选择性vpac2受体肽激动剂的制作方法

专利名称：：选择性vpac2受体肽激动剂的制作方法选择性VPAC2受体肽激动剂本发明涉及选择性VPAC2受体肽激动剂。特别地，本发明涉及环状选择性VPAC2受体肽激动剂。II型糖尿病，或者非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)是最常见的糖尿病形式，影响90%的糖尿病患者。NIDDM患者具有受损的P细胞功能，导致胰岛素产生不足和/或降低的胰岛素敏感性。如果不控制NIDDM，过量的葡萄糖将累积在血液中，导致高血糖症。随着时间的推移，可能引发更严重的并发症，包括肾功能障碍、心血管问题、视力丧失、下肢溃疡、神经病和局部缺血。NIDDM的治疗包括改善々大食、锻炼、控制体重以及寸吏用多种口服药物。NIDDM个体最初可以通过月良用这些口月良药物而控制其血糖水平。然而，这些药物不能减緩在NIDDM患者中发生的P细胞功能的累进性损失，因此这些药物不足以控制疾病较后阶段的血糖水平。而且，使用目前可获得的药物的治疗使得NIDDM患者面临潜在的副作用，例如低血糖、胃肠问题、液体潴留、水肿和/或体重增加。垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)和血管活性肠肽(VIP)属于与促胰液素和胰高血糖素相同的肽家族。PACAP和VIP通过三个G蛋白偶联的受体起作用，该受体通过cAMP介导的和其它C介导的信号转导通路发挥它们的功能。这些受体已知为PACAP-优选的I型(PAC1)受体(Isobe等人，Regul.Pept.，110:213-217(2003);Ogi等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，196:1511-1521(1993))和两个VIP共有(VIP-shared)的II型受体(VPAC1和VPAC2)(Sherwood等人，Endocr.Rev.，21:619-670(2000);Hammar等人，PharmacolRev，50:265-270(1998);Couvineau等人，J.Biol.Chem.，278:24759-24766(2003);Sreedharan等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，193:546-553(1993);Lutz等人，FEBSLett.，458:197-203(1999);Adamou等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，209:385-392(1995))。一系列PACAP类似物公开在US6,242,563和WO2000/05260中。对于所有三种受体，PACAP具有同等的活性，而VIP选择性激活两种VPAC受体(Tsutsumi等人，Diabetes,51:1453-1460(2002))。已经证明当由静脉内给予时，VIP(Eriksson等人，Peptides,10:481-484(1989))和PACAP(Filipsson等人，JCEM,82:3093-3098(1997))都不仅刺激人类的胰岛素分泌，而且增加胰高血糖素分泌和肝葡萄糖的排出量。结果，PACAP或VIP刺激一般不导致糖血的净改善。通过PACAP或VIP的多个受体的激活也具有对神经、内分泌、心血管、生殖、肌肉和免疫系统的广泛的生理效应(Gozes等人，Curr.Med.Chem.,6:1019-1034(1999))。另夕卜，大鼠中VIP诱导的水泻看起来仅仅是通过VPAC受体之一VPACl介导的(Ito等人，Peptides,22:1139-1151(2001);Tsutsumi等人，Diabetes,51:1453-1460(2002))。另夕卜，VPACl和PACl受体在ot细胞和肝细胞上表达，并且因此最有可能参与对肝葡萄糖排出量的作用。从希拉毒蜥(GilaMonster,HelodermaSuspectum)的唾液分泌物中发现毒蜥外泌肽4(Eng等人，J.Biol.Chem.，267(11):7402-7405(1992))。其是39个氨基酸的肽，并且具有葡萄糖依赖的促胰岛素分泌活性。特定的加入聚乙二醇的毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽激动剂肽公开在WO2000/66629中。从研究线性VIP类似物的结构和蛋白水解剪切获得的信息已经用于合成和开发环状VIP类似物(Bolin等人，Biopolymers(PeptideScience),37:57-66(1995)和Bolin等人，DrugDesignandDiscovery,13:107-114(1996))。US5677419和EP0536741(Hoffmann-LaRocheInc.)公开了一系列环状VIP类似物，其用于治疗哮喘。从四个保护的肽片段合成环状(Hoffmann-LaRocheInc.)中。一个特定的称为RO15-1392的环状VIP类似物已经被证明是选择性VPAC2受体激动剂(Bolin等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,281(2):629-633(1997))。另夕卜，环状VIP类似物用作开发VPAC2受体肽拮抗剂的起始物(Moreno等人，Peptides,21:1543-1549(2000))。最近的研究表明选择性针对VPAC2受体的肽能够刺激胰岛素从胰腺分泌而没有胃肠(GI)副作用，并且也不增加胰高血糖素释放和肝葡萄糖排出量(Tsutsumi等人，Diabetes,51:1453-1460(2002))。选择性针对VPAC2受体的肽最初通过修饰VIP和/或PACAP而被鉴定(参见，例如，Xia等人，JPharmacolExpTher.，281:629-633(1997);Tsuts腿i等人,Diabetes,51:1453-1460(2002);WO01/23420;WO2004/006839)。然而，目前报道的许多VPAC2受体肽激动剂具有比所期望的小的效能、选择性和稳定性特性，这将阻碍其临床应用。另外，由于这些肽中的许多存在制剂中多肽所相关的稳定性问题，以及这些多肽在体内短的半衰期问题，使得其不适合用于商业目的。因此，存在寻求新疗法的需求，该疗法可以克服与目前用于NIDDM的药物相关的问题。本发明致力于提供选择性针对VPAC2受体的改善的化合物，其诱导胰岛素仅仅在高血糖水平的情况下从胰腺分泌。本发明的化合物是肽，其^皮认为也改善了P细胞的功能。这些肽可以具有诱导胰岛素分泌而没有GI副作用或者没有相应的肝葡萄糖排出量增加的生理效应，并且相比较于已知的VPAC2受体肽激动剂，一般地也具有提高的肽的选择性、效能和/或体内稳定性。本发明特别地致力于提供相比较于线性VPAC2受体肽激动剂，具有增加的选择性、效能和/或稳定性的环状VPAC2受体肽激动剂。根据本发明的第一个方面，提供了包含下述氨基酸序列的环状VPAC2受体肽激动剂<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>根据本发明的第二个方面，提供了药物组合物，其包含本发明的环状VPAC2受体肽激动剂和一种或者多种可药用稀释剂、载体和/或赋形剂。