affymetrix流控技术站(Affymetrix FluidicsStation)的EUKGE-WS2方案染色。链霉亲和素-藻红素以及生物素化羊抗链霉亲和素抗体被用于染色。可通过使用HP氩离子激光共聚焦扫描仪(Hewlett packard)扫描被染色的基因芯片来测定其荧光强度。当使用这种荧光染料时，通过使用488nm激发光在570nm测定荧光。
优选的是应用基因芯片软件(Affymetrix)作定量数据分析处理。为了定量分析RNA，对于每个探针系列可得到一个“差异[(完美匹配杂交信号)一错配信号]”的平均值。当此值为50或高于50时，并且在二种状态下获得的RNA定量值发生偏离，优选地是当它们偏离1.8倍或更多时，则可确定该基因表达已显著“提高”或“降低”。
当列举于表3中的一种或几种基因的RNA水平提高时，或者当列举于表4中的一种或几种基因的RNA水平降低时，则可确定此肿瘤细胞对该抗癌药剂是敏感的。
此外，通过使用SYBR Green和ABI Prism 7700序列检测系统(Perkim Elmer应用生物系统)按如下所述实施定量PCR。
按逆转录反应和PCR反应二步进行操作。通过对所获得的RNA加入dNTP，寡d(T)16引物，RNA酶抑制剂混合物和多录逆转录酶(Perkim-Elmer应用生物系统)，将此混合物保持在25℃10分钟，然后在48℃加热混合物30分钟，这样就实施了作为第一步的逆转录反应。在95℃加热5分钟使反应终止。
使获得的cDNA进行作为第二步的PCR反应。例如，在由如下成分组成的反应系统中进行此PCR反应4ng cDNA，1×SYBR PCR缓冲液，3mM MgCl2，dATP，dCTP和dGTP各200μM，400μM dUTP，200nm引物对0.01U/μl AmpEr酶UNG。以及0.025U/μl AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer应用生物系统)。例如，可按如下程序实施此PCR反应，先在50℃反应2分钟，在95℃反应10分钟，随后进行95℃20秒，55℃20秒和72℃30秒的反应循环，循环重复40次。例如，可通过使用Primer Expression(Perkin-Elmer应用生物系统)来设计引物和探针。为了比较二个或更多的样品，对于每个样品都通过应用持家基因的mRNA水平将定量值校正成为转录量后再使用，这种基因表现出很小的转录量变异，优选地是应用GAPDH的mRNA水平。
当列举于表3中的一个或几个基因的RNA水平提高，或者列举于表4中的一个或几个基因的RNA水平降低时，可确定该肿瘤细胞对此抗癌药剂是敏感的。
本发明还提供了一种本发明试验方法中使用的定量RNA的试剂，它包含互补于一种RNA的寡核苷酸作为一种成分，此RNA是其表达水平将被测定的一种基因的转录产物。作为成分包含的这种寡核苷酸是用于定量PCR的引物和/或探针，并且可以如上所述被设计。除了上述寡核苷酸之外，本发明的RNA-定量试剂还可以包含常规用于普通定量试剂的成分。
3.蛋白质的定量虽然基于其活性或抗原性都可以定量分析蛋白质，但优选的是基于抗原性的定量法，即免疫化学定量法，免疫化学定量法可被方便、广泛地应用于蛋白质。
至于针对蛋白质的抗体，根据Parker等的报导(parker.J.M.R，Guo D，Hodges R.S，生物化学25，5425，1986)或Karplus等的报导(Karplus P.A，Schulz G.E，Naturwissenchaften72，212，1985)，从氨基酸序列可预测抗原决定簇来合成肽。另一方面是融合蛋白，例如，可表达与谷胱甘肽合成酶(GST)的融合蛋白，并可通过使用谷胱甘肽柱纯化来产生抗原，然后用获得的抗原免疫家兔或小鼠等动物来产生多克隆抗体或优选地产生单克隆抗体(Harlow E，Lane D，抗体实验室手册，1988，冷泉港实验室出版社，纽约)。并且，当有市场上能买到的抗体可利用时，在证实了它们的特异性之后也可以使用。
通过使用所获得的抗体，可实施酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)来定量蛋白质，例如借助于酶免疫测定法(IshikawaE等，Igakushoin，1982)或在Ishikawa E，Kawai T，Miyai K，酶免疫测定，Igekushoin，Tokyo，New York，1981中所述的方法。当蛋白质是从肿癌细胞分泌出时，可以不用从肿瘤细胞中提取蛋白质而定量培养基中的蛋白质。
当列举于表3中的一种或几种基因的蛋白质水平提高，或者列举于表4中的一种或几种基因的蛋白质水平降低时，可确定该肿癌细胞对此抗癌药剂是敏感的。
本发明还提供了用于本发明试验方法的免疫测定试剂，它包含一种针对该蛋白质的抗体作为成分。用作成分的抗体可如上所述获得。除了上述抗体之外，本发明的免疫测定试剂还可含有常规用于普通的免疫测定试剂中的成分。
