灯盏乙素酯及其医疗用途的制作方法

专利名称：：灯盏乙素酯及其医疗用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药研究领域，具体涉及一类灯盏乙素酯及其制备方法，该衍生物或其药物组合物在脑缺血治疗方面的医疗用途。
背景技术：
：灯盏花素(scutellarin)是从菊科飞蓬属植物短葶飞蓬(EWgera"Z^v&ca;w;y(Vant.)Hand,Mazz.)中提取的黄酮类有效成分，其主要活性成分(约70%以上)为灯盏乙素，即4',5,6-三羟基黄酮-7-0-P-D-葡萄糖醛酸苷，又称野黄芩苷。药理研究表明灯盏花素能够扩张血管、增加心脏冠脉流量、增加脑血流量、降低脑血管阻力、提高血脑屏障通透性以及对抗由二磷酸腺苷引起的血小板凝集等作用。临床上主要用于中风后遗症、冠心病、心绞痛等疾病的治疗，疗效确切。目前灯盏花素上市的剂型有多种，注射用剂型有粉针剂、冻干粉、输液制剂和脂质体冻干粉针剂；口服剂型有普通片剂、软胶囊剂、滴丸、分散片、控释片等。灯盏花素为黄酮苷类化合物，缘于其平面的化学结构而表现出其水溶性和脂溶性均较差。灯盏花素注射给药体内吸收快、半衰期短、体内消除迅速，有效血药浓度维持时间短。特别是口服灯盏花素的生物利用度很低，十余家GCP基地的报告均表明几乎在体内无法检出灯盏乙素，因此对口服途径的治疗效果产生了疑问。作为中风恢复期的药物，患者多逸择在家接受治疗，加上目前对灯盏花素注射剂不良反应的增多，注射给药不是该类疾病治疗的最佳选择，而目前方便、价廉的口服的灯盏花素制剂却存在口服生物利用度极低的问题。为了克服上述缺点，同时保持药物的临床疗效，方便用药，我们从改善药物的吸收入手，对灯盏乙素进行结构修饰和活性筛选评价，并发现其酯类衍生物能够克服其生物利用度极低的缺陷。本发明针对灯盏乙素分子中的7位葡萄糖醛酸上的羧基进行一系列的酯化，改善了原药的理化性质和渗透性，提高了其口服生物利用度。有关灯盏花素申请的专利有82个，其中外观设计专利7个，发明专利75个，发明公开内容主要涉及灯盏花素片剂、输液制剂、滴丸和颗粒剂等剂型制备工艺和方法。关于灯盏乙素衍生物的专利未见报道。
发明内容本发明的目的在于提供灯盏乙素酯类化合物。本发明的目的在于提供灯盏乙素酯类化合物的合成制备方法。本发明的目的在于提供灯盏乙素酯和与药学上可接受的载体形成的药物组合物。本发明的目的在于提供灯盏乙素酯或其药物组合物在脑缺血治疗方面的医疗用途具体实施例方式为了克服灯盏花素注射给药体内吸收快、半衰期短、体内消除迅速，有效血药浓度维持时间短，口服制剂生物利用度极低，几乎不吸收的缺陷，本发明采用酯化法对灯盏乙素进行结构修饰，修饰点为灯盏乙素结构中的羧基，以阻止药物吸收过程中葡萄糖醛酸水解酶对灯盏乙素的酶解(因其酶解产物4'，5,6,7-四羟基黄酮极不稳定)，提高其口服生物利用度。为达到上述目的，本发明通过下述技术方案予以实施。一类通式I所示的灯盏乙素酯，其特征在于R为C1C15的链脂肪醇、环脂肪醇、取代脂肪醇，如甲醇、乙醇、戊醇、环丙醇、环己醇、苄醇、苯乙醇等，或者是Cl-C10的脂肪二醇，如l，4-丁二醇等，或者C1-C10的脂肪三醇，如甘油等，或者酚类，如苯酚、对甲苯酚、萘酚等。通式I所述的灯盏乙素酯，其制备方法为灯盏乙素在酸催化下，与醇或酚类化合物的羟基在加热回流(或微波辅助)状态下进行反应，萃取，重结晶，制备得到。所述的灯盏乙素酯，在其制备过程中所用的酸为药学上允许的有机酸或无机酸，优选氯化氢(气)，浓硫酸，对甲苯磺酸。