根据本发明的第三个方面，提供了用作药物的本发明的环状VPAC2受体肽激动剂。根据本发明的第四个方面，提供了本发明的环状VPAC2受体肽激动剂，其用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病或者胰岛素依赖型糖尿病，或者用于抑制食物摄入。根据本发明的第五个方面，提供了本发明的环状VPAC2受体肽激动剂在制备用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病或者胰岛素依赖型糖尿病，或者抑制食物摄入的药物中的用途。根据本发明的另一个方面，提供了治疗需要其的患者的非胰岛素依赖型糖尿病或者胰岛素依赖型糖尿病、或者抑制食物摄入的方法，包括施用有效量的本发明环状VPAC2受体肽激动剂。根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病或者胰岛素依赖型糖尿病，或者抑制食物摄入的含有本发明环状VPAC2受体肽激动剂的药物组合物。本发明的VPAC2受体肽激动剂具有如下优势，即相比已知VPAC2受体肽激动剂具有增强的选择性、效能和/或稳定性。作为c-帽化序列而加了VPAC2受体的选择性以及增加了蛋白水解稳定性。特别地，环状VPAC2受体肽激动剂与小冲等大小的线性VPAC2受体肽激动剂相比具有受限制的构象灵活性，并且由于这个原因，环状肽比线性肽具有较少量的被允许的构象。通过环化作用限制线性肽构象的灵活性相比较于线性肽增强了受体结合亲和性，增加了选择性并且改善了蛋白水解稳定性以及生物利用率。本发明的环状VPAC2受体肽激动剂可以是加入聚乙二醇的。聚乙二醇化是将一个或者多个聚乙二醇(PEG)分子或者其衍生物共价连接到VPAC2受体肽激动剂的特定残基上。例如，PEG分子可以连接到肽激动剂中的赖氨酸上。术语"VPAC2"用于指本发明的激动剂激活的特定受体(Lutz等人，FEBSLett.，458:197-203(1999);Adamou等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,209:385-392(1995))。这个术语也用于指本发明的激动剂。本发明的"选择性VPAC2受体肽激动剂"或者"VPAC2受体肽激动剂"是选择性激活VPAC2受体以诱导胰岛素分泌的肽。优选地，选择性VPAC2受体肽激动剂的序列具有28个天然发生的和/或非天然发生的氨基酸并且还包括C末端延伸序列(extension)。"选择性环状VPAC2受体肽激动剂"或者"环状VPAC2受体肽激动剂"是通过肽链中两个氨基酸侧链的共价键连接环化的选择性VPAC2受体肽激动剂。该共价键可以例如是内酰胺键或者二硫键。本文使用的术语"内酰胺键"指连接肽激动剂中一个氨基酸的側链氨基端和肽激动剂中另一个氨基酸的侧链羧基端的共价键，特别是酰胺键。内酰胺键可以通过共价连接Xaa。位残基的侧链和Xaa^4位残基的侧链而形成，其中n是l至28。内酰胺键可以通过共价连接Lys，Orn或Dab残基的侧链氨基端和Asp或Glu残基的侧链羧基端而形成。P403具有内酰胺键，其通过共价连接21位Orn残基的侧链氨基末端和25位Glu残基的侧链羧基末端而形成。本文使用的术语"二疏键"指连接肽激动剂中一个氨基酸的侧链末端上的硫原子和肽激动剂中另一个氨基酸的侧链末端上的疏原子的共价键。二硫键可以通过共价连接XaaJ立残基的侧链和Xaa^4位残基的侧链而形成，其中n是1至28。二硫键可以通过共价连接Cys或hC残基的侧链和另一个Cys或hC残基的侧链而形成。本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂具有C末端延伸序列。"C末端延伸序列，，可以包括具有一个至十三个天然发生的或者非天然发生的氨基酸的序列，在该C末端延伸序列的N末端通过肽键连接到肽序列的C末端。C末端延伸序列中的任何Cys，Lys，K(W)或K(CO(CH2)2SH)残基可以被共价连接PEG分子，和/或C末端延伸序列的羧基末端氨基酸可以被共价连接PEG分子。P403的C末端延伸序列是GGPSSGAPPPS(SEQIDNO:7)。如本文所使用的，涉及术语C末端延伸序列的术语"连接到"包括直接添加或者附加氨基酸或者化学基团到肽序列的C末端上。本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂含有N末端修饰。P403的N末端修饰是添加己酰基团。N末端修饰的其它例子在下文公开。本文使用的术语"N末端修饰"包括直接向肽的N末端添加或者附加氨基酸或者化学基团，以及形成化学基团，其在肽的N末端掺入氮原子。N末端修饰可以包含添加一个或者多个天然发生或者非天然发生氨基酸到VPAC2受体肽激动剂序列，优选不超过十个氨基酸，更优选是一个氨基酸。可以被添加到N末端的天然发生的氨基酸包括甲硫氨酸和异亮氨酸。被添加到N末端的修饰的氨基酸可以是D-组氨酸。作为备选，下述氨基酸可以,皮添加到N末端SEQIDNO:5Ser-Trp-Cys-Glu-Pro-Gly-Trp-Cys-Arg，其中将Arg连接到肽激动剂的N末端。优选地，任何被添加到N末端的氨基酸通过肽键而被连接到N末端。如本文所使用的，涉及术语N末端修饰的术语"连接到"包括直接添加或者附加氨基酸或者化学基团到VPAC2受体激动剂的N末端。上述N末端修饰的添加可以在用于肽键形成的正常偶联条件下完成。肽激动剂的N末端也可以通过添加烷基(R)，优选C广d6烷基以形成(R)NH-而被修饰。作为备选，肽激动剂的N末端也可以通过添加式-C(O)R1所示的基团以形成如式！^C(0)NH-所示的酰胺而被修饰。式-C(O)R1所示的基团的添加可以通过与式R"COOH所示的有机酸反应而完成。本领域描述了使用酰化修饰氨基紗列的N末端(例如Gozes等人，J.PharmacolExpThen273:161-167(1995))。式-C(O)R1所示的基团的添加可以导致在N末端形成尿素基团(参见WO01/23240，WO2004/006839)或者氨基甲酸酯基团。通过添加焦谷氨酸或6-氨基己酸也可以修饰N末端。肽激动剂的N末端也可以通过添加式-S02R5所示的基团以在N末端形成氨磺酰基团而被修饰,胺基团而被修饰。该琥珀酰亚胺在肽的N末端掺入氮。作为备选，N末端也可以通过添加甲疏氨酸亚砜，生物素基-6-氨基己酸或—C(=NH)-NH2而被修饰。添加-C(-NH)隱NH2是胍化(guanidation)修饰，其中N末端氨基酸的NH2末端变成-NH-C(-NH)-NH2。本发明的大多数的序列(包括N末端修饰和C末端延伸序列)含有二十种天然发生氨基酸的标准单字母或者三字母编码。本文使用的其它编码如下定义C6=己酰Aib=氨基异丁酸OMe-甲氧基Nle=正亮氨酸Orn=鸟氨酸K(CO(CH2)2SH)=s-(3，-巯基丙酰)-赖氨酸K(W)=s-(L-色氨酰)-赖氨酸Dab-二氨基丁酸hC二高半胱氨酸PEG=聚乙二醇I——I=内酰胺键或者二硫键。