用于治疗神经障碍的lh或hcg和epo的给药方案的制作方法

专利名称：用于治疗神经障碍的lh或hcg和epo的给药方案的制作方法
专利说明本申请要求2006年3月17日提交的美国临时申请No. 60/783,500， 2006年4月5日提交的美国临时申请No. 60/789,132,和 2006年10月24日提交的美国临时申请No. 60/862,669的优先权和权益， 其全文在此引入作为参考。
背景分离和体外培养多潜能神经干细胞的技术的发展(例如，见 美国专利No. 5,750,376; 5,980,885; 5,851,832 )显著改进了神经变性疾病 和病症的治疗前景。已经发现胎儿脑可用于分离和体外培养多潜能神经 干细胞。而且，与长期以来认为胎儿脑细胞是不能复制或再生的脑细胞 的观点相反，已经发现神经干细胞也可从成体哺乳动物脑中分离。这些 干细胞，不管是来自胎儿还是成体脑中，是能够自我复制的。子代细胞 可增殖或分化为神经细胞系中的任何细胞，包括神经元，星形胶质细胞 和少突神经胶质细胞。因此，这些发现不仅提供了可用于移植的神经细 胞的来源，还证实了成体脑中多潜能神经干细胞的存在。某些试剂，神经干细胞增殖试剂，已#^发现在体外或体内增 加神经干细胞的数量。所述增加的机理可能包括刺激增殖，抑制分化， 和/或防止神经干细胞的死亡。附加试剂，干细胞分化试剂，已,皮发现在 体外或体内选择性增强神经元前体细胞或神经胶质前体细胞的生产。这 些增殖和分化试剂可因此用于增加和选择性增强神经元和神经胶质细 胞。
概述此处提供的是用于神经干细胞增殖试剂和分化试剂的有效给 药方案，其试剂盒和用途。所述物质的组合物和方法可短期利用(例如， 在神经伤害后或神经病学症状发作之后的数天内)或可长期利用(例如， 对于持续的神经伤害或发生中的神经病学症状)。而且，所述组合物和 方法可连续地或间歇地利用。
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相应的，提供了治疗或改善哺乳动物中的神经变性疾病或病 症的方法。本方法包含给予哺乳动物有效量的hCG或LH和有效量的 EPO,其中hCG或LH以至少三个剂量全身给药，任选的通过利用试剂 盒。hCG, LH和/或EPO可连续或间歇地给药。而且，hCG或LH可在 第一治疗期内给药，EPO可在第二治疗期内给药。例如，hCG或LH可 在第一治疗期的第1、 3和5天间歇给药，然后EPO可在第二治疗期的 第1、 2和3天连续给药。此处还提供了治疗或改善哺乳动物的神经变性疾病或病症的 其它方法。本方法包括在第一治疗期给予哺乳动物有效量的hCG或LH, 紧接着在第二治疗期给予有效量的EPO，任选的通过利用试剂盒。hCG 或LH可在第 一治疗期间歇给药并且EPO可在第二治疗期连续给药。例 如，hCG或LH可在第一治疗期的第1、 3和5天间歇给药，然后EPO 可在第二治疗期的第1、 2和3天连续给药。在本方法和试'剂盒中，治疗期可以是，例如，至少3天。本 治疗方法可重复几次或多次，具有第二、第三、第四、第五等治疗期。 不管是给药一次、两次、几次、或多次，本治疗方法可采取一个或多个 试剂盒的形式。本方法和试剂盒的详细内容在附图和下面的说明书中阐述。 本方法和试剂盒的其它特征、目标和优点将从说明书和附图和权利要求 中明显地表现出来。
附图简述

图1显示了进行了下述治疗的遭受了大脑中动脉闭塞 (MCAo)中风的大鼠功能恢复的效果，用逐渐增加剂量的hCG,在肌 肉内(IM)给予hCG剂量之后，每天静脉内(IV)给予1440 IU的EPO。图2显示了进行了下述治疗的遭受了 MCAo中风的大鼠与未 治疗对照相比功能恢复的区别效果，每天用440 IU的hCG并IV给予 1440 IU的EPO、单独用hCG、或单独用EPO。图3是显示进行了下述治疗的遭受了 MCAo中风的大鼠与未 治疗对照相比的组织损失％ (与非中风半球相比)的图，每天用440 IU 的hCG并IV给予1140 IU的EPO、单独用hCG、或单独用EPO。图4显示了进行了下述治疗的遭受了 MCAo中风的大鼠与未治疗对照相比的组织损失的示意图，每天用440 IU的hCG并IV给予 1140 IU的EPO、单独用hCG、或单独用EPO。图5是显示实施例2中在第三次IM给予hCG之后测量的血 清hCG水平的柱形图。图6显示了以10、 15、和20倍于用于脑室内输注的浓度对 雄性大鼠皮下输注催乳素六天的结果。展现了来自每个动物的8个切片 的室下区(SVZ)中的溴脱氧尿苷阳性(BrdU+)细胞总数量。SVZ增 殖水平的最大增加在15倍剂量时观察到(170 ng/天，进行6天)。(10 倍=113^/天；20倍=226貼/天；对照=仅用大鼠血清白蛋白(RSA))。相 对于对照的显著性10x=*p<0.05; 15x=**p<0.01;20x=p<0.05;对于所有 条件11=3;用Tukey posthoc测试进行单因素方差分析(ANOVA)。图7显示了对雄性大鼠利用每天单次腹膜内注射的催乳素给 药的结果。展现了每个给药方案的每个切片的BrdU+细胞总数量。(A) 对于高的3天剂量观察到SVZ增殖的小的增加。(B)对于增加SVZ 增殖水平的最强给药条件利用低的，每天170pg/天的剂量进行6天。显 著性是相对于RSA对照的。n=3; *p<0.05; **p<0.01;接着用Tukey posthoc测试进行单因素ANOVA。图8显示了在中风后(中风=第0天)第1、 3和5天单次肌 肉内注射hCG引起前脑SVZ显著增加的增殖。在1000 pg剂量条件(n二3; *p<0.05;用Tukey posthoc进行单因素ANOVA)下观察到每脑室的磷酸 -组蛋白H3阳性(pHH3+)细胞数量的显著增长。图象显示了 RSA软膜 条对照大鼠对比给药1000pg hCG的动物的侧脑室背外侧角中的核标记 Hoechst和pHH3的表达。注意对于给药1000 |tig的动物SVZ中总细胞 数量和pHH3的表达增加。图9显示了在中风后(中风=第0天)第1、3和5天每天单 次肌肉内注射1000 pg的hCG引发了前脑SVZ中神经发生的增加。确 定给药的动物中的doublecortin+神经元的数量，在1000 |ig给药的动物 中该数量翻倍。图10显示了中风后(中风=第0天)24小时开始每天单次 肌肉内注射hCG进行7天的结果。(A)每天330 ng/注射的给药方案相 对于所有其它给药条件和对照(11=3; *p<0.01;用Tukey posthoc进行单因 素ANOVA)显著增加了 SVZ中增殖的数量(pHH3+细胞)。(B)观察给药的大鼠的运动皮层中的缺血性病变，表明每天接受330 ng/注射的给药 方案的动物显示出新的组织生长并且用组织填料(tissue plug)填充病变位点。图11显示了通过计数BrdU+细胞确认的每天以330 pg/注射 的hCG给药的动物SVZ中增加的增殖。在330 ng/注射的条件下相对于 对照和100 pg/注射(pO.01; n=3;用Tukey posthoc分析的单因素 ANOVA)每脑室的BrdU+细胞数量显著增加了 。这些结果进一步确认了 用pHH3染色观察到的增殖的增加。不同图中相同的参考标记表示相同的成分。
i羊细4苗述目前没有临床上批准用于治疗神经系统疾病或病症的神经干 细胞增殖和分化试剂。这些试剂对于治疗神经系统疾病和病症是有用 的，因而需要有利用这些试剂的有效给药方案。在此提供了对于神经干 细胞增殖和分化试剂的有效给药方案，包含对于神经千细胞增殖试剂的 有效给药方案的试剂盒，和它们的用途。所述试剂盒和方法可短期利用 (例如，在伤害或神经变性疾病或病症发作之后的数天内)或可长期利 用(例如，对于'隄性神经变性疾病或病症)。而且，如下面进一步描述 的，本组合物和方法可连续或间歇利用。在此描述的方法利用用于治疗或改善神经变性疾病或病症的 神经干细胞增殖试剂。在这些方法中，在第一治疗期过程中给予神经干 细胞增殖试剂。神经干细胞增殖试剂可在第 一治疗期内连续或间歇给 予。可在第一治疗期过程中进一步添加神经干细胞分化试剂。实施例和 说明书包括神经干细胞增殖试剂(例如，催乳素、hCG 、 LH、 CSF、 G國CSF、 GM-CSF、 VEGF)和分化试剂(例如，EPO、 BDNF、 BMP、 PACAP)的用途；然而，所述试剂的类似物，片l殳或变体可类似的应用 于此处所述的任何方法、装置、或试剂盒中。作为一个特定的实施例， 公开了给予哺乳动物有效量的hCG或LH和有效量的EPO的方法，其 中hCG或LH以至少三个剂量全身给药。利用用于治疗或改善神经变性疾病或病症的神经干细胞增殖 试剂的这些方法可进一步包括在第二治疗期内给予神经细胞分化试剂， 所述第二治疗期开始于第一治疗期之后。第二治疗期可以是至少三天。可在第二治疗期中连续或间歇给予神经干细胞分化试剂。第二治疗期可 于第一治疗期结束后至少一天开始。作为一种特定的实施例，公开了一 种方法，在所述方法中，神经干细胞增殖试剂在第一治疗期中至少三次 全身连续给药，神经干细胞分化试剂在第二治疗期中给药。作为进一步 的实施例，公开了一种方法，其中第一治疗期是五天，神经干细胞增殖 试剂间歇给药，第二治疗期开始于第一治疗期结束后一天，并且神经干 细胞分化试剂连续给药至少三天。作为另一个实施例，可在第一治疗期
