专利名称：：鬼针草总黄酮的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种鬼针草活性成分的制备方法，属于天然药物活性成分制备领域。
背景技术：
：鬼针草属菊科(Compositae)鬼针草属植物，又名婆婆针、鬼钗草、盲肠草、引线包、针包草、一把针、豆渣菜、脱力草，产于东北、华北、华东、西南及陕西、甘肃等地，生长于路边、荒地、山坡及田间。《中药大辞典》记载"鬼针草味苦性平，无毒，清热解毒、散瘀消肿之功，主治疟疾、腹泻、痢疾、肝炎急性肾炎、胃痛、肠痈、咽喉肿痛、跌打损伤、蛇虫咬伤等"。鬼针草可用于治疗感冒、甲状腺肿、慢性盆腔炎、子宫脱垂、神经衰弱等有较好疗效；其制剂悦年片对原发性高血压有较好疗效；我国云南少数民族地区用其水煎剂治疗糖尿病，可见本植物具有较高药用开发价值。近年来，对鬼针草黄酮和酚酸类成分的药理作用有较多研究，小花鬼针草中的酚酸类成分，主要为奎尼酸、咖啡酸、原儿茶酸、对羟基桂皮算、咖啡酰奎宁酸等具有抑制组胺释放的作用(王珏，王乃利，等.小花鬼针草中酚酸类成分及其抑制组胺释放活性.中国药物化学杂志[J].2006,16(3):168)。文献记载，鬼针草总黄酮具有抗大鼠肝纤维化的作用，并具有降血压、调血脂的作用。李帅、匡海学等(李帅，匡海学，等.鬼针草提取物对n型糖尿病小鼠降血糖作用的研究.中医药学报[J]2003,31(5》37)对鬼针草正己垸、乙酸乙酯、正丁醇萃取物、水提取物部分对II型糖尿病小鼠进行降血糖作用研究，发现乙酸乙酯、正丁醇萃取部位能降低正常小鼠的血糖。中国专利CN1899340A公开的鬼针草提取物(主要含有总黄酮类和双咖啡酰类化合物)具有降血糖作用。鬼针草含多种生物活性成分，其中以黄酮类化合物为其主要成分，另外还有酚酸类、挥发油类、氨基酸类、三萜及甾体类、少量生物碱类化合物。鬼针草不同药用部位所含黄酮量差别较大，文献(冯强.鬼针草不同部位总黄酮含量比色法比较.现代中药研究与实践[J].2003,17(2):25)报道，鬼针草全草总黄酮含量为5.40%,叶片总黄酮含量为6.66%，花序总黄酮含量为6.68%，茎叶总黄酮含量为0.89%，果实中总黄酮含量为3.24%，以叶片和花序中含量最高。对鬼针草总黄酮的工艺研究，以有较多文献报道，其中多是以大孔吸附树脂为富集载体，研究重点侧重于不同型号的大孔吸附树脂对鬼针草总黄酮的吸附量及洗脱量的考察，且其中多是对直接用乙醇提取后的提取液进行考察，这样的处理加大了大孔树脂的负荷。如文献(1、魏英勤，马毅等.大孔吸附树脂分离纯化鬼针草总黄酮的研究.时珍国医国药[J].2006,17(ll):2257-2258;2、钟明媚，陈飞虎等.正交设计法优选鬼针草中总黄酮的提取工艺研究.时珍国医国药[J].2006，17(12):2520-2521)，这些方法处理原料药时过于简便，所得到的产物总黄酮含量相对较低，杂质含量也相对较高，且对树脂的负载量过大，树脂用量过多。中国专利CN1899340A公开了一种获得鬼针草总黄酮的方法，其所用的方法为鬼针草乙醇渗漉液浓縮后经石油醚脱脂，乙酸乙酯萃取即得总黄酮活性提取物，但其产物得率低，10kg干燥鬼针草药材中最终产物为40g,原料损失程度大。
发明内容本发明的目的在于提供一种含量较高且鬼针草总黄酮产物得率高的鬼针草总黄酮的制备方法。本发明以药材鬼针草为原料，其中鬼针草可以是鬼针草叶片、花序、全草或果实。本发明中，鬼针草先以60%90%的乙醇回流提取，所得乙醇提取液经减压回收乙醇至乙醇含量低于15%后，药液浓度约为每毫升含原药材0.7~0.85g，将回收后的药液置冷处放置24小时，药液中析出不溶物，过滤或离心，不溶物弃去，清液除去乙醇，以低极性有机溶剂萃取脱脂，脱脂后的药液再用与水不互溶的有机溶剂萃取以初步富集药液中的黄酮类化合物，将富集的黄酮类药液浓縮除去萃取所用的有机溶剂，所得的浓缩液加水稀释，分散后经树脂处理，以不同浓度的乙醇洗脱树脂柱，收集含黄酮类的流份，即得鬼针草总黄酮提取物。其总黄酮含量大于等于50%。