专利名称：一种组织工程化微粒组织及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程化 微粒组织及其制备方法。
背景技术：
在外科修复领域中常遇到皮源不足的问题，特别是大面积深度烧伤造 成的大范围皮肤缺损给手术及治疗带来困难。微粒皮技术是目前烧伤临床 上常用的一种自体皮肤移植技术，当自体皮肤严重不足时，利用患者剩余
的有限皮源，用物理方法将其制成O. 5mm3 lnW的皮肤碎片，以一定间隔点 状分散移植于创面，利用皮肤细胞自身的增殖能力，形成皮岛并逐渐相互 连接从而愈合伤口 ；其优点是可以最大化地利用自身皮源修复较大创面。
随着组织工程技术研究的深入，应用组织工程技术体外构建人体组织 器官是目前组织器官缺损修复研究的热点之一，国内外也已将相关产品投 入临床使用，如组织工程皮肤、组织工程软骨等。传统组织工程技术构建 人工组织/器官的措施是将种子细胞与支架材料相复合，这种方法在培养的 组织/器官体积较大时，中心部的细胞难以得到足够的营养物质供应，代谢 产物也难以及时清除，致使体外难以培养出较大的组织/器官，无法满足临 床的需要。经检索，目前尚无组织工程化微粒组织的公开资料。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明的目的就是提供 一 种组织工程微 粒组织及其制备方法，所获得的组织工程微粒组织具有细胞活力高、可塑
性强，能够充填组织器官缺损并能促进愈合的优点。
本发明所提出的组织工程微粒组织的特征在于，是由细胞复合于微载
体上构建而成的具有生物活性的组织工程微粒组织；具体是以微载体为核 心、其上附着有生长的细胞，形成微粒组织；包括由多个微粒组织相互连 接所形成的更大微粒组织。所述的微载体是机体可接受的生物可降解材料 制备而成，包括胶原、细胞外基质、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、藻 酸盐、多糖、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物 (PLGA)的任一种或是几种的组合；所述的微载体粒径为50~ 500 Mm。所述 的细胞为自体/同种异体来源的成体细胞、或成体干细胞的任一种或几种的 组合，可以是皮肤细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、骨髓间充质干 细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细 胞等，其选择是根据所修复组织的需求确定。
本发明所述的组织工程微粒组织的制备方法，包括以下步骤 步骤1:微载体的选择，微载体可以选择已商品化的产品(如Cy todex 1 、 Cytodex2、 Cytodex3)或自行制备。其材质为机体可接受的生物可降解材 料，包括胶原、细胞外基质、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、藻酸盐、 多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的任一种或几种的 组合；微载体为粒径50 500,的实心结构，也可以是多孔样结构。 步骤2:组织工程微粒组织的构建
用细胞培养液浸泡无菌微载体24小时，弃去细胞培养液，再用促进细 胞贴附的物质(如胶原、多聚赖氨酸等)包被微载体;将处理后的微载体加 至至少含有105个/ni1细胞的细胞培养液中静置0. 5~2小时，釆用旋转细 胞培养方法，定时观测细胞生长情况，待细胞长满微载体后取出，组织工程微粒组织培养完毕。
在本发明所述的制备方法中，若组织工程微粒组织的构建需要两种或 多种细胞时，根据所培养组织的结构在细胞培养液中可同时加入两种或多
种细胞与微载体共同培养，形成混合细胞结构的微粒组织；或是待起始加 入的细胞长满微载体后再加入其他细胞，形成双层或多层的细胞结构。