所述的灯盏乙素酯，在其制备过程中所用的醇或酚类化合物为R为C1-C15的链脂肪醇、环脂肪醇、取代脂肪醇，如甲醇、乙醇、戊醇、环丙醇、环己醇、苄醇、苯乙醇等，或者是C1-C10的脂肪二醇，如l，4-丁二醇等，或者C1-C10的脂肪三醇，如甘油等，或者酚类，如苯酚、对甲苯酚、萘酚等。4所述的灯盏乙素酯，在其制备过程中可以在加热回流(或微波辅助)状态下进行反应，优选50—11(TC。上述灯盏乙素酯与药学上可接受的载体形成药物组合物。所述的药物组合物，其剂型为药学上允许的任何剂型，通常为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、微囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂等。所述的药物组合物的制备方法是将灯盏乙素酯与药学上可接受的辅料混合均匀，常规工艺制成所需剂型。所述的灯盏乙素酯，能够被口服吸收，在体内转化为灯盏乙素。所述的灯盏乙素酯，对大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血有显著治疗作用。通过下述实例有助于理解本发明，但并不能限定本发明的内容。实施例l灯盏乙素甲酯的合成灯盏乙素溶于适量甲醇中，在浓盐酸的催化下，加热到沸腾，保持微沸状态，反应3h，TLC监测反应进程，反应结束后，有机溶剂萃取，回收溶剂，再以甲醇溶解，室温进行重结晶，得灯盏乙素甲酯纯品，收率85%-95%。淡黄色针状结晶，mp250°C(dec);分子式为C22H2()012，ESI-MS给出准分子离子峰m/z477.4[M+H]+;'H-NMR(DMSO-d6):S12.76(1H，br.s，5-0H)，S10.37(1H，br,s，4'-OH.)，S8.60(1H，br.s，6-0H)，S7.92(2H，d，2，,6，-H)，S6.93(2H，d，3，,5，-H)，S7.08(1H，s，8-H)，S6.81(1H，s，3-H)，53.76(3H，OCH!)。实施例2灯盏乙素乙酯的合成将灯盏乙素悬浮于无水乙醇中，加入适量的酸，加热回流3h，TLC监测反应进程，反应结束后，NaHC03调节pH值，有机溶剂萃取，回收溶剂，再以乙醇溶解，室温进行重结晶，得灯盏乙素乙酯纯品，收率85%-96%。淡黄色针状结晶，mp:257-259°C;分子式为C23H22012，ESI-MS给出准分子离子峰m/z491.2[M+H]+;红外光谱(FT-IR)中1738cm—1为酯羰基的吸收峰，1664cm—1为C-4位缔合羰基的吸收峰；'H-NMR(DMSO-d6)给出22个氢质子信号，512.73(1H，br.s，5-0H)，S10.36(1H，br.s，4'-OH)，S8.61(1H，br.s，6-OH)，S7.93(2H，d，2',6，-H)，S6.94(2H，d，3'，5，隱H)，S7.0(1H，s，8陽H)，S6.8(1H，s，3-H)，S5.52(1H，d，glc-l-H)，51.2GH，t，-CH"CH2)。实施例3灯盏乙素异丙酯的合成将灯盏乙素悬浮于无水异丙醇中，加入适量的酸，加热回流4h，TLC监测反应进程，反应结束后，得到纯度为80%的灯盏乙素异丙酯产物，用甲醇重结晶两次，得纯度95%的灯盏乙素异丙酯，收率约40%。淡黄色针状结晶，mp:250-251°C;分子式为(3241124012，ESI-MS给出准分子离子峰m/z505.2[M+H]+;红外光谱中1737cm-1为酯羰基(中等强度)的吸收，同时，羧基上的羰基吸收(1720-1680cm")消失。