分枝杆菌SecA2突变体的制作方法

专利名称：分枝杆菌SecA2突变体的制作方法
分枝杆菌SecA2突变体 对相关申请的交互参考
本申请要求于2006年1月12日提交的美国临时申请No. 60/758， 944的;^又益。
关于联邦资助研究或开发的声明
如资金No. R01 AI54540, AI26170, AI063537和AI57158的条款 所规定的，美国政府在本发明中具有已全部偿付的许可和在有限情况 下要求专利权人以合理条件许可他人的权利，上述所有资金都是由国 立卫生院授予的。
背景技术：
(1) 发明领域
本发明总地涉及分枝杆菌疫苗。更加具体地，本发明涉及包含 SecA2突变的分枝杆菌组合物及其在诱导对分枝杆菌和抗原的免疫性 中的用途。
(2) 相关现有技术的说明
结核分枝杆菌f妙co6s"er/咖MercWosisJ -结核病的病原， 导致每年比任何其它单一病原体更多的死亡(Corbett等，2003)。结 核分枝杆菌耐药菌林的出现和HIV共感染导致这种疾病的影响越来越 恶化。该病原体显示出非凡的破坏和抵抗其感染宿主的杀菌反应的能 力。结核分枝杆菌毒力与其最初通过以许多不同方式规避宿主反应而 在巨噬细胞内存活有关。结核杆菌存留在内吞泡中(Armstrong和 Hart， 1975; Clemens和Horwitz， 1995)，后者由于结核分枝杆菌 介导宿主蛋白质TACO滞留在这些泡的膜上而不能与溶酶体融合 (Gatfield和Pieters， 2000)。类似地，结核分枝杆菌可以下调 MHC-II (Noss等，2001)和共刺激分子(Stenger等，1998; Wadee等， 1995)的表达，调节其附近的细胞因子环境(VanHeyningen等，1997)
并抑制宿主细胞的凋亡(Keane等，1997)。尽管结核分枝杆菌规避i午 多宿主反应以便在可居住的环境中维持自身，仍需要阐明介导这些效 应的细菌效应物。侵入宿主细胞后，在结核杆菌的膜和细胞壁外形成 了嚢样的结构(Daffe和Etienne， 1999),这一界面包含重要的参与 发病机制和对TB的免疫应答的表面蛋白质。位于分枝杆菌与其真核宿 主之间的界面上的分泌的和细胞被膜结合的蛋白质介导宿主-病原体 相互作用。所以，这些蛋白质是候选的毒力因子，值得进一步研究 (Finlay和Falkow， 1997)。
有人提出结核分枝杆菌输出型和分泌型蛋白质在毒力方面发挥作 用，并且事实上导致对TB的免疫应答(Abou-Zeid等，1988; Johansen 等，1996; Nagai等，1991; Zhang等，1992)。对几种细菌病原体的 研究揭示大多数毒力因子是分泌型的(Finlay和Falkow, 1997)。研 究还强调了结核分枝杆菌的分泌型和输出型蛋白质对产生保护性免疫 应答的重要性。这一特性最显著的实证来自以下实验，其中将小鼠或 豚鼠用胞外蛋白质免疫，引发出显著的保护性免疫(Andersen, 1994; Hubbard等，1992; Pal and Horwitz， 1992; Roberts等，1995)。 近来，输出型ERP(输出型重复蛋白质)蛋白质被显示出促成结核分枝
杆菌的毒力(Berthet等，1998)。同样地，超氧化物歧化酶(SOD)--
种培养物滤液组分，被显示出通过干扰宿主凋亡而与毒力相关联 (Edwards等，2001)。尽管已经研究了许多分泌型蛋白质，但由于分 离膜蛋白样品的技术限制，仍然缺乏对细胞表面蛋白质的研究。
宿主细胞凋亡参与分枝杆菌属的毒力和保护性免疫(例如， Alemdn等，2002; Balcewicz-Sablinska等，1998; Ciaramella等， 2000; Duan等，2001， 2002; Duarte等，1997; Eddine等，2005; Grode等，2005; Keane等，2000; Kornfeld等，1999; L6pez等， 2003; Protales-P6rez等，2002; Sly等，2003; Spira等，2003)。 但是，需要更多关于影响宿主细胞凋亡的分枝杆菌宿主基因的信息。 本发明正是致力于这种需要。
发明概述
相应地，发明人发现SecA2蛋白阻止宿主细胞凋亡。发明人还发 现不表达SecA2的分枝杆菌突变体提高了分枝杆菌诱导针对毒性分 枝杆菌或由分枝杆菌表达的重组抗原的免疫应答的能力。
因而，本发明涉及分枝杆菌，其包含(a)不在&"2基因中的突变， 其中当与无该突变的野生型分枝杆菌相比时，包含该突变的野生型分 枝杆菌在哺乳动物中显示减弱的毒力；和(b)在Sed2基因中的突变， 其中所述突变消除SecA2活性。
本发明还涉及包含在&"2基因中的突变的分枝杆菌，其中所述 突变消除SecA2活性。这些分枝杆菌不是结核分枝杆菌或耻垢分枝杆 菌況s/z/eg迈a 〃s入
此外，本发明涉及在哺乳动物中诱导免疫应答的方法。该方法包括 对该哺乳动物接种任何上述分枝杆菌。
本发明 还涉及在人中诱导针对致病性分枝杆菌的免疫应答的方 法。该方法包括用分枝杆菌疫苗接种人。所述分枝杆菌疫苗包含含有 在5^"2基因中的突变的分枝杆菌，其中所述突变消除SecA2活性。
附图简述


图1是显示结核分枝杆菌A/ /W诱导THP-l细胞凋亡的前向光散 射和TUNEL测定的图。
图2是显示结核分枝杆菌A/2/W和Ase"2细胞诱导THP-l细胞 凋亡的前向光散射和TUNEL测定的图。
图3是显示恢复Asec^ 突变体分泌SodA逆转"^^缺失对宿主 细胞凋亡的效应的图表和TUNEL测定图。图A是通过表达转基因的
基因在△ 结核分枝杆菌中恢复SodA分泌的策略的图表。图
B是显示△ se"2结核分枝杆菌(而非△ se"2- oc SodA结核分枝杆菌) 诱导宿主细胞凋亡的TUNEL测定的图。
图4是用来评估各种转基因分枝杆菌在暴露于巨噬细胞后由诱 导0T-1细胞产生干扰素-Y (IFNy)的能力的策略的图表。用结核分枝 杆菌抗原与卵白蛋白抗原SIINFEKL的融合蛋白转染分枝杆菌。来自凋
亡的转基因分枝杆菌的融合蛋白将呈递在巨噬细胞上，其中SIINFEKL 表位将被0T-1细胞识别，诱导0T-1细胞产生IFN y 。
图5是显示受感染的骨髓衍生巨噬细胞对SIINFEKL肽(OVA)的体 外交叉呈递的实验数据的图。A/2/W-19k-0VA和厶5^"2-19k-0VA的 IFN y产生表明△ /7/W和△ 突变体是凋亡性的。
图6是实验数据的图，其显示使用对在小鼠静脉内感染后第7天 收获的脾细胞的特异性IFN Y ELISPOT分析，表达OVA (SIINFEKL)的 结核分枝杆菌突变体在体内对CD8 T细胞的致敏。A/3/"-19k-OVA和 A5^d^l9k-0VA的IFN y产生表明△/ /"和△ SecJ2突变体是凋亡性 的。
图7是显示用于测定分枝杆菌感染对羧基焚光素二醋酸酯，琥珀 酰亚胺酯(CFSE)-标记的0T-1脾细胞的增殖的影响的策略的图表。
图8是显示诱导凋亡的结核分枝杆菌突变体厶/2/W-19k-OVA和 △ Se"2-19k-0VA活化幼稚CD8+ T细胞的实验结果的图。
图9是显示测定分枝杆菌在体内诱导CTL免疫应答的能力的策略 的图表。
图10是显示结核分枝杆菌突变体△ / 7aJ-19k-OVA和A ^d2-19k-0VA诱导针对呈递19k-OVA抗原的细胞的CTL应答的实验 结果的图。
图ll是显示"d2突变体在鼠骨髓巨噬细胞中的生长缺陷的实验 结果的图。骨髓衍生巨噬细胞获自C57BL/6小鼠，将2xl()5个巨喧细 胞接种到腔式栽玻片上的孔中，随后用结核分枝杆菌以1. 0的感染复 数(MOI)将巨噬细胞感染4小时。4小时后，洗涤巨噬细胞单层并加入 新鲜培养基。通过裂解所述单层并将连续稀释的裂解物铺平板来测定 CFU。显示的菌林是H37Rv(方块)和se"2突变体(圆圏)。该图给出了 8次独立实验的土SEM。
图12是显示"d2突变体引发更多来自INF-y处理的巨噬细胞 的活性氮中间体(RNI)的实验结果的图。通过用100U/ml鼠INF-y预 处理24小时激活来自C57B1/6小鼠的骨髓衍生巨噬细胞。以MOI 10
感染巨噬细胞。在整个4小时的细菌摄取期维持INF-y。摄取后，洗 涤单层并加入新鲜培养基。感染后24小时使用Griess试剂测量RNI。 该图给出5次实验的平均值土SEM。
图13是显示""2突变体引发更多来自INF-y处理的THP-1细 胞的HLA-DR信使的实验结果的图。在人INF- y存在的情况下以MOI 10 感染PMA分化的THP-1细胞24小时。使用TRIzol从受感染细胞中分 离总RNA。通过定量实时RT-PCR测定HLA-DR表达。将HLA-DR表达相 对于18S核糖体RNA的表达标准化。该图给出了 4次实验的平均值 之SEM。
图14是显示结核分枝杆菌A""2突变体在低剂量喷雾感染 C57BL/6小鼠中减毒的实验结果的图。将免疫活性C57BL/6小鼠在整 体气溶胶室中暴露于结核分枝杆菌H37Rv(画)或Ai ed2突变体(0)， 每只小鼠接受大约200 CFU(菌落形成单位)/肺。图A:在感染后不同 时间点处死小鼠并通过铺平板由肺匀浆测定CFU来评估菌林的生长。 结果代表两次实验。丰与A"a^突变体相比的p值为p < 0.005 (Student氏t检验)。图B:监测用各菌林感染的4只小鼠的组的存 活情况。
