专利名称：：一种应用x射线灭活鱼类精子遗传物质的方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种鱼类人工雌核发育的方法，特别涉及一种高效灭活鱼类精子遗传物质的方法。
背景技术：
：人工诱导雌核发育是鱼类遗传育种的重要途径之一，可以用于鱼类性别控制、纯系建立、无性繁殖和克隆、保护濒危鱼类、基因定位等，在遗传学研究和新品种培育方面都有着广泛的应用。人工诱导雌核发育包括两个核心技术，一是在保持精子授精功能的前提下，使精子的遗传物质失活，二是用遗传灭活的精子与具有正常遗传物质的卵子授精获得受精卵后，进行遗传物质(染色体)加倍，其中如何高效灭活精子的遗传物质是关键。可用于灭活精子遗传物质的方法包括x射线、Y射线、紫外线等射线照射。到目前为止，曾用X射线处理鱼类精子的有R.Lasher和R.Rugh(1962)、Romashov(1963)、Golovinskaya(1963)、Stanley(1974)和Cherfas(1975)等报道；曾用Y射线处理鱼类精子的有Purdom(1969)、Nagy等(1978)、Chourrout(1980,1984)和Refstie(1982)等报道；用紫外线处理鱼类精子的有Nace(1970)、Chourrount(1982)、Onozato和Yamaha(1983)、Shelton(1989)、Christensen和Tiersch(1994)等报道。紫外线具有安全、廉价和操作简便的优点，但由于穿透力很差，往往不能灭活全部精子，所获得的后代鱼中，除雌核发育鱼外，还有正常授精的鱼，干扰了结果的分析及其应用，同时紫外线灭活精子时，需要事先用稀释液将精液进行稀释，致使精子活力降低且存活时间縮短，诱导雌核发育的效率低且重复性较差。Y射线穿透力很强，精液不需要稀释，对精子遗传物质具有很强的灭活效果，但正是由于其超强的穿透力，Y射线源需要放置在专门建造的深井中，并且需要非常严格的配套防护设备，费用昂贵，无法大规模推广应用。X射线的穿透力介于Y射线和紫外线之间，精液不需要稀释，完全能满足灭活精子的要求，与此同时，X射线的防护相较于Y射线简单，几毫米厚的铅板就能够阻挡住，因此X射线应用于人工诱导雌核发育具有显著的优势。据文献报道，1913年，X射线首次被应用于处理鱼类精子，至上世纪80年代，X射线在鱼类诱变育种方面的应用也有报道，虽发现X射线可用于灭活和诱变遗传物质，但均属于初步的定性研究，缺乏系统和深入的研究，没有确定灭活鱼类精子的最佳照射条件和最佳照射剂量。特别是上世纪80年代至今，未见X射线应用于鱼类研究的报道，有关研究停顿了近30年，致使X射线在鱼类中的应用停滞不前。在此背景下，本发明人对X射线的照射剂量进行了系统的研究，确定了灭活鱼类精子的最佳照射剂量，建立了应用X射线灭活鱼类精子遗传物质的方法，填补了近30年来X射线在鱼类遗传育种研究领域应用的空白。
发明内容本发明的目的在于提供一种应用X射线灭活鱼类精子遗传物质的方法，在保持精子授精功能的前提下，实现对鱼类精子遗传物质的高效灭活。本发明的目的是通过以下技术方案实现的提供一种应用X射线灭活鱼类精子遗传物质的方法，鱼类精液量为0.51.5ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管，X射线强度为100kV-5mA，照射时间为5080分钟，照射距离为5~15cm。所述照射时间优选为50~60分钟。所述照射时间更优选为60分钟。所述照射距离优选为10cm。所述的灭活鱼类精子遗传物质的方法的最优选方案为鱼类精子量为1.5ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管，X射线强度为100kV-5mA，照射时间为60分钟，并且照射距离为10cm。本发明还提供所述的应用X射线灭活鱼类精子遗传物质方法在淡水鱼类遗传育种中的应用，所述淡水鱼类为鲤鱼、锦鲤或金鱼等淡水鱼类。正常两性繁殖鱼类其成熟的卵子一般处于第二次成熟分裂中期，所以用遗传失活的精子激发的卵子将发育为单倍体。选择一个合适的X射线照射剂量使精子染色体完全失活而不影响其授精能力是得到雌核发育单倍体胚胎的关键。X射线对精子DNA具有很强的损伤效应，X射线属于电离辐射线，它辐射致使精子染色体遗传失活的原理在于，它能够诱发染色体断裂，导致DNA结构的损伤，如DNA单链断裂(SSB)、DNA双链断裂(DSB)、碱基的化学修饰(SCA)、产生缺嘌呤位点(APS)、DNA-蛋白质交联(DPC)、DNA-DNA交联(DDC)等等多种损伤，从而影响DNA的正常复制和转录。