专利名称：一种组织工程化骨及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种Nell-1基因修饰 的bMSCs构建组织工程化骨及其应用。
背景技术：
Nell-l (Nel样I型分子)是具有成骨能力的新基因，与颅缝早闭 有关。Nel卜l蛋白是一个分泌蛋白，结构上含有分泌信号肽序列， 一个 氨基端trombospondin-1-like分子，5个含半胱氨酸残基的Von Wi 1 lebrand因子样重复，以及6个表皮生长因子(EGF )样功能团。Nel l-l 编码90kDa的多肽，在真核细胞中，N端与50kDa的碳水链连接，在胞浆 内糖基化成140kDa。Ne11-l最终形成400kDa磷酸化的三聚体分泌到胞夕卜。 种系间基因序列高度保守，比如人与大鼠Nel 1-1蛋白有93 %的同源性。 在研究颅缝早闭时，发现该基因在非家族性非系统性患者的早闭颅缝部位 上调。人的Nell-l主要在颅缝成骨部位的间充质细胞和成骨细胞内表达。 CMV驱动的Nell-l转基因小鼠，主要表现颅骨增生，发生颅缝早闭。最 近的研究显示，Nell-l促进成骨的能力非常强。Nell-l it^达可加速颅 骨成骨细胞系MC3T3和原代成骨细胞FRCC的分化，矿化结节较对照组增 加约6倍，而Nel卜l的反义表达可抑制该细胞的分化。Nell-l体外诱导FRCC细胞ALP表达的能力比BMP-4强。应用Nell-1蛋白修复小鼠颅骨缺 损的在一定的条件下与BMP-2相当。有意思的是该基因可以促进成骨细胞 的分化以及成骨分化终末阶段所伴随的凋亡，而对成纤维细胞系或原代的 成纤维细胞却没有作用，其作用部位可能是在成骨信号通路的下游，或者 通过与BMP成骨作用不同的机制促进成骨。由于BMPs对多种组织和细胞 有广泛的生物学活性，而Nell-1促进细胞的矿化只针对具有成骨潜能的 细胞，局限在成骨环境内成骨，所以应用该因子在安全性方面较BMP有着 潜在的优越性。Nell-1转基因小鼠的出生死亡率和致畸率大大低于BMP 转基因小鼠，也提示Nel卜l具有较低的全身毒性。Nell-l作为新克隆的 成骨基因，在颅颌面部骨组织特异性表达的特点、潜在的应用安全性以及 明显的成骨能力，使得应用Nell-l修复口腔颌面部骨缺损具有良好的应 用前景。
发明内容
本发明的目的在于 (1 )提供一种Nell-1基因〗务饰的bMSCs构建组织工程化骨； (2)提供组织工程化骨用途。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的选择Nell-1基因腺病 毒载体转染体外培养扩增的大鼠bMSCs，Nell-1基因是具有成骨能力的新 基因，目前的研究认为在细胞水平上，NeU-1单独诱导一定程度的成骨 分化，它可能操纵了一些成骨相关基因的下游途径，并影响了其他信号通 路，促进成骨细胞的分化。作为一种新克隆的成骨相关基因，Nell-1具有潜在的安全性以及明显的成骨作用，它的产物蛋白可能成为骨组织工程 中一种新的生长因子。根据目前研究结果的总结，在成骨方面它有如下的
特点(l)生物学特异性，Nell-l促进成骨主要作用于成骨细胞或具有成 骨潜能的细胞，尚未见作用于其他细胞；(2)细胞周期特异性，Nel卜l基 因只在分化期作用于成骨细胞。它的机理可能是操纵成骨相关基因的下游 途径，相对来说，具有成骨特异性；(3)潜在较低的生物学毒性，Nel卜l 转基因小鼠的出生死亡率和致畸率都大大低于BMP转基因小鼠；采用腺病 毒作为载体，不仅仅是由于转染效率的考虑，更重要的是病毒基因组不会 将外源基因整合到细胞染色体。腺病毒载体能够克服组织特异性的转染屏 障，不会在不需要的组织中产生转染。腺病毒所介导的基因只能短暂表达， 较为安全。而组织工程化组织构建是一个相对短暂的过程，只需要一段时 间内的基因表达，如BMP-2基因用于骨构建需3周左右的时间。所以采用 短暂表达的腺病毒更适合组织工程化骨的构建。腺病毒基因转染作为骨组 织工程的方法在研究细胞系已经得到较多的应用，被证实有很肯定的转染 效率和活跃的治疗性生长因子表达。骨髄基质细胞(bone marrow stromal cells,bMSCs)具有来源丰富，采集方便，容易在体外培养、诱导、扩增的 特点，并具有明确的成骨潜能，是组织工程化骨理想的种子细胞。该细胞在 体外培养具有较强的传代增殖能力，外源目的基因易于导入，因此也是骨