图15是显示结核分枝杆菌Asec^ 突变体在未活化的鼠骨髓衍生 巨噬细胞中减毒的实验结果的图。以M0I-1用(图A)结核分枝杆菌 H37Rv (■)或Ased2突变体(O)和(图B) Asec^突变体(O)或Asec^ 补足突变体(A"^么attB:: secA2) (A)感染来自C57BL/6小鼠的未 活化的鼠骨髓衍生巨噬细胞。在感染后不同时间点通过将巨噬细胞裂 解物铺平板来测定CFU。每个时间点对每个菌林以一式三份孔进行感 染，误差条代表对于一式三份孔的平均值±标准偏差。显示的数据代 表对野生型和A""2突变体的超过20次实验，和对于补足菌林的5 次实验。丰与Asec^相比的p值是p < 0. 05 (Student氏t检验)。
图16是显示Ai ed2突变体在IFN- y处理的鼠骨髓衍生巨噬细胞 中的存活的实验结果的图。在平行实验中在来自C57BL/6小鼠的(图 A)活化的和(图B)未活化的鼠骨髓衍生巨噬细胞中检查Asec^突变体
和H37Rv的存活和生长。通过用10 ng/ml rmINF-y预处理24小时来 活化巨噬细胞。如所述用H37Rv(B)或Ased^突变体(0)以M0I-1感 染巨噬细胞。图中显示了 5次实验的平均值士SEM。承与AsecA2突变体 相比的p值为p < 0. 05 ( Student氏t检验)。
图17是显示A""2突变体在来自小鼠的骨髓衍生巨噬细胞中减 毒的实验结果的图，所述小鼠为吞噬细胞氧化酶组分缺陷型(phox—〃)。 用结核分枝杆菌H37Rv(在C57BL/6巨噬细胞中- ■;在phox+巨噬细 胞中□)和A"c^突变体(在C57BL/6巨噬细胞中-"在phox+巨 噬细胞中O)以M0I-1平行感染来自C57BL/6小鼠和来自(A) p47ph°x+ 或(B) gp9rh°x +的未活化的骨髓衍生巨噬细胞。图中显示多次实验(六 次p47—-/-，三次gp91—x+)的平均值土平均值的标准误差(SEM)。 * 与Asec爿2相比的p值为p < 0. 05 ( Student氏t检验)。
图18是显示受感染的骨髓衍生巨噬细胞的细胞因子释放的实验 结果的图。 <吏用Cytometric Bead Array试剂盒(BD Biosciences)须'J 量细胞因子。 一式三份以M0I=1感染来自C57BL/6小鼠的骨髓衍生巨 噬细胞。感染后24小时收集上清液并测定细胞因子。图中显示了未感 染的巨噬细胞(黑条)，或感染了 H37Rv(灰条)、Asec^突变体(白条)， 或A"d2补足菌林(阴影线条)的巨噬细胞中的(图A)TNF-a或(图 B)IL-6的细胞因子水平，误差条描述了一式三份样品的标准偏差 (SD)。显示的数据代表八次实验。,与AsecA2突变体相比的p值为p < 0. 05 ( Student氏t检验)。
图19是显示由受感染的骨髓衍生巨噬细胞产生的活性氮中间体 的实验结果的图。使用Griess试剂测量RNI。以MOI-10进行感染并 在感染后72小时收集样品的未活化巨噬细胞(图A)并在感染后24小 时收集IFN-Y活化的巨噬细胞(图B)。条柱显示未感染细胞(黑条)， 或感染H37Rv的细胞(灰条)，感染A"d2突变体的细胞(白条)，或感 染A""2补足菌林的细胞(阴影线条)的一式三份样品的平均值，误差 条表示一式三份样品的标准偏差(SD)。显示的数据代表三次实验。* 与AsecA2突变体相比的p值为p < 0. 05 (Student氏t检验)。图20是显示Ased2突变体在来自小鼠的骨髓衍生巨噬细胞中减 毒的实验结果的图，所述小鼠为诱导型一氧化氮合酶(N0S2)缺陷型。 如上所述，用结核分枝杆菌H37Rv(在C57BL/6巨噬细胞中麗；在 N0S2—/_中口)和Ased2突变体(在C57BL/6巨噬细胞中《;在N0S2+ 巨噬细胞中O)以M0I-1平行感染来自C57BL/6小鼠和来自N0S2+小 鼠的未活化的骨髓衍生巨噬细胞。图中显示的是四次实验的平均值土 平均值的标准误差(SEM)。承与AsecA2突变体相比的p值为p < 0. 05 (Student氏t检验)。
图21是显示通过定量实时PCR测量的II类MHC表达的抑制的 实验结果的图。通过对由鼠骨髓衍生巨噬细胞或THP-1细胞制得的RNA 的qRT-PCR测定宿主mRNA表达。用结核分枝杆菌菌林以MOI-10感染
细胞并用rIFN-Y刺激，用rIFN-Y类似地处理未感染的细胞。对于鼠 巨噬细胞，用结核分枝杆菌菌林感染细胞并在加入2 ng/ml rmIFN-Y 之前静置21小时。加入rIFN-y后15小时取RNA样品。对于THP-1 细胞，细胞同时用结核分枝杆菌感染并用200 ng/ml rhIFN-y进行处 理。感染后24小时取RNA样品。将qRT-PCR样品相对于18S内部对照 标准化。条柱表示在一天进行的一式三份感染的经标准化的II类MHC 水平，误差条显示标准偏差。显示的数据代表对每种(A)鼠骨髓衍生巨 噬细胞和(B)THP-1细胞的5次实验。显示的样品为未感染的(黑条)， 或以H37Rv(灰条)，A"c^突变体(白条)，或补足菌林(阴影线条)感 染的细胞。*与野生型和补足型相比的p值为p < 0. 003 (Student氏 t检验)。 发明详述
相应地，发明人发现SecA2蛋白阻止宿主细胞凋亡。发明人还发 现不表达SecA2的分枝杆菌突变体提高了分枝杆菌诱导针对毒性分 枝杆菌或由分枝杆菌表达的重组抗原的免疫应答的能力。
因而，本发明涉及分枝杆菌，其包含(a)不在Sec^2基因中的突变， 其中当与无该突变的野生型分枝杆菌相比时，包含该突变的野生型分 枝杆菌在哺乳动物中显示减弱的毒力；和(b)在Sed2基因中的突变， 其中所述突变消除SecA2活性。
这些分枝杆菌可以是任何种，例如耻垢分枝杆菌(脱^z e^z7a〃s)， 牛分枝杆菌(6oy")，鸟分枝杆菌(脱肝i咖)，草分枝杆菌(M ; 力/e"， 偶发分枝杆菌尸0"i7/7咖)，/"/V，副结核分枝杆菌(乂 ;^r^〃6ei"c〃/oW"，哈瓦那分枝杆菌(#. ^3&加)，瘰病分枝杆菌
scro/"u/sc函)，胞内分枝杆菌(i/i"ace//u/are)，结核分枝 杆菌(t由環/,'s)，或堪萨斯分枝杆菌(ira扁"/)。-优选地， 所迷分枝杆菌是牛分枝杆菌BCG或结核分枝杆菌，因为这些种作为疫 苗特别有用。
由于这些分枝杆菌通常在体内使用，优选所述分枝杆菌是无毒的 或被制成无毒的，例如，通过筛选无毒菌林或通过改造分枝杆菌使其 具有一个或多个能够达到该目的的突变。许多这类突变是本领域已知 的，例如使得分枝杆菌成为营养缺陷型的突变，例如； a/2突变或Ars 突变，或消除致病性基因的突变诸如A/^缺失，如本领域已知的。因而， 不在Se"2基因中的突变优选是RDl区的至少一部分中的缺失，或控 制维生素或氨基酸产生的基因中的缺失。参见例如国际专利公开号W0 03/070164，在此将其通过参考引用并入本文。还优选用于本发明的分 枝杆菌可以在宿主中定殖，使得分枝杆菌对宿主提供长期抗原性刺激， 从而建立强免疫应答。
尽管可以使用非重组方法产生这些分枝杆菌，例如，使用诱变剂 并篩选AsecA2表型，但是优选至少一种突变通过遗传工程方法制成， 因为这些方法比非重組方法更为容易和准确得多。
可选地，所述分枝杆菌可以进一步包含可操作连接至启动子的重 组基因，当该分枝杆菌感染哺乳动物细胞时，所述启动子指导该基因 的表达。优选地，所述基因编码抗原，例如赘生物、胂瘤或癌的抗原， 或最优选人病原体的抗原，以便利用针对抗原的提高的免疫原性(作 为厶^eo^突变的结果)。在这些分枝杆菌中有用抗原的病原体(例如， 人病原体)的实例包括病毒(例如，HIV，丙肝病毒，疱渗病毒，'流感， 天花，白喉，破伤风，麻渗，腮腺炎，狂犬病，脊髓灰质炎病毒等)，
细菌(例如，致病性分枝杆菌，沙门氏菌属等)，和真核寄生虫(例如， 疟疾，利什曼原虫等)。
本发明还涉及包含在^ec^ 基因中的突变的分枝杆菌，其中所述 突变消除SecA2活性。这些分枝杆菌不是结核分枝杆菌或耻垢分枝杆 菌。但是，它们可以是任何其它分枝杆菌种。优选地，所述分枝杆菌 是牛分枝杆菌，最优选牛分枝杆菌BCG。如同以上所述的分枝杆菌， 这些分枝杆菌的突变优选通过遗传工程方法制得。也如同上述的分枝 杆菌，这些分枝杆菌可以进一步包含可操作连接至启动子的重组基因， 当该分枝杆菌感染哺乳动物细胞时，所述启动子指导该基因的表达。 优选地，所述基因编码抗原，例如赘生物、肿瘤或癌的抗原，或最优选 人病原体的抗原。在这些分枝杆菌中有用抗原的病原体(例如，人病原 体)的实例包括病毒、细菌和真核寄生虫。
此外，本发明涉及诱导哺乳动物免疫应答的方法。该方法包括对该 哺乳动物接种任何上述分枝杆菌。
本发明还涉及诱导人针对致病性分枝杆菌的免疫应答的方法。所 述方法包括用分枝杆菌疫苗接种人。所述分枝杆菌疫苗包含含有在 ^"2基因中的突变的分枝杆菌，其中所述突变消除SecA2活性。优 选地，所迷分枝杆菌疫苗包含牛分枝杆菌或结核分枝杆菌，最优选牛分 枝杆菌BCG。
所述分枝杆菌疫苗中的分枝杆菌还可以进一步包含不在^"2基 因中的突变，其中当与没有所述不在&"2基因中的突变的野生型分 枝杆菌相比时，包含所述不在Sed2基因中的突变的野生型分枝杆菌 在哺乳动物中显示减弱的毒力。当疫苗所源自的野生型分枝杆菌是毒 性病原体例如结核分枝杆菌时，这些突变通常是重要的。优选地，所 述不在^"^基因中的突变是RD1区的至少一部分中的缺失，或控制 维生素或氨基酸产生的基因中的缺失。