本发明中，鬼针草的提取工艺可具体为鬼针草先以60%~90%的乙醇回流提取，所得乙醇提取液经减压回收乙醇至乙醇含量约为10%后，药液浓度约为每毫升含原药材0.80g，将回收后的药液置冷处放置24小时，药液中析出不溶物，过滤或离心，不溶物弃去，清液以正己烷萃取脱脂，脱脂后的药液再用4:1的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取以初步富集药液中的黄酮类化合物，将富集的黄酮类药液浓縮除去萃取所用的有机溶剂，所得的浓縮液加适量水稀释，分散后经大孔吸附树脂柱处理，树脂先用去离子水洗脱35个柱体积，至Molish反应呈阴性，改用50%~80%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓縮，干燥，粉碎，即得鬼针草总黄酮提取物干膏粉。其总黄酮含量大于等于50%。具体地，本发明鬼针草总黄酮的提取工艺还可以是鬼针草先以60%~90%的乙醇回流提取，所得乙醇提取液经减压回收乙醇至乙醇含量约为10%后，药液浓度约为每毫升含原药材0.80g，将回收后的药液置冷处放置24小时，药液中析出不溶物，过滤或离心，不溶物弃去，清液以石油醚萃取脱脂，脱脂后的药液再用4:1的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取以初步富集药液中的黄酮类化合物，将富集的黄酮类药液浓縮除去萃取所用的有机溶剂，所得的浓縮液加适量去离子水稀释，分散后经聚酰胺树脂柱处理，树脂先用去离子水洗脱35个柱体积，至Molish反应呈阴性，改用50%80%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓縮，干燥，粉碎，即得鬼针草总黄酮提取物干膏粉。其总黄酮含量大于等于50%。本发明中，初步富集鬼针草总黄酮所用的萃取溶剂除了是4:1的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂外，还可以是单用正丁醇，或单用乙酸乙酯，或用正丁醇和乙酸乙酯混合溶剂的其它比例，其所用的溶剂都经水预先饱和。本发明中，在用树脂处理前，含黄酮的鬼针草药液经过提取、除杂、脱脂、初步富集处理，使得药液中的其它杂质类成分大大减少，黄酮类的成分也相对较高而纯，这样不仅减轻了树脂的负荷，且用量也较没处理过的药液直接上柱处理少，得到的产物总黄酮的含量也得到提高。本发明处理工艺过程中，也可以在除杂、脱脂两步程序中单用一种程序，即经浓缩沉淀除杂后，不采用低极性的有机溶剂萃取，直接进入到用乙酸乙酯或正己烷或正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取过程；或者不采用沉淀除杂，浓縮至含乙醇低于15%后直接采用正己垸或石油醚萃取脱脂，而后用乙酸乙酯或正丁醇或正丁醇-乙酸乙酯混合溶液萃取过程；本发明中，处理工艺还可以是鬼针草药材经提取，浓縮脱脂后的药液直接上树脂柱处理，而省去乙酸乙酯或正丁醇或正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取过程；或鬼针草药材经提取、浓縮至含乙醇量低于15%后静置除杂，除杂后的上清药液再蒸去残余的乙醇后，上树脂柱处理。上处理过程也都落在本发明的保护范围之内。但上处理方法所得上柱前的药液不如前述方法纯、含杂质也较前述方法多。本发明所得鬼针草总黄酮提取物，具有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化、防止肝纤维化的作用，可用于制备具有治疗心血管疾病作用、降血压、降血脂、降血糖和防止肝纤维化的药物。以下从药理实验来说明本发明的效果，但所举的药理实施例并局限于此作用，而只是一种非限制性的说明。对应激性高血压大鼠的降压实验Wistar大鼠在指定的环境中适应1周后，将其放入MG-2型迷宫刺激器的不同风格中，以间断性交流电，强度2-4mA，持续时间为50ms，每次通电的间隔由计算机程序控制，2次电击间隔在3-30s之间的任意时间长度，电流的输出无规律可循，从而增强了应激强度，使之产生高度精神及情绪上的紧张，为了更加减少躯体性伤害刺激而增加精神紧张刺激，在给予电击的同时伴随一个噪音信号(80100ds，时程50ms)以建立条件反射，应激动物每天应激2次，上午和下午各1次，每次2h，2次间隔在4小时以上，连续应激15d，以2。/。NaCl溶液代饮用水正常喂养，并观察血压变化，待血压平均升高2.0kPa以上，视为造模成功。