VIP作为含有28个氨基酸的单一序列天然发生。然而，PACAP以38个氨基酸肽(PACAP-38)或者具有酰胺化羧基的27个氨基酸肽(PACAP-27)的形式存在(Miyata等人，BiochemBiophysResCommun，170:643648(1990))。VIP,PACAP-27和PACAP-38的序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本文使用的术语"天然发生的氨基酸，，指由人类遗传密码编码的二十种氨基酸(即二十种标准的氨基酸)。这二十种氨基酸是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。"非天然发生的氨基酸"的例子包括合成的氨基酸和那些被身体修饰的氨基酸。这些包括D-氨基酸、精氨酸样氨基酸(例如高精氨酸)和其它在侧链具有额外的亚甲基的氨基酸("高，，氨基酸)，以及修饰的氨基酸(例如正亮氨酸，赖氨酸(异丙基)，其中赖氨酸的侧链胺被异丙基修饰)。还包括例如鸟氨酸，氨基异丁酸和2-氨基丁酸的氨基酸。本文使用的"选择性"指VPAC2受体肽激动剂相比较于其它已知的受体具有对VPAC2受体的增加的选择性。选择性的程度通过VPAC2受体结合亲和性与VPAC1受体结合亲和性的比率确定，或者通过VPAC2受体结合亲和性与PAC1受体结合亲和性的比率确定。结合亲和性以下文实施例4中所述进行测定。"促胰岛素活性(Insulinotropicactivity)"指响应提高的葡萄糖水平而刺激胰岛素分泌，因此引起细胞摄取葡萄糖并且降低血浆葡萄糖水平的能力。可以使用本领域已知的方法检测促胰岛素活性，包括使用检测VPAC2受体结合活性或者受体活化的实验(例如通过胰岛素瘤细胞系或者胰岛的胰岛素分泌，静脉内葡萄糖耐量试验(IVGTT)，腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)和口服葡萄糖耐量试验(OGTT))。促胰岛素活性在人类中通过检测胰岛素水平或者C肽水平常规地检测。本发明的选择性VPAC2受体肽激动剂具有促胰岛素活性。本文使用的"体外效能"指在基于细胞的测定中，肽激活VPAC2受体的能力的度量。体外效能表述为"ECso"，其是在单一剂量响应实验中，导致活性最大增加值的50%的化合物的有效浓度。为了本发明的目的，使用两个不同的测定法检测体外效能DiscoveRx和ct篩选(AlphaScreen)。这些测定法的详细描述参见实施例3和5。尽管这些测定法以不同的方式实施，但是结果证明在这两个测定法之间具有一般相关性。术语"血浆半衰期"指相关分子的一半被清除之前在血浆中循环的时间。作为备选使用的术语是"清除半衰期"。血浆半衰期或者清除半衰期中使用的术语"延长的"或者"加长的，，指在相当的条件下所测定的，聚乙二醇化的VPAC2受体肽激动剂的半衰期相对于参考分子(例如肽的非聚乙二醇化的形式或者天然肽)的半衰期具有统计学上的显著增加。本领域技术人员将理解半衰期是衍生的参数，其作为清除率和分布体积两者的函数而改变。清除率是身体清除药物的能力的度量。当由于例如药物的修饰而使清除率降低时，半衰期将被预料到增加。然而，仅仅当分布的体积没有改变时，这种互反关系才是确切的。终端记录-线性半衰期(terminallog-linearhalf-life)(t1/0、清除率(C)和分布体积(V)之间的有用的近似关系在下述等式^2-0.693(V/C)中给出。清除率不是指多少药物被清除，而是更确切地指为解决清除将不得不完全没有药物的生物液体(例如血液或者血浆)的体积。清除率表述为每单位时间的体积。本文使用的"序列同一性的百分数(％)"用于表示当比对时，在相似的位置或者区域具有相似(相同或者保守替代)氨基酸的序列，其中相同或者保守替代氨基酸是指当与初始蛋白质比较时，那些不改变蛋白质的活性或者功能的氨基酸。例如，彼此具有至少85%同一性的两个氨基酸序列是当进行允许最多3个缺口的最佳比对时，在相似位置具有至少85%的相似性(相同或者保守替代残基)的序列，条件是关于缺口，涉及总数不超过15个氨基酸残基。本文用于序列同一性百分数计算的参考肽是激动剂#SEQIDNO:序列P576C6國HSDAVFTENY(OMe)TKLRKQNleAAKKYLNDLKKGGPSSGAPPPSI-1序列同一性的百分数可以通过如下步骤进行计算确定在本发明包括的肽和参考肽(例如P57(SEQIDNO:6))之间不同的残基数目，获取该数目并且用参考肽的氨基酸数目(例如对于P57是39个氨基酸)去除该数目，结果乘以100，并且然后从100中减去所获得的数字。例如，具有4个不同于P57的氨基酸的39个氨基酸序列，其序列同一性的百分数(％)是90o/o(例如100-((4/39)x100))。对于长度超过39个氨基酸的序列，为了上述的计算，不同于P57序列的残基数目将包括超过39的额外的氨基酸数。例如，具有41个氨基酸的序列，其具有4个不同于P57序列的39个氨基酸的氨基酸和两个在羧基端的额外氨基酸(其不存在于P57序列中)，将一共具有6个不同于P57的氨基酸。因此，该序列将具有的序列同一性百分数是84%(例如100-((6/39)x100))。序列同一性的程度可以使用本领域所熟知的方法进行测定(参见，例如，Wilbur,W.J.和Lipman，D.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:726-730(1983)和MyersE.和MillerW.，Comput.Appl.Biosci.4:11-17(1988))。在测定相似性程度中可以使用的一个禾呈序是MegAlignLipman-Pearson—对方法(onepairmethod)(使用缺省参数)，其可以作为Lasergene系统的一部分从DNAstarInc，1128，SelfparkStreet,Madison,Wisconsin,53715，USA获得。可以使用的另一个程序是ClustalW。这是由Thompson等人(NucleicAcidsResearch,22(22):4673-4680(1994))开发的用于DNA或者蛋白质序列的多序列比对软件包。这个工具可用于进行相关序列的物种间比较并观察序列的保守性。ClustalW是针对DNA或者蛋白质的综合目的的多重序列比对程序。其产生趋异序列的有生物学意义的多重序列比对。其计算选定序列的最佳匹配，并将它们排列起来，以便可以观察到同一性、相似性和差异性。通过观察进化树或者系统发生树可以看到进化关系。选择性的环状VPAC2受体肽激动剂是对VPAC2受体具有选择性的，并且可以与P57(SEQIDNO:6)具有范围为60%至70%，60%至65%,65%至70%,70%至80%，70%至75%，75%至80%，80%至卯％，80%至85%，85%至90%，90%至97%，卯％至95%或95%至97%的序列同一性。P403与P57具有85%的序列同一性。本文使用的术语"PEG"指聚乙二醇分子。在其典型的形式中，PEG是具有末端羟基的线性聚合物，并且具有式HO-CH2CH2-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH的结构，其中n从大约8至大约4000。