如同上面讨论的分枝杆菌，所述分枝杆菌疫苗中的分枝杆菌可以 可选地进一步包含可操作连接至启动子的重组基因，当该分枝杆菌感 染哺乳动物细胞时，所述启动子指导该基因的表达。优选地，所述基
因编码抗原，例如赘生物、胂瘤或癌的抗原，或最优选人病原体的抗原，
以便利用针对抗原的提高的免疫原性(作为A5^"2突变的结果)。 在这些分枝杆菌中有用抗原的病原体(例如，人病原体)的实例包括病 毒、细菌和真核寄生虫。
在下列实施例中描述了本发明的优选实施方案。考虑说明书或本 文所披露的发明的实施，在权利要求范围内的其它实施方案对于本领 域技术人员来说将是显而易见的。意欲将说明书连同实施例 一起仅仅 视作例示性的，本发明的范围和精神由实施例后面的权利要求所指明。
实施例1.厶/2/W和Ase"2突变体的免疫学评估
使用免疫学和流式细胞计数法评估A"/W(参见2006年1月12 日提交的PCT专利申请PCT/US06/01132)和△ se"2突变体 (Braunstein等，2003)诱导宿主凋亡和对分枝杆菌的免疫性的能力。
用结核分枝杆菌菌林H37Rv，厶A贝(HsuT，等，2003)， 和 Asec力2以M0I为10:1感染THP-1细胞(人髄/单核细胞系)。60小时 后收获细胞，并如下通过TUNEL分析。以原位细胞死亡试剂盒(Roche) 对细胞进行染色，所述试剂盒通过末端脱氧核普酰转移酶介导的向游 离3'-OHDNA末端添加荧光素dUTP来标记链断裂。通过测量前向和边 缘光散射来评估受感染THP-1细胞的大小和复合性，并通过使用荧光 活化细胞分选仪(FACS)测定焚光素掺入来评估DNA断裂(Schrijvers 等，2004)。用厶/2/W或Asec^ (但非Rv或厶^ /)感染的THP-1细 胞显示广泛的凋亡(图1和2)。
结核分枝杆菌SecA2基因在超氧化物歧化酶A(SodA)分泌中发挥 作用(Braunstein等，2003)。从毒性结核分枝杆菌中缺失5W^2减弱 分枝杆菌在小鼠中的毒力。为了评估SecA2超氧化物歧化酶是否阻止 凋亡，通过用cxSodA质粒构建体转染结核分枝杆菌AsecA2突变体来 恢复SodA活性(图3A)。该载体呈现驱动^W基因表达的Hsp60启 动子和Ag85信号序列(Braunstein等，2000)。这一质粒驱动SodA蛋 白质的组成性表达，所述蛋白质由SecAl系统分泌。这提供了不依赖
于SecA2的SodA蛋白质，因而补足了 ASecA 突变体的SodA分泌缺 陷。用野生型结核分枝杆菌H37Rv， △ Sec〃突变体，和△ Se"2- oc SodA SOD恢复菌株感染THP-1细胞。如上所述利用TUNEL来评价THP-1细 胞的凋亡程度。如图28B中所示，厶^"2突变体诱导凋亡，但厶^"2-菌林恢复了分枝杆菌抑制凋亡的能力。这表明SodA蛋白质的 分泌能够直接负责抑制感染诱导的凋亡。
据信凋亡通过使得病原体抗原可被旁观树突细胞呈递而在宿主防 御中发挥作用(Schaible等，2003; Yrlid和Wick， 2000)。为了确 定巨噬细胞当被诱导凋亡的分枝杆菌感染时是否比当被不诱导凋亡的 分枝杆菌感染时呈递更多的病原体抗原，将诱导凋亡的分枝杆菌菌林 △ sed2和A"/aJ，和抑制凋亡的菌林H37Rv(毒性)，△ i / 7和△ / a/7C"(减弱的毒力-参见国际专利申请号W0 03/070164，通过参考引 用并入本文)用质粒构建体转染，所述质粒构建体包含在Hsp 60启动 子控制下的与鸡卵白蛋白(0VA)的氨基酸残基252-269 (SIINFEKL [SEQ ID NO: l])的编码序列融合的19kDA脂蛋白抗原(图4)，生成厶 secA2-19k-OVA， △ nlaA-19k-0VA， H37Rv-19k-0VA， ARDl-19k-0VA和 ApanCD-19k-0VA。这些菌林的每一林都与骨髓衍生巨噬细胞合并以便 感染巨噬细胞，随后加入来自TCR转基因0T-1小鼠的T细胞(SIINFEKL / H-2r特异性的)并通过ELISA测定干扰素-y (IFNy)。 OVA肽抗原 呈递在巨噬细胞上的I类匪C H-2Kb分子上，在那里OVA抗原被0T-1 细胞上的T细胞受体所识别，导致IFNy的产生(图4)。如图5中所示， 只有让宿主凋亡的菌抹△ sed2-l 9k-0VA和△ / /a j-19k-OVA刺激0T-1 产生IFNy 。
通过将标记了 5(6)-羧基荧光素二乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯(CFSE) 的0T-1脾细胞(Thy 1.2+)注射入Thyl.l同类小鼠体内，然后在24 小时后用突变体分枝杆菌感染小鼠，来测定上述表达转基因19k-0VA 融合蛋白的突变体在体内刺激脾细胞增殖的能力。5-7天后，处死小 鼠并通过FACS分析其脾细胞以测定Thyl. 2+ T细胞中CFSE荧光的强 度(图7)。 CFSE进入细胞中并通过与胺反应可逆地结合胞内蛋白和细
胞表面蛋白。当细胞分裂时，每个子细胞的荧光强度减半，所以增殖
细胞群(例如，抗原活化的T细胞)显示如图7右下所示的流式细胞荧 光曲线。这些实验的结果显示于图8中。只有让宿主凋亡的菌林A "d2-19k-0VA和Ai7/W-19k-0VA显示体内0T-1 T细胞活化。这表 明受感染细胞的凋亡促进T细胞针对分枝杆菌抗原的致敏和活化。
用图9中列出的体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定来进一步评 估诱导凋亡的突变体诱导针对分枝杆菌抗原的免疫应答的能力。用上 述19k-0VA抗原分枝杆菌菌林对小鼠进行免疫。7-IO天后，对小鼠注 射以107个化71.2+ T细胞，所述细胞标记了 (a)低浓度的CFSE和OVA SIINFEKL肽，或(b)高浓度的CFSE而无OVA肽。大约36h后，处死小 鼠并进行FACS分析以定量低和高强度荧光性淋巴结细胞。当小鼠具有 对OVA肽特异性的CTL应答时，该反应只会杀死CFSE1。细胞；CFSEhi细 胞应不受影响并作为对照。
图10显示了该测定的结果。用诱导凋亡的分枝杆菌免疫的小鼠产 生了对携带OVA抗原的T细胞的CTL应答，而用不诱导凋亡的类似分 枝杆菌免疫的小鼠未产生CTL应答。
实施例2.接种抑制宿主凋亡的结核分枝杆菌突变体减弱毒性结 核分枝杆菌的感染
对小鼠接种106个生物体的牛分枝杆菌BCG，实施例1中所述的具 有/3/W缺失的转基因结核分枝杆菌(表1中的A/ /a力，组合了上述厶 和A/7/W缺失的转基因结核分枝杆菌(Asecv^/A/ /a力，和如 国际专利申请号WO O3/070164 A2 (通过参考引用并入本文)中所述 具有i "7和pa/7中的缺失并表达转基因李斯特菌溶胞素(如在Grode 等，2005中)的转基因结核分枝杆菌(Ai^7/厶/7a/7"李斯特菌溶胞素)。 接种后两个月，通过气溶胶途径用200 CFU的结核分枝杆菌Erdman 攻击小鼠。攻击后1个月和3个月评价肺和脾中的TB生长。结果在表 1中提供。
表l.数值以lOgw表示
l个月迎旌
幼稚的(na'i've)6.30土0.065.35土0.07
BCG4.92+0.07(--1.38)4.24土0.18 (画.1.11)
4.52土0.15 (画-1.78)4.04+0.24(--1.3"
△ secW/ △ "/a」5.25+0.08 (--1.05)4.27+0.20 (-.1.08)
3个月
幼稚的(nai've )5.43+0.024.93+0.10
BCG4.92+0.14 (画,0.51)4.31±0.11(-.0.62)
厶/j/a/(4.56+0.16(-0.87)3.79+0.26(-4.14)
△ sec爿2/厶刀/a爿5.17+0.14 (--0.26)4.88+0.09(-0.05)
在利用相同方案的第二项实验中，评价结核分枝杆菌A"d2和 △ /7/W，以及BCG的保护作用(表2)。 表2.
丝1个月肺1个月脾3个月肺3个月脾
幼稚的6. 67土0. 084. 61土0. 045. 78土0. 024. 79土0. 03
△4. 77土0. 07 (-1.90)3. 84土0. 11 (-0. 77)5. 16土0. 05 (-0. 62)4. 49土0. 15
厶/ /aJ5. 34之0. 08 (-1.33)4. 04土0. 19 (-0. 57)5. 38土0. 09 (-0. 40)4. 67土0. 07
BCG5. 52土0. 0215)3. 76土0. 08 (-0. 85)5. 73土0. 144. 67土0. 09
还测定了 BCG， A/7/W突变体，和AsecJ2/A/7/d突变体的细胞因 子诱导。用106个生物体接种后两个月，通过气溶胶途径用200 CFU 的结核分枝杆菌Erdman攻击小鼠。攻击后的10天，取出肺细胞并利 用实时PCT分析细胞因子信使(message )(直接分析细胞而无体外刺 激)。结果在表3中报告，表示为相对于GAPDH管家基因的信使水平。
表3.