本发明利用组织工程技术培养出高活力的组织工程化微粒组织，其植 入体内后可修复缺损的组织或器官。所制备的组织工程微粒组织具有以下 优点细胞生长状态良好、具有较高的细胞活力，可解决临床上供体组织 少、修复面积大的难题；其中微载体最终可被降解，不会对机体痊愈后造 成影响。本发明在临床治疗中的功能有(1)可作为修复大面积组织缺损 的移植物；(2)作为充填材料用于机体凹陷畸形的修复；(3)可以移植于 创面，也可注射使用，应用范围广，使用方便。
本发明所制备组织工程微粒组织中的细胞复合于微载体上，在旋转培 养方式下，呈三维方向生长；在培养过程中，细胞仍然继续增殖、合成并 分泌细胞外基质成分，最终形成组织；加入的其他细胞共同生长可形成两 层或多层细胞排列的微粒组织，与天然组织器官的结构相似。所形成的微 粒皮肤具有良好的临床治疗效果。
附图及其说明
附
图1为明胶(制备的)微载体的微观照片。附图2为明胶微载体与 成纤维细胞复合后，成纤维细胞在微载体表面生长的电镜扫描照片。
具体实施例方式
以下结合实验将本发明技术方案做进 一步的详细说明。
实例1:组织工程微粒皮肤组织的制备
1、脱细胞真皮基质(细胞外基质)微载体的制备取猪新鲜背部皮肤, 切成5cmx 10cm大小，用取皮鼓反向取皮，切除表皮部分约0. 3mm厚的皮 片，暴露真皮部分；再用取皮鼓切取约0. 3mm厚真皮，备用。
将猪真皮置于2. 5g/L胰蛋白酶溶液中消化，清洗后将猪真皮置于-80 x:冷冻半小时以上，确保真皮内外温度达到一致；取出后室温下自然解冻， 如此反复冻融2 5次，使细胞完全破裂崩解；用水清洗后将真皮置于4% NaOH溶液浸泡，每隔6小时更换NaOH溶液，浸泡24小时；然后使用PBS 溶液(磷酸盐缓冲液)浸洗至pH值为7.2左右。最后经冷冻干燥彻底去除 存活细胞。将冻干的猪真皮粉碎成微粒，过筛至60~ 200一粒径大小，用 钴60照射消毒后，无菌密封保存。
2、组织工程皮肤微粒组织的制备在无菌条件下，将2克微载体加入 到细胞培养液(含有10%胎牛血清的DMEM培养液)20ml中浸泡24小时， 使微载体充分融胀，离心去除上清液。以lmg/ml胶原蛋白溶液5ml浸泡微 载体1小时后，弃去液体，在无菌条件下自然晾干。
将含有2xl()5个/ml成纤维细胞的细胞培养液(含有10%胎牛血清的 DMEM培养液)10ml与微载体混合，静置1.5h后，再加入培养所需量的细 胞培养液，使用旋转式细胞培养系统旋转培养3天；更换为表皮细胞培养 液(含有10%胎牛血清的FAD培养液)，再加入相同数量的表皮细胞，静置 lh,再加入表皮细胞培养液，继续旋转培养8天，组织工程微粒皮肤组织 制备完成。
实例2:组织工程微粒脂肪组织的制备
1、明胶微载体的制备参照文献〔王忆娟等.作为细胞微载体的明胶 基缓释微球的制备.高等学校化学学报，2007 28 ( 9 ): 1776 - 1780〕制备
明胶微载体，筛选粒径为250 nm 350ym的微载体，钴60消毒后保存备用。
2、组织工程微粒脂肪组织的制备无菌条件下，用细胞培养液(含有
10°/。胎牛血清的画EM培养液)20ml浸泡2克明胶微载体24小时，使之充
分融胀后，离心去除上清液；再加入lmg/ml多聚赖氨酸溶液5ml浸泡微载
体2小时，弃去液体；在无菌条件下自然晾干。
将含有1 x 1()5个/ml脂肪细胞的细胞培养液10ml与微载体混合，静置
l~2h，再加入培养所需量的含有10%胎牛血清的DMEM培养液，发酵罐进
行旋转培养8天后，组织工程微粒脂肪组织制备完成。
实例3:组织工程微粒软骨组织的制备
1、 PLGA微载体的制备:参照文献〔Jean-Manuel P 6 an等.NGF release from poly (D, L-lactide-co -glycolide)microspheres. Effect of some formulation parameters on encapsulated NGF stability. Journal of Controlled Release. 1998 56 (4): 175-187 〕制备PLGA微载体，筛选粒径 为150Mm~ 250 Mm的微载体，钴60消毒后保存备用。