iHNMR显示分子中有24个质子，其中51.1-1.2(6H，2XCH3)为异丙基的两个甲基上质子，S4.91-4.98(m，m)为异丙基连氧碳上的质子。实施例4灯盏乙素-4，-羟基丁酯的合成灯盏乙素适量溶解于THF中，加入适量l，4-丁二醇，在浓硫酸催化下，与l，4-丁二醇在低温条件下反应4h，得到纯度为80%的灯盏乙素-4'-羟基丁酯产物，甲醇重结晶，得灯盏乙素-4，-羟基丁酯纯品，收率75%。针状结晶；分子式为C25H26013，阳离子ESI-MS给出准分子离子峰m/z535.4[M+H]+;&NMR与灯盏乙素的'HNMR相比，多出了4，-羟基丁基的质子氢的信号。'实施例5灯盏乙素甘油酯的合成灯盏乙素适量溶解于THF中，加入适量甘油，在酸催化下，加热回流4h(TLC监测反应进程)，反应结束后，混合物倾入冰水中，有机溶剂萃取，重结晶，得纯度98%的灯盏乙素甘油酯，收率约40%。针状结晶；分子式为C24H24014，阳离子ESI-MS给出准分子离子峰m/z537.4[M+H]+;&NMR与灯盏乙素的&NMR相比，多出了甘油基的质子氢的信号，即四个连氧碳上的氢质子和活泼氢的信号。实施例6灯盏乙素苄酯的合成灯盏乙素(lmoL)悬浮于无水MDF中，加入苄醇(1.2moL)和适量的酸，加热回流约4h(TLC监测反应进程)，反应结束后，倾入冰水中，过滤，重结晶，得纯度98%的灯盏乙素苄酯，收率约70%;针状结晶，mp:285-287。C;分子式为C29H26012，ESI-MS:m/z565.2[M-H]—;^NMR(DMSO-d6):S12.72(1H，s，5-0H)，10.38(1H，s，4'-OH)，8.58(1H，s，6-OH)，7.85(2H，d，J=8.5Hz，2'-H，6'陽H)，6.99(1H，s，8-H)，6.卯(2H，d，J=8.5Hz,3'隱H，5'陽H)，6.81(1H，s，3-H)，7.27—7.38(5H，m，-ph)，5.12(2H，br.s，*巡-)。实施例7灯盏乙素苯酯的合成灯盏乙素(lmoL)悬浮于适量的二甲基甲酰胺中，加入溴苯(1.2moL)，和适量氢溴酸，加热回流约2h(TLC监测反应进程)，反应结束后，反应混合物倾入冰水中，乙酸乙酯萃取，萃取液回收至干，甲醇溶解，重结晶，得纯度98%的灯盏乙素苯酯，收率约55%;针状结晶，mp:223-226°C;分子式为C28H24012，ESI-MS:m/z551.2[M-H]_;^NMR(DMSO陽d6):S12.72(1H，s，5-OH)，10.38(1H，s，4'-OH)，8.59(1H，s，6-OH),7.88(2H，d，J=8.8Hz，2'-H，6'-H)，6.99(1H，s，8-H)，6.91(2H，d，J=8.8Hz,3'-H，5'-H)，6.81(1H，s，3-H)，7.27-7.38(5H，m，-ph)。实施例8灯盏乙素酯对大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血的影响药物与试剂灯盏乙素纯度95%;灯盏乙素乙酯纯度95%;灯盏乙素异丙酯纯度95%，三样品均于每闩给药前加入不同体积的pH6.8磷酸盐缓冲液混悬，配成所需浓度。实验方法和结果取体重130150g的健康雄性SD大鼠40只，按体重随机分为4组，即模型对照组，灯盏乙素组(阳性药组)、灯盏乙素乙酯组、灯盏乙素异丙酯组，每组10只。灌胃给药，灯盏乙素组、灯盏乙素乙酯组、灯盏乙素异丙酯组给药剂量均为50mg/kg，给药体积为lmL/100g，每天给药1次，连续给药7天。模型对照组给等体积生理盐水。