实验组IFN-yIL-12IL-4
幼稚的(naive )4. 0300. 8
BCG27250. 3
32160. 3
39201. 3
实施例3. SecA2突变体的进一步表征
包含sed2基因的符合读框的完全缺失的结核分枝杆菌突变体 mc23112在结核病鼠模型中毒力减弱(Braunstein等，2003) 。 SecA2是 一小组结核分枝杆菌蛋白质输出到培养物滤液中所需的辅助分泌因子 (Braunstein等，2003)。依赖于SecA2的蛋白质之一是抗氧化剂超氧 化物歧化酶A (SodA) 。 Edwards等报道SodA减少的结核分枝杆菌菌林 毒力减弱，并且感染SodA-减毒型结核分枝杆菌菌抹的小鼠肺中的凋 亡细胞增加(Edwards等，2001)。上面的实施例1和2显示sec A 突变 体导致宿主中凋亡增多并促进抗原呈递和T细胞活化。这与Schaible 等人(2003)—致，他们报道了结核分枝杆菌诱导的凋亡通过携带MTB 抗原至未感染的抗原呈递细胞的凋亡泡来促进抗原呈递。这提示凋亡 增多可以促进形成针对结核分枝杆菌感染的保护性免疫应答。
分枝杆菌疫苗包括结核分枝杆菌疫苗和牛分枝杆菌BCG疫苗中整 合入促凋亡特性，可以在很大程度上有益于所引发的保护性应答。因 此，结核分枝杆菌的Md2突变体和牛分枝杆菌的"d2突变体是改 进型活分枝杆菌疫苗的候选物。所以构建了牛分枝杆菌BCG的sed2 突变林。
具有se"2基因的符合读框的缺失的牛分枝杆菌BCG突变体的构 建.利用涉及自杀反选择载体pMB179的等位基因交换策略来生成所迷 突变体(Braunstein等，2003)。用1 jj g碱处理的pMB179质粒DNA对 牛分枝杆菌BCG Pasteur(W. R.Jacobs的菌抹收藏)和牛分枝杆菌BCG
Tice (Oranon)进行电穿孔。自杀载体pMB179包含""^缺失等位基因 以及^3CA反选择标记和力/g(潮霉素抗性)选择标记。从每种菌林获得 潮霉素抗性菌落，其源于pMB179上缺失的""2等位基因与染色体中 Md2的单一交换事件。这些单一交换菌株-牛分枝杆菌BCG Pasteur MB542和牛分枝杆菌BCG Tice MB543 -包含通过栽体力/g和^c"序列 分隔的突变型和野生型"c^等位基因。将MB542和MB543各自生长 至饱和状态并使用0. 5 ml接种10 ml 7H9-ADS培养基。生长10天后， 将连续稀释物平板接种至具有3%蔗糖的7H10-ADS琼脂上。分枝杆菌 中^M的表达阻止在蔗糖培养基上生长。获得源自两个"d2等位基 因之间第二次重组事件的蔗糖抗性和潮霉素敏感性重组体。从重组体 中分离基因组DNA并进行Southern分析以鉴定存在的等位基 因。用质粒pMB146的1. 5 kb ^7oRI/#//^III片段对用fcoRI/i7//^111 消化的DNA进行探针探测。获得下列M(^2突变体MB544是牛分枝杆 菌BCG Pasteur的sed^突变体而MB546是牛分枝杆菌BCG Tice的 se"2突变体。得到的缺失突变体是"d2的符合读框的未标记突变， se"2基因的大部分缺失。全长SecA2长度为808个氨基酸，而sec^ 缺失突变只编码SecA2框内头31个氨基酸和最后49个氨基酸。在这 两种BCG突变体中的"cv^缺失都与相应的结核分枝杆菌突变体中的 se"2缺失相同。
阐明结核分枝杆菌SecA2在巨噬细胞中的作用.对于结核分枝杆 菌突变体先前报道的在小鼠中的减毒表型是在早期感染过程中 的生长缺陷(Braunstein等，2003)。在感染的该体内生长期间，结核 分枝杆菌在巨噬细胞中复制。这提示se^2突变体对于在巨噬细胞中 生长是缺陷型的。为了检验这一假设，用H37Rv或sec^ 突变体感染 来自C57BL/6小鼠的鼠骨髓衍生巨噬细胞，并通过将巨噬细胞裂解物 铺平板来测定与巨噬细胞相关联的活细菌的数目随着时间的变化。这 些实验已经证明，与H37Rv相比，sed2突变体在这些巨噬细胞内生 长的能力是缺陷型的(图11)。这些结果与观察到的结核分枝杆菌 se"2突变体的体内生长缺陷相符。
结核分枝杆菌抑制宿主的免疫应答，这对于发病机理和形成保护
性免疫应答可能是重要的(Beltan等，2000; Hussain等，19";Nau 等，2002;Noss等，2000)。本实施例显示，经IFN-y处理的感染了结核 分枝杆菌sed2突变体的细胞比感染了野生型结核分枝杆菌H37Rv菌 林的相应细胞更加高度活化。这提示SecA2在抑制巨噬细胞活化中的 作用，这可能解释它在毒力中的作用。还提示用结核分枝杆菌或牛分枝 杆菌BCG的seo^突变体进行免疫可通过增强的宿主细胞活化而引发 更强的免疫应答。
如图12和13中所示，用IFN-v处理并感染了 sec^2结核分枝杆 菌突变体的培养细胞比感染了 H37Rv的相同细胞更为活化(基于活性 氮中间体和HLA-DR/II类MHC信使的产生增多)。
实施例4.结核分枝杆菌的SecA2分泌因子促进在巨噬细胞中的生 长并抑制宿主免疫应答 实施例概述
SecA蛋白质存在于所有细菌中，并且它是总的Sec-依赖型蛋白质 输出途径的关键组分。结核分枝杆菌一个不寻常的特性是存在两种 SecA蛋白SecAl -基本的"管家型"SecA，和SecA2 -辅助的分泌因子。 在此我们报道结核分枝杆菌的Ased2突变体对于在低剂量喷雾感染 CWBL/6小鼠早期的生长方面是缺陷型的，此时所述杆菌主要在巨谨 细胞中复制。与这种体内表型一致，我们发现A"d2突变体对于在来 自C57BL/6小鼠的巨噬细胞中生长是缺陷型的。Ased2突变体对于 在来自phox—z-小鼠和来自N0S"—小鼠的巨噬细胞中生长也是减毒的。 这些小鼠分别在生成活性氧中间体(ROI)的吞噬细胞氧化酶或生成活 性氮中间体(RNI)的诱导型一氧化氮合酶上是缺陷型的。这表明SecA2 在结核分枝杆菌的胞内生长中发挥作用，所述生长不依赖于针对这些 R0I或RNI的保护。感染了A""2突变体的巨噬细胞产生更高水平的 TNF- oc ， IL-6， RNI和IFN- y诱导的11类MHC。这证明了结核分枝杆菌 SecA2在抑制巨噬细胞免疫应答中的功能，这可以解释SecA2在胞内
生长中的作用。我们的结果提供了结核分枝杆菌毒力和抑制宿主免疫 应答之间关系的另 一个实例。 介绍
结核分枝杆菌-结核病的病原-在所有时候都是最成功的细菌病 原体之一。结核病的全球负担处于其最高水平并包括不断增加数目的
多重耐药结核分枝杆菌感染(世界卫生组织，2005)。需要新的抗结核病 预防和治疗措施以控制这一健康危机，彻底了解结核分枝杆菌发病机
理将有助于实现这一目标。
结核分枝杆菌被吸入并被未活化的宿主巨噬细胞摄取，在那里它 能够复制和存活。关于结核分枝杆菌如何在这些巨噬细胞中逃避宿主 防御知之甚少。涉及的过程可能是复杂和多因素的。在参与结核分枝 杆菌在巨噬细胞中存活的特性中，有所述杆菌阻断吞噬泡酸化、阻断 吞噬体-溶酶体融合和抵抗活性氧和氮中间体(ROI和RNI)的能力
(Koul等，2004; Smith, 2003)。
针对结核分枝杆菌的早期先天免疫应答包括巨噬细胞的Toll-样 受体(TLR)刺激(Krutzik和Modiin， 2004; Quesniaux等，2004)。 TLR 信号传递导致RNI和促炎性细胞因子包括TNF-oc和IL-6的分泌。在 感染后期，发生适应性TH1免疫应答对宿主巨噬细胞的活化，导致抑 制胞内生长和控制结核分枝杆菌感染。I FN- y是这一反应的重要介质； 它上调抗分枝杆菌过程和巨噬细胞抗原呈递(Flynn和Chan， 2001)。由 ifn- y诱导的抗分枝杆菌效应物中的一种是rni，其由诱导型一氧化 氮合酶(N0S2)产生，尽管还存在其它的IFN- y依赖型效应物机制 (Chan等，1992;MacMicking等，1997; MacMicking等，2003) 。 TNF-ct是 另一种在宿主控制结核分枝杆菌感染中发挥整体作用的细胞因子 (Bean等，1999; Botha和Ryffel， 2003; Flynn等，1995)。在对TNF-ot 报道的许多特性中，它能够与IFN-y协同诱导巨噬细胞强有力的抗分 枝杆菌活性(Chan等，1992;Flesch和Kaufmann， 1990; Flynn和 Chan,2001)。
越来越显而易见的是，结核分枝杆菌能够限制宿主免疫应答和巨
噬细胞活化，并且这种抑制作用可能对于在巨噬细胞中存活是重要的
(Koul等，2004)。尽管取决于实验条件，有若干报道感染了毒性更 高的结核分枝杆菌的巨噬细胞，与被较低毒性或减毒的分枝杆菌感染 的巨噬细胞相比，产生的TNF-cx和/或RNI的水平或活性较低 (Balcewicz-Sablinska等，1998; Beltan等，2000; Falcone等，1994; Reed等，2004; Shimono等，2003)。以更加直接的方式已经显示结核分 枝杆菌抑制大肠杆菌(&c力er/c/ /a co7/)诱导的促炎性IL-12的表 达(Nau等，2002)。还已知结核分枝杆菌抑制IFN-y上调基因包括II 类主要组织相容性复合体(MHC)基因(Fortune等，2005; Nagabhushanam等，2003; Noss等，2000; Pai等，2004)。对II类MHC的 抑制减少参与在体内形成有效TH1应答的抗原呈递。