人工诱导鱼类雌核发育技术中，精子遗传物质失活彻底与否，直接影响到雌核发育的成功与否，因而建立良好的灭活精子遗传物质的方法，是实现雌核发育的关键。本发明应用X射线灭活鱼类精子遗传物质的方法，在确保鱼类精子DNA完全失活的同时不影响其授精能力，在两方面都达到了显著效果，有以下实验为证本实验选择我国广泛养殖的建鲤(CyprinuscarpioVarJian)作为实验对象，利用本发明灭活鱼类精子遗传物质的方法诱导其雌核发育，然后观察并记录胚4胎发育状况。实验方法包括1.选择亲鱼选取体格健壮，外无损伤，轻压腹部有精液流出的建鲤成熟雄鱼；选取体格健壮，外无损伤，腹部膨大而松软，两侧卵巢轮廓明显，生殖孔微红的建鲤成熟雌鱼。2.采集精液先用干净的毛巾将雄鱼生殖孔周围的水擦干，轻压腹部两侧，迫使精液流出，用干燥洁净的吸管将精液吸出，并放入1.5ml的Eppendorf离心管，盖紧盖子并用腊膜密封。精液要求无水，无血，无尿，乳白色，遇水后即迅速散开。3.照射精液将精液均匀分成4份，分别装入4个Eppendorf离心管中，并将离心管放在盛有冰水混合物的培养皿中，然后将培养皿放入X射线辐照机中进行照射，其中，X射线强度为100kV-5mA，照射时间分别为50、60、70和80分钟，源距为10cm。4.催产雌鱼人工催产挑选出的雌鱼，其中鲤脑垂体2g/kg,促排卵素2号(杭州动物药品厂)和絨毛膜促性腺素(杭州动物药品厂)按说明书推荐剂量使用。5.授精与孵化采用干法授精，选取己催产、轻压腹部有卵子流出的雌鱼，将鱼卵挤入一干燥的小瓷盆中，再将鱼卵按称重法平均分成4份，将不同照射时间的精液，分别与之混合，并用羽毛将卵与精液充分混合，然后均匀地洒在网片上，放入盛有暴汽水的水族箱(有效容积40L)中孵化。水温控制在2527'C，全天充气增氧，每天换水1/3。6.观察统计在水温2527X:孵化，受精12小时，统计各组的受精卵数以及授精率，并在鱼苗孵出期统计总苗数、正常鱼苗数和畸形鱼苗数，计算各组的出苗率、正常苗率和畸形苗率，结果见表l。表1.应用本发明灭活方法处理鱼类精子的授精孵化结果注:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>授精率=启动卵裂的卵子数/受精卵总数*100%，出苗率=出苗总数/受精卵总数*100%，畸形率=畸形苗数/出苗总数*100%,正常率=正常苗数/出苗总数*100%。由表1的数据结果可以看出，本发明方法处理过的建鲤精子授精率达到95%以上，在授精孵化后，出苗率最高可达4.32%，且100%为畸形，使建鲤精子遗传物质高效灭活的同时仍能保持很高的授精率。同样照射强度下，如果照射时间少于50min，则X射线剂量不足，精子灭活不彻底，有部分精子的遗传物质没有受到破坏，导致后代中出现正常鱼苗，严重干扰雌核发育鱼的鉴别、分析和应用；如果照射时间在80min以上，贝U由于剂量过大，导致精子不仅遗传物质被破坏，同时授精等生理功能也遭到不同程度破坏，不能实现本发明的效果。总之，本发明的方法在确保精子授精功能的前提下，实现了对鱼类精子遗传物质的高效灭活。与现有技术相比，本发明方法的优点还在于X射线的相关参数可完全人工控制，可控性强，重复性高，结果稳定，灭活效果好，同时可大批量灭活精子，应用前景广阔。具体实施例方式下面通过具体实施例进一步对本发明作详细说明，但本发明不局限于下列实施例。实施例11.选择鱼种选取体格健壮，外无损伤，轻挤压腹部有精液自动流出的雄性建鲤。2.采集精液先用干净的毛巾将雄鱼生殖孔周围的水擦干，轻挤压鱼腹部两侧，迫使精液流出，用干燥洁净的吸管将精液吸出1.5ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管。精液要求无水，无血，无尿，乳白色，遇水后即迅速散开。3.精液遗传物质灭活处理将离心管放在盛有冰水混合物的培养皿中，然后将培养皿放入X射线辐照机中进行照射，强度100kV-5mA，源距5cm，照射时间为50分钟。将照射完的精液于4'C冰箱中保存备用。4.经过使用上述步骤3得到的精子与建鲤卵子进行常规授精与孵化后发现，其出苗率为0.23%，正常鱼苗率为0，畸形鱼苗率为100%。实施例21.