中给予有效量的hCG或LH,然后在第二治疗期中给予有效量的EPO。如此处所用，连续对受试者递送(deliver )或给予(administer) 物质意味着将该物质在连续数天的时期内至少一天一次的递送或给予。 例如，可通过注射(例如，IM或皮下)或口服至少每天一次全身给药， 或通过以导致每天递送到受试者的组织或血流中的方式输注给药。任选 的，该物质通过输注或输注以外的方式递送。如此处所用的，"全身" 一词不包括大脑内脑室输注。该物质持续递送或给予的持续期或治疗期 可持续三天到几年，甚至在受试者剩余的生命中持续。例如，持续期可 以是3 - 6天，3 - 14天，3-21天，3-28天，1-4个月，1-6个月，1-9个月， 1-12个月，1-2年，1-3年，1-5年，l-10年等。对于进一步的实施例，持续 递送的治疗期可以是至少三天，至少四天，至少五天，至少六天，至少 七天，或至少十四天。而且，该物质可在给药期第1， 2和3天连续递 送。如此处所用的，间歇的对受试者递送或给予物质意味着以少 于每天地递送或给予该物质，例如，在一l殳时期内每2, 3， 4, 5或7 天一次。例如，该物质可在一定治疗期内每隔一天递送或给予，例如， 在治疗期第1, 3和5天。该物质间歇递送或给予的持续期或治疗期可 持续三天到几年，甚至在受试者剩余生命中持续。例如，持续期可以是 3 - 6天，3 - 14天，3画21天，3-28天，1-4个月，l國6个月，l画9个月，1國12 个月，l-2年，l-3年，1-5年，l-10年等。对于进一步的实施例，间歇递送 的治疗期可以是至少三天，至少四天，至少五天，至少六天，至少七天， 或至少十四天。此处提供的方法，例如，可通过给予具有神经变性疾病或病 症的受试者有效量的增殖试剂，利用增殖试剂催乳素、hCG 、 LH、CSF、 G-CSF、 GM-CSF或VEGF治疗神经变性疾病或病症。作为例子，增
10殖试剂hCG和LH结合相同的受体，并可互换地在此处提供的特定实施 例中以等效剂量利用。作为进一步的实施例，增殖试剂hCG可以大约 120-200 IU/kg/天的剂量肌肉内给药，然后静脉内给予大约570-950 IU/kg/天的EPO。对于进一步的实施例，可以160IU/kg/天的剂量肌肉内 给予hCG,然后静脉内给予765 IU/kg/天的EPO。用hCG和LH间歇治 疗任选地包含数天的hCG或LH给药(例如，在第1, 3, 5天)。所述 神经干细胞试剂的给药可紧接着数天的间歇(例如，第7, 9, 11天) 或连续(例如，第7, 8, 9天)给予分化试剂例如EPO。等效剂量的其 它神经干细胞增殖试剂也可^^皮用于类似的方案中。因而，实施例4显示了催乳素(另一种增殖试剂)的给药方 案。不同量的催乳素每天给药进行了 6天，检查对神经干细胞数量的效 果。结果显示大约150-200pg/天(包括例如170^g/天)在该给药方案中 是最佳量。这种给药方案，大约170pg/天进行6天，然后通过缩短给药 期而改变(170^g/天进行3天)或将更高的每日剂量与缩短的期间结合 以获得类似的总剂量(大约396pg/天进行3天)。结果显示在更长时期 内持续递送更低剂量是有效的。
况。不意味着限二，、这种改进可与哺^动物中神经干细胞"数量"增加有 关。有效量的神经干细胞增殖试剂的效力可被最优化以增加哺乳动物中 神经干细胞数量或神经状况。本方法包括持续或间歇对哺乳动物给予神 经干细胞增殖试剂一段时间，其中给予的神经干细胞增殖试剂总剂量等 于有效量，并且其中该试剂在第 一治疗期内给予至少三次。此处所述的方法可被最优化以增加有效量的神经干细胞增殖 试剂对于治疗或改善哺乳动物的神经变性疾病或病症的功效。本方法包 括对哺乳动物持续或间歇给予神经干细胞增殖试剂 一段时间，其中在所 述时期内给予的神经干细胞增殖试剂总剂量等于有效量，并且其中该试 剂在第一治疗期内给予至少三次。神经干细^3曾殖试剂可在大约14天内(例如，0到大约14 天)给予中枢神经系统(CNS)损伤、症状发作、或诊断的哺乳动物。 如此处所用的，O天指CNS损伤、症状发作、或诊断的时间。任选的， 神经干细胞增殖试剂可在CNS损伤、症状发作、或诊断的大约13, 12, 11， 10,9,8,7,6,5,4,3,2,或1天内(例如，0到大约5天)给予。任选的，神经干细^9包增殖试剂可在CNS损伤、症状发作、或诊断的24小时内给 予哺乳动物。任选的，神经干细胞增殖试剂可在CNS损伤、症状发作、 或诊断的12， 11， 10, 9, 8, 7, 6, 5，4, 3, 2, 1小时内给予哺乳动物。对于间歇治疗，可利用更高剂量的试剂，或可利用连续治疗。 特别的，神经干细胞增殖试剂可在连续模式中以低剂量给予哺乳动物受 试者，与以高剂量间歇给予相反。神经干细胞增殖试剂任选的在神经损 伤或神经病学症状发作之后24到72小时之内给药。任选的，神经干细 胞增殖试剂的连续给药是进行2-5天。例如，对于给定总有效量的催 乳素，或催乳素的类似物、片段或变体，包含每天递送总量的1/6进行 6天的给药方案比每天递送总量的1/3进行3天更有效。在类似范例中 可利用等效剂量的其它神经干细胞增殖试剂。此处描述的方法也可包括监视哺乳动物生物液中神经干细胞 增殖试剂或神经干细胞分化试剂的水平。监^L的生物液可以例如是脑脊 髓液或血液。例如，血清中hCG (或另一种神经干细月包增殖试剂或神经 干细胞分化试剂)的水平可在治疗期之内或之后在给药后测量。等效水 平的不同神经干细胞增殖试剂或神经干细胞分化试剂都可以在生物液 中被测量和监视。此处还提供了治疗或改善哺乳动物的神经变性疾病或病症的 试剂盒。试剂盒包含至少三个剂量单元的在第一治疗期内给予的神经干 细胞增殖试剂。在第 一治疗期内给予的神经干细胞增殖试剂总剂量可以 等于有效量。治疗期可以是至少三天。试剂盒可包括试剂盒的使用说明 书。使用说明书可以是对于神经干细胞增殖试剂的连续给药或间歇给 药。试剂盒可进一步提供至少三个剂量单元的分化试剂。分化试 剂可在第 一治疗期内利用。在第 一治疗期内给予的分化试剂的总剂量可 等于有效量。治疗期可以是至少三天。分化试剂的治疗期任选是用神经 干细胞增殖试剂的治疗期之后的第二或随后的治疗期。试剂盒可包括分 化试剂的使用说明书。该使用说明书可以是对于神经干细胞增殖试剂的 连续给药或间歇给药。试剂盒中神经干细胞增殖试剂、分化试剂、或其它试剂每种 的总剂量可在一个容器、多个容器、或在其任何组合中提供。例如，一 种或多种神经干细胞增殖试剂的总剂量可在一个适于提供计量的剂量或适于提取剂量的容器中，所述提取例如是被待治疗的人或被另外的人 例如护理者进行。 一种或多种神经干细胞增殖试剂可存在于多个容器中 而不是单个容器中，所述多个容器提供适于每天、每周、每月等给药的 等分量的剂量。用于分化试剂或其它试剂的单个容器或多个容器可类似 地在该试剂盒中提供。也可包括组合，其中试剂盒中可包含一个容器的 神经干细胞增殖试剂，多个容器的分化试剂，或相反。而且，用于第一 治疗期的神经干细胞增殖因子的总剂量可以在一个单独的容器中或多 个容器中，第二治疗期的总剂量可以在一个单独容器中或多个容器中， 或其组合。神经干细胞增殖试剂和分化试剂可任选的包装在试剂盒中， 以使试剂盒中包含治疗期中待递送的神经干细胞增殖试剂和分化试剂 的总量。试剂盒可任选包含其它成分或其它成分的组合，包括例如血液 取样装置或其成分。试剂盒可进一步包含监视患者中的血细胞比容水平的装置或 设备或从患者中去除一定量的血液的适当的装置或同时包括监视装置 和血液采样装置。血液采样和监视是需要的，因为血细胞比容水平可能 上升到高于可接受的水平。可接受的血细胞比容水平可以通过任何本领 域已建立的标准确定。任选的，用于给药的给药装置可包括在试剂盒中，其包含神 经干细胞增殖试剂和/或分化试剂。试剂盒可适于用于健康护理机构，例如住院患者护理机构或 紧急护理机构。健康护理机构包括例如医院。试剂盒还适于在离开住院 患者护理机构之后或没进入时使用。以试剂盒形式的包装有利于患者早 日离开健康护理机构，通过允许在长期护理机构中或在家中的患者治 疗，例如通过自我治疗、门诊患者治疗、或通过护理者或健康护理提供 者在家中或长期护理机构中等的治疗而实现。类似的，以试剂盒形式的 包装允许患者在紧急情况下的立即治疗，包括在急诊室或通过定点紧急 护理提供者(例如，通过紧急医师，运动教练员等)。在本方法和试剂盒中，时期可以是例如至少3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 14、 21、 28天，或在3到28天之间的任何天数。 任选的，本方法和试剂盒可包含在第二治疗期中连续给予哺乳动物神经 干细胞增殖试剂，其中第二治疗期开始于该时期结束后至少1、 2或3