末端羟基可以被保护基团(例如烷基或者链烷醇基团)所取代。优选地，PEG具有至少一个羟基，更优选其是末端羟基。正是这个羟基被优选激活以与肽反应。在本领域存在PEG的多种衍生物(参见，例如，美国专利号5,445,090;5，900，461;5,932,462;6，436，386;6,448,369;6,437,025;6，448，369;6,495,659;6，515，100和6,514,491和Zalipsky，S.BioconjugateChem.6:150-165,1995)。PEG分子的分子量优选从500-100,000道尔顿。PEG可以是线性的或者分枝的，并且PEG化的VPAC2受体肽激动剂可以具有连接到肽的一个、两个或者三个PEG分子。更优选每个PEG化的VPAC2受体肽激动剂具有一个或者两个PEG分子。还设想PEG分子的两个末端是同或者异官能化的，用于将两个或者多个VPAC2受体肽激动剂交联在一起。在本发明中，PEG分子可以共价连接到P403的赖氨酸残基上。肽激动剂中的任何Lys可以被K(W)或K(CO(CH2)2SH)取代，然后其可以被PEG化。K(W)是偶联到Lys残基侧链上的Trp残基，并且它通过共价连接PEG分子到Trp残基上而被PEG化。K(CO(CH2)2SH)基团被PEG化以形成K(CO(CH2)2S-PEG)。本文使用的术语"PEG化"指共价连接如上所述的一个或者多个PEG分子到VPAC2受体肽激动剂上。野生型VIP从位置8的天冬氨酸到位置26的异亮氨酸的区域具有oc螺旋结构。肽的增加的螺旋含量增强了肽的效能和选择性，并且同时提高了对酶降解的保护。使用c末端延伸序列(例如毒蜥外泌肽4的延伸序列)可以增加肽的螺旋度。另外，共价键(例如内酰胺键)的引入也可以增加肽的螺旋度，其中该共价键连接螺旋表面上的两个氨基酸的侧链。蛋白质的PEG化可以克服与使用肽或者蛋白质作为治疗剂相关的许多药理学和毒理学/免疫学问题。然而，对于任何个别的肽而言，不确定肽损失。-、、、,、'、、PEG化蛋白质的生物活性可以被下述因素影响，例如i)PEG分子的大小；ii)连接的特定位点；iii)修饰的程度；iv)不利的偶联条件；v)是否接头用于连接或者是否该聚合物被直接连接；vi)有害共产物的产生；vii)由活化的聚合物施加的损害；或者viii)电荷的滞留。例如对细胞因子的PEG化进行的工作证明PEG化可以具有的影响。取决于使用的偶联反应，细胞因子的聚合物修饰导致生物活性的显著降低Francis，G.E.等人，(1998)细胞因子和其它治疗蛋白质和肽的PEG化偶联^L术的生物学最优化的重要性(PEGylationofcytokinesandothertherapeuticproteinsandpeptides:theimportanceofbiologicaloptimizationofcouplingtechniques)，Intl.J.Hem.68:1-18]。维持PEG化肽的生物活性甚至比维持蛋白质的生物活性更有问题。由于肽比蛋白质小，通过PEG化的修饰可以潜在地在生物活性方面具有更大的影响。本发明的VPAC2受体肽激动剂可以通过共价连接聚乙二醇(PEG)的一个分子而被修饰，并且由于较慢的蛋白水解降解和肾清除率，而可以具有改善的药物代谢动力学图谱。连接PEG分子(PEG化)将增加VPAC2受体肽激动剂的表观大小，因此降低肾滤过并且改变生物分布。PEG化可以遮蔽VPAC2受体肽激动剂的抗原表位，因此降低网状内皮的清除和被免疫系统识别，并也降低蛋白水解酶(例如DPP-IV)的降解。将PEG分子共价连接到小的生物活性VPAC2受体肽激动剂上造成了不利地影响激动剂的风险，例如通过去稳定内在的二级结构和生物活性构象，并且降低生物活性，以至于使得激动剂不适合用作治疗剂。然而，当与非PEG化VPAC2受体肽激动剂比较时，VPAC2受体肽激动剂的PEG化可以令人惊讶地导致具有延长的半衰期以及降低的清除率的生物活性的PEG化的VPAC2受体肽激动剂。为了确定在VPAC2受体肽激动剂中潜在的PEG化位点，可以实施丝氨酸扫描。在肽的特定位点上的丝氨酸残基被替代，并且检测丝氨酸修饰肽的效能和选择性。如果丝氨酸替代对效能具有最小的影响，并且丝氨酸修饰肽对VPAC2受体有选择性，那么Ser残基被替代为Cys或Lys残基，其起直接或者间接PEG化位点的作用。残基的间接PEG化是指键合到PEG化位点残基上的化学基团或者残基的PEG化。Lys的间接PEG化包括K(W)和K(CO(CH2)2SH)的PEG化。本发明的VPAC2受体肽激动剂可以共价连接一分子的聚乙二醇(PEG)或者其衍生物。PEG化可以增强该选择性VPAC2受体肽激动剂的半衰期，导致PEG化VPAC2受体肽激动剂的清除半衰期至少为1小时，优选至少为3,5，7，10，15，20或24小时，并且最优选至少为48小时。PEG化VPAC2受体肽激动剂优选具有200mL/h/kg或者更小的清除率，更优选180，150,120，100，80,60mL/h/kg或者更小的清除率，最优选小于50，40或20mL/h/kg的清除率。本发明包括如下发现添加到VPAC2受体肽激动剂的肽序列C末端的特定氨基酸可以保护该肽，并且可以增强其活性、选择性和/或效能。例如，这些C末端延伸序列可以稳定肽的螺旋结构并且稳定位于C末端邻近的易于被酶剪切的位点。另外，本文公开的许多C末端延伸的肽可以比VIP，PACAP和其它已知的VPAC2受体肽激动剂对VPAC2受体更具有选择性，并且更具有效能。优选的C末端延伸序列的实例是毒蜥外泌肽4的延伸肽GGPSSGAPPPS。此毒蜥外泌肽4的C末端延伸序列是P403的C末端延伸序列。毒蜥外泌肽4发现于希拉毒蜥的唾液分泌物中(Eng等人，J.Biol.Chem.，267(11):7402-7405(1992))。其它C末端延伸序列的实例是毒蜥皮肽和毒蜥肽的C末端序列。毒蜥皮肽和毒蜥肽也发现于希拉毒蜥的唾液分泌物中。另夕卜，还发现VPAC2受体肽激动剂的N末端的修饰可以增强效能和/或提供对抗DPP-IV剪切的稳定性。VIP和一些已知的VPAC2受体肽激动剂对多种酶剪切是敏感的，并且因此在体内具有短的半衰期。VPAC2受体肽激动剂中多种酶剪切位点在下文讨论。该剪切位点相对于VIP(SEQIDNO:2)中的氨基酸位置进行讨论，并且可以应用于本文提到的其它序列。由二肽基-肽酶-IV(DPP-IV)对肽激动剂的剪切发生于位置2(VIP中的丝氨酸)和位置3(VIP中的天冬氨酸)之间。通过添加N末端修饰，本发明的化合物可以被赋予在这个区域针对DPP-IV剪切的更好的稳定性。可以提高对抗DPP-IV剪切的稳定性的N末端修饰的实例包括添加乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、曱硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、3-苯基丙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基、正亮氨酸、D-组氨酸、异亮氨酸、3-巯基丙酰基，生物素基-6-氨基己酸或-C(-NH2)-NH2。