将40只造模成功的Wistar大鼠随机平均分为5组，模型组；盐酸维拉帕米注射液(Ver)12.25mg/kg剂量给药组；鬼针草总黄酮提取物20、40、60mg/kg3个剂量组，将未造模的8只大鼠设为空白对照组(Sham),不做任何处理，三味降压片各组大鼠每日灌胃l次，连续15天，模型组给予10mL/kg生理盐水灌胃。降压结果见表l表l鬼针草总黄酮对应激性高血压大鼠的降压影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01由上表结果可知，各应激大鼠应激后平均动脉压与应激前相比，血压显著升高。给予动物应激刺激时，大鼠出现紧张和恐惧、呼吸加快、尖叫、颤抖、直立、逃避等行为表现。灌胃给药15d后，Control组大鼠应激后平均动脉压升髙到(22.45±U3)kPa，与应激前大鼠血压比较，血压升高显著。鬼针草总黄酮60mg/kg组大鼠应激后平均动脉压为(17.97±0.62)kPa，较模型组大鼠应激后平均动脉压升高幅度值明显降低，PO.Ol，鬼针草总黄酮三个剂量组较模型组大鼠应激后平均动脉压升高幅度值均有显著降低，并成剂量依赖关系。对大鼠血脂水平的影响实验对30只体重为220-250g的wistar大鼠随机分为5组，分别设1个空白对照组、l个实验对照组、3个实验组。空白对照组(A组)饲喂标准基础饲料，实验对照组(B组)饲喂由1%的胆固醇、10%的猪板油、0.2%的丙基硫氧嘧啶和88.8%基础伺料组成的高脂词料；实验组在饲喂高脂饲料的同时，各组分别腹腔注射给予鬼针草总黄酮10、15、20mg/kg三个剂量组，6周后静脉取血，采用酶联试剂(盒)使用VitalabMicro半自动化分析仪测定甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)和高密度脂蛋白(HDL-C)的含量，根据测定结果计算低密度脂蛋白单股出(LDL-C)及LDL-C/HDL-C、HDL-C/TC值，结果见表1表l对大鼠血脂水平的影响(；±s，n=6)组别/Jo"/mn^W/rZl^/nZ^LDL-C/HDL-CHDL-C/TCA1.50±0.211.81±0.401.51±0.490.56±0.240.37±0.160.83±0.42B2.29±0.22*3.71±0.51*0.83±0.14*0.87±0.17*1.05±0.23*0.22±0.39*C1.26±0.29**#1.49±0.46**#2.04±0.37**#0.43±0.21**#0.21±0.19**#1.37±0.58**#D1.34±0.31**#1.57±0.52**#1.3±0.32**#0.48±0.27**#0.25±0.14**#1.23±0.51**#E1.10土0.27**#1.27土0.40**#2.31士0.27**#0.36土0.31**#0.16士0.20**#1.82±0.49**#与空白对照组相比，*P<0.01，**P<0.05;与实验对照组相比，#P<0.01实验结果表明，饲喂高脂饲料的对照组与正常对照组相比，6周后血清中TG、TC、LDL-C含量、LDL-C/HDL-C明显提高(PO.Ol)，各实验组与空白对照组相比，TG、TC、HDL-C水平均有所降低，HDL-C水平有所上升；实验组与实验对照组相比，各项指标均较实验对照组有显著差异，说明鬼针草总黄酮具有降低大鼠血脂水平的作用。具体实施例实施例1干燥鬼针草叶10kg，以10倍量70%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮，至药液中含乙醇量约为10%，药液浓度约为每毫升含鬼针草叶片0.8g，冷处放置24h,析出不容物，离心，弃沉淀，上清液以正己烷(1/2药液体积X3次)萃取脱脂，药液减压浓缩，除去残余的有机溶剂后，再用4:1的水饱和过的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，至萃取液颜色变淡，合并混合溶剂萃取液，减压浓縮除去溶剂，浓缩液以少量蒸馏水分散，上已处理好的NKA-9型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱4个柱体积，改用50。/。的乙醇洗脱6个柱体积，收集50%的乙醇洗脱液，浓縮，真空干燥，粉碎，得鬼针草总黄酮提取物干膏粉289g。