实施例此后，将参照下面特定的实施例对本发明作更具体的说明。但是，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1 E7070敏感株和E7070-抗性株的培养以及RNA的提取所有的细胞都是在补充了10％胎牛血清，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中5％CO2之下37℃培养。
将E7070或者如下所示结构式表示的ER-35748或ER-68487以8μM的浓度加到E7070-敏感株HCT116-C9和E7070-抗性株HCT116-C9-C1的培养基中，培养这些细胞。然后在0、3、6和12小时之后收获细胞。而且还在不加入药物时将这些细胞培养12小时，并收获细胞。
从这些细胞中提取出总RNA，并随后对此RNA进行分析。应用实施例2中所述的DNA微阵列法，将从与药物共同培养12小时的细胞中提取的RNA，以及从不加入药物培养12小时的细胞中提取的RNA用于基因表达分析。HCT116-C9是从来源于人结肠癌的HCT116中分离出的亚株(美国模式菌种保藏中心)，而HCT116-C9-C1是E7070抗性亚株，是通过在有逐渐增加浓度的E7070存在时培养这种HCT116-C9得到的。
类似地，将 E7070以8μM的浓度加到E7070-敏感株LX-1和E7070-抗性株LX-1-E2的培养基中，培养这些细胞。在0，3，6和12小时之后收获细胞。从这些细胞中提取出总RNA，并随后对此RNA进行分析。LX-1(日本癌研究基地化学治疗中心，日本东京)是来源于人小细胞肺癌的细胞，而LX-1-E2是E7070-抗性亚株，是通过在有逐渐增加浓度的E7070存在时培养这种LX-1得到的。
将这些有效的细胞株HCT-116-C9，HCT116-C9-C1，LX-1和LX-1-E2加入E7070培养72小时。借助于MTT法(Mosmann T.免疫学方法杂志65，55(1983))测定的细胞生长抑制曲线被显示在图1中。实际操作是通过应用96孔滴定板非放射性细胞增殖测定法(Promeg，Madison.WI)，按照所附的操作手册进行。
总RNA是通过使用TRIZOL试剂(东方生命技术公司)，按照所附的操作手册从收获的细胞中提取出。
实施例2 使用DNA微阵列作基因表达分析1)合成cDNA并以生物素标记将实施例1中获得的每种RNA溶解于以二乙基焦碳酸盐(DEPC)处理的无菌水100μl中，并通过使用Rneasy柱(QIAGEN)作进一步纯化，而且通过使用Superscript选择系统(东方生命技术公司)和T7-d(T)24引物合成了双链cDNA。
首先，将5μM T7-d(T)24引物，1X第一链缓冲液，10mM DTT，500μM dNTP混合物和20单位/μl Super Script II逆转录酶加到10μg RNA中，使此混合物在42℃反应1小时以便合成单链DNA。随后，对此DNA加入1X第二链缓冲液，200μM dNTP混合物，67U/ml DNA连接酶，270U/ml DNA聚合酶I和13U/ml RNA酶H，使此混合物在16℃反应2小时以便合成双链cDNA。进而，对此cDNA加入67U/ml T4DNA聚合酶I，并使该混合物在16℃反应5分钟，然后加入10μl 0.5M EDTA终止反应。
用酚/氯仿纯化获得的cDNA，并通过使用RNA转录标记试剂盒(Enzo诊断)，按照所附的操作手册以生物素化的UTP和CTP实施标记反应。用Rneasy柱纯化此反应产物，并在200mM Tris/乙酸盐缓冲液(PH8.1)，150mM乙酸镁，50mM乙酸钾中94℃加热35分钟以便获得cRNA片段。
2)与DNA微阵列(基因芯片)杂交并进行测定在100mM MES，1M钠盐，20mM EDTA和0.01％吐温20中使已经成为片段的cRNA与基因芯片Hu6800(Affymetrix)45℃杂交16小时。杂交之后，洗涤此基因芯片并按照联接在Affymetrix流控技术站的EuKGE-WS2方案染色。链霉亲和素-藻红素以及生物素化羊抗链霉亲和素抗体被用于染色。通过使用HP氩离于激光共聚焦扫描仪(HewlettPackard)扫描被染色的基因芯片以便测定其荧光强度。使用488nm激发光在570nm测定荧光。
通过使用基因芯片软件(Affymetrix)进行全部定量数据分析。为了定量分析RNA，对于每个探针系列获得了一个“差异[(完美匹配杂交信号)-错配信号)]”的平均值。当此值为50或高于50时，并在二种状态下测定的RNA定量值发生偏离，优选地是它们偏离了1.8倍或更多时，可确定该基因表达已显著“提高”或“降低”。