选择鱼种选取体格健壮，外无损伤，轻挤压腹部有精液自动流出的成熟雄金鱼。2.采集精液先用干净的毛巾将雄鱼生殖孔周围的水擦干，轻挤压鱼腹部两侧，迫使精液流出，用干燥洁净的吸管将精液吸出0.5ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管。精液要求无水，无血，无尿，乳白色遇水后即迅速散开。3.精液遗传物质灭活处理将离心管放在盛有冰水混合物的培养皿中，然后将培养皿放入X射线辐照机中进行照射，强度100kV-5mA，源距10cm，照射时间为60分钟。将照射完的精液于4'C冰箱中保存备用。4.经过使用上述步骤3得到的精子与金鱼卵子进行常规授精与孵化后发现，其出苗率为6.54%，正常鱼苗率为0，畸形鱼苗率为100%。实施例31.选择鱼种选取体格健壮，外无损伤，轻挤压腹部有精液自动流出的成熟雄锦鲤。2.采集精液先用干净的毛巾将雄鱼生殖孔周围的水擦干，轻挤压鱼腹部两侧，迫使精液流出，用干燥洁净的吸管将精液吸出lml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管。精液要求无水，无血，无尿，乳白色遇水后即迅速散开。3.精液遗传物质灭活处理将离心管放在盛有冰水混合物的培养皿中，然后将培养皿放入X射线辐照机中进行照射，强度100kV-5mA，源距10cm，照射时间为70分钟。将照射完的精液于4'C冰箱中保存备用。4.经过使用上述步骤3得到的精子与锦鲤卵子进行常规授精与孵化后发现，其出苗率为2.43%，正常鱼苗率为O，畸形鱼苗率为100%。实施例41.选择鱼种选取体格健壮，外无损伤，轻挤压腹部有精液自动流出的成熟雄金鱼。2.采集精液先用干净的毛巾将雄鱼生殖孔周围的水擦干，轻挤压鱼腹部两侧，迫使精液流出，用干燥洁净的吸管将精液吸出0.8ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管。精液要求无水，无血，无尿，乳白色遇水后即迅速散开。3.精液遗传物质灭活处理将离心管放在盛有冰水混合物的培养皿中，然后将培养皿放入X射线辐照机中进行照射，强度100kV-5mA，源距15cm，照射时间为80分钟。将照射完的精液于4t冰箱中保存备用。4.经过使用上述步骤3得到的精子与金鱼卵子进行常规授精与孵化后发现，其出苗率为0.39%,正常鱼苗率为0，畸形鱼苗率为100%。权利要求1.一种应用X射线灭活鱼类精子遗传物质的方法，是用X射线照射人工采集的鱼类精液，其特征在于鱼类精液量为0.5～1.5ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管；X射线强度为100kV-5mA；照射时间为50～80分钟；照射距离为5～15cm。2.权利要求1所述的灭活鱼类精子遗传物质的方法，其特征在于所述照射时间为50~60分钟。3.权利要求2所述的灭活鱼类精子遗传物质的方法，其特征在于所述照射时间为60分钟。4.权利要求1所述的灭活鱼类精子遗传物质的方法，其特征在于所述照射距离为10cm。5.权利要求1所述的灭活鱼类精子遗传物质的方法，其特征在于鱼类精子量为1.5ml,盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管；X射线强度为100kV-5mA;照射时间为60分钟；照射距离为10cm。6.权利要求1所述的应用X射线灭活鱼类精子遗传物质方法在淡水鱼类遗传育种中的应用。7.权利要求6所述的应用，其特征在于所述淡水鱼类为鲤鱼、锦鲤、金鱼。全文摘要本发明涉及一种应用X射线灭活鱼类精子遗传物质的方法，是用X射线照射人工采集的鱼类精液，其中，鱼类精液量为0.5～1.5ml，盛放于1.5ml透明聚丙烯Eppendorf离心管；X射线强度为100kV-5mA；照射时间为50～80分钟；照射距离为5～15cm。本发明的方法在保持精子授精功能的前提下，实现了对鱼类精子遗传物质的高效灭活。本发明还涉及所述应用X射线灭活鱼类精子遗传物质的方法在淡水鱼类遗传育种中的应用。文档编号A61K35/48GK101468041SQ20071030209公开日2009年7月1日申请日期2007年12月24日优先权日2007年12月24日发明者何新龙,傅洪拓,滟吴,熊贻伟,王晓娟,蒋速飞,龚永生申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心