经紫外-可见分光光度法测定，总黄酮含量为59%。实施例2鬼针草全草10kg，以8倍量60°/。的乙醇回流提取3次，每次lh，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，至药液中含乙醇量约为15%,药液浓度约为每毫升含鬼针草全草0.85g，冷处放置24h，析出不容物，离心，弃沉淀，上清液以正己烷(1/2药液体积X3次)萃取脱脂，药液减压浓縮，除去残余的有机溶剂后，再用水饱和过的正丁醇萃取，至萃取液颜色变淡，合并正丁醇萃取液，减压浓縮除去溶剂，浓縮液以少量蒸馏水分散，上已处理好的HP-20型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱3个柱体积，改用60%的乙醇洗脱6个柱体积，收集60%的乙醇洗脱液，浓縮，真空干燥，粉碎，得鬼针草总黄酮提取物干膏粉260g。经紫外-可见分光光度法测定，总黄酮含量为62%。实施例3鬼针草干燥全草10kg，以10倍量80%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮，至药液中含乙醇量约为5%，药液浓度约为每毫升含鬼针草全草0.70g，冷处放置24h，析出不容物，离心，弃沉淀，上清液以石油醚(1/2药液体积X3次)萃取脱脂，药液减压浓縮，除去残余的有机溶剂后，再用4:1的水饱和过的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，至萃取液颜色变淡，合并混合溶剂萃取液，减压浓缩除去溶剂，浓縮液以少量蒸馏水分散，上已处理好的聚酰胺(30-60目)吸附树脂柱，先用水洗脱5个柱体积，改用70%的乙醇洗脱6个柱体积，收集70%的乙醇洗脱液，浓縮，喷雾干燥，粉碎，得鬼针草总黄酮提取物干膏粉218g。经紫外-可见分光光度法测定，总黄酮含量为72°/。。实施例4鬼针草干燥叶，以12倍量80%的乙醇回流提取3次，每次L5h，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮，至药液中含乙醇量约为8%，药液浓度约为每毫升含鬼针草叶0.75g，冷处放置24h，析出不容物，离心，弃沉淀，上清液以石油醚(1/2药液体积X3次)萃取脱脂，药液减压浓縮，除去残余的有机溶剂后，再用水饱和过乙酸乙酯混合溶剂萃取，至萃取液颜色变淡，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓縮除去溶剂，浓縮液以少量蒸馏水分散，上已处理好的聚酰胺(30-60目)吸附树脂柱，先用水洗脱5个柱体积，改用80%的乙醇洗脱6个柱体积，收集80%的乙醇洗脱液，浓縮，真空干燥，粉碎，得鬼针草总黄酮提取物干膏粉75g。经紫外-可见分光光度法测定，总黄酮含量为85%。实施例5干燥鬼针草叶10kg，以10倍量70。/。的乙醇回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮，至药液中含乙醇量约为10%，药液浓度约为每毫升含鬼针草叶片0.8g，冷处放置24h，析出不容物，离心，弃沉淀，上清药液减压浓縮，除去残余的乙醇，再用4:1的水饱和过的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，至萃取液颜色变淡，合并混合溶剂萃取液，减压浓缩除去溶剂，浓縮液以少量蒸馏水分散，上已处理好的NKA-9型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱4个柱体积，改用50%的乙醇洗脱6个柱体积，收集50%的乙醇洗脱液，浓縮，真空干燥，粉碎，得鬼针草总黄酮提取物干膏粉294g。经紫外-可见分光光度法测定，总黄酮含量为52%。实施例6鬼针草干燥全草10kg，以10倍量80%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，至药液中含乙醇量约为5%，药液浓度约为每毫升含鬼针草全草0.70g，浓縮液以石油醚(1/2药液体积X5次)萃取脱脂，药液减压浓縮，除去残余的有机溶剂后，再用4:1的水饱和过的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，至萃取液颜色变淡，合并混合溶剂萃取液，减压浓縮除去溶剂，浓縮液以少量蒸馏水分散，上已处理好的聚酰胺(30-60目)吸附树脂柱，先用水洗脱5个柱体积，改用70%的乙醇洗脱6个柱体积，收集70%的乙醇洗脱液，浓缩，喷雾干燥，粉碎，得鬼针草总黄酮提取物干膏粉242g。