在野生型VIP中存在位于氨基酸10和11(酪氨酸和苏氨酸)和氨基酸22和23(酪氨酸和亮氨酸)之间的胰凝乳蛋白酶剪切位点。Tyr(OMe)替代酪氨酸可以增加10-11位的稳定性。例如连接21和25位氨基酸侧链的内酰胺键可以保护22-23位不受剪切。在野生型VIP的12和13位氨基酸之间存在胰蛋白酶剪切位点。某些氨基酸(例如12位的鸟氨酸)赋予肽在此位点对剪切较小的敏感性。在野生型VIP和本领域已知的多种VPAC2受体肽激动剂中，存在位于14和15位的碱性氨基酸之间和在20和21位的那些氨基酸之间的剪切位点。由于在这些位点的替代，本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂在体内可以具有增加的抗蛋白水解稳定性。在这些位点优选的替代包括那些赋予肽对类胰蛋白酶(包括胰蛋白酶)剪切较小的敏感性的替代。例如在15位的氨基异丁酸和21位的鸟氨酸是优选的替代，其可以导致提高的稳定性。在野生型VIP的25和26位氨基酸之间也存在剪切位点。包括27、28和29位氨基酸的VPAC2受体肽激动剂的区域也对酶剪切敏感。添加C末端延伸序列可以赋予肽激动剂对抗神经内肽酶(NEP)更好的稳定性，并且也可以提高对VPAC2受体的选择性。此区域也可以被类胰蛋白酶攻击。如果发生这样的情况，额外的羧肽酶活性可以使肽激动剂丟失其C末端延伸序列，并导致肽的失活形式。通过使用鸟氨酸替代27和/或28位的氨基酸可以增加此区域对剪切的抗性。除了具有对多种肽酶剪切的抗性的选择性环状VPAC2受体肽激动剂之外，本发明的选择性环状VPAC2肽受体激动剂还可以包括相比较于本领域已知的一些肽具有增强的对VPAC2受体的选择性，增加的效能和/或增加的稳定性的肽。优选地，本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂具有小于2nM的ECso值。更优选ECs。值小于lnM。甚至更优选，ECso值小于0.5nM。仍然更优选，ECso值小于O.lnM。优选地，本发明的激动剂具有选择性比率(selectivityratio)，其中针对VPAC2受体的亲和性比针对VPAC1和/或PAC1受体的亲和性大至少50倍。更优选地，此针对VPAC2的亲和性比针对VPAC1和/或PAC1的亲和性大至少100倍。甚至更优选，针对VPAC2的亲和性比针对VPAC1和/或PAC1的亲和性大至少200倍。仍然更优选，针对VPAC2的亲和性比针对VPAC1和/或PAC1的亲和性大至少500倍。然而更优选，针对VPAC2的比率比针对VPAC1和/或PAC1的比率大至少1000倍。如本文所使用的，"选择性环状VPAC2受体肽激动剂"也包括本文公开的激动剂的可药用盐。本发明的选择性VPAC2受体肽激动剂可以具有足够的酸性基团、足够的碱性基团或者此两种官能团，并因此与多种无机碱和无机和有机酸的任何一种反应以形成盐。一般使用的形成酸加成盐的酸是无机酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等等)和有机酸(例如对-曱苯磺酸、甲磺酸、草酸、对-溴苯基-磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸、三氟乙酸等等)。这些盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、石充酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐(bisulfite)、磷酸盐、磷酸一氢盐(monohydroge叩hosphate)、磷酸二氩盐、偏鳞酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、不典化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丁炔-l，4-二酸盐、己炔-l，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯曱酸盐、甲基苯曱酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、曱氧基苯曱酸盐、苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲^酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、Y-羟丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-l-磺酸盐，萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等等。碱加成盐包括那些衍生自无机碱的盐，例如铵或者碱金属或者碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等等。用于制备本发明盐的这些碱因此包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等等。本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂优选配制为药物组合物。可以使用标准的药物配制技术，例如那些公开在Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Eastern，PA中的技术。本发明的选择性VPAC2受体肽激动剂可以被配制为口含、局部、口服、经皮、鼻或者肺途径给药，或者胃肠外给药。胃肠外给药可以包括例如全身性给药，例如通过肌内、静脉内、皮下、真皮内或者腹膜内注射给药。选择性环状VPAC2受体肽激动剂可以结合可药用载体、稀释剂或者赋形剂一同给予受试者，该可药用载体、稀释剂或者赋形剂作为用于治疗NIDDM或者下文讨论的疾病的药物组合物的一部分。药物组合物可以是溶液，或者如果胃肠外给药，可以是环状VPAC2受体肽激动剂的悬浮液或者络合二价金属阳离子(例如锌)的环状VPAC2受体肽激动剂的悬浮液。合适的药用载体可以含有不与肽或者肽衍生物反应的惰性成分。用于胃肠外给药的合适的药用载体包括，例如无菌水、生理盐水、制菌盐溶液(含有大约0.9%mg/ml苄醇的盐溶液)、磷酸緩沖盐溶液、Hank氏溶液、Ringer氏-乳酸盐等等。合适的赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露糖醇。本发明的环状VPAC2受体肽激动剂可以被配制而用于给药以便血浆水平在延长的时间期限中被维持在有效的范围内。有效的口服肽药物递送的主要障碍是由于酸和酶引起的肽降解，通过上皮膜的差的吸收，以及在暴露于消化道中酸性pH环境之后肽转变为不可溶的形式而导致的差的生物利用率。针对肽(例如本发明包括的那些肽)的口服递送系统是本领域已知的。例如，可以使用微球体将环状VPAC2受体肽激动剂包被，然后口服递送。例如，环状VPAC2受体肽激动剂可以被包被在由商业上可获得的、生物相容的、可生物降解的聚合物一一聚(丙交酯-共-乙交酯)-COOH组成的微球体中，并且其中橄榄油起填充剂的作用(参见Joseph等人Diabetologia43:1319-1328(2000))。