各组大鼠于第6天给药lh后，腹腔注射10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉。按Tamura等方法[^右侧卧位固定，在眼眦和外耳道中线处做一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，用咬骨钳咬去颧弓，暴露鳞状骨大部分，然后在颧弓和鳞状骨前联合的下方约2mm处用牙科钻钻孔，开一约2mm直径小颅窗，暴露大脑中动脉。将吸有50%三氯化铁溶液(用lmol/L盐酸配制)10ul滴在小片滤纸上，敷在大鼠该段大脑中动脉处，放置30min后去掉滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，常规皮肤消毒后回笼饲养。手术过程室温控制在2325'C。术后第二日(造模后23h)继续给药1次。于造模后24h断头取脑。对神经体征的影响取按照上述方法给药并造模各组大鼠，于术后6h和24h进行神经症状的行为评分。方法如下①提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术的对侧前肢出现腕屈、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘屈曲又有肩内旋者，分别计为l、2、3、4分。②将动物置于平地上，分别推双肩向对侧移动，检査阻力，如双侧阻力对等且有力，计为O分，如向手术的对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为l、2、3分。③将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为O分，同样根据手术对侧肢张力下降程度不同计为l、2、3分。④动物有不停向一侧转圈者，计为1分，根据评分标准，满分为11分，分数越高，动物行为障碍越严重。结果显示，按照行为学评分标准，各组大鼠在造模后6h、24h出现不同程度的神经体征。与模型组比较，各给药组均可不同程度地降低大脑中动脉栓塞致脑缺血大鼠的行为评分，在造模后6h，灯盏乙素组、灯盏乙素乙酯组、灯盏乙素异丙酯组与模型组比较均未见显著性差异；造模后24h，灯盏乙素组、灯盏乙素乙酯组、灯盏乙素异丙酯组与模型组比较均有显著性差异；灯盏乙素乙酯组与灯盏乙素异丙酯组对神经体征的改善作用强于灯盏乙素组，与灯盏乙素组相比有显著性差异；灯盏乙素乙酯组作用稍强于灯盏乙素异丙酯组，但两者相比无显著性差异。见表l。即灯盏乙素酯对大脑中动脉栓塞所致大鼠神经症状行为评分的影响强度为灯盏花乙素乙酯》灯盏花乙素异丙酯〉灯盏乙素。表l灯盏乙素及其衍生物对大脑中动脉栓塞大鼠神经体征的影响(x±s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>对脑梗塞范围的影响取按上述方法给药、造模并进行术后24h行为评分的4组大鼠，每组10只，分别断头处死，迅速取出全脑，除去嗅球、小脑和低位脑干，左、右脑分开，分别在0—4'C下冠状切3刀分4片，迅速将脑片置于TTC染色中(每5ml染液中所含4y。TTC1.5ml，lmol/LK2HP040.lml)，37。C避光温孵30min，取出后置于10%甲醛溶液中避光保存24h。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。.将白色梗塞灶仔细挖下称重，以梗死组织重量占总脑重量的百分比作为脑梗死范围，分别计算每只动物的脑梗塞范围，比较组间差异。左侧大脑为空白对照。