以8μM的浓度将E7070或者ER-35748或ER-68487，加到用于HCT116-C9的培养基中并进行培养。将从培养12小时的这种细胞中提取的RNA通过使用基因芯片的分析结果，同除了不加入药物之外其余以相同方式获得的HCT116-C9细胞的RNA分析结果作了比较。结果，通过以3种类型的药物，E7070，ER-35748和ER-68487处理，其表达水平都提高的基因名单被显示在表1中(基因库注册号也被显示(相同的情况将用于在下面显示的其它表格中))。类似地，通过以此3种类型药物处理，其表达水平都降低的基因名单被显示在表2中。
表1
表2
表2(续)
表2(续)
表2(续)
表2(续)
表2(续)
表2(续)
对二种E7070抗性株(C9-C1和另一种用与C9-C1相同的方法获得的抗性株(C9-C4))，按与上述相同的方式用8μM E7070处理12小时，然后通过使用基因芯片对列举于表1和表2中的基因分析其基因表达的变异。结果，在此二株细胞中没有观察到提高或降低1.8倍或更多一点的基因。
根据上述结果，显然，通过检测它们每种基因的改变或者它们的二种或更多组合的改变，可以将以这三种类型抗癌药剂处理其表达水平都发生改变的基因，用作E7070及其相关化合物抗肿瘤作用的替代性标志。
实施例3 借助于定量PCR的基因表达分析为了证实实施例2中得到的基因表达变异反映了肿瘤细胞对E7070的敏感性，使用实施例1中显示的RNA以及SYBR Green和ABI引物7700序列检测系统(Perkin-Elmer应用生物系统)，通过定量PCR测定了E7070-敏感细胞和E7070-抗性细胞基因表达的改变。
操作按逆转录反应和PCR反应二步进行。通过如下操作实施作为第一步骤的逆转录反应先对1μg总RNA加入1×TaqMan RT缓冲液，5.5mM MgCl2，500μM dNTP混合物，2.5μM寡d(T)16引物，0.4U/μlRNA酶抑制剂和1.25U/μl多录逆转录酶(Perkin-Elmer应用生物系统)，将此混合物在25℃保持10分钟，然后在48℃加热30分钟。通过在95℃加热5分钟终止反应。
使所获得的cDNA进行作为第二步骤的PCR反应，在由如下组成的反应系统中进行PCR反应4ng cDNA，1×SYBR PCR缓冲液，3mM MgCl2，dATP、dCTP和dGTP各200μM，400μM dUTP，200nM引物对，0.01U/μl AmpEr酶UNG以及0.025U/μl AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer应用生物系统)。按如下程序实施此PCR反应，先在50℃反应2分钟，在95℃反应10分钟，随后进行95℃20秒，55℃20秒和72℃30秒的反应循环，循环重复40次。作为其引物，具有SEQID NOS1和2核苷酸序列的寡核苷酸被用于GAPDH，SEQ ID NOS3和4核苷酸序列被用于S80343，SEQ ID NOS5和6核苷酸序列被用于U07919，SEQ ID NOS7和8核苷酸序列被用于U11791，SEQ ID NOS9和10核苷酸序列被用于M95809，SEQ ID NOS11和12核苷酸序列被用于U18291，SEQ ID NOS13和14核苷酸序列被用于U63743，以及SEQ ID NOS15和16核苷酸序列被用于M61764。
通过测定荧光强度定量分析了每个样品中的mRNA水平。为了比较二个或更多的样品，根据每个样品中GAPDH的mRNA水平对定量值作了校正。在图2-图5显示出药物处理时间与各mRNA水平之间的相互关系，图中药物处理后0小时的定量值被用作对照(100％)。在具有最高敏感性的HCT 116-C9中，其基因显示出最大的表达变异(图2)，而在敏感株LX-1中，除S80343外的所有基因都显示出表达变异，尽管其变异量小于HCT 116-C9中的变异量(图3)。另一方面，对于抗性株HCT 116-C9-C1未观察到表达变异(图4)，而在抗性株LX-1-E2中，U11791显示出表达改变，M95809和U18291显示出轻微的表达改变(图5)，此细胞株实验中在8μM药物浓度下显示出某些生长抑制作用。
在实施例2中取回的基因，其表达变异与对E7070的敏感性相关连，并且证实，实施例2中取回的基因可被单独或组合地用作E7070及其相关化合物抗肿瘤作用的替代性标志。
实施例4 用酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析借助于已被报导的ELISA法，检测了在列举于实施例2表2的基因中X51956(对于神经元特异性(r)烯醇酶的人ENO2基因)的表达水平，已报导此基因从细胞中被分泌出(Duncan M.E，MeAleese S.M，Booth N.A，Melvin W.T，和Fothergill J.E，免疫学方法杂志151，227-236，1992；Yamaguchi K Aoyagi K，UrQkami K，FukutaniT.，Maki N.，Yamamoto S，Otsubo K，Miyake Y，和Kodama T.日本癌研究杂志，86，698-705，1995)。通过使用Eiken Chemical(东京)生产的NSE ELISA试剂盒，按照所附的参考资料进行实际检测。