缺损基因治疗较为理想的靶细胞。本发明利用腺病毒介导的Nell-l基因 体外转染大鼠bMSCs,转染后72小时基因转染效率达到峰值，基因表达 也达到峰值。利用LacZ基因作为测定转染效率和阴性对照的报告基因。 LacZ为编码p-半乳糖苷酶(p-galactosidase, |3-gal)的基因。使用LacZ的原理为基因转染之后合成的(3-gal能水解X-gal，产生蓝色的沉 淀能在显微镜下直观地观察到并计算。在M01=80pfu/cell时可获得54. 8 ±4.6%的转染效率，在MOI芸160pfu/ce11时，基因转染效率随着转染滴 度增加而增高。反转录PCR显示，在转染目的基因的泳道中，400bp大小 的条带明显。结果表明有Nell-l基因转录水平的表达，而LacZ组和空白 对照组未见此条带出现，表明此两组中无Nell-l基因的表达。以P-actin 蛋白为内参照，进行各组间内参照蛋白浓度一致的蛋白电泳，可见转染目 的基因泳道有大小约90kDa的蛋白条带表达,条带的表达随转染滴度的增 加而更加明显，显示转染目的基因的泳道有Nell-1基因蛋白水平的表达， 而LacZ组和空白对照组未见此条带出现，显示对照组无Nell-1基因蛋白 水平的表达。
光基团的探针来标记PCR产物。本发明在实时荧光PCR前用反转录PCR 进行初步验证时，设定未见明显二聚体的引物设计及退火温度为采用标
见非特异性PCR产物，说明实时荧光PCR的结果是可信的。基因4全测结果 显示利用腺病毒介导的Nel卜l基因体外转染大鼠bMSCs后促进ALP、BSP、 OCN、 OPN等成骨分化表型标志基因的上调。
应用腺病毒介导的Nell-1基因体外转染鼠、兔、羊、猪、狗等bMSCs， 然后将基因修饰的细胞与生物支架材料复合(如P-TCP、天然型无机骨 NNB、珊瑚、藻酸钓、PGA、 PLGA、胶原等)可以构建组织工程化骨促进颌 骨缺损的修复。以贝奥路公司研制的微孔结构及降解率可控P -磷酸三钩(P-tricalcium phosphate, p-TCP)为例，可以起到临时支架作用，引导 骨生长，允许周围的骨向材料中浸润长入，然后材料被逐渐吸收，无炎症 或排斥反应，不产生局部或全身性毒性反应。P-TCP是磷酸三钩不同相 结晶物的一种。自二十世纪70年代以来，P -TCP —直是骨替代材料研究 领域的热点之一，其分子式为Ca3 (P04) 2，工业合成P -TCP 4分料的钓/磷比 为1.49-1.51,与正常骨组织的钙磷比接近。P-TCP的成分与骨基质的 无机成分[Cai。 (P04) 6 (OH) 2 ]相似，故被认为具有良好的生物相容性。P -TCP 具有吸收緩慢，低免疫反应和低毒性等特点，并具有骨引导性，适合作为 组织工程修复颌骨的材料。Nell-l基因修饰大鼠bMSCs复合P -TCP材料 棵鼠皮下植入实验大体观察显示植入物表面皮肤完整光滑，无积液，伤口 无感染，植入物无排出。周围软组织包裹材料，未见异物排斥反应，也未 见明显炎症反应。HE染色标本病理学观察N组可见较多的软骨样和板层 骨样组织自支架区向空隙区生长，血管结构和骨陷窝样结构较C组和L 组明显。成骨面积N组高于其余两组。应用NeU-1基因修饰的bMSCs还 可以与支架材料复合，构建组织工程化骨促进大鼠临界骨组织缺损(CSD ) 的》务复。Micro-CT可以更加直 见的显示N组^修复区i^密度大于L组，骨 质生长未超出材料的体积范围；N组在组织工程化骨与材料结合处也更加 致密。
本发明的技术方案如下 一种Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工 程化骨，它由下列方法制得
(1) Nell-l基因转染体外培养的骨髓基质细胞；
(2 )将步骤(1)得到的产物、生物支架材料构建组织工程化骨，所述的Nel 1-1基因以MOI=50 ~ 80pfu/cel 1工作浓度转染体外培养的骨髓 基质细胞，骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，生物支 架材料是磷酸三钩、多孔羟基磷灰石、珊瑚、藻酸钩、胶原，生物支架材 料是P-磷酸三钙，细胞密度为5xl(T/ml的细胞悬液与生物支架材料复 合。
Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨在领骨缺损修复领域中 应用。
本发明所公开一种组织工程化骨及其应用，其优点表现在本发明利 用腺病毒介导的Nell-l基因有效的稳定的转染大鼠bMSCs，并成功获得 了 Nell-l转录和蛋白水平的表达，为骨组织工程中Nel卜l基因治疗打 下了基础。本发明把Nell-l基因治疗与组织工程方法结合起来，以bMSCs 作为基因治疗的靶细胞，同时应用其作为组织工程化骨的种子细胞，通过 基因修饰bMSCs后的自分泌和旁分泌作用，加速成骨。Nell-l基因修饰 的组织工程化骨植入棵鼠体内后，材料网孔内新骨成骨多，Micro-CT显示 Nell-l基因修饰的组织工程化骨修复大鼠临界骨组织缺损时，可以在大 鼠颌骨CSD内安全生长，并能更有效的修复骨缺损。
图1:转染效率测定，在工作浓度时可获得较高的转染效率(荧光显 微镜下观察，放大倍数IOO)。
图2:转染bMSCs后Nell-l基因转录水平的表达，反转录PCR转染 后3天各组内参照条带均较为明显。N组泳道中出现400bp左右大小的条带而对照组和LacZ组无相应条带出现。C:空白对照组；N: Nell-l组； L: LacZ组。
图3:转染bMSCs后Nell-1基因在蛋白水平的表达，Western blot 显示各组的内参照条带灰度较为相近，N组出现90kDa左右大小的条带， MOI为20、 40、 80pfu/cell的3组条带灰度依次增加，未对照组和LacZ 组无相应的条带出现。C:空白对照组；L: LacZ组；N20/N40/N80: Nell-1 组，MOI依次为20/40/80pfu/cell。
图4: VonKossa硝酸银染色，第15日至第28日，各组中的4丐结节 数目逐渐增多，Von Kossa硝酸银染色后，C组和L组4丐结节数目少于N 组。
图5: N组棵鼠皮下异位成骨组织切片(HE染色，放大倍数IOO)可见 较多的软骨样和板层骨样组织自支架区向空隙区生长，成骨面积较C组和 L组明显。
图6: C组棵鼠皮下异位成骨组织切片(HE染色，放大倍数IOO)。 图7: L组棵鼠皮下异位成骨组织切片(HE染色，放大倍数IOO)。 图8: Micro-CT显示N组(右侧颌骨)修复区域密度大于L组(左侧
颌骨)，骨质生长未超出材料的体积范围；N组在组织工程化骨与材料结
合处更加致密。
图9:颌骨缺损组织切片术后8周N组(HE染色，放大倍数200)的成 骨较C组更加明显。
图10:颌骨缺损组织切片术后8周C组(HE染色，放大倍数200)的 成骨。图11:术后4周Nell-l基因转染的bMSCs所形成的新骨(E， G)较 BMP-2组骨组织更致密(F, H0。
具体实施例方式
下面结合具体实验及其结果分析和相应的说明书附图，对本发明进一 步详细说明。 实施例1
一、Nell-l基因转染大鼠bMSCs及表达测定
步骤一、原代bMSCs的获取及培养无菌状态下，取SPF级6周龄雄 性Fischer 344大鼠胫骨和股骨骨髓，所得细胞悬液离心，吸去上清液和 漂浮于液面的脂肪，加DMEM培养液，均匀吹散，置于培养条件为37"C恒 温混合气体(含95%空气，5%C02)， 100%饱和湿度的培养箱中培养。每 周换液3次，待90%左右的细胞融合时予以传代，培养至第2至3代时， 更换培养液为DMEM成骨诱导培养液，用于研究。
步骤二、 Nell-l基因转染bMSCs 细J包生长至70 - 80%融合时，予以 传代，24小时后细胞全部附着于底壁，此时吸去DMEM诱导分化培养液， 无血清DMEM成骨诱导培养液洗涤2次，加入一半量包含一定滴度腺病毒 载体的无血清DMEM成骨诱导培养液，Nell-1腺病毒载体浓度为3. 5 x 10"pfu/ml，加入稀释的携基因的腺病毒载体后，在培养箱中培养一小时， 期间每隔15分钟均匀轻摇晃，使病毒充分接触细胞，提高转染效率。一 小时后加入另外半量的含20%血清的培养液。此时培养液中FBS含量为 10%。置培养箱培养24小时后，吸去培养液，PBS液洗涤两次，加入全量成骨诱导分化培养液，继续培养。每3天换液。Nell-l基因从美国0rigen 公司获得。