2、 组织工程微粒软骨组织的制备在无菌条件下，用细胞培养液(含 有10°/ 胎牛血清的FAD培养液，另加有2mg/ml多聚赖氨酸溶液5ml)20ml， 浸泡2克PLGA微载体24小时，使之充分融胀；离心去除上清液后，在无 菌条件下自然晾干。
将含有3 x 1(f个/ml软骨细胞的细胞培养液10ml与微载体混合，静置 1 2h后，加入培养所需量的含有10%胎牛血清的FAD培养液，每5天换液 一次，用生物反应器旋转培养15天后，组织工程微粒软骨组织制备完成。
权利要求
1、一种组织工程微粒组织，其特征在于是由细胞复合于微载体上构建而成的具有生物活性的组织工程微粒组织；具体是以微载体为核心、其上附着有生长的细胞所形成；包括由多个微粒组织相互连接所形成的更大微粒组织。
2、 根据权利要求l所述的组织工程微粒组织，其特征在于所述的微 载体是机体可接受的生物可降解材料制备而成，包括胶原、细胞外基质、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、藻酸盐、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、 聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的任一种或几种的组合；所述微载体的粒径为 50 ~ 500 jum。
3、 根据权利要求l所述的一种组织工程微粒组织，其特征在于所述 的细胞为自体/同种异体来源的成体细胞，或成体干细胞的任一种或是几种 的组合，其选择是根据所修复组织的需求确定。
4、 制备权利要求l所述组织工程微粒组织的方法，其特征在于，包括 以下步骤在选择确定微载体后，用细胞培养液浸泡无菌微载体24小时， 弃去细胞培养液，用促进细胞贴附的物质包被微载体，将处理后的微载体 加至至少含有1(T'个/ml细胞的细胞培养液中静置0. 5~2小时，釆用旋转 细胞培养方法，定时观测细胞生长情况，待细胞长满微载体后取出，组织 工程微粒组织培养完毕。
5、 根据权利要求4所述的组织工程微粒组织制备方法，其特征在于 在所述的细胞培养液中同时加入两种或多种细胞与微载体共同培养，形成 混合细胞结构的微粒组织；或是待起始加入的细胞长满微载体后再加入其他细胞，形成双层或多层的细胞结构。
6、根据权利要求4所述的组织工程微粒组织制备方法，其特征在于所述微载体的制备步骤为，将真皮置于胰蛋白酶溶液中消化，清洗后将真 皮置于-8(TC冷冻半小时以上；取出后室温下自然解冻，如此反复冻融2 5次；用水清洗后将真皮置于碱液浸泡，每隔6小时换液，浸泡24小时； 然后用磷酸盐缓冲液浸洗至pH值为7.2左右；经冷冻干燥后粉碎成微粒， 过筛至50 - 500,粒径大小，消毒后无菌密封保存。
全文摘要
一种组织工程微粒组织及其制备方法，其特点是由细胞复合于微载体上构建而成的具有生物活性的组织工程微粒组织，包括由多个微粒组织相互连接所形成的更大微粒组织。本发明利用组织工程技术培养出高活力的组织工程化微粒组织，植入体内可修复缺损的组织或器官；本发明具有细胞生长状态良好、具有较高的细胞活力，可解决临床上供体组织少、修复面积大的难题，微载体最终可被降解，不会对机体痊愈后造成影响的优点。在临床治疗中，可作为修复大面积组织缺损的移植物；作为充填材料用于机体凹陷畸形的修复；可以移植于创面，也可注射使用，应用范围广，使用方便。
文档编号A61L27/00GK101195044SQ200710096699
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月29日 优先权日2007年12月29日
发明者张勇杰, 岩 金 申请人:中国人民解放军第四军医大学