在细菌发病机理中的一个共同主题是病原体的蛋白质输出和分泌 途径对毒力的重要性。这些途径将蛋白质输出细胞质至细胞表面或将 蛋白质分泌出细菌。表面蛋白质和分泌型蛋白质都暴露于外部环境。 结果，这些蛋白质理想地定位以保护细菌免受巨噬细胞攻击或改变针 对杆菌的宿主免疫应答(Coombes等，2004;Kurtz和Braunstein， 2005)。像所有细菌一样，结核分枝杆菌具有常规的Sec途径和Sec蛋 白质用来将蛋白质输出细胞质(Kurtz和Braunstein, 2005)。较为不寻 常的是结核分枝杆菌中存在两种SecA蛋白质(SecAl和SecA2) (Braunstein等，2001)。结核分枝杆菌的SecA2蛋白是一种辅助分泌 因子，其促进一小组蛋白质的分泌，包括超氧化物歧化酶(SodA)和过 氧化氢酶-过氧化物酶(KatG) (Braunstein等，2003)。这两种酶都能解 毒氧自由基SodA将超氧化物转化为过氧化氢和氧而KatG将过氧化氪 转化为水和氧。KatG还能够分解过氧亚硝酸盐，后者是超氧化物和一 氧化氮的危险反应产物(Wengenack等，1999)。如先前在高剂量鼠结核 病^f莫型中使用结核分枝杆菌A"d2突变体所示，SecA2促成结核分枝 杆菌的毒力(Braunstein等，2003)。
在此描述的是结核分枝杆菌的A""2突变体在鼠感染喷雾模型 和在鼠骨髓衍生巨噬细胞中的研究。两种模型的结果一致并且揭示了
SecA2在鼠感染早期和在未活化巨噬细胞中促进结核分枝杆菌生长的 作用。使用来自phox+和N0S2+小鼠的巨噬细胞我们进一步显示SecA2 的作用并非简单地通过下列事实解释，即不耐受由吞噬细胞氧化酶产 生的ROI或由诱导型一氧化氮合酶产生的RNI。对比巨噬细胞针对 A"^^突变体或亲本H37Rv结核分枝杆菌感染的应答，我们发现，基 于以下若干标准，感染了A"d2突变体的巨噬细胞更为活化增加的 TNF-oc， IL-6，RNI和IFN-y调节的II类MHC。这表明SecA2在结核分 枝杆菌抑制免疫应答中的作用，其可能对于在宿主中存活和发病机理 是重要的。
材料和方法
细菌菌抹和生长条件.将本研究中所用的结核分枝杆菌菌株 H37Rv，mc23112(A^d2突变体，来自单个菌落的原种)和mc23116 (A鄉"，a〃A，ec^力(Braunstein等，2003)生长在Middlebrook 7H9肉汤(Difco)中，所述肉汤含有0. 2%甘油，1 X ADS(白蛋白葡萄糖 盐水)和0. 05% Tween 80(Tw)。适宜时，向培养基中添加抗生素卡那 霉素(2Q)ag/ml)。
动物.雌性C57BL/6小鼠购自Charles River Laboratories。如 先前所述生成并维持p47一"-小鼠(Barry-lane等，2001) 。 gp91ph°x—厂 小鼠和N0S2_/—小鼠购自Jackson Laboratories,所有小鼠都圏养在无 菌微栅笼中并随意给予经高压灭菌的食物和水。两种phox〃—小鼠抹系 都维持在其水中伺以磺胺甲恶唑(200 mg/5ml)和甲氧节咬(40 mg/5ml) (Hi-Tech Pharmacal)的抗生素口服混悬液以预防才几会性感 染。
喷雾感染.将38-45天龄的雌性C57BL/6小鼠用于喷雾研究。将结 核分枝杆菌菌林培养至对数中期(0D600 ~ 0. 5-1. 0)。将培养物洗涤一 次并重悬于含有0.05% Tween 80 (PBS-Tw)的磷酸盐緩冲盐水(PBS)中 至1 x 107 CFU(菌落形成单位)/ml的浓度。将细菌悬液置入整体暴露 气溶胶室的喷雾罐(Mechanical Engineering Workshop, Madison, WI) 中。将小鼠暴露15分钟，室吹洗(purge)时间为20分钟。在特定的时间点，通过co2窒息从每一组处死四只小鼠并取出肺、肝和脾，在 含有IOO ng/ml环已酰亚胺和50 |i g/ml羧节西林的PBS-Tw中均浆。 将匀浆铺至含有10mg/ml环已酰亚胺的7H10 ADS甘油平板上进行CFU计数。
巨噬细胞感染.如下从C57BL/6, p47ph°x+， gp9rh。"—，和N0S2+小鼠 制备骨髓衍生巨噬细胞。通过C02窒息处死小鼠并取出股骨。使用包 含10°/。热灭活胎牛血清(HI-FBS) ， 2mM谷酰胺和IX非必需氨基酸(NEAA) 的补充型DMEM(Sigma)将细胞冲洗出股骨。将细胞洗两次并于补充型 DMEM中在20% L929条件培养基(LCM)存在的情况下培养6天。6天后， 使用5mMEDTA(PBS中)取出细胞，用补充型DMEM洗两次，并重悬于含 有10% LCM的补充型DMEM中。随后将细胞接种入8孔腔式载玻片的孔 中(2xl05巨噬细胞/孔)，或24孔板的孔中(8xl05巨噬细胞/孔)，使其 贴壁过夜，然后进行感染。在一些实验中，在感染前用10ng/ml重组 鼠IFN-y (rmIFN-y ， Chemicon)预处理巨噬细胞24小时。由生长对 数中期取结核分枝杆菌菌林并在PBS-Tw中洗一次。将细胞重悬于 PBS-Tw中并进一步在补充型DMEM中稀释至适当的CFU/ml。向细胞单 层中加入合适浓度的细菌以达到感染复数(MOI)为1或10。将巨谨细 胞感染4小时，此时用补充型DMEM将单层洗三次以去除任何非细胞关 联的细菌，随后加回含有10% LCM的新鲜培养基。在不同的时间点， 从孔中取出培养基并用0.1% Tween 80和强烈抽吸裂解细胞。将裂解 物在PBS-Tw中稀释并铺至7H10 ADS甘油0. 05% Tw板上进行CFU计数。 RNI测量.我们^f吏用Griess试剂(Molecular Probes)并按照厂商 规程测量RNI。简言之，使用0.2 jum低蛋白结合滤器，将来自受感 染巨噬细胞单层的上清液过滤除菌两次，并以1: l与Griess试剂混合。 于548nm测量样品，并使用以亚硝酸钠生成的标准曲线将数值转化为 iaM亚硝'酸盐。
体外敏感性测定.将细菌在7H9 ADS甘油Tw中生长至对数中期， 洗涤，并在PBS-Tw中稀释至大约lxl06CFU/ml的密度。通过比较来自 处理样品的CFU数与未处理样品的CFU数，对每种菌林测定杀伤百分
比。釆用下列的处理热激(53。C， 45分钟)和酸性pH (pH4. 0， 24小时)。 使用多种化合物进行体外ROI杀伤测定。我们检验了对次黄嘌呤/黄嘌 呤氧化酶的敏感性(0和3小时)(250juM次黄嘌呤)(Sigma)/黄嘌呤氧 化酶(Q. lU/ml黄嘌呤氧化酶)(Roche)，存在或不存在过氧化氢酶 (lU/ml) (Sigma)，加入来解毒生成的过氧化氢(DeGroote 等，1997; Piddington等，2001)。检验的其它生成R0I的化合物包括过 氧化氢(O， 5， 10mM， 4小时)，白花丹素(O. 2mM, 3. 5, 7. 5， 10. 5小时)， 焦没食子酚(2 mM， 0， l，和4小时)，和过氧化氢枯烯(O. 5mM， 0， 1和4 小时)(Sigma)。使用精脒nonoate(SPER/N0)检测对RNI的体外敏感性 (200juM， 0和4小时)(Alexis Biochemicals)。所有的体外ROI和 RNI测定都在37°C进行。
细胞计数微珠测定(CBA).如上所述进行骨髓衍生巨噬细胞的感 染，以M0I为1来感染细胞。在感染后24小时从感染的巨噬细胞收集 上清液并通过0. "jum低蛋白结合滤器过滤2次，将上清液保存在 _80°C。使用小鼠炎症CBA试剂盒(BD Biosciences)才艮据厂商的规程来 进行CBA。在BD Biosciences FACSCalibur流式细胞仪上分析样品。 将对每种菌株的一式三份样品取平均值并将数据显示为平均值±标准 偏差。
定量实时-PCR (qRT-PCR)测定感染巨噬细胞的IFN- Y反应.如上 所述制备鼠骨髓衍生巨噬细胞并以M0I为10感染3小时，此时洗去未 掺入的细菌并将新鲜培养基加回单层。感染后21小时，从单层取出培 养基并更换为含2 ng/ml rmIFN-y的新鲜培养基。rmIFN-y处理15 小时后，取出上清液，并用TRIzol试剂(Invitrogen)裂解单层。将人 单核细胞系THP-1(ATCC TIB-202)维持在含有10% HI-FBS的补充型 RPMI中。为了制备THP-1细胞进行感染，将它们在含有FBS的新鲜RPMI 中洗涤两次，重悬于含有50ng/ml乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA) (Sigma)的 含FBS的RPMI中，并以2 x 106细胞/孔接种于6孔组织培养板中。 24小时PMA处理后，在200ng/ml重组人IFN-y (rhIFN-y Pierce)存 在下以M0I为10感染细胞4小时。摄取后，洗涤细胞并加入含有rhIFN-Y的新鲜培养基。感染后24小时，从受感染的单层取出上清液并用 TRIzol裂解细胞。对TRIzol裂解物处理进行RNA抽提。将RNA样品 逆转录并使用带有Absolute QPCR Mix的Taq-Man序列检测系统
(Applied Biosystems)进行实时PCR。基于对每种基因生成的标准曲 线来计算数值。通过将II类MHCmRNA的拷贝数除以18S rRNA的拷贝 数来确定样品的标准化。18S探针(5， -TAMRA-CAAATTACCCACTCCCGACCG -3， [SEQ ID N0:2])和引物F(5' -GCTGCTGGCACCAGACTT-3， [SEQ ID N0:3])和R(5' -CGGCTACCACATCCAAGG-3， [SEQ ID N0:4]);鼠II类 MHC(I-Ab)探针(5'-FAM-CGCAGCGCATACGATATGTGACCA-TAMRA-3' [SEQ ID N0:5])和引物Rev(5'-CTGTCGTAGCGCACGTACT-3' [SEQ ID N0:6〗) 和 Fo^(5,-GGCGAGTGCTACTTCACCA-3, [SEQ ID N0:7]);人 II 类 MHC (HLA-DRA) 探 针 (5' -FAM-CTGGACCCTTTGCAAGAACCCTTCCC-TAMRA-3' [SEQ ID N0:8〗)和引物F (5'-TCCAATGAACGGAGTATCTTGTGT-3' [SEQ ID NO: 9])和 R(5'-TGAGATGACGCATCTGTTGCT-3' [SEQ ID NO: 10]) (Gehring等，2003; Wengenack等，1999)。 结果