13天的间隔，并且其中第二治疗期是至少三天。第二治疗期，类似第一治
疗期，可以是，例如至少3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 14、 21 或28天。第一治疗期和接下来的治疗期之间的间隔也可以是例如至少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 14、 21或28天。这种治疗 曰程可重复几次或多次。用于第二或后来的治疗期的神经干细胞增殖试 剂可以与用于第 一 治疗期或其它治疗期中使用的神经干细胞增殖试剂 相同或不同。而且，在单个治疗期中可利用一种以上的神经干细胞增殖 试剂。因而，本方法中有用的试剂盒可包含用于一种或多种治疗期的一 种或多种神经干细胞增殖试剂。神经干细胞增殖试剂或其它试剂(例如，分化试剂)可通过 本领域已经建立的任何方法给药，例如，通过静脉内、动脉内、结肠内、 气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、髓内、胸膜内、皮内、 皮下、肌肉内、口服、局部给药、肺给药、或其任意组合。任选的，用 于给药的药物递送装置或其元件可包括在含有神经干细胞增殖试剂的 试剂盒中。神经干细胞增殖试剂可以是能够在体外或在体内增加哺乳动 物神经干细胞数量的任何物质。此处所用的促进试剂与增殖试剂具有相 同含义。可增加神经干细J包数量的试剂包括^旦不限于
1. 促卵泡激素(FSH),其经常与LH的作用相合作，并且诱导LH 受体表达，因而增强LH信号传导的效果。
2. 生长激素(GH),其可刺激神经干细胞增殖。
3. 胰岛素生长因子(IGFs),包括IGF-1，其是从响应于GH的许多 组织中释放并且介导GH的许多生长增殖效应的生长调节素
(somatomedians ),并且其刺激神经干细月包增殖。
4. 生长激素释放激素(GHRH),其从下丘脑分泌，并且诱导GH 从垂体前叶释放，引起循环GH的增加的水平。
5. 催乳素(PRL),其从垂体前叶中分泌并且促进神经干细胞增殖。
6. 催乳素释放肽(PRP),其引发催乳素的释放。
7. 成纤维细胞生长因子(FGF),神经干细胞的促有丝分裂试剂。
8. 雌激素，其促进神经干细胞的增殖，包括例如在海马中。
9. 血清素，其促进海马中神经干细胞的增殖。
10. 表皮生长因子(EGF),神经干细胞的促有丝分裂试剂。11. 转化生长因子a (TGFoc ),神经干细胞的促有丝分裂试剂。
12. 促性腺激素释放激素(GnRH)，其引发LH的释放。
13. 睫状神经营养因子(CNTF)和白血病抑制因子(LIF)，其通过一种信号传导途径通过gp130亚基传导信号，所述信号传导途径促进神经干细胞自我更新，因而扩增脑神经干细胞群体。
14. 集落刺激因子(CSF)。
15. 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
16. 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
17. 血管内皮生长因子(VEGF)。
18. 促黄体素(LH)。
19. 人绒毛膜促性腺激素(hCG)。而且，可给予神经细胞分化试剂以选择性增强神经元形成或神经胶质细胞形成。这些分化试剂也可根据给药方案和试剂盒递送。示例性的分化试剂包括但不限于
1. 红细胞生成素(EPO),其增进神经干细胞定型为神经细胞谱系，并且对于治疗小鼠和大鼠的中风模型是有用的。
2. 源自脑的神经营养因子(BDNF),其是一种已知的促进神经谱系的存活因子和分化试剂。
3. 转化生长因子P和骨形态发生蛋白(BMPs),其是促进神经谱系和特定神经表型(例如，脊髓中的感觉中间神经元)的产生的分化试剂。
4. 甲状腺激素(TH,包括T3和T4形式)，一种促进少突神经胶质细胞的成熟和产生的分化试剂，见例如Rodriguez-Pena, 1999。
5. 甲状腺刺激激素(TSH)和曱状腺释放激素(TRH),其促进TH从垂体前叶中释放，产生增加水平的循环TH。这种试剂可与LH或hCG组合使用以促进从神经干细胞的少突神经胶质细胞发生。
6. 音猬蛋白(sonic hedgehog) (SHH), —种在发育过程中使发育的CNS成形的形态发生素，并且以不同的浓度促进特定类型的神经元
(例如，脊髓中的运动神经元)和少突神经胶质细力包的产生。这种试剂可与LH或hCG组合使用以促进从神经干细胞的神经发生和/或少突神经胶质细胞发生。
7. 血小板源生长因子(PDGF),其促进少突神经胶质细胞从神经干细胞的产生和分化。这种试剂可与LH或hCG组合使用以促进从神经干
15细胞的少突神经胶质细胞发生。
8.环AMP和增强cAMP途径的试剂，例如垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)和血清素，其选择性促进神经元的产生。任何方法和试剂盒可包含多种神经干细胞增殖试剂和/或神经细胞分化试剂。因而， 一种或多种神经干细胞增殖试剂可共同或相继
且， 一种或多种神经干细胞增殖试剂和一种或多种神经干细胞分化试剂可共同或相继给药，并且可通过分别的组合物或组合在单个组合物中的形式给药。例如，PRL和LH或hCG可组合使用以使神经干细胞增殖最大化；PRP可与LH或hCG组合使用以使神经干细胞增殖最大化；GnRH可与LH或hCG组合使用或替代其使用以增加LH的循环水平并且增强
经干细胞增殖和增加CNS中神经干细胞群的大小。进一步例如，催乳素可与EPO —起使用，LH可与EPO —起使用，hCG可与EPO —起使用。没有明确阐述的所有其它组合也可使用。这些因子的适当的剂量可根据本领域已经建立的方法确定。例如，催乳素的剂量范围为可以是从大约0.510 IU/kg/天到大约100,000IU/kg/天，例如，大约0.510-100,000; 0.510-75,000; 0.510-50,000;0.510-25,000; 0.510-10,000; 100-5,000; 100-2,000; 500-2,000; 1,000-2,000;100-1,000; 200-800 IU/kg/天。hCG的剂量范围可以是从大约0.5 IU/kg/天到大约3,000,000 IU/kg/天，例如，大约0.5-2,000,000; 0.5-1,000,000;0.5-500,000; 0.5-250,000; 0.5-100,000; 0.5-50,000; 10-25,000; 10-10,000;240-216,000; 1,200-2,000; 2,160;或1,600 IU/kg/天。hCG也可以10,000IU/天的剂量提供。LH的剂量范围可以是从大约0.5 IU/kg/天到大约500,000 IU/kg/天，例如，大约0.5-300,000; 0.5-200,000; 0.5-100,000;0.5-50,000; 0.5-25,000; 24-21,600; 1,000; 120-200; 216;或160 IU/kg/天。LH也可以10,000 IU/天的剂量提供。EPO的剂量范围可以是从大约100IU/kg/天到大约2000IU/kg/天，例如，大约100-1500; 100-1000; 160-1000;570-950; 765;或1020 IU/kg/天。EPO也可以30,000 IU/天的剂量提供。可利用等效剂量的其它试剂。此处的剂量指在整个治疗期中每天或间歇地递送的平均剂量。例如，如果神经干细胞增殖或分化试剂不是每天递送，在整个治疗期中的递送试剂总量可除以包括间隔的治疗期的总天