其它类型的微球体技术也是商业上可获得的，例如来自Alkermes的Medisorb⑧和Prolease⑧生物可降解聚合物。Medisorb⑧聚合物可以使用任何丙交酯异构体生产。丙交酯乙交酯的比例可以在0:100和100:0之间变化，允许宽范围的聚合物性质。这使得设计的递送系统和可植入装置的吸收时间为数周至数月。Emisphere也发表了大量讨论肽和蛋白质口服递送技术的文章。例如，参见Leone-bay等人的WO95/28838，其公开了由修饰的氨基酸组成的特定载体，以促进吸收。本文公开的选择性环状VPAC2受体肽激动剂可以用于治疗多种疾病和病症的受试者。本发明包括的激动剂通过对称作VPAC2受体的受体起作用而发挥其生物学效应。对VPAC2受体刺激或者对VPAC2受体肽激动剂的施用有利地应答的患有疾病和/或病症的受试者，因此可以使用本发明的环状VPAC2激动剂治疗。这些受试者被表达为"需要使用VPAC2激动剂治疗"或者"需要VPAC2受体刺激"。本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂可以用于治疗糖尿病，包括I型和II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病或者NIDDM)两者。该激动剂也可以用于治疗需要使用VPAC2受体激动剂预防性治疗的受试者，例如具有发展为NIDDM风险的受试者。这些治疗也可以延迟糖尿病和糖尿病并发症的发病。可以使用本发明的激动剂治疗的其它的受试者包括那些患有葡萄糖耐量降低(IGT)的受试者(关于糖尿病分类的专家委员会(ExpertCommitteeonClassificationofDiabetesMellitus)，DiabetesCare22(Supp.1):S5，1999)，或者空腹血糖异常(impairedfastingglucose)(IFG)的受试者(Charles等人，Diabetes40:796，1991)，或者体重高出对于受试者的高度和体格而言正常体重的大约25%的受试者，一个或者多个双亲患有NIDDM的受试者，已经患有妊娠糖尿病的受试者和患有代谢紊乱(例如由内源性胰岛素分泌降低引起的那些代谢紊乱)的受试者。选择性环状VPAC2受体肽激动剂可以用于防止患有葡萄糖耐量降低的受试者进展为NIDDM，防止胰腺P细胞退化，资导P细胞增殖，改善P细胞功能，激活休眠的P细胞，使细胞分化为P细胞，刺激P细胞增殖，以及抑制P细胞凋亡。可以使用采用本发明激动剂的方法治疗或者预防的其它疾病和病症包括年轻人的成年型糖尿病(MODY)(Herman等人，Diabetes43:40，1994);成年人的隐性自身免疫糖尿病(LatentAutoimmuneDiabetesAdult)(LADA)(Zimmet等人，DiabetesMed.11:299，1994);妊:I(W尿病(Metzger，Diabetes,40:197,1991);代谢综合征X,血脂异常(dyslipidemia),高血糖症，高胰岛素血症，高甘油三酯血症和抗胰岛素性。本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂也可以用于本发明治疗糖尿病的继发性原因的方法中(关于糖尿病分类的专家委员会，DiabetesCare22(Supp.1):S5，1999)。这些继发性原因包括糖皮质激素过剩，生长激素过剩，嗜铬细胞瘤和药物诱导的糖尿病。可以诱导糖尿病的药物包括但不限于pyriminil、烟酸、糖皮质激素、苯妥英、甲状腺激素，P-肾上腺素能活性剂(adrenergicagents)，a-千扰素和用于治疗HIV感染的药物。本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂可以有效地抑制食物摄入并可治疗肥胖症。本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂也可以有效地预防或者治疗疾病，例如动脉粥样硬化疾病、高脂血症、高胆固醇血症、低HDL水平、高血压、原发性肺动脉高压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、冠心病和冠状动脉疾病)、脑血管疾病和外周血管疾病；以及用于治疗狼疮、多嚢性卵巢综合征(polycysticovarysyndrome)、癌发生和增生、男性和女性生殖问题、性功能障碍、溃疡、睡眠障碍、脂类和糖类代谢疾病、生理节奏的功能障碍、生长障碍、能量内稳态障碍、免疫疾病，包括自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮)，以及急性和慢性炎症、类风湿性关节炎和败血症性休克。本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂也可以用于治疗生理学紊乱，其涉及例如产生脂类积累细胞的细胞分化，胰岛素敏感性和血糖水平的调控，其涉及例如异常胰腺P细胞功能，胰岛素分泌肿瘤和/或自身免疫低血糖(其归因于针对胰岛素的自身抗体、针对胰岛素受体的自身抗体，或者刺激胰腺P细胞的自身抗体)，导致动脉粥样硬化斑块形成的巨噬细胞分化，炎症反应，癌形成，增生，脂肪细胞基因表达，脂肪细胞分化，胰腺P细胞质量的减少，胰岛素分泌，组织对胰岛素的敏感性，脂肪肉瘤细胞生长，多嚢性卵巢疾病，慢性不排卵，雄激素过多症，孕酮产生，类固醇生成，细胞的氧化还原电位和氧化应激，氧化氮合酶(NOS)产生，增加的Y谷氨酰转肽酶，过氧化氢酶，血浆三酰甘油，HDL和LDL胆固醇水平等等。另外，本发明的选择性环状VPAC2受体肽激动剂可以用于治疗哮喘(Bolin等人，Biopolymer37:57-66(1995);美国专利号5,677,419;证明多肽R3PO在松弛豚鼠气管平滑肌中有效)；低血压诱导(VIP诱导哞喘患者低血压，心动过速和面颊潮红(Morice等人，Peptides7:279-280(1986);Morice等人，Lancet2:1225-1227(1983));治疗男性生殖问题(Siow等人，Arch.Androl.43(1):67-71(1999));作为抗凋亡/神经保护剂(Brenneman等人，Aim.N.Y.Acad.Sci.865:207-12(1998));在局部性缺血事件中用于保护心脏(Kalfin等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.1268(2):952-8(1994);Das等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.865:297-308(1998));用于控制昼夜节律钟和其相关疾病(Hamar等人，Cell109:497-508(2002);Shen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.97:11575-80，(2000));作为抗溃疡剂(Tuncel等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.865:309-22，(1998))和作为针对AIDS的治疗(Branch等人，Blood106:Abstract1427，(2005))。