实施例5 三种癌中的基因表达分析通过使用基因芯片，按照与实施例2中相同的方式检测了由E7070引起的(以8μM处理12小时)，HCT 116-C9(人结肠癌细胞株)，MDA-MB-435(人乳癌细胞株)和MDLT-4(人T淋巴母细胞的血病细胞株)三种癌细胞中基因表达的改变。
在此三种癌细胞中其表达都提高了1.8倍或更多的基因名单被显示在表3中。并且，在此三种癌细胞中其表达都被抑制了1.8倍或更多的基因名单被显示在表4中。因为，在从具有完全不同遗传背景的癌症病人建立的这三种癌细胞株中，其表达都发生改变(增强或减弱)的基因很可能与对肿瘤细胞所共有的E7070抗肿瘤作用机制较密切地相联系，所以认为，在测定肿瘤细胞对E7070及其相关化合物的敏感性时可以将它们用作有效的标记。
表3
表4
表4(续)
表4(续)
表4(续)
产业可应用性按照本发明，通过测定肿瘤细胞中列举于表3和表4中的一种或几种基因的表达水平，其中该肿瘤细胞是从以通式(I)表示的抗癌药剂治疗的癌症病人采集的，或者通过使以通式(I)表示的抗癌药剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞，然后测定列举于表3和表4中的一种或几种基因的表达水平，都可以检测肿瘤细胞对这种抗癌药剂的敏感性。
序列表<110>卫材株式会社<120>试验肿瘤细胞对于抗癌药剂敏感性的方法<130>0124WOOP1251<150>JP 2000-357398<151>2000-11-24<160>16<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gaaggtgaag gtcggagtc 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gaagatggtg atgggatttc 20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3gcattttacg gttccctgag at 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>4gatacgccac atgttcacct tc22<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cagaatcaat agcccagaga gctt 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gttgtggcgt tagaagattg gatc 24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gtcattctgc tgagcttgca ctta 24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gagagattct accaggtcgt catca25<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>9ccaagttacg aagctctgtc cat 23<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10tgtaggctgt ctggagcatc tct 23<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11tgttgattcc tcagaacgca tc 22<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12tgtatcatct cgcctaagac caag24<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13atctcaccag gcataagctc ct 22<210>14
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14acagttcctc ctcttccttg gat 23<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15ctcaagaggc tgacgcagaa t 21<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16ctggctgaca tgatggtaga cac 2权利要求