16数，以获得每天的剂量。
指定特定的剂量单元(也就是，在治疗期中的系列给药的;次给药^量二
这些剂量单元可以是特定的剂量和此处指定的剂量范围。剂量单元可根据必须给予以获得受试者中神经干细胞增殖或分化试剂的期望水平的
量来界定。例如，提供血清中0.03 IU/L到5,000,000 IU/L的神经千细胞增殖或分化试剂水平的神经干细胞增殖试剂的剂量单元。或，作为进一步的例子，提供脑脊髓液中大约0.003 IU/L到大约5,000 IU/L的增殖试剂水平的神经干细胞增殖或分化试剂的剂量单元。当神经干细胞增殖试剂和分化试剂全身给药时，血脑屏障渗透剂可任选地包括在试剂盒中或用于方法中以促进进入脑中。血脑屏障渗透剂是本领域已知的，包括例如緩激肽和描述于美国专利No.5，686,416; 5,506,206和5，268,164中的緩激肽激动剂(例如，NH2 -精氨酸-脯氨酸-hydroxyproxyproline -甘氨酸-p塞吩丙氨酸-丝氨酸-脯氨酸-4 - Me -酪氨酸c]; (-012丽)-精氨酸-COOH)。作为选择地，如美国专利No. 6,329,508; 6,015,555; 5,833,988或5,527,527所述，待递送的神经干细胞增殖试剂或分化试剂可与转铁蛋白受体抗体配合。神经干细胞增殖试剂和分化试剂还可作为融合蛋白给药，所述融合蛋白包含神经干细胞增殖或分化试剂和与脑毛细管内皮细胞受体具有反应性的配体，例如转铁蛋白受体(见例如美国专利No.5,977,307)。药物组合物可通过将期望的治疗剂和适于计划的给药途径的适当载体混合而制备，任选用于适当的给药装置中。在制备本发明的药物组合物中，治疗剂通常与赋形剂混合，被赋形剂稀释或包封在所述载体中，所述载体可以是胶嚢、嚢袋(sachet)、纸或其它容器的形式。当药学上可接受赋形剂作为稀释剂时，它可以是固体、半固体、或液体物质，其作为治疗剂的媒介、载体或介质。因而，组合物可以是下列形式片剂、丸剂、粉末剂、锭剂、嚢剂、扁嚢剂(cachets )、酏剂(elixirs )、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、含有例如达10%重量的治疗剂的膏剂、软和硬的明胶胶嚢、栓剂、无菌可注射溶液、和无菌包装4分末。适当的赋形剂的一些例子包括人工脑脊髓液，乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯树胶，磷酸钓，藻酸盐，黄芪胶， 明胶，硅酸钾，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，无菌水，糖浆， 和曱基纤维素。制剂中可另外包括润滑剂例如滑石，硬脂酸镁，和矿
物油；湿润剂；乳化和悬浮剂；防腐剂例如甲基苯甲酸盐和丙羟基苯甲 酸盐；甜味剂；和调味剂。本发明的组合物可配制为在利用本领域已知 方法给予患者之后提供治疗剂的快速，持续或延迟释放。对于制备固体组合物例如片剂，治疗剂与药学赋形剂混合以 形成包含本发明的化合物的均质混合物的固态前制剂(preformulation) 组合物。当将这些前制剂组合物表示为均质时，意味着治疗剂均匀地分 散在组合物中以致组合物可容易的细分为等效的单元剂量形式，例如片 剂、丸剂和胶嚢剂。本发明的片剂或丸剂可以是包衣的或另外是复合的 以产生提供延长作用的优点的剂形。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量 和外部剂量成分，后者的形式为包裹在前者之外。这两种成分可被肠衣 层(enteric layer)隔开，所述肠衣层的作用是抵抗胃中的分解并允许内 部成分完整地进入十二指肠中或净皮延迟释放。对于所述肠衣层或包衣可 利用多种物质，所述物质包括多种聚合酸和聚合酸和例如虫胶，十六烷 醇和醋酸纤维素的材料的混合物。可用于口服或注射给药的本发明新的组合物的液体形式可以 包括水溶液、适当调味的糖浆、水性或油性悬浮液、和用食用油调味的 乳剂，所述食用油例如是玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油， 以及酏剂和类似药物々某介。用于吸入或吹入的组合物包括药学上可接受的水或有机溶剂 或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可包含此 处所述的适当的药学上可接受的赋形剂。组合物通过为局部或全身效果 的口服或鼻吸途径给药。处于优选药学上可接受溶剂中的组合物可以利 用惰性气体成喷雾状。喷雾状溶液可从喷雾装置中直接吸入，或者喷雾 装置可附着于面罩吸入器，或间歇加压呼吸装置。溶液、悬浮液、或并分末组合物可从以适当方式递送制剂的药 物递送装置优选口服或经鼻给药，用于本发明的方法的另一种制剂利用 透皮药物递送装置("贴片")。所述透皮贴片可用于提供以控制量的 本发明治疗剂的连续或不连续的输注。用于给药的透皮贴片的结构和用 途是本领域公知的。见例如，美国专利No. 5,023,252,此处全文引入作为参考。所述贴片可以为连续的，脉动的，或根据给药需要而构造。其
它适于用于本发明的制剂可在Remington's Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, ed. University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia Pa.， 2005中找到。利用此处描述的方法和试剂盒治疗的哺乳动物可以是任何年 龄的，包括儿童，青少年，和成体。本申请中使用的词语如下定义，除非有相反的提示。
神经干细胞是神经细胞系中的干细胞。干细胞是能够自我复 制的细胞。换句话说，产生于干细胞分裂的子细胞包括干细胞。神经干 细胞能够最终分化为神经细胞系的所有细胞类型，包括神经元、星形胶 质细胞和少突神经胶质细胞，星形胶质细胞和少突神经胶质细胞统称为 神经胶质或神经胶质细胞。因而，此处表示的神经干细胞是多潜能神经 干细胞。神经干细胞增殖试剂是能够增加神经干细胞数量的物质，例 如，通过刺激增殖、抑制分化、和/或防止神经干细胞死亡。神经变性疾病或病症是与神经元丧失或功能障碍相关的疾病 或医疗状况。神经变性疾病或病症的例子包括神经变性疾病，中枢神经 系统损伤或功能障碍。神经变性疾病包括，例如，阿尔茨海默氏病或其 它痴呆、多发性硬化症(MS)、精神分裂症、黄斑变性、青光眼、糖 尿病性视网膜病、外周神经病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、和 帕金森氏症。CNS损伤包括，例如，脑血管事件，如中风(例如，出血 性中风、局部缺血性中风或全脑缺血性中风)、眼缺血、和硬脑膜窦血 栓；创伤性脑或脊髓损伤(例如，由脑或脊髓外科手术或人身事故导致 的损伤)；震荡；由药物导致的损伤(例如，化疗、消闲性药物(recreational drugs)、和精神抑制药)；冠状动脉旁路移植术(CABG);和分娩中 的缺血症。CNS功能障碍包括，例如，抑郁症、癫痫症、神经机能病和 精神病。神经变性病症的实例包括衰老。室下区的神经干细胞数量在年 老小鼠中显著降低。相应的，与衰老问题有关问题的改善通过根据本方 法和试剂盒给予神经干细胞增殖试剂和任选的神经千细胞分化试剂而 获得。治疗和改善表示减少或完全去除疾病或医疗状况的一种或多 种症状(包括神经症状或行为表现)。所述治疗或改善可包括当对有疾病或医疗状况风险的患者给药时延迟或消除一种或多种症状的发作。治 疗或改善的成功的实验是本领域公知的。