■结果显示，与空白对照相比，各组大鼠的脑组织均出现明显不同面积的白色脑梗塞区域。与模型组比较，灯盏乙素组、灯盏乙素乙酯组、灯盏乙素异丙酯组均可不同程度的减少大鼠大脑中动脉栓塞所致梗死范围的重量百分比，差异显著；与灯盏乙素组比较，灯盏乙素乙酯组和灯盏乙素异丙酯组作用明显强于灯盏乙素组，差异显著；与灯盏乙素乙酯组比较，灯盏乙素异丙酯组作用弱于灯盏乙素乙酯组，差异显著；即灯盏乙素酯对大脑中动脉栓塞所致大鼠脑梗塞范围的影响强度为灯盏花乙素乙酯>灯盏花乙素异丙酯〉灯盏乙素。见表2。表2灯盏乙素及其衍生物对大脑中动脉栓塞大鼠脑梗塞范围的影响(x±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注组间T检验，与模型组比较*p<0.05，林p<0.01，与灯盏乙素组比较.#p<0.05，##p<0.01。实施例9灯盏乙素酯的血浆样品分析取体重130150g的健康雄性SD大鼠80只，按体重随机分为2组，即灯盏乙素乙酯组、灯盏乙素异丙酯组，每一组设8个取血点，每点5只，试验前各组动物禁食12h，分别灌胃给予灯盏乙素乙酯、灯盏乙素异丙酯各50mg/kg，给药体积为lmL/100g，于给药后30、45、60、90、120、150、180、240min腹主动脉取血3.0mL，置于肝素化试管中，4。C离心15min(3000rpm/min)分离血桨。取血浆样品l.OmL置于lO.OmL具塞试管中，精密加入30yL原儿茶醛内标(IS)溶液Q.SOug'mL-1),混匀，加入乙酸乙酯2.0mL，涡旋2min，静置，上清液转移至梨形瓶中，重复上述操作2次(即乙酸乙酯萃取3次，每次2.0mL)，合并萃取液，40。C减压蒸干，残渣用400uL甲醇溶解，0.22um微孔滤膜滤过，进样20uL，进行HPLC分析。通过空白血浆、含药血浆、灯盏乙素对照品、灯盏乙素乙酯对照品和灯盏乙素异丙酯对照品的HPLC色谱图和色谱峰的紫外全波长扫描图比较，表明灯盏乙素乙酯和灯盏乙素异丙酯口服给药能够被吸收，并且在体内转化为灯盏乙素。实施例IO灯盏乙素乙酯的药物组合物(1)灯盏乙素乙酯片的制备有效成分灯盏乙素乙酯20g崩解剂交联羧甲基纤维素钠10g稀释剂和干粘合剂微晶纤维素50g填充剂乳糖20g制备方法灯盏乙素乙酯与上述辅料按处方量混合均匀，过100目筛，采用直接,压片法进行压片，制成1000片，每片含主药量20mg。包衣可用药学允许的普通薄膜包衣和肠溶衣。(2)灯盏乙素乙酯胶囊的制备有效成分灯盏乙素乙酯20g崩解剂羧甲基淀粉钠20g稀释剂和干粘合剂微晶纤维素60g制备方法灯盏乙素乙酯与上述辅料按处方量混合均匀，过IOO目筛，胶囊填充，制成1000粒，每粒含主药量20mg。(3)灯盏乙素乙酯滴丸的制备有效成分灯盏乙素乙酯20g基质聚乙二醇600060g聚乙二醇400020g制备方法灯盏乙素乙酯与上述辅料按处方量混合，制成均一的药液，保温条件下按常规滴制法滴制，二甲基硅油冷却，制成1000丸。实施例11注射用灯盏乙素乙酯(1)灯盏乙素乙酯20g聚山梨酯8020mL20%氢氧化钠0.1%活性炭注射用水制备方法灯盏乙素乙酯20g，加入注射用水约950mL，加聚山梨酯8020mL，加20。/。氢氧化钠调pH值至7.5，加0.1%活性炭加热煮沸15min，冷藏24h，滤过，滤液调pH值至7.5，加注射用水使成1000mL，滤过，灌封，灭菌，即得。(2)灯盏乙素乙酯20g95%乙醇400mL丙二醇200mL苯甲醇20mL20%氢氧化钠1%活性炭注射用水制备方法灯盏乙素乙酯20g,加400mL95%乙醇溶解，加200mL丙二醇，加注射用水至1000mL，加1%活性炭，20。