A""2突变体在鼠低剂量喷雾感染模型中減毒.先前,有人证明 结核分枝杆菌的符合读框和未标记的AsecA2缺失突变体在小鼠中高 剂量静脉内施用后减毒(Braunstein等，200D。为了更好地表征 △secA2突变体的表型，我们使用更加天然的低剂量喷雾暴露模型，用 大约200个杆菌感染C57BL/6小鼠的肺，并包括比先前所分析的更早的 时间点。用AsecA2突变体或毒性结核分枝杆菌亲本H37Rv感染后，在 感染后时间处死各组小鼠，通过将匀浆铺平板观察菌落形成单位(CFU) 来计数肺、肝和脾中的细菌负荷。对于H37Rv我们在小鼠的肺中观察 到了典型的生长模式在感染早期显著生长，随后是持续期，在此期间 杆菌的数目随时间保持恒定(Orme和Coll ins, 1994)(图14A)。生长期 与持续期之间的转换与建立TH1应答相关联，它的核心特征是巨谨细 胞被IFN-y活化(North和Jung, 2004; Orme和Collins, 1994)。当与 HWRv相比时，A""2突变体在感染的早期生长期中有缺陷。早在感
染后9天，与H37Rv相比，Asec^突变体在肺中具有少一个对数的杆 菌(图14A)。这一区别在整个实验过程中都得以保持，尽管两种菌株 都继续生长至第16天的时间点。我们还观察到，当与H37Rv相比时， Ased2突变体在肝和脾中的CFU较少(少0. 5-1. 0 log)(数据未显示)。 在感染的后期，A"^2突变体在持续方面与H3 Rv类似，尽管在最后 第80天的时间点，在A^d2突变体感染小鼠的肺中的CFU负荷略微 下降。除了减少的杆菌负荷之外，与感染了 H37Rv的小鼠(平均存活 173 ±16天)相比，感染了A"c^ 突变体的小鼠显示存活长度增长(平 均存活372±29天(图14B)。
Ase^^突变体在未活化的巨噬细胞中具有减毒的表型，但在活化 的巨噬细胞中则并非如此。观察到的A"c^突变体的体内表型表明 SecA2在感染早期的作用，在此期间结核分枝杆菌在巨噬细胞中生长。 假设A"" 突变体对于在未活化的巨噬细胞中生长是缺陷型的。通过 将A"d 突变体和H37Rv在来自C57BL/6小鼠的未活化骨髓衍生巨噬 细胞中复制的能力进行比较，来检验这一假说。离体感染巨嗟细胞， 摄取4小时后洗涤单层并加回新鲜培养基。通过将巨噬细胞裂解物铺 平板计算活CFU，在5天的时间内评价每种菌抹的生长。Ased2突变 体显示在巨噬细胞中生长减弱，并到第5天显示少了高达一个对数的 CFU(图15A)。通过将野生型拷贝的secA2引入整合质粒上而补足了 A"^^突变体的胞内生长缺陷，这表明突变体表型归因于secA2的缺 乏(图15B)。
与允许结核分枝杆菌生长的未活化的巨噬细胞形成对比的是，活 化的巨噬细胞由于增强的抗分枝杆菌活性而抑制结核分枝杆菌生长 (Chan等，1992; Flesch and Kaufmann， 1990; Flyrm and Chan， 2001)。 我们在用重组鼠IFN-y (rmIFN-y)预处理24小时而活化的鼠骨髓衍 生巨噬细胞中比较了Asecy^突变体和H37Rv。在经IFN-y处理的巨镇 细胞中，H3 Rv随时间未能生长但存活，Asec〃突变体的表现类似(图 16A)。平行进行对未活化的巨噬细胞的感染，并且再次揭示了 Asec^ 突变体的胞内生长缺陷(图16B)。
这些结果揭示了 SecA2在促进结核分枝杆菌在未活化的巨噬细胞 中生长的作用，但SecA2对于结核分枝杆菌在活化的巨噬细胞中存活 没有明显作用。其与体内生长模式相一致，其中厶""2突变体显示 在感染的早生长期在肺中的生长减弱，随后在出现TH1免疫应答和伴 随的巨噬细胞活化后与H37Rv表现类似。
A"c^突变体在氧化爆发(oxidative burst)缺陷型巨噬细胞 中具有减毒表型.先前报道结核分枝杆菌的A""2突变体在分泌抗 氧化酶SodA和KatG方面是缺陷型的(Braunstein等，2003)。结核分 枝杆菌相对耐受R0I(Chan等，1992)，对于面对巨噬细胞氧化爆发而 在胞内存活这可能是一种重要特性，并且SecA2依赖性分泌的SodA和 KatG是参与这种耐受性的结核分枝杆菌分子(Smith, 2003)。检验 SecA2在巨噬细胞生长中的唯一作用是否是保护杆菌免受胞内感染期 间的氧化爆发。制备来自p47一-, gP91ph°x-7-,和C57BL/6小鼠的骨髓 衍生巨噬细胞并平行地感染A""2突变体或H37Rv。这些phox+小鼠 缺乏吞噬细胞氧化酶复合物的不同组分，所述吞噬细胞氧化酶复合物 负责巨噬细胞的氧化爆发(Nauseef, 2004)。在这些氧化爆发缺陷型巨 噬细胞中，A;yed^突变体显示了与在野生型C57BL/6巨噬细胞中观察 到的相同的生长缺陷(图17)。这表明SecA2即使在不存在氧化爆发的 情况下也有助于胞内生长。因此，在仅仅保护杆菌免受氧化爆发期间 生成的ROI攻击之外，SecA2必然在胞内生长中也具有功能。
作为对SecA2在保护对抗氧自由基方面的作用的独立评估，在 A"cX 突变体和H37Rv之间比较了对多种ROI物质的体外敏感性。 检验的化合物有焦没食子酚和次黄噤呤/黄嘌呤氧化酶；这两种处理都 生成胞外超氧化物。还检验了白花丹素(细胞质超氧化物生成剂)，过 氧化氢，和过氧化氢枯烯。在所有情形中，对Ased2突变体和H37Rv， ROI处理都显示等同程度的杀伤(数据未显示)。还对菌株测试了它们 对其它应激的敏感性，包括酸性pH和热激。同样，在杀伤上没有明显 差异。A"^2突变体未改变的体外敏感性结合来自phox—〃巨噬细胞的 数据提示，SecA2在促进在巨噬细胞内生长中的作用不仅仅是保护细
菌免受破坏性ROI攻击，而是涉及其它机制。
感染Ase"2突变体的巨噬细胞释放较高水平的促炎性细胞因子 和RNI.为了确定SecA2-依赖性分泌途径是否促成结核分枝杆菌抑制 宿主免疫应答，在感染了A""2突变体或H37Rv的巨噬细胞中比较了 细胞因子的产生。如前对来自C57BL/6小鼠的骨髓衍生巨噬细胞进行 感染，感染后24小时使用细胞计数微珠阵列(BDBiosciences)对上清 液测定细胞因子产生。感染了A""2突变体的巨噬细胞比感染H37Rv 的巨噬细鸡产生更多的TNF-ot和IL-6(图18)， TNF-ot的平均差异为 2. 5倍而IL-6为3. 5倍。引入表达野生型secA2的整合质粒补偿了 Ased2突变体细胞因子产生增多的表型。
还使用Griess试剂在受感染巨噬细胞的上清液中测定了 RNI的 产生，所述Griess试剂测定亚硝酸盐(一氧化氮的氧化产物)。在 感染后48， 72和96小时进行测量。与感染了 H37Rv的巨噬细胞相 比，感染了A""2突变体的巨噬细胞在所有时间点都产生更多的 RNI(图19A，对"小时显示了数据)，平均差异为1.5倍。在感染后 0, 4和24小时的相同实验中，还测量了细胞中的ROI水平。在感染 了A""2突变体或H37Rv的细胞之间ROI的水平没有明显差异(数据 未显示)。还检验了在感染前24小时用IFN-Y预处理的感染细胞的RNI 产生水平，所述预处理上调RNI产生。正如预期的，与未处理的细胞 相比，用IFN-Y预处理的细胞的RNI产生有总体提高。在感染后24 小时，感染了 A""2突变体的巨噬细胞再次显示了上清液中较高水平 的RNI(图WB)。通过引入野生型拷贝的secA2，补偿了在缺乏和存在 IFN-y的情况下感染Ase"2突变体后观察到的RNI产生增多。
重要的是注意到，在这些实验中，对于两种菌林在4小时感染期 之后巨噬细胞裂解物中的CFU数目等同。上面的结果提示，与H37Rv 相比，△ 突变体在抑制巨噬细胞产生免疫刺激性分子的能力方面
是缺陷型的。最终的结果是在感染A""2突变体之后更高度活化的巨 遵细胞。
A""2突变体在N0S2+巨噬细胞中具有减毒表型.鉴于RNI的抗
分枝杆菌活性，有可能所观察到的RNI水平增加单独导致A; ed2突变 体在巨噬细胞中的生长缺陷。为了检验这一想法，在来自N0S2—小鼠 的未活化的巨噬细胞中检查Ased2突变体和H37Rv的生长，所述小鼠 缺乏诱导型一氧化氮合酶并对于亚硝化爆发(nitrosative burst)是 缺陷型的(MacMicking等，1997a)。 A"" 突变体在N0S2+巨噬细胞 中仍然显示生长缺陷，所述缺陷等同于在来自C57BL/6小鼠的巨噬细 胞中观察到的缺陷(图20)。这一数据表明SecA2在胞内生长中的作用 涉及除保护对抗活性氮中间体之外的功能。
如对ROI所进行的，还检查了Asec^突变体和H37Rv对由精脒 nonoate(SPER/NO)生成的N0的体外敏感性。用SPER/N0处理导致对 △""2突变体和H37Rv等同程度的杀伤(数据未显示)。体外敏感性结 果连同观察到的Ase"2突变体在N0S2—/_巨噬细胞中的生长缺陷提示， SecA2在胞内生长中的作用并不仅仅是保护对抗RNI。