水平上具有i少大约30%同^一性。多肽与天然因子:氨基酸水平lj二 性优选至少大约40% ,更优选至少大约60% ,仍然更优选至少大约70 %,并且最优选至少大约80%。因而，基本相似性可在大约30 - 99% 同一性之间。类似物或变体与天然因子的同 一性百分比或同 一性％的表述 指当比对时也在类似物或变体中发现的天然因子中的氨基酸序列百分 比。同一性百分比可通过本领域已经建立的任何方法或算法确定，例如， LALIGN或BLAST 。如果多肽能够结合天然因子的受体或被针对天然因子的多克 隆抗体识别，则该多肽具有天然因子的生物活性。优选地，多肽能够在 受体结合测试中特异性结合天然因子的受体。天然因子的功能激动剂是结合并活化天然因子的受体的化合 物，尽管它不必要具有与天然因子的基本序列相似性。促黄体素或LH是包含天然哺乳动物(例如，人)LH的蛋白或 与天然哺乳动物LH相当(comparable)的多肽序列的蛋白。如此处所 用，LH类似物、变体或片段(l)包含与天然哺乳动物LH具有基本序 列类似性的多肽，优选天然人LH;和(2)具有天然哺乳动物LH生物 学活性。天然哺乳动物LH是由垂体前叶分泌的促性腺激素。LH是由非 共价结合的a和P亚基组成的异源二聚体。oc亚基在LH,FSH和HCG中 是共同的，P亚基对于每种激素是特异的。在本方法和试剂盒中有用的 LH可以具有天然a亚基，和与天然哺乳动物LH具有基本序列类似性的 P亚基。可选的，LH可具有天然P亚基，和与天然哺乳动物LH具有基 本序列类似性的a亚基。LH类似物、变体或片段也可同时具有与天然 相应的亚基具有基本序列类似性的oc亚基和P亚基。因而，术语LH类 似物或变体包含天然LH亚基的缺失、插入、或取代突变体。而且，术 语LH包括来自其它物种的LH和其天然存在的变体。另外，LH类似物 也可以是天然哺乳动物LH受体的功能性激动剂。人绒毛膜促性腺激素或hCG是包含天然哺乳动物hCG (例 如，人的)或与天哺乳动物hCG类似的多肽序列的蛋白。如此处所用，hCG类似物，变体、或片段(l)包含与天然hCG具有基本序列类似性 的多肽；和(2)具有天然hCG的生物学活性。天然hCG是由非共价结 合的a和P亚基组成的异源二聚体。oc亚基在LH,FSH和HCG中是共同 的，p亚基对于每种激素是特异的。然而，hCG和LH的P亚基之间具 有85%的序列类似性。本发明和试剂盒中有用的hCG可具有天然oc亚 基，和与天然hCG具有基本序列类似性的P亚基。可选的，hCG可具 有天然P亚基，和与天然hCG具有基本序列类似性的a亚基。hCG类
的a亚基和^亚基。"二，、术语:CG'i似: 变:/或S段包含了天然 hCG亚基的缺失、插入、或取代突变体。而且，术语hCG包括了来自 其它物种的hCG相似物和其天然存在的变体。另外，hCG类似物也可 以是天然哺乳动物hCG/LH受体的功能性激动剂。催乳素是包含天然哺乳动物催乳素(例如，人的)或与天然 哺乳动物催乳素类似的多肽序列的多肽。如此处所用，催乳素类似物、 变体或片段(1)与天然哺乳动物催乳素具有基本序列类似性，优选天 然人催乳素；和(2)具有天然哺乳动物催乳素的生物学活性。天然人 催乳素是主要在垂体腺中合成的199个氨基酸的多肽。因而，术语催乳 素包括了催乳素类似物、变体或片段，其是天然催乳素的缺失、插入、 或取代的突变体。而且，术语催乳素包括了来自其它物种的催乳素和其 天然存在的变体。另外，催乳素类似物、变体或片段也可能是天然哺乳动物催 乳素受体的功能性激动剂。例如，功能性激动剂可以是美国专利No. 6，333,031中公开的催乳素受体的活化氨基酸序列；具有催乳素受体激动 剂活性的金属复合受体配体(美国专利No. 6,413,952); G120RhGH,其是 人生长激素类似物但作为催乳素激动剂(Mode et al., 1996);或美国专利 No. 5,506,107和5,837,460中描述的催乳素受体的配体。表皮生长因子或EGF是包含天然哺乳动物EGF或类似于哺乳 动物EGF的多肽序列的蛋白。如此处所用，EGF类似物、变体、或片段 与天然EGF具有基本氨基酸序列类似性，并具有天然EGF的至少一种 生物学活性，例如与EGF受体的结合。特别包括的作为EGF的是任何 物种的天然EGF、 TGFa、或重组修饰的EGF。特定的例子包括但不限 于，具有两个C末端氨基酸的缺失和位点51的中性氨基酸取代的重组
21修饰的EGF (特别是EGF51 gln51 ; 美国专利申请公开No. 20020098178A1 )，位点16的His残基纟皮中性或酸性氨基酸取代的EGF 突变蛋白(EGF-X16)(美国专利No, 6,191,106),缺乏天然EGF的氨基 末端残基的EGF的52-氨基酸缺失突变体(EGF-D) , N-末端残基以 及两个C-末端残基(Arg-Leu)被删去的EGF缺失突变体(EGF-B),位点 21的Met残基净皮氧化的EGF-D ( EGF-C )，位点21的Met残基被氧化 的EGF-B (EGF-A),肝素结合性EGF样生长因子(HB-EGF ) , P -细 胞素，双调蛋白，神经调节蛋白，或包括上述任何蛋白的融合蛋白。其 它有用的EGF类似物，变体和片段描述于美国专利申请公开No. 20020098178Al,和美国专利No. 6,191,106和5,547，935。另外，EGF类似物、变体、或片段也可以是天然哺乳动物EGF 受体的功能性激动剂。例如，功能性激动剂可以是公开于美国专利No. 6,333,031中的EGF受体的活化氨基酸序列，或具有EGF受体激动剂活 性的抗体(Fernandez-Pol, 1985和美国专利No. 5,723,115)。垂体腺苷酸环化酶活化多肽或PACAP是包含天然哺乳动物 PACAP (例如，人)或与天然哺乳动物PACAP类似的多肽序列的多肽。 如此处所用，PACAP类似物、变体、或片段是天然PACAP或任何PACAP 类似物、变体、或片段，所述PACAP类似物、变体、或片段与天然PACAP 具有基本氨基酸序列类似性并具有天然PACAP的至少一种生物学活 性，例如与PACAP受体的结合。有用的PACAP类似物、变体、和片段 包括但不限于，PACAP的38氨基酸和27氨基酸变体(分别为PACAP38 和PACAP27),以及公开于例如美国专利No. 5,128,242; 5,198,542; 5,208,320; 5,326,860; 5,623,050; 5,801,147和6,242,563中的类似物和变 体。另外，PACAP类似物、变体、和片l殳也可以是天然哺乳动物 PACAP受体的功能性激动剂。例如，功能性激动剂可以是maxadilan, 一种作为PACAP 1型受体的特异性激动剂的多肽(Moro etal.， 1997)。红细胞生成素或EPO是包含天然哺乳动物EPO(例如，人)或 类似于天然哺乳动物EPO的多肽序列的蛋白。如此处所用，EPO类似 物、片段或变体与天然EPO具有基本氨基酸序列相似性，并具有天然 EPO的至少一种生物学活性，例如与EPO受体的结合。EPO类似物、 变体、和片段的例子公开于，例如，美国专利N0.6048971和5614184。
另夕卜，EPO类似物、变体、或片段也可以是天然哺乳动物EPO 受体的功能性激动剂。例如，功能性激动剂可以是EPO模拟肽l(EMPl; Johnson et al., 2000);描述于Wrighton et al., 1996和美国专利No. 5,773,569中的一种EPO的短肽才莫拟物;公开于Kaushansky, 2001中的任 何小分子EPO模拟物；描述于美国专利No. 5,885,574、 WO 96/40231、 WO 97/48729, Fernandez-Pol, 1985或美国专利No. 5,723,115中的活化 EPO受体的抗体；公开于美国专利No. 6,333,031中的EPO受体的活化 氨基酸序列；具有EPO受体的激动剂活性的金属复合受体配体(美国专 利No. 6,413,952),或描述于美国专利No. 5,506,107和5，837,460中的 EPO受体配体。LH/hCG -诱导试剂是当给予动物时能够增加动物中的LH或 hCG量的物质。例如，LH-释放激素(LHRH)刺激LH的分泌。哺乳动物信息素可以是包含天然哺乳动物信息素(例如，人) 或类似于天然哺乳动物信息素的多肽序列的蛋白或小分子。如此处所 用，信息素类似物、变体、或片段是作为对相同物种的另一动物的信号 的物质，所述动物通常为相反性别。优选地，信息素选自2-仲-丁基 —4, 5 — 二氢瘗唑(SBT )、2,3 —脱氢—夕卜—brevicomin ( DHB )、 oc和P法呢烯、6 —羟基一6—曱基一3 —庚酉同、2 —庚酉同、反式一5 —庚 烯一2 —酉同、反式一4 —庚烯一2 —酉同、n-戊基乙酸面旨、川页式一2 —戊烯 -1-基-乙酸酯、2, 5-二曱基吡。秦、十二烷基丙酸酯、和(Z) -7 -十二烯-1-基乙酸酯(见，例如，Dulaceta1.