经紫外-可见分光光度法测定，总黄酮含量为68%。实施例7鬼针草全草10kg，以8倍量60%的乙醇回流提取3次，每次lh，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮，至药液中含乙醇量约为15%，药液浓度约为每毫升含鬼针草全草0.85g，冷处放置24h，析出不容物，离心，弃沉淀，上清液减压浓縮除去残余的乙醇后，上已处理好的HP-20型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱3个柱体积，改用60%的乙醇洗脱6个柱体积，收集60%的乙醇洗脱液，浓缩，真空干燥，粉碎，得鬼针草总黄酮提取物干膏粉313g。经紫外-可见分光光度法测定，总黄酮含量为51%。权利要求1、一种鬼针草总黄酮的制备方法，其特征是鬼针草以60％～90％的乙醇回流提取，提取液回收乙醇至含乙醇量低于15％，静置除杂，清液以低极性有机溶剂萃取脱脂后，继续以与水不互溶的中等极性有机溶剂萃取富集黄酮，所得萃取液减压除去萃取溶剂后以树脂纯化，不同浓度乙醇洗脱，收集富含黄酮的流份即得鬼针草总黄酮，所得总黄酮含量大于等于50％。2、如权利要求1所述的制备方法，其特征是鬼针草以60%~90%的乙醇回流提取，提取液回收乙醇使含乙醇量低于15%,冷处放置24小时，析出不溶物，离心或过滤，清液以正己烷萃取脱脂后，继续用4:1的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取至萃取液颜色变淡，富集黄酮，减压浓縮，除去混合萃取溶剂后，浓縮液加水稀释，上已处理好的大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至Molish反应呈阴性，继续以50%~80%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，.减压浓縮，干燥，粉碎，得鬼针草总黄酮干浸膏粉，其中所得提取物总黄酮含量大于等于50%。3、如权利要求1所述的制备方法，其特征是鬼针草以60%90%的乙醇回流提取，提取液回收乙醇使含乙醇量低于15%，冷处放置24小时，析出不溶物，离心或过滤，清液以石油醚萃取脱脂后，继续用4:1的正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取至萃取液颜色变淡，富集黄酮，减压浓縮，除去混合萃取溶剂后，浓缩液加水稀释分散，上已处理好的聚酰胺树脂柱，先用水洗脱至Molish反应呈阴性，继续以50%80%的乙醇洗脱，.收集乙醇洗脱液，减压浓縮，千燥，粉碎，得鬼针草总黄酮干浸膏粉，其中所得提取物总黄酮含量大于等于50%。4、如权利要求1所述的制备方法，其中所述的与水不互溶的中等极性有机溶剂可以选自乙酸乙酯、正丁醇或两者的混合中的任一种。5、如权利要求4所述的制备方法，其中所述的与水不互溶的中等极性有机溶剂优选正丁醇与乙酸乙酯的混合溶剂。6、由权利要求1至5中任一项权利要求所述的制备方法中所得的鬼针草总黄酮在制备具有降血压、降血脂药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种鬼针草总黄酮的制备方法，鬼针草以乙醇回流提取后，回收乙醇至少量，经静置除杂、有机溶剂脱脂、混合溶剂萃取富集、树脂纯化后可得到鬼针草总黄酮，所得总黄酮提取物黄酮含量高，大于等于50％，工艺简单可行，总提取物产率得率高，适合工业化生产。本发明所得的总黄酮提取物具有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化、防止肝纤维化的作用，可用于制备具有治疗心血管疾病作用、降血压、降血脂、降血糖和防止肝纤维化的药物。文档编号A61K36/28GK101185665SQ200710176330公开日2008年5月28日申请日期2007年10月25日优先权日2007年10月25日发明者张树祥,熊国裕申请人:北京星昊医药股份有限公司