A"d2突变体与更高的IFN-y诱导的II类MHC表达相关联. 已经证实了与H37Rv感染的巨噬细胞相比，感染了Ai ed2突变体的 巨噬细胞产生更高水平的细胞因子和RNI，随后评价了Ased2突变所 改变的其它巨噬细胞应答的抑制。多家实验室已经证明结核分枝杆菌 抑制宿主若干种IFN-y调节的基因的表达。这些基因中有抗原呈递所 需的IFN-y诱导的II类MHC基因(Nagabhushanam等，2003; Noss等， 2000; Pai等，2004)。为了检验SecA2在结核分枝杆菌抑制IFN-y反 应中的作用，采用了两种不同的系统，所述系统先前被用来研究这种 IFN-y抑制原代鼠巨噬细胞和人单核细胞系thp-1。用a《ed2突变 体，HWRv，或补足型菌林以M0I为10预感染鼠骨髓衍生巨噬细胞24 小时，随后用rmIFN-y刺激。IFN-y处理15小时后，通过定量实时 PCR(qRT-PCR)测量II类MHC(IA-b)转录物的表达。如预期的，IFN-y 处理未感染细胞增加了 II类MHC转录物并且H37Rv抑制IFN-y对II 类MHC的诱导。相比之下，感染Ase"2突变体并未将II类MHC水平 减少到与H37Rv相同的程度(图2U)。在五次独立的实验中，Asec^ 突变体和H37Rv之间在IFN-y诱导的II类MHC水平方面的这种差异
是Ased2突变体大至少2.0倍(通过Mann-Whitney检验p=0. 008)。 用人THP-1细胞进行类似的实验。在这些实验中，在感染Ase"2突变 体，H37Rv，或补足型菌林时将rhIFN-y加入到细胞中。对在感染后24 小时收集的样品进行qRT-PCR来测量II类MHC(HLA-DR)转录物的表 达。再次地，感染A""2突变体并未将II类MHC水平减少到与H37Rv 相同的程度。A"c〃突变体和H37Rv之间在IFN-Y诱导的II类MHC 水平方面的这种差异是可再现的，在五次独立的实验中，Ase"2突变 体显示HLA-DR转录物水平平均1. 5倍的差异(通过Student氏t检验 p- 0.00003)。通过引入野生型拷贝的secA2，补偿了Ased2突变体 在鼠巨噬细胞和THP-1细胞中的表型。这一数据提供了另一个实例， 即SecA2在结核分枝杆菌抑制宿主免疫应答的过程中发挥作用。 讨论
辅助分泌因子SecA2促成结核分枝杆菌的毒力。如本文用天然低 剂量喷雾感染模型所显示的，早在感染后9天，与亲本结核分枝杆菌 H37Rv相比，Ase^2突变体在小鼠的肺中具有较低的细菌负荷。突变 体的减毒表型在感染的早生长期期间出现，此时结核分枝杆菌主要在 未活化的巨噬细胞中生长。与此结果相一致，当与H37Rv相比，Asec^ 突变体在未活化的鼠骨髓巨噬细胞中具有生长缺陷。应当注意到当生 长在肉汤培养基中时，A""2突变体并不显示任何显著的生长缺陷 (Braunstein等，2001)。与在未活化的鼠巨噬细胞中的表型相比， A""2突变体在IFN-Y活化的巨噬细胞中并不显示表型。用原代鼠 巨噬细胞进行的体外实验似乎反映了在体内在鼠感染模型中观察到的 表型。由于SecA2是辅助分泌因子，SecA2的作用可能是胞内生长所 需的结核分枝杆菌蛋白质的适当分泌或表面定位。先前，将SodA和 KatG鉴定为其分泌入培养基中依赖于SecA2的蛋白质(Braunstein等， 2003)。由于这两种蛋白质都是抗氧化剂，考虑简单的假设，即SecA2 促进ROI的解毒并由此保护杆菌免受巨噬细胞的氧化爆发影响以促进 胞内生长。巨噬细胞生成的ROI可能具有直接的抗微生物作用或间接 的涉及宿主细胞信号传递途径改变的作用(Nathan, 2003; Thannickal
和Fanburg， 2000)。有输出的超氧化物歧化酶有助于细菌病原体毒力 的先例(Battistoni， 2003)，多种实验提示结核分枝杆菌SodA， KatG， 和表面定位的超氧化物歧化酶SodC在发病机理和保护对抗巨噬细胞 氧化爆发中的作用(Dussurget等，2001; Edwards等，2001; Manca 等，1999; Ng等，2004; Piddington等，2001)。不过，当在phox— 巨噬细胞中检验Asecy^突变体时，它显示出等同于在野生型C57BL/6 巨噬细胞中观察到的生长缺陷。此外，检测厶sec^ 突变体对ROI物 质包括胞外生成的超氧化物的改变的体外敏感性的努力是不成功的。 总而言之，这些实验并未揭示SecA2在保护对抗氧化爆发中的作用， 并且它们表明SecA2在胞内生长中的不同功能。
然而，SecA2有助于ROI抗性的可能性并不能被完全排除。在巨 噬细胞中和在体外保护对抗ROI的作用可能被SecA2在胞内生长中的 其它功能和/或结核分枝杆菌的众多ROI抗性机制所遮蔽。另外，即使 在缺乏吞噬细胞氧化酶的情况下，仍然有活性氧物质在细胞中通过线 粒体电子传递而生成。线粒体生成的R0I促成Ased2突变体表型的可 能性并不能被排除。
还评估了 SecA2在调节免疫应答中的作用。越来越明显的是毒性 结核分枝杆菌抑制先天性和适应性的免疫应答。关于先天性免疫应答， 在共感染测定中已经显示结核分枝杆菌抑制巨噬细胞产生IL-12 (Nau 等，2002)。此外，有新出现的倾向，即毒性结核分枝杆菌菌林比毒性 较弱的结核分枝杆菌菌林由巨噬细胞引发降低水平的促炎性细胞因子 (包括TNF-a和IL-6)和RNI。已经对于结核分枝杆菌的高毒性HN878 菌林和结核分枝杆菌的高毒性mcel突变体描述过这一现象(Manca等， 2004; Reed等，2004; Shimono等，2003)。还有毒性结核分枝杆菌 由巨噬细胞引发细胞因子和RNI的水平或活性低于減毒和无毒分枝杆 菌的报道(Balcewicz-Sablinska等，1998; Beltan等，2000; Falcone 等，1994; Freeman等，2006)。不过，必须注意到对于TNF-a来说， 提高的分枝杆菌毒力和降低的细胞因子产生之间的关联不是普遍的发 现(Byrd， 1997; Engele等，2002;Rao等,2005; Silver等，1998)。
关于适应性应答，结核分枝杆菌抑制巨噬细胞对IFN-Y刺激的反应， 诸如II类MHC的上调(Fortune等，2004; Nagabhusha画等，2003; Noss等，2000; Pai等，2004)。 II类MHC和分枝杆菌抗原向CD4+ T 细胞的呈递是针对结核分枝杆菌的适应性免疫应答的基本组成成分 (Flynn和Chan， 2001)。
在本研究中，感染A""2突变体的巨噬细胞比感染H37Rv的巨 噬细胞产生显著更高水平的TNF-oc ， IL-6和RNI。这提示SecA2在抑 制先天性免疫应答中的功能。未能检测到受感染巨噬细胞产生IL-12。 相对于H37Rv对于A^ec^ 突变体观察到的IFN-yi秀导的II类MHC信 使水平的提高提示，SecA2在抑制适应性免疫应答中的额外作用。这 是对具有抑制IFN-Y反应的缺陷的结核分枝杆菌突变体的第一次报 道。
SecA2的这些免疫调节活性可能对于结核分枝杆菌毒力是重要 的。被鉴定为受SecA2调节的所有宿主分子都被证实有助于控制小鼠 模型中的结核病。正如与野生型小鼠感染相比器官细菌负荷增多以及 存活时间长度缩短所示，TNF-ot, IL-6， N0S2，或CIITA(II类MHC转
录调节蛋白)缺陷的小鼠全部都对结核分枝杆菌感染更加易感(Bean 等，1999; Flynn等，1995; MacMinking等，1997b; Repique等，2002; Saunders等，2000)。 SecA2的免疫抑制作用可能以许多方式影响结核 分枝杆菌感染的过程，包括建立允许在巨噬细胞中进行胞内生长的环 境和限制宿主中的抗原呈递。通过用A"c^突变体感染N0S2—〃巨噬细 胞，证实对RNI的抑制并不是SecA2调控的用来促进胞内生长的唯一重 要因素。Asec^ 突变体在巨噬细胞和小鼠中的减毒表型似乎反映了 多种细胞因子和效应物机制的不平衡，可能包括我们尚未识别的分子。 令人感兴趣的是，由感染了Ase"2突变体的巨噬细胞上调的所有四种 分子都与宿主细胞中的Toll样受体2(TLR2)和髓系分化因子88(MyD88) 信号传递途径相关联。在不同的程度上，分枝杆菌刺激TLR2-依赖性 MyD88-依赖性途径诱导TNF-oc 、 IL-6和RNI (Brightbi 11等，1999; Heldwein等，2003; Jang等，2004; Nicolle等，2004; Reiling等，
2002; Shi等，2005; Shi等,2003; Underhill等，1999)。因而， A"cW突变体通过TLR2-MyD88-依赖性途径传递信号的能力的提高可 以解释增强的巨噬细胞应答。不过，鉴于细胞信号传递途径的复杂性， 存在有其它不同的解释。令人感兴趣的是，TLR2在结核分枝杆菌抑制 IFN-y诱导的II类MHC的过程中也有作用(Fortune等，2004; Gehring 等，2003; Noss等,2001)。不过，我们的观察结果，即感染Asec^ 突变体比感染H37Rv导致更高的IFN-y诱导的II类MHC信使，与通 过增强的TLR2信号传递会预测的结果相反。结核分枝杆菌抑制IFN-Y反应的TLR2-非依赖性途径也已被鉴定，SecA2可能涉及其中 (Fortune等，2004; Quesniaux等，2004)。或者，由Asec"突变体 产生的TNF-a水平提高可与IFN-Y协同促进所观察到的II类MHC的 增力口(Watanabe和Jacob, 1991)。