，2003)。有效量是足以获得期望目的的治疗剂的量。例如，增加神经 干细胞数量的LH或hCG的有效量是如该情况可能成为的足以在体内或 体外导致神经干细胞数量增加的量。LH或hCG治疗或改善神经变性疾 病或病症的有效量是足以降低或去除神经变性疾病或病症的一种或多 种症状的LH/hCG的量。给定的治疗剂的有效量将随着例如试剂性质， 给药途径，接受治疗剂的动物大小和物种，以及给药目的的因素而改变。 本领域熟练技术人员可根据本领域已经建立的方法根据经验确定每个 个体病例中的有效量。神经干细胞增殖试剂的等效量是获得与另一种神经干细胞增 殖试剂相同或等效的效果所需要的神经干细胞增殖试剂的量。等效量可 以通过等效量的相对水平或结果而详细说明。因而，等效量或等效剂量可以是获得与另一种特定神经干细胞增殖试剂相同的血清或脑脊髓液 水平所需要的神经干细胞增殖试剂的量或剂量。药物递送装置是适于给予有效量的神经干细胞增殖试剂或分 化试剂的物品。药物递送装置可影响通过本领域已经建立的任何方法给 予神经干细胞增殖试剂或分化试剂的效果，所述方法包括例如，肠胃外、 静脉内、动脉内、结肠内(intracolonical)、气管内、腹膜内、鼻内、 血管内、鞘内、颅内、骨髓内、胸膜内、皮内、透皮、皮下、肌肉内、 腹膜内、口服、直肠、阴道、局部给药、肺部给药、或其任何组合。全 身递送可通过一些技术完成，所述技术包括例如，肠胃外、静脉内、动 脉内、结肠内(intracolonical)、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘 内、颅内、骨髓内、胸膜内、皮内、透皮、皮下、肌肉内、腹膜内、口 服、直肠、阴道、局部给药、肺部给药、或其任何组合。药物递送装置 可以是，例如，可植入装置或泵(例如，渗透泵)、制剂的5&库(緩释) 递送、或注射笔(用或不用针)。任选地，药物递送装置是输注装置或 其元件；或可选的，为输注之外的装置。下面的实施例意图进一步阐述本发明的特定实施方式，而不 意图限制权利要求的范围。
实施例在下面的实施例中，下述缩写具有下述意思。没有定义的缩 写具有一般所接受的含义。
°c =摄氏度
hr =小时
min =分钟
luM =微摩尔
mM =毫摩尔
M =摩尔每毫升(molar ml milliliter)
"=微升
mg =毫克
Mg =微克
FBS =胎牛血清
PBS =磷酸盐緩冲盐水DMEM = Dulbecco， s改良Eagle' s medium MEM= 改良的Eagle， s medium EGF =表皮生长因子 NSC=神经干细胞 SVZ =室下区
PACAP =垂体腺苷酸环化酶活化多肽 BMP=骨形态发生蛋白 RSA =大鼠血清白蛋白 实施例1
利用rhCG + EPO的中风后功能改进通过临时闭塞右侧大脑中动脉(MCA)而损伤雄性大鼠，然 后给予逐步增加剂量的重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)，紧接着给予 3天的红细胞生成素(EPO, Epogen 1440 IU/天)。将雄性Long Evans大鼠(280-330g)禁食过夜，但允许自由获 取水。硫酸阿托品(0.5mg/kg, i.p.)在麻醉之前IO分钟注射。用70%—氧 化二氮和30%氧的混合物中的3.5%异氟烷诱导麻醉。所有的大鼠都口 部插管并机械通气。通气过程中，动物用泮库溴铵(pancuronium bromide ) (0.6 mg/kg,i.p)麻醉。如Zea Longa et al. (Stroke 20:84 (1989))所述和(Belayev et al., Stroke 27:1616 (1996))的修改将MCA临时闭塞90分钟。缝合处置之后， 封闭颈部切口，允许动物从麻醉中苏醒。MCAo之后60分钟，在标准 神经行为成套测试中测试，以确认神经缺陷的存在(Belayevetal, 1996)。 没有表现出左上肢轻瘫的大鼠(总神经得分小于9;见行为测试，下面 和图1 )排除在进一步研究之外。MCAo90分钟之后，大鼠;f皮重新麻醉， 重新插入温度探针，并且小心的去除腔内缝线。MCAo之前和闭塞过程中(在60分钟时)在所有大鼠中进行 行为测试以确认MCAo的成功。成套测试由先前利用的2个测试组成以 评价神经功能的不同方面(1 )姿势反射测试，为Bederson et al. (Stroke 17:472 (1986))所研发，以检查当动物通过尾巴被悬挂时的上身姿势；和 (2 )前肢放置测试(forelimb placing test),为De Ryck et al. (Stroke 20:1383 (1989))所研发，以冲企查对一见觉、触觉和本体感受刺激的前肢方丈 置反应中的感觉运动综合。神经功能被分级为0- 12等级(正常待分=
250,最大得分=12)。治疗和实-睑组如下
组1: n=8,在第1, 3和5天IM给予盐溶液(与IM给予的hCG 等体积)，然后从外科手术后第7， 8， 9天开始通过A1ZET⑧泵(Alzet Osmotic Pumps; Cupertino, CA) IV给予盐。首次注射是在中风外科手术 之后24小时给予。
组2: n=8; MCA闭塞之后第1， 3和5天IM给予盐溶液(与IM 给予的hCG等体积)，然后从第7, 8, 9天开始通过ALZET 泵IV 给予EPO(1440 IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组3: n=8;在MCA闭塞之后第1, 3和5日IM递送hCG ( 33IU/ 天)，然后从第7, 8, 9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO(1440 IU/ 天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组4: n = 8;在MCA闭塞之后第1 ， 3和5天IM递送hCG ( 100 IU/ 天)，然后从第7， 8, 9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO ( 1440 IU/ 天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组5: n = 8;在MCA闭塞之后第1, 3和5天IM递送hCG ( 300 IU/ 天)，然后从第7, 8, 9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO(1440 IU/ 天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组6: n = 8;在MCA闭塞之后第1, 3和5天IM递送hCG( 1000 IU/ 天)，然后从第7， 8, 9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO ( 1440IU/ 天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组7: n = 8;在MCA闭塞之后第1 ， 3和5天IM递送hCG( 3000 IU/ 天)，然后从第7, 8， 9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO ( 1440IU/ 天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组8: n=8;在MCA闭塞之后第l， 3和5天IM递送hCG ( 10000 IU/天)，然后从第7,8,9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO ( 1440 IU/ 天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组9: n=8;在MCA闭塞之后第l， 3和5天IM递送hCG ( 30000 IU/天)，然后从第7,8,9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO ( 1440 IU/ 天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。如从图1中所见，这些接受了 hCG然后接受了 EPO的动物的 功能性恢复好于仅接受了 EPO的动物。