选择性环状VPAC2受体肽激动剂的"有效量"是指当施用于需要VPAC2受体刺激的受试者时，产生所期望的治疗和/或预防效果而没有引起不可接受的副作用的量。"所期望的治疗效果，，包括下述一个或者多个1)改善与疾病或者病症相关的症状；2)延迟与疾病或者病症相关症状的发作；3)相比较于缺少治疗而延长寿命；4)相比较于没有治疗而提高生活质量。例如，用于治疗NIDDM的环状VPAC2激动剂的"有效量"是比无治疗时产生更好的对血糖浓度控制的量，因此导致糖尿病并发症发病的延迟，该并发症为例如视网膜病、神经病或肾病。预防NIDDM的选择性环状VPAC2受体肽激动剂的"有效量"是指相比较于无治疗，将延迟升高的血糖水平发生的量，该升高的血糖水平需要使用抗低血糖药物例如磺酰脲，瘗唑烷二酮，胰岛素，和/或双胍类的治疗。施用于受试者的选择性环状VPAC2受体肽激动剂的"有效量"还取决于疾病的类型和严重程度，以及取决于受试者的特征，例如一般的健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。有效地正常化患者血糖的选择性环状VPAC2肽受体激动剂的剂量将取决于许多因素，其包括但不限于受试者的性别，体重和年龄，不能调节血糖的严重程度，肽的给药的途径和生物利用率、药物代谢动力学图傳、效能和制剂。本发明选择性环状VPAC2受体肽激动剂的典型剂量范围是每天大约l將至每天大约5000照。优选地，剂量范围是每天大约l照至每天大约2500將，更优选，剂量范围是每天大约l照至每天大约IOOO照。甚至更优选，剂量范围是每天大约5照至每天大约100將。还优选的剂量范围是每天大约10照至每天大约50照。最优选，剂量是大约每天20照。"受试者"是哺乳动物，优选人，但是也可以是动物，例如宠物(例如狗、猫等等)，家畜(例如牛、绵羊、猪、马等等)和实验动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等等)。可以使用固相肽合成技术的标准方法制备本发明的选择性环状VPAC2受体肽'激动剂。肽合成仪可以从例如Rainin-PTISymphonyPeptideSynthesizer(Tucson,AZ)购得。固相合成的试剂例如可以从Glycopep(Chicago,IL)购得。根据厂商的说明，固相肽合成仪可以用于封闭干扰基团，保护待反应的氨基酸，偶联，解偶联和对未反应的氨基酸封。典型地，ot-N-保护的氨基酸和树脂上正在生长的肽链的N端氨基酸在室温下，存在偶联剂(例如二环己基碳二亚胺和l-羟基苯并三唑)和碱(例如二异丙基乙胺)的情况下，在惰性溶剂(例如二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮或二氯曱烷)中偶联。使用诸如三氟乙酸或哌啶的试剂将ot-N-保护基团从获得的肽树脂上除去，并且使用下一个期望被加入肽链的N-保护的氨基酸重复偶联反应。合适的胺保护基团是本领域所熟知的，并且，H口,皮公开在Green和Wuts，"ProtectingGroupsinOrganicSynthesis",JohnWiley和Sons,1991中。实例包括叔丁氧基羰基(tBoc)和芴基曱氧基羰基(Fmoc)。羰基或芴基曱氧基羰基-ot-氨基酸合成选择性VPAC2受体肽激动剂。合成完成之后，将肽从固相支持体上剪切下来，同时使用标准的氟化氢方法或者三氟乙酸(TFA)将侧链脱保护。在VydacC18柱上采用反向层析的方法，使用0.1%TFA中的乙腈梯度进一步纯化粗品肽。为了除去乙腈，从含有0.1%TFA，乙腈和水的溶液中冷冻干燥肽。通过分析反向层析可以证实纯度。通过质谱可以证实肽的身份。可以将肽溶解在中性pH的水性緩冲液中。也可以使用真核细胞和原核细胞宿主，通过本领域已知的重组方法制备本发明的肽激动剂。VPAC2受体肽激动剂的环化可以在溶液或固相支持体上实现。在固相合成肽之后可以立即在固相支持体上实施肽的环化。这涉及选择或者正交保护在环化作用中将被共价连接的氨基酸。通过参考下述非限制性实施例，将公开本发明多个优选特征和实施方案。实施例1——通过固相t-Boc化学方法制备选择性环状VPAC2受体肽激动剂将大约0.5-0.6克(0.35-0.45mmole)BocSer(Bzl)-PAM树脂放置在标准的60mL反应容器中。在AppliedBiosystemsABI433A肽合成仪上运行双偶联。下述侧链保护的氨基酸(2mmole的Boc氨基酸药筒)获得自MidwestBiotech(Fishers，IN)并且在合成中使用Arg陽甲苯磺酰基(Tos)，Asp-环己西旨(OcHx)，Asp画9國药基曱基(Fm)，Cys-p-甲基节基(p-MeBzl)，Glu-环己酯(OcHx)，His-千氧基甲基(Bom)，Lys-2-氯代节氧基羰基(2Cl-Z),Lys-9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，Orn-2-氯代节氧基羰基(2C1-Z)，Ser-O-二千醚(OBzl)，Thr-O-二千醚(OBzl)，Tyr-2誦溴代千氧基羰基(2Br-Z)，Boc-Ser(OBzl)PAM树脂和MBHA树脂。三氟乙酸(TFA),二-异丙基乙胺(DIEA)，1.0M羟基苯并三唑(HOBt)的NMP溶液和1.0M二环己基碳二亚胺(DCC)的NMP溶液购自PE-AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。二甲基曱酰胺(DMF-BurdickandJackson)和二氯甲烷(DCM-Mallinkrodt)购自MaysChemicalCo.(Indianapolis,IN)。苯并三唑-l-基-氧基-三-(二甲基氨基)-铸六氟磷酸盐(BOP)获得自NovaBiochem(SanDiego，CA)。使用对称的酐或者HOBt酯(都是使用DCC形成的)进行标准的双偶联。在完成合成时，移去N末端Boc基团，并且使用DMF中的二异丙基碳二亚胺(DIC)用有机酸(例如己酸)对肽基树脂封端。然后使用DMF中的20%哌啶处理树脂20分钟。选择性移去Fmoc和Fm保护基团，并且在DIEA存在的情况下，通过使用BOP激活天冬氨酸羧基而实现环化。允许反应进行24小时并且通过7JC合茚三酮试验进行监测。使用DCM洗涤之后，将树脂转移到TEFLON反应容器中并且在真空中干燥。通过将反应容器连接在HF(氢氟酸)装置(PenninsulaLaboratories)上而进行剪切。添加lmL间曱酚/g树脂并且将10mLHF(购自AGA，Indianapolis,IN)冷凝到预冷的容器中。当存在曱石克氨酸时，加入lmLDMS/g树脂。在冰浴中搅拌反应物1小时。真空中移去HF。将残留物悬浮于乙醚。过滤固体并使用醚洗涤。每种肽萃取到乙酸水溶液中并且或者冷冻干燥或者直接加入到反相柱中。