改变免疫应答是其它细菌病原体为在宿主中存活所使用的策略， 涉及的细菌因子经常是通过特化分泌系统定位的分泌型和表面蛋白 (Coombes等，2004)。当前，在结核分枝杆菌中有两种已知的特化分 泌系统SecA2-依赖性系统和ESAT-6/Snm系统(Kurtz和 Braunstein, 2005)。令人感兴趣的是，定位小ESAT-6和CFP-10蛋 白的ESAT-6/S認系统也已被报道有助于免疫抑制(MacGurn等，2005; Stanley等，2003)。缺乏ESAT-6系统的 ^m^0 W《7T) 和 m迈夕O W"Jc)组分的结核分枝杆菌突变体引起巨噬细胞产生增加水 平的TNF-ct、 RNI和IL-12。另外，结核分枝杆菌m/b突变体表现出 在未活化的巨噬细胞中的生长缺陷和在小鼠中的早期生长表型 (Fortune等，2005; Guinn等，2004; Hsu等，2003; MacGurn等， 2005; Stanley等，2003)。对于s/ 边和A sed^突变体表型的类似性 没有直接的解释，因为A""2突变体分泌ESAT-6(数据未显示)。
因为SecA2是分泌因子，它在免疫调节中的作用最有可能与免疫 抑制因子的适当分泌或细胞壁定位有关。不过，尚未了解由SecA2定 位的所有蛋白质，特别是细胞壁蛋白质。分枝杆菌细胞壁是一种复杂 的结构，其包含许多不同的具有报道过的免疫调节特性的分子(Karakousis等，2004)。这些包括若千表面分子，据报道其影响炎性 TNF-ot、 IL-6和/或RNI的产生，诸如表面脂蛋白，脂阿拉伯甘露聚 糖(LAM)及其前体脂甘露聚糖(LM),结核菌醇dimycocerosates (PDIM 或DIM)，和经修饰的海藻糖二霉菌酸酯(Adams等，1993; Barnes等， 1992; Brightbill等，1999; Dao等，2004; Krutzik和Modlin， 2004; Quisniaux等，2004a， b; Rao等，2005; Rousseau等，2004)。 由A""2突变体引发的免疫应答增强可以解释如下，即细胞壁中不同 量的免疫调节分子，或改变的细胞壁结构，使得与宿主受体如TLR2 相互作用的刺激性分子更大暴露。因而，我们正在考虑这种可能性， 即SecA2的免疫抑制作用归因于在影响细胞壁结构的细胞壁合成酶的 定位中的作用。最后的可能性是Ase"2突变体表型实际上代表刺激性 分子的释放增多(Braunstein等，2003)。
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鉴于以上所述，可以看出实现了本发明的若干益处并取得了其它 益处。
由于可以对以上方法和组合物进行多种改变而不偏离本发明的范 围，意图将包含在以上说明书以及显示在附图中的所有内容都解释为 示例性的而非限定意义。
特此将本说明书中引用的所有文献都通过参考引用并入本文。在 此对参考文献的讨论仅仅意在概述由作者所作出的断言，而非承认任 何参考文献构成现有技术。申请人保留挑战所引用文献的准确性和适 当性的权利。
附录一 SEQ ID NO
SEQ ID NO: 1-鸡卵白蛋白的氨基酸残基252-269的编码序列 SII翻KL
SEQ ID NO:2-18S rRNA的探针 CAAATTACCCACTCCCGACCG
SEQ ID N0:3-18S rRNA的正向引物 GCTGCTGGCACCAGACTT
SEQ ID NO: 4 - 18S rRNA的反向引物 CGGCTACCACATCCAAGG
SEQ ID N0:5-鼠II类MHC(I-Ab)的探针 CGCAGCGCATACGATATGTGACCA
SEQ ID NO: 6 -鼠II类MHC(I-Ab)的反向引物 CTGTCGTAGCGCACGTACT
SEQ ID NO: 7 -鼠II类MHC (I-Ab)的正向引物 GGCGAGTGCTACTTCACCA
SEQ ID NO: 8 -人II类MHC (HLA-DRA)的探针 CTGGACCCTTTGCAAGAACCCTTCCC
SEQ ID N0:9-人II类MHC(HLA-DRA)的正向引物 TCCAATGAACGGAGTATCTTGTGT
SEQ ID NO: 10 -人II类MHC (HLA-DRA)的反向引物 TGAGATGACGCATCTGTTGCT
权利要求
1. 一种分枝杆菌，其包含(a)不在SecA2基因中的突变，其中当与不含该突变的野生型分枝杆菌相比时，包含该突变的野生型分枝杆菌在哺乳动物中显示减弱的毒力；和(b)在SecA2基因中的突变，其中该突变消除SecA2活性。
2. 权利要求1的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌是耻垢分枝杆菌 傲s顶eg迈"/s入牛分枝杆菌n ，鸟分枝杆菌化S7/'"迈入草分枝杆菌W. p力7e/入偶发分枝杆菌沐/o"u/twz7入7i/尸"，副 结核分枝杆菌况/7S了"u6ercu/oi /s人p合瓦那分才支杆菌(力a6a/ fl)， 瘰疬分枝杆菌沐sci^/""/sce"/i7人胞内分枝杆菌W. //7mce/7〃/sreJ 结核分枝杆菌(#. f"6erc"7c^/《)，或堪萨斯分枝杆菌(M ira"^y/7)。
3. 权利要求1的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌是牛分枝杆菌BCG。
4. 权利要求1的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌是结核分枝杆菌。
5. 权利要求l的分枝杆菌，其中所述不在^e"2基因中的突变 是RD1区的至少一部分中的缺失，或控制维生素或氨基酸产生的基因 中的缺失。
6. 权利要求1的分枝杆菌，其中至少一种所述突变由遗传工程 方法制得。
7. 权利要求1的分枝杆菌，进一步包含可操作连接至启动子的 重组基因，当该分枝杆菌感染哺乳动物细胞时，所述启动子指导该基 因的表达。
8. 权利要求7的分枝杆菌，其中所述基因编码赘生物、肿瘤或 癌的抗原。
9. 权利要求7的分枝杆菌，其中所述基因编码哺乳动物病原体 的抗原。
10. 权利要求9的分枝杆菌，其中所述病原体是病毒。
11. 权利要求9的分枝杆菌，其中所述病原体是细菌。
12. 权利要求9的分枝杆菌，其中所迷病原体是真核寄生虫。
13. 权利要求9的分枝杆菌，其中所述哺乳动物病原体是人病原体。
14. 包含在^d^基因中的突变的分枝杆菌，其中所述突变消除 SecA2活性，并且其中所述分枝杆菌不是结核分枝杆菌或耻垢分枝杆 菌。
15. 权利要求14的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌是牛分枝杆菌。
16. 权利要求14的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌是牛分枝杆菌BCG。
17. 权利要求14的分枝杆菌，其中所述突变通过遗传工程方法 制得。
18. 权利要求14的分枝杆菌，进一步包舍可操作连接至启动子 的重组基因，当该分枝杆菌感染哺乳动物细胞时，所述启动子指导该 基因的表达。
19. 权利要求18的分枝杆菌 或癌的抗原。
20. 权利要求18的分枝杆菌 体的抗原。
21. 权利要求20的分枝杆菌
22. 权利要求20的分枝杆菌
23. 权利要求20的分枝杆菌
24. 权利要求20的分枝杆菌 原体。
25. —种诱导哺乳动物免疫应答的方法，所述方法包括用权利要 求1-24任一项的分枝杆菌接种该哺乳动物。
26. 诱导人针对致病性分枝杆菌的免疫应答的方法，该方法包括 用分枝杆菌疫苗接种人，其中所述分枝杆菌疫苗包含含有在Se"2基 因中的突变的分枝杆菌，其中所述突变消除SecA2活性。，其中所述基因编码赘生物、肺瘤，其中所述基因编码哺乳动物病原，其中所述病原体是病毒。,其中所述病原体是细菌。，其中所述病原体是真核寄生虫。，其中所述哺乳动物病原体是人病
27. 权利要求26的方法，其中所述分枝杆菌疫苗包含牛分枝杆 菌或结核分枝杆菌。
28. 权利要求26的方法，其中所述分枝杆菌疫苗包含牛分枝杆 菌BCG。
29. 权利要求26的方法，其中所述分枝杆菌疫苗中的分枝杆菌 进一步包含不在Sed2基因中的突变，其中当与不含所述不在Sec^ 基因中的突变的野生型分枝杆菌相比时，包含所述不在Se"2基因中 的突变的野生型分枝杆菌在哺乳动物中显示减弱的毒力。
30. 权利要求29的方法，其中所述不在Se"2基因中的突变是 RD1区的至少一部分中的缺失，或控制维生素或氨基酸产生的基因中 的缺失。
31. 权利要求26的方法，其中所述分枝杆菌疫苗中的分枝杆菌 进一步包含可操作连接至启动子的重组基因，当该分枝杆菌感染哺乳 动物细胞时，所述启动子指导该基因的表达。
32. 权利要求31的分枝杆菌，其中所述基因编码赘生物、肿瘤 或癌的抗原。
33. 权利要求31的分枝杆菌，其中所述基因编码哺乳动物病原 体的抗原。
34. 权利要求33的分枝杆菌，其中所述病原体是病毒。
35. 权利要求33的分枝杆菌，其中所述病原体是细菌。
36. 权利要求33的分枝杆菌，其中所述病原体是真核寄生虫。
全文摘要
本发明提供了分枝杆菌，其包含(a)不在SecA2基因中的突变，所述突变减弱所述分枝杆菌在哺乳动物宿主中的毒力，和(b)在SecA2基因中的突变，所述突变消除SecA2活性。还提供了包含在SecA2基因中的突变的分枝杆菌，所述突变消除SecA2活性，其中所述分枝杆菌不是结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌。此外提供了使用以上分枝杆菌突变体诱导哺乳动物免疫应答的方法和诱导人针对致病性分枝杆菌的免疫应答的方法。
文档编号A61K39/04GK101395265SQ200780007413
公开日2009年3月25日 申请日期2007年1月11日 优先权日2006年1月12日
发明者M·布朗斯坦, S·A·波尔切利, W·R·雅各布 申请人:犹太大学阿尔伯特爱因斯坦医学院;查珀尔希尔北卡罗来纳大学