26
转化为人给药遵循从大鼠给药的mg/kg转化为人给药的 mg/n^的异速生长比例因子8。根据该转化已经建立的指南(Guidancefor Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Does in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health and Human Services, FDA Center for Drug Evaluation and Research, July 2005),对于观察到的300 IU/天的大鼠最佳剂量转化为
HD= [AD * AKm] / HKm
其中，
HD-人剂量， AD=动物剂量 AKm=动物km因子 HKm=人km因子因此，对于体重为305 g的普通大鼠300 IU/天(在本研究中 其相当于每天30 ughCG,也就是lpghCG= 10IUhCG )相当于动物 中的98.4 pg/kg剂量。大鼠km因子为8，人km因子为37,对于人给药 的hCG最佳剂量因而计算为
HD= 98.4 pg/kg * 8/37 = 21.28 pg/kg或212.8 IU/kg/天
EPO的人剂量可^L计算，根据本实施例中体重为305g的普通 大鼠的1440 IU/天的EPO剂量的活性相当于动物的4721.3 IU/kg的剂 量。用大鼠km因子为8，人km因子为37,对于人给药的EPO最佳剂 量因而计算为
HD=4,721.3 IU/kg *8/37 = 1020.82 IU/kg 实施例2
利用hCG + EPO的中风后的功能改进第二组雄性大鼠通过如实施例1所述临时闭塞右侧大脑中动 脉(MCA)而被损伤，然后给予人源的人绒毛膜促性腺激素(hCG), 紧接着如实施例l所述给予3天的红细胞生成素(EPO, Epogen 1440 IU/天)。将雄性Long Evans大鼠(280-330g)禁食过夜，但允许自由获 取水。硫酸阿托品(0.5mg/kg, i.p.)在麻醉之前IO分钟注射。用70%—氧 化二氮和30%氧的混合物中的3.5%异氟烷诱导麻醉。所有的大鼠都口 部插管并机械通气。通气过程中，动物用泮库溴铵(pancuroniumbromide ) (0.6 mg/kg,i.p)麻醉。如实施例1所述在MCAo之前和闭塞过程中(在60分钟)对 所有大鼠进行行为测试，以确认MCAo的成功。治疗和实验组如下
组1: n= 10;在第1, 3和5天IM给予盐溶液(与IM给予hCG 相等体积)，然后从外科手术后第7， 8, 9天开始通过八1^￡丁@泵1￥给 予盐。
组2: n-10;在MCA闭塞之后第l, 3和5天IM递送hCG ( 440 IU/天)，然后从第7, 8, 9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO(1440 IU/天)。
组3: n= 10;在MCA闭塞之后第1， 3和5天IM递送hCG( 440 IU/ 天)，然后从第7， 8, 9天开始通过八!^￡丁@泵1￥给予相同体积比例的盐。
组4: n=10;在MCA闭塞之后第l, 3和5天IM递送盐，然后从 第7, 8, 9天开始通过ALZET⑧泵IV给予EPO(1440IU/天)。
组5: n=5,无MCAo,无治疗，在第-1, 1, 2， 3, 4和6周以四 种行为任务培训并测试动物。图2显示了中风后同一时间点上测试组之间神经功能上的差 异，分为0-12级。如所见的，以在此处所述的方案给予hCG然后给予 EPO产生显著的功能改进。而且，图3显示了这些测试组的组织损失％ (与非中风大脑半球相比)的图表，图4显示了每个组的组织损失的代 表图。另外，在第三次IM给予hCG之后测量血清hCG水平。如图 5所示，循环的hCG水平在给药动物中是显著的。 实施例3
在人急性中风的治疗中利用hCG + EPO对于人中风患者开始了一项研究，涉及到在研究参与的第1， 3和5天提供给患者3个每日 一次的hCG ( 10000 IU/天)IM剂量，接着 一天的洗出期(第6天)，然后再研究参与的第7, 8和9天三个一天一 次的红细^^生成素(30000 IU/天)IV剂量。首次IMhCG剂量在中重度 的中风事件之后24到48小时之间递送。治疗过程中在几个点以及在中 风发作之后6周和3个月检查患者。基线评价包括临床/安全、神经学、血液学、和血管状态，以及脑MRI。临床/安全、神经学、血液学、和血 管状态的评价将在完成治疗后第l天，15天和80天重复。为对比目的， 脑MRI将在完成治疗(中风发作之后大约90天)之后80天重复。
实施例4
催乳素的给药在两个催乳素给药实验中利用雄性大鼠(250 - 300g)。催乳 素通过皮下微-渗透泵输注(ALZET②微泵)每天一次的给予。储存的催 乳素在碳酸氢盐緩冲液中稀释，并且进一步在用于注射的lmg/ml的盐 水中的大鼠血清白蛋白(RSA)中进行稀释。大鼠没有受到缺血性损伤。 在第6天动物在10小时内接受6 BrdU注射(Sigma-Aldrich) (60 mg/kg， i.p.)，并在最后的BrdU注射30分钟后处死。冷冻切割大脑并且利用每 个动物8个切片在SVZ中量化BrdU+细胞。如图示符号所示，结果表示 为SVZ中的BrdU+细胞总数量或表示为每切片的平均值。
实验# 1:大鼠给药6天，并且接受皮下输注以下剂量的RSA(对照)或 大鼠寸崔專'L素(National Hormone and Peptide Program, Torrance, CA)(每纟且 二只大鼠)
*10x = 99ul/泵(2mg/0.25ml PRL)画113(ig/天
**15x= 148.5ul/泵(2mg/0.25mlPRL) - 170 (ig/天
***20x = 198ul/泵(2mg/0.25ml PRL)画226 pg/天
其中
*10x= IO倍于脑室内输注给予的剂量(大约ll^ig/天) * * 15 x= 15倍于脑室内输注给予的剂量 ***2(^=20倍于脑室内输注给予的剂量 结果如图6所示，170pg/天导致了在前脑SVZ之内的增殖(BrdU+ 细胞数量)的最大增加。 实验#2:大鼠给药3或6天，并且接受每天单次腹膜内注射以下剂量 的RSA或大鼠催乳素(每组3只大鼠) 170 pg/天3天 396 ng/天3天
29170 ng/天6天 结果如图7所示，170 pg/天递送6天导致了在前脑SVZ之中增 殖(BrdU+细胞数量)的最大增加。 实施例5 hCG的给药本研究的目的是为了确定使成体雄性大鼠的前脑胚带的细 胞增殖和组织再生最大化的hCG剂量，所述大鼠已经受到运动皮层的软 膜条(pial strip)血行阻断缺血性损伤。
方法
动物和外科手术250 - 350g雄性大鼠如前所述受到运动皮层的软膜条血行阻 断缺血性损伤(Gonzalez and Kolb. A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology. Eur J Neurosci. 2003. 18(7):1950曙1962)。对于戊巴比妥钠麻醉(60mg/kg)的动物，从前卣点 向前/向后+4到-2 mm和/人中线4黄向1.5到4.5mm钻一个矩形洞。去除 硬脑膜并且利用无菌盐水浸泡的棉签从皮层表面擦拭软脑膜和附着的 血管。
给药 '
中风后一天开始(24小时后)，动物接受单独肌肉内(i.m.) 注射hCG(National Peptide and Hormone Program, Torrance, CA)),剂量^口 表1所述给出，并且以5天三次注射(在第1, 3和5天给药)或一周 内每天注射，注射在每天9: 00am给予。对照大鼠接受盐水中的大鼠血 清白蛋白(RSA; Sigma, lmg/ml)注射。在最后给药的当天，hCG注射之 后30分钟开始，动物10小时内接受6次BrdU注射。BrdU(Sigma-Aldrich) 以60mg/kg剂量，i.p.给予。动物用4%多聚甲醛透心输注。切割大脑， 在蔗糖中冷冻保藏并冷冻切割。大脑以14微米冷冻切割为两系列的8 个切条，每个切条具有8个切片。利用兔抗-磷酸组蛋白H3