在2,2x25cmVYDACC18柱上緩冲剂A(0.1%TFA水溶液)中进行纯化。20%至卯％的B(0.1%TFA乙腈溶液)的梯度以10mL/分钟的速率在HPLC(Waters)上流动120分钟，在280nm监测UV(4.0A)，收集一分钟级分。将合适的级分合并、冷冻并冷冻干燥。通过HPLC(0.46x15cmMETASILAQC18)和MALDI质语分析干燥的产物。通过分别使用Fmoc和Fm选择性保护例如鸟氨酸残基和谷氨酸残基的这些残基的侧链，而制备具有内酰胺键(例如连接鸟氨酸残基和谷氨酸残基)的环状VPAC2受体肽激动剂。在合成中使用的所有其它氨基酸是标准的节基侧链保护的Boc氨基酸。环化作用然后可以在固相合成肽之后立即实施。实施例2——通过固相Fmoc化学合成制备选择性VPAC2受体环状肽激动剂将大约114mg(50mmole)Fmoc-Ser(tBu)WANG树月旨(购自GlycoPep，Chicago,IL)放置于每个反应容器中。在RaininSymphonyPeptideSynthesizer(RaininSymphony肽合成仪)上实施合成。使用75mg(50拜ole)RinkAmideAM树月旨(RappPolymere.Tuebingen,Germany)制备具有C末端酰胺的类似物。下述Fmoc氨基酸购自GlycoPep(Chicago,IL)和NovaBiochem(LaJolla，CA):Arg-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，Asn-三苯甲基(Trt)，Asp-P-叔丁酯(tBu)，Asp-P画烯丙酯(Allyl)，Glu-5-叔丁酯(tBu)，Glu-5-烯丙酯(Allyl)，Gln-三苯甲基(Trt)，His-三苯甲基(Trt),Lys國叔丁氧基羰基(Boc),Lys-烯丙基氧基羰基(Aloc)，Orn-烯丙基氧基羰基(Aloe),Ser-叔丁醚(OtBu)，Thr-叔丁醚(OtBu)，Trp-叔丁氧基羰基(Boc)，Tyr一又丁醚(OtBu)。溶剂二甲基甲酰胺(DMF-BurdickandJackson),N-甲基吡咯烷酮(NMP-BurdickandJackson)，二氯曱烷(DCM國Mallinkrodt)购自MaysChemicalCo.(Indianapolis,IN)。羟基苯并三唑(HOBt)，二-异丙基碳二亚胺(DIC)，二-异丙基乙胺(DIEA)和哌啶(Pip)购自AldrichChemicalCo(Milwaukee,WI)。苯并三喳-l-基-氧基-三-(二甲基氨基)-铸六氟磷酸盐(BOP)获得自NovaBiochem(SanDiego,CA)。所有的氨基酸以0.3M的浓度溶解在DMF中。在使用20。/。哌力DMF20分钟脱保护之后，运行3小时DIC/HOBt活化的偶联。在脱保护和偶联之后，使用DMF洗涤每种树脂。在最后偶联和脱保护之后，使用DCM洗涤肽基树脂并且在反应容器中真空干燥肽基树脂。对于N末端酰化作用，将四倍过量的相应酸的对称酐加入到肽树脂上。通过在DCM中DIC活叶匕而制备对称酐。允许反应进行4个小时并通过7JC合茚三酮实验进行监测。选择性移去Aloe和Allyl保护基团，并且通过在存在DIEA的情况下使用BOP活化天冬氨酸的羧基基团而实现环化。然后使用DCM洗涤肽树脂并且在真空中千燥。将由每10mLTFA中含有0.2mL^P克基甲烷，0.2mL甲醇，0.4mL三异丙基甲多圭烷(均购自AldrichChemicalCo.，Milwaukee,WI)組成的剪切混合物(cocktail)与剪切反应物混合2小时。如果序列中存在Cys，加入2%乙二硫醇(ethanedithiol)。将TFA滤液力口入40mL乙醚中。以2000转/分钟(rpm)离心沉淀2分钟。弃去上清。将沉淀重悬于40mL醚中，再离心、再弃去，在氮气中并且然后在真空中干燥。0.3-0.6mg每种产物溶解在lmL0.1%TFA/乙腈(ACN)中，并使用20jiL在HPLCLiM原液，来自处死的正常Wistar大鼠的血清，牛胰蛋白酶抑制剂和DiscoveRx检测试剂盒。将大鼠血清储存在4。C直到使用并且在两周内使用。在第0天，对于每个整分试样，通过添加10|liL肽原液到90|nL大鼠血清中而制备含有10nM肽的大鼠血清的两个100fiL整分试样。将250kIU牛胰蛋白酶抑制剂/mL加入这些整分试样之一。该含有牛胰蛋白酶抑制剂的整分试样保存在4°C。没有牛胰蛋白酶抑制剂的整分试样保存在37°C。整分试样孵育24小时。第1天，在第0天制备的整分试样孵育24小时之后，制备含有PBS+1.3mMCaCl2，1.2mMmgCl2，2mM葡萄糖和0.5mMIBMX的孵育緩冲液。为4°C和37°C整分试样制备含肽血清的11个系列3倍稀释的板，以进行每种肽的研究。4000nM用作最大的浓度。含有细胞的板在孵育緩冲液中洗涤两次，并且细胞在每孔50iLiL的孵育介质中孵育15分钟。将每孔50nL溶液转移到细胞上，该细胞来自使用4°C和37°C整分试样肽的11个系列3x稀释而制备的板，用于研究每种肽，使用通过初步筛选而表明的最大浓度一式两份进行。这个步骤将肽的浓度稀释2倍。将细胞在室温孵育30分钟。移去上清液。加入40inL/孔的DiscoveRx抗体/提取緩冲液。将细胞在振荡器(300rpm)上孵育1小时。遵循使用DiscoveRx试剂盒的通常操作方法。cAMP标准品包括在柱12中。从cAMP测定数据确定ECso值。通过式ECs。，4C/EC5G,37c为每个条件评估活性肽的剩余量。不超出本发明范围的本发明的其它修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。权利要求1.包括下述氨基酸序列的环状VPAC2肽受体激动剂:2.药物组合物，其包含根据权利要求1的环状VPAC2受体肽激动剂和一种或多种可药用稀释剂、载体和赋形剂。3.用作药物的根据权利要求1的环状VPAC2受体肽激动剂。4.根据权利要求1的环状VPAC2受体肽激动剂在治疗非胰岛素依赖型糖尿病或者胰島素依赖型糖尿病，或者抑制食物摄入中的用途。5.根据权利要求1的环状VPAC2受体肽激动剂在制备用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病或者胰岛素依赖型糖尿病，或者抑制食物摄入的药物中的用途。6.治疗需要其的患者的非胰岛素依赖型糖尿病或者胰岛素依赖型糖尿病、或者抑制食物摄入的方法，该方法包括施用有效量的根据权利要求1的环状VPAC2受体肽激动剂。7.含有根据权利要求1的环状VPAC2受体肽激动剂的药物组合物，其用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病或者胰岛素依赖型糖尿病，或者抑制食物摄入。8.基本上如上文参考实施例所述的环状VPAC2受体肽激动剂。全文摘要本发明包括选择性激活VPAC2受体的肽，以及其在治疗糖尿病中的用途。文档编号A61K38/00GK101389647SQ200780006145公开日2009年3月18日申请日期2007年2月26日优先权日2006年2月28日发明者J·阿尔西纳-费尔南德斯,张连山申请人:伊莱利利公司