1.与作为列举于表3和表4中的一种或多种基因的转录产物的一种或多种RNA相互补的寡核苷酸在制备用于检测肿瘤细胞对抗癌剂敏感性的试剂方面的应用，其包括1)测定肿瘤细胞中选自列举于表3和表4中的一种或多种基因的表达水平，该肿瘤细胞是从经如下通式表示的抗癌剂治疗的癌症病人采集的 其中RA是氰基或亚磺酰氨基，nA是0或1-3，RB是甲基，乙基，正丙基或异丙基，nB是0或1或2，RC是氰基或氯原子，和nC是0或1或2，以及2)与用该抗癌剂治疗前从癌症病人采集的肿瘤细胞中基因的表达水平相比较，当列举于表3中的一种或多种基因的表达水平提高，或者当列举于表4中的一种或多种基因的表达水平降低时，能确定该肿瘤细胞对此抗癌剂是敏感的。
2.与作为列举于表3和表4中的一种或多种基因的转录产物的一种或多种RNA相互补的寡核苷酸在制备用于检测肿瘤细胞对抗癌剂敏感性的试剂方面的应用，其包括1)使抗癌剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞，所述抗癌剂由如下通式表示 其中RA是氰基或亚磺酰氨基，nA是0或1-3，RB是甲基，乙基，正丙基或异丙基，nB是0或1或2，RC是氰基或氯原子，和nC是0或1或2，2)测定肿瘤细胞中选自列举于表3和表4中的一种或多种基因的表达水平，以及3)与未被处理的肿瘤细胞的基因表达水平相比较，当列举于表3中的一种或多种基因的表达水平提高，或者当列举于表4中的一种或多种基因的表达水平降低时，能确定该肿瘤细胞对此抗癌剂是敏感的。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中使用DNA微阵列，通过定量作为列于表3和表4中的一种或多种基因的转录产物的一种或多种RNA来测定所述的一种或多种基因的表达水平。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其中借助于定量PCR法，通过定量作为列于表3和表4中的一种或多种基因的转录产物的一种或多种RNA来测定所述的一种或多种基因的表达水平。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述的抗癌剂是N-(3-氯-7-吲哚基)-1，4-苯二磺酰胺。
6.针对列举于表3和表4中的一种或多种基因所编码蛋白的抗体在制备用于检测肿瘤细胞对抗癌剂敏感性的试剂中的应用，其包括1)测定肿瘤细胞中选自列举于表3和表4中的一种或多种基因的表达水平，该肿瘤细胞是从经以如下通式表示的抗癌剂治疗的癌症病人采集的 其中RA是氰基或亚磺酰氨基，nA是0或1-3，RB是甲基，乙基，正丙基或异丙基，nB是0或1或2，RC是氰基或氯原子，和nC是0或1或2，以及2)与用该抗癌剂治疗前从癌症病人采集的肿瘤细胞中基因的表达水平相比较，当列举于表3中的一种或多种基因的表达水平提高，或者当列举于表4中的一种或多种基因的表达水平降低时，能确定该肿瘤细胞对此抗癌剂是敏感的。
7.针对列举于表3和表4中的一种或多种基因所编码蛋白的抗体在制备用于检测肿瘤细胞对抗癌剂敏感性的试剂方面的应用，其包括1)使抗癌剂作用于从癌症病人采集的肿瘤细胞，所述抗癌剂由如下通式表示 其中RA是氰基或亚磺酰氨基，nA是0或1-3，RB是甲基，乙基，正丙基或异丙基，nB是0或1或2，RC是氰基或氯原子，和nC是0或1或2，2)测定肿瘤细胞中选自列举于表3和表4中的一种或多种基因的表达水平，以及3)与未被处理的肿瘤细胞的基因表达水平相比较，当列举于表3中的一种或多种基因的表达水平提高，或者当列举于表4中的一种或多种基因的表达水平降低时，能确定该肿瘤细胞对此抗癌剂是敏感的。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其中借助于免疫化学方法，通过定量列于表3和表4中的一种或多种基因所编码的一种或多种蛋白质来测定所述的一种或多种基因的表达水平。
9.根据权利要求8所述的应用，其中借助于酶联免疫吸附测定法，通过定量列于表3和表4中的一种或多种基因所编码的一种或多种蛋白质来测定所述的一种或多种基因的表达水平。
10.根据权利要求8所述的应用，其中借助于蛋白质印迹试验，通过定量列于表3和表4中的一种或多种基因所编码的一种或多种蛋白质来测定所述的一种或多种基因的表达水平。
11.根据权利要求6或7所述的应用，其中，所述的抗癌剂是N-(3-氯-7-吲哚基)-1，4-苯二磺酰胺。
全文摘要
从给予了抗癌药剂(E7070及类似的化合物)的癌症病人取出肿瘤细胞，然后测定列举于表3和表4中基因的表达量。按另一种方式是，用抗癌药剂处理从癌症病人取出的肿瘤细胞，然后测定列举于表3和表4中基因的表达量。在列举于表3中基因的表达量增加，或者列举于表4中基因的表达量减少的情况下，可判定此相应的肿瘤细胞对相应的抗癌药剂是敏感的。因此，可检测肿瘤细胞对于抗癌药剂的敏感性。
文档编号A61K31/404GK101054604SQ20071009669
公开日2007年10月17日 申请日期2001年11月26日 优先权日2000年11月24日
发明者大和隆志, 横井晃, 黑光淳郎, 河合隆利, 加藤弘之, 长洲毅志 申请人:卫材R&D管理有限公司