步骤三、基因转染效率检测 细胞接种于6孔板。转染LacZ基因 72小时后，吸去培养液，以PBS轻轻漂洗细^^两次，室温下以4°/。多聚曱 醛固定10分钟，再次以PBS轻漂洗两次。每孔加入X-gal染色液lml, 37°C水浴箱中染色1-3小时，观察发现细胞绿色染色即以PBS漂洗中止实 验，在100x放大倍数下随机选择6个视野，统计LacZ表达阳性的细胞 占细胞总数的百分比。
步骤四、反转录PCR测定Nell-l基因的转录 转染后72小时，提 取总RNA,反应的条件为42。C水浴2小时后，立即》文入95 °C水浴5分 钟进行反转录，合成好的cDNA模板立即进行PCR反应。Nell-l的引物序 列如下正向引物5， -CTGTGTGGCTCCTAACAAGTGTG-3，；反向引物5， -GGATTCTGGCAATCACAAGCTGCT-3',退火温度60。C,预计产物400bp。内参 照J3-actin的引物序列正向引物5， - GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3，；反 向引物5， - AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3，，退火温度60°C。循环参数为 95。C预变性5分钟，95°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒，30个循环，最 后72°C延伸10分钟。PCR产物采用2%凝胶电泳紫外灯下观察，与DNA Ladder Marker对比磁基大小，以出现与预计产物石咸基大小相同的片断为 阳性。
步骤五、Western blot检测Nell-l基因的蛋白表达 转染后72小 时，吸去培养液，漂洗细胞，裂解，移入EP管；振荡后置冰盒中，离心， 移上清入另一 EP管；加入等体积2%SDS和1M DTT的混合物(SDS: DTT体积比为4:1),充分振荡。变性后立即冷却。配浓度为5%的SDS丙烯酰胺 积层胶，6Y。的SDS丙烯酰胺分离胶，以80V电压在积层胶中电泳，随后以 100V电压在分离胶中电泳。聚偏氟乙烯(PVDF)膜预湿，》丈入电转緩冲 液浸泡15分钟，随后将蛋白电泳分离后的凝胶与PVDF膜置入电转系统电 转。封闭后孵育一抗。 一抗滴度anti-Nell-1为1: 850的兔抗；内参 照anti-p-actin为1: 10000的小鼠抗。二抗山羊抗兔抗体，滴度1: 3000;山羊抗鼠抗体，滴度l: 1000。以ECL plus化学发光试剂盒显影。 二、 Nel卜l基因影响大鼠bMSCs成骨分化的体外研究 步骤一、Von Kossa硝酸银法染色 bMSCs接种在6孔板内，每孔接 种2乂105个。基因转染方法同前。转染21， 28天后，细胞以O. 1°/。戊二醛 溶液固定，蒸馏水漂洗，加入5%硝酸银溶液，紫外灯下反应，蒸馏水漂 洗后加入5。/U克代辟u酸钠溶液反应，酒精漂洗。》见察直径大于0. 5 mm的钙 结节lt目。
步骤二、 Real-time PCR测定成骨相关基因表达 在基因转染后3 天，7天，14天，21天进行总RNA提取纯^f匕及cDNA合成。采用PP5软件 设计候选大鼠A^P、 BSP、 0C、 0P和Sox9基因引物，并合成引物序列。采 用梯度PCR扩增样品，反转录合成cDNA。在50°C-68°C的范围内选定最佳 退火温度，进行PCR扩增。PCR产物采用2%琼脂凝胶电泳紫外灯下观察， 与DM Ladder Marker对比碱基大小，以出现与候选基因石tt大小相同的 片l殳为阳性。实时荧光定量PCR的体系加入96孔反应^反后在ABI 7300 型荧光定量PCR仪进行扩增。65 。C -95 °C绘制熔解曲线。所有标本均重 复3次检测。检测的临界点设定为PCR反应过程中，焚光信号达到所设定的荧光信号阈值对应的循环^t (cycle number at threshold, CT值)处。 为了校正标本RNA的质量和反转录效率的差异，将标本才企测所得的基因 CT值与相对应的GAPDH基因CT值相减来进行标准化。