/。氢氧化钠调pH值至7.5，加热煮沸15min，冷藏24h,滤过，加苯甲醇20mL，调pH值至7.5，加注射用水至1000mL，滤过，灌封，灭菌，即得。实施例12灯盏乙素异丙酯的药物组合物1000g灯盏乙素异丙酯颗粒剂的制备有效成分灯盏乙素异丙酯20g崩解剂羧甲基淀粉钠20g稀释剂和干粘合剂微晶纤维素60g制备方法灯盏乙素异丙酯与上述辅料按处方量混合均匀，过100目筛，采用70%乙醇制粒，干燥、整粒、制成1000g，每粒含主药量20mg。权利要求1.一类通式I所示的灯盏乙素酯，含该类衍生物的药物组合物及其在脑缺血疾病治疗方面的医疗用途。通式I2.权利要求1中通式I所示的灯盏乙素酯，其特征在于其中R为C1-C15的链脂肪醇、环脂肪醇、取代脂肪醇，如甲醇、乙醇、戊醇、环丙醇、环己醇、苄醇、苯乙醇等，或者是C1-C10的脂肪二醇，如l，4-丁二醇等，或者C1-C10的脂肪三醇，如甘油等，或者酚类，如苯酚、对甲苯酚、萘酚等。3.权利要求l中通式I所示化合物的制备方法，其特征在于灯盏乙素在酸催化下，与醇或酚类化合物的羟基在常温或加热回流状态下进行反应，即得灯盏乙素酯。所用的酸为有机酸或无机酸，优选氯化氢(气)，浓硫酸，对甲苯磺酸。所用的醇可为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、甘油、节醇、苯酚、对甲苯酚、萘酚等。4.权利要求1中含灯盏乙素酯的药物组合物，特征在于灯盏乙素酯与药学上可接受的载体形成的药物组合物。5.权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于权利要求1中的灯盏乙素酯与药学上可接受的辅料混合均匀，利用制剂工艺制成所需剂型。优选片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、微囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂等。6.权利要求l中灯盏乙素酯，其特征在于灯盏乙素酯作为前药，能够被口服吸收，在体内转化为灯盏乙素，克服灯盏乙素口服生物利用度极低的缺陷。7.权利要求1中灯盏乙素酯，其特征在于灯盏乙素酯对大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血有显著治疗作用。通式I全文摘要本发明涉及一类灯盏乙素酯及其合成制备方法，以及在脑缺血治疗方面的医疗用途。灯盏乙素酯类化合物结构见式I，其中R为C1～C15的链脂肪醇、环脂肪醇、取代脂肪醇，如甲醇、乙醇、戊醇、环丙醇、环己醇、苄醇、苯乙醇等，或者是C1-C10的脂肪二醇，如1，4-丁二醇等，或者C1-C10的脂肪三醇，如甘油等，或者酚类，如苯酚、对甲苯酚、萘酚等。该类化合物通过以下步骤获得在酸催化下，与醇或酚类化合物的羟基在常温或加热回流状态下进行反应制备得到。该类衍生物与药学上可接受的载体形成药物组合物。该药物组合物的制备方法是将灯盏乙素酯与药学上可接受的辅料混合均匀，而制成所需剂型。灯盏乙素酯能够被口服吸收，对大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血有显著改善作用。文档编号A61P9/10GK101423537SQ20071017666公开日2009年5月6日申请日期2007年11月1日优先权日2007年11月1日发明者燕仝,李建荣,王智民,王维皓,高慧敏申请人:中国中医科学院中药研究所