三、 Nell-l基因修饰大鼠bMSCs复合fi-TCP材料净果鼠皮下成骨 步骤一、支架材料的处理与细胞复合 TCP材料高温消毒备用。
与细胞复合前24小时与成骨诱导培养液中浸泡以充分排出孔隙中的气 泡。用消毒滤纸吸出孔隙中的培养液后，立即复合。将基因转染3天的 bMSCs消化，制成细胞密度为5 x 107ml的细胞悬液,缓慢滴加到|3-TCP
材料至饱和状态，复合后的细胞-支架复合物即刻植入。
步骤二、细胞-支架复合物棵鼠皮下植入 经吸入少量乙醚后，棵 鼠腹部注射氯胺酮3mg/0. 3ml麻醉，在背部皮下剪开3个约lcm长的切口 ， 以止血钳钝性分离皮下组织，复合物植入，缝合。
步骤三、取材及组织病理学观察 术后4周注射过量戊巴比妥致死， 分离材料周围皮下组织，取出移植物，置10y。EDTA液脱钩2周，脱水，包 埋于石蜡，取圆柱形横断面切片，观察新骨成骨面积。
四、 构建组织工程化骨促进颌骨缺损修复
步骤一、大鼠bMSCs培养及基因转染 取Fischer 344大鼠胫骨和 股骨骨髓，置于培养条件为37。C恒温混合气体，100%饱和湿度的培养箱 中培养。培养至第2至3代时，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液。细 胞生长至70 - 80%融合时，予以传代，24小时后细胞全部附着于底壁，进 行基因转染。步骤二、组织工程化骨的构建 将基因转染3天的bMSCs消化，制 成细月包密度为5 x 10Vml的细月包悬液，纟爰i曼滴力口到直径为5mm的圆柱形P -TCP材料至饱和状态，使得材料湿润，而液体不流出。
步骤三、大鼠下颌骨缺损模型创建及缺损修复实验无菌状态下将成 年Fisher 344大鼠麻醉、颌下区备皮、消毒，在大鼠颌下做平行于下颌 下缘的切口，切开皮肤，皮下组织和肌肉-骨膜层并翻瓣，暴露下颌骨的 颊侧和舌侧骨板。用Kavo高速钻机带5mm外径的钻头在下颌升支制造5mm 直径的圆形缺损，过程中始终緩慢注射生理盐水冷却。在钻孔过程中注意 对颌骨舌侧软组织的保护，防止伤及翼静脉丛。将bMSCs-P-TCP复合物 填充于缺损中。随后以4-0缝线缝合肌肉-骨膜层和皮肤-皮下组织层。
步骤四、取材、组织病理学观察和Micro-CT扫描 将大鼠注射过量 戊巴比妥致死，锐性分离软硬组织，以骨剪取出移植物，脱4丐、脱水，石 蜡包埋、切片、HE染色观察。将样本置于Micro-CT系统的检测试管内，沿 颌骨的长轴方向扫描，获取连续的Micro-CT图像。图像高斯滤波后，选 取水平面图像信息，并选取能够显示左右两侧缺损区域的3D图像。
实验结果
一、Nell-l基因有效的转染大鼠bMSCs并获得表达 转染后72小时，基因转染效率达到峰值。选取此时间点来测定基因 转染的效率。直视下即可以直观地观察到不同转染滴度下转染效率的差 异。没有转染LacZ基因的细胞几乎无P-半乳糖苷酶活性，即不被X-Gal 染色。在MOI-80pfu/ce11时可获得54. 8±4. 6%的转染效率(见图1)，在 M01^160pfu/ce11时，基因转染效率随着转染滴度增加而增高。反转录PCR显示，在转染目的基因的泳道中，400bp大小的条带明显。结果表明 有Nell-l基因转录水平的表达，而LacZ组和空白对照组未见此条带出现， 表明此两组中无Nell-1基因的表达(见图2)。以p-actin蛋白为内参照， 进行各组间内参照蛋白浓度一致的蛋白电泳，可见转染目的基因泳道有大 小约90kDa的蛋白条带表达，条带的表达随转染滴度的增加而更加明显， 显示转染目的基因的泳道有Nell-1基因蛋白水平的表达，而LacZ组和空 白对照组未见此条带出现，显示对照组无Ne 11 -1基因蛋白水平的表达(见 图3)。
二、 Nell-l基因转染促进bMSCs的成骨分化
转染后第15日，N组中首先出现钙化结节；第15日至第28日，各组 中的钙结节数目逐渐增多，Von Kossa硝酸4艮染色后，C组和L组4丐结节 数目少于N组(见图4 )。根据Rea 1-1 ime PCR数据分析，N组相对于对照 组各成骨相关基因的相对表达存在一定的差异。0C基因第3天时下调， 第7天和第14天时上调，但都不明显，21天时表达明显上调，达55. 6 倍。0P基因表达上调，7天和14天时较显著。BSP基因N组BSP较L组 表达明显上调，至14天时为26. 2倍，21天时为16. 0倍。
三、 棵鼠皮下异位成骨
4周后获取标本时，植入处轮廓清晰可见，植入物表面皮肤完整光滑， 无积液，伤口无感染，植入物无排出。周围软组织包裹材料，未见异物排 斥反应，也未见明显炎症反应。HE染色组织切片见N组可见较多的软骨 样和板层骨样组织自支架区向空隙区生长，成骨面积较C组和L组明显， C组和L组支架材料空隙中存在较多的梭形细胞，显示纤维组织结构。(见图5、图6、图7)。
四、构建组织工程化骨促进颌骨缺损的修复
术后8周的Micro-CT可以更加直;i见的显示N组1务复区域密度大于L 组，骨质生长未超出材料的体积范围；N组在组织工程化骨与材料结合处 也更加致密(见图8)。 HE染色，成骨面积N组最高。(见图9，图IO)。
实施例2
Nell-l与BMP-2基因修饰bMSCs体内成骨的比较
步骤一、细胞的培养和转染及体内实验基因转染3天的bMSCs用于 体内实验，制备细胞密度5xl0Vml的细胞悬液，在5-6周大小BALB/c 棵鼠大腿肌肉内注射细胞悬液100ja 1。
步骤二、取材、组织病理学观察、X线) 见察和Micro-CT扫描 术 后4周处死实验动物，并将标本置10%福尔马林固定，高分辨率Micro-CT 扫描，juCT Ray T3. 3和juCT Evaluation Program V5. 0三维重建，最后 将标本脱钓，石蜡包埋，切片，HE染色。
实验结果
术后4周Nel卜l基因转染的bMSCs所形成的新骨(E， G)较BMP-2 组骨组织更致密(F， H ),(见图11 )。
权利要求
1、一种组织工程化骨，它由下列方法制得(1)Nell-1基因转染体外培养的bMSCs；(2)将步骤(1)得到的产物、生物支架材料复合构建组织工程化骨。
2、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于所述的Nell-l 基因以MOI=50 ~ 80pfu/cel 1的工作浓度转染体外培养的骨髄基质细胞。
3、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于骨髓基质细胞来 源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞。
4、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于骨髄基质细胞来 源鼠骨髓基质细胞。
5、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于生物支架材料是 磷酸三钙、多孔羟基磷灰石、珊瑚、藻酸4丐、胶原。
6、 根据权利要求l所述的组织工程化骨，其特征在于生物支架材料是
7、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于细胞密度为5x 107ml的细胞悬液与生物支架材料复合。
8、 权利要求1-7任一所述的组织工程化骨在颌骨缺损修复领域中应用。
全文摘要
本发明涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨及其应用。本发明的技术方案如下一种Nell-1基因修饰的bMSCs构建组织工程化骨，它由下列方法制得(1)Nell-1基因转染体外培养的骨髓基质细胞；(2)将步骤(1)得到的产物、生物支架材料构建组织工程化骨，促进了裸鼠皮下异位成骨和大鼠颌骨临界骨缺损(CDS)修复的效果。本发明优点表现在Nell-1基因修饰的组织工程化骨植入裸鼠体内后，材料网孔内新骨较对照组成骨多，Micro-CT显示Nell-1基因修饰的组织工程化骨修复大鼠临界骨组织缺损时，可以在大鼠颌骨CSD内安全生长，并能更有效的修复骨缺损。
文档编号A61L27/00GK101444644SQ20071017105
公开日2009年6月3日 申请日期2007年11月27日 优先权日2007年11月27日
发明者刘根桃, 孙小娟, 张志愿, 张秀丽, 王绍义, 胡镜宙, 蒋欣泉, 君 赵, 陈建国 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院