(phosphohistone H3 )(抗pHH3; 1:100; Upstate Biotechnologies)、 大鼠 抗- BrdU(l: 100;Seralab)、山羊抗-doublecortin(DCX; 1:100; Santa Cruz Biotechnologies)进行免疫染色。每个动物的侧脑室周围的前脑室下区
(SVZ)中的磷酸组蛋白H3 (phosphohistone H3 ) (pHH3-—种有丝分裂-活性细胞标记物)、BrdU、和doublecortin(DCX -不成熟神经元的 标记物)阳性细胞的数量在8个切片中量化，并且表示为每个侧脑室的阳 性细胞平均数量。 统计数值是平均值+平均值标准误差(SEM)。显著性使用单因 素方差分析然后进行Tukey HSD posthoc测试(^pO.05; **口<0.01)而确 定。每组中包括三只动物。
结果本研究检查了肌肉内注射hCG促进中风后成体前脑室下区 中的神经干细胞和祖细胞的增殖的能力。动物进行了软膜条血行阻断外 科手术以诱导运动皮层的局部缺血性损伤，治疗在24小时后开始。在 弹丸浓注的高剂量策略中，如表l中概括的，动物在5天内的第1 (中 风后24小时)、3和5天接受3剂hCG。动物在第5天^^皮处死分析前脑 SVZ的增殖水平。如表2和图8所示，本方案与接受RSA对照注射的 中风动物相比在增加增殖上是有效的。在1000pg的剂量时，增殖增加 了几乎2.5倍，并且，如图9所示，这些动物的SVZ中新产生的 doublecortin阳性(DCX+)神经元的数量类似地显著增加。在另一研究中，动物如表1所概括的每天接受hCG给药7 天，开始于中风后24小时，在第7天给予动物BrdU 10小时，然后处 死。如图IOA所示，通过pHH3免疫反应性显示的SVZ中分裂细胞数 量在330pg/注射的组中相对于所有其它组显著增加了 。这种增加通过相 对于RSA对照量化这些动物的SVZ中的BrdU+细胞数量而确认(图11 )。 相对于软膜条RSA对照在100pg治疗组中有增加的趋势(图IOA和11 )。 注意图10中的未治疗动物没有接受注射和没有软膜条中风。作为内部 对照， 一个组接受与330^g/注射的组相同的总剂量(见表1)，但在第 1, 3和5天以770pg/注射3次注射给予hCG,并且动物在第5天处死。 基于此研究，以每天330ng/注射给予的低的，常规剂量的hCG对于大 脑缺血性损伤之后的前脑SVZ中的增殖的增加是最有效的。为确定是否任何给药方案都可能导致新的皮层组织的生长， 我们分析了 hCG治疗动物的皮层的损害位点。在以330pg/注射的低的 常规剂量的给药方案给药的动物组中组织再生长是特别明显的(图 10B)。及领域的熟练技术人员的水平。这些专利和公开文献在此全文引入作为 参考，如同每篇单独文献特别并单独的引入作为参考一样。本发明不限于实施例中公开的实施方式的范围，实施例只是
意图作为本发明的某些方面的例证，任何功能等同的实施方式在本发明 的范围内。在此展示和描述之外的本方法和试剂盒的多种修饰对于本领 域熟练技术人员来说是明显的，并且落在所附权利要求的范围内。而且，
的，并且也落在所附权利要求的范围内。因而步骤或组合物的组合可在
此明确提及；然而，步骤或组合物的其它组合尽管没有明确阐述也包括 在内。
表l.hCG给药策略。大鼠在中风后24小时开始接受5天内或7天 内三次肌肉内(I.M.)注射hCG。对照大鼠仅仅接受RSA注射。
总剂量 剂量/注射 剂量/注射
(IUshCG) (IUshCG) (微克Og) hCG)
图8 和9
在第1, 3和5天的给药 RSA(未中风)
RSA
330 110 11
990 330 33
9900 3300 330
30000 10000 1000
图10和11
每天给药进行7天
未处理(未中风并且未注射)
32RSA
7000 1000 100
23100 3300 330
46200 6600 660
70000 10000 1000 在第1， 3和5天的给药
23100 7700 770
表2.对于软膜条血行阻断中风后24小时用hCG给药的动物相对于 对照的pHH3+, BrdU+和DCX+细胞的定量，将每侧脑室阳性细胞的平均 数量表示为实际值± SEM。
给药条件pLig/注射)_pHH3+细胞_BrdU十细胞
每脑室的阳性细胞数量
每天给药进行1周
未治疗未中风 8.7±2 —
RSA 9.3±0.3 374±15
10 19.3±5 459±138 33027±3** 874±91* 660 12.3±2 — 1000 17±2 —國
770 (在第1, 3和5天给药)16±1 —
DCX+细胞
在第1, 3和5天注射的5天给药
RSA 8.7±1 280±15
11 8±2 — 33 8±0.1 — 330 13±1 — 1000 19±1* 533±42*
3权利要求
1. 治疗或改善哺乳动物中神经变性疾病或病症的方法，包含给予哺乳动物有效量的hCG或LH和有效量的EPO，其中所述hCG或LH以至少三个剂量全身给药。
2. 权利要求1的方法，其中hCG或LH的第一剂量在神经变性疾病 或病症的症状发作或诊断的0到大约14天内给予哺乳动物。
3. 权利要求1的方法，其中hCG或LH的第一剂量在神经变性疾病 或病症的症状发作或诊断的0到大约5天内给予哺乳动物。
4. 权利要求1的方法，其中hCG或LH在至少大约三、四、五、六、 七或十四天的治疗期内给予哺乳动物。
5. 权利要求1或4的方法，其中hCG的剂量单元在哺乳动物中提供 大约0.03 IU/L到大约5,000,000 IU/L的hCG血清水平。
6. 权利要求1或4的方法，其中hCG剂量单元在哺乳动物中提供大 约0.003 IU/L到大约5,000 IU/L的hCG脑脊髓液水平。
7. 权利要求1或4的方法，其中给予哺乳动物的hCG的量是大约0.5 IU/kg/天到大约3,000,000 IU/kg/天。
8. 权利要求1或4的方法，其中给予哺乳动物的hCG的量是大约 10,000 IU/天。
9. 权利要求1或4的方法，其中给予哺乳动物的LH的量是大约0.5 IU/kg/天到大约300,000 IU/kg/天。
10. 权利要求1或4的方法，其中给予哺乳动物的LH的量是大约 10,000 IU/天。
11. 权利要求1或4的方法，其中给予哺乳动物的EPO的量是大约 100- 1000 IU/kg/天。
12. 权利要求1或4的方法，其中给予哺乳动物的EPO的量是大约 570- 950 IU/kg/天。
13. 权利要求1或4的方法，其中给予哺乳动物的EPO的量是大约 765 IU/kg/天。
14. 权利要求1或4的方法，其中给予哺乳动物的EPO的量是大约 30,000 IU/天。
15. 权利要求1或4的方法，其中hCG或LH在治疗期内连续给药。
16. 权利要求1的方法，其中hCG或LH在治疗期内间歇给药。
17. 权利要求16的方法，其中hCG或LH在治疗期的第1、 3和5 天给药。
18. 权利要求1的方法，其中hCG或LH在第一治疗期给药，并且 EPO在第二治疗期给药。
19. 权利要求18的方法，其中hCG或LH在第一治疗期间歇给药， 并且EPO在第二治疗期连续给药。
20. 权利要求19的方法，其中hCG或LH在第一治疗期的第1、 3 和5天递送，并且EPO在第二治疗期的第1、 2和3天递送。
21 j又利要求20的方法，其中10,000 IU/天的hCG和30,000 IU/天 的EPCM皮给予哺乳动物。
22. 权利要求21的方法，其中神经变性疾病或病症是中风。
23. 权利要求19的方法，其中第一治疗期是至少大约三、四、五、 六、七或十四天。
24. 权利要求19的方法，其中第二治疗期是至少大约三、四、五、 六、七或十四天。
25. 权利要求19的方法，其中第二治疗期开始于第一治疗期之后的 至少一天。
26. 权利要求1、 2、 4、 16或17的方法，其中神经变性疾病或病症 选自阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏 症、CNS损伤、多发性硬化、和精神分裂症。
27. 权利要求1的方法，其中神经变性疾病或病症是CNS损伤。
28. 权利要求27的方法，其中CNS损伤是中风、脑或脊髓损伤、震 荡、由药物导致的损伤、与冠状动脉旁路方法相关的损伤、或分娩中的 缺血症。
29. 权利要求27的方法，其中神经干细胞增殖试剂的第一剂量在 CNS损伤之后至少一天给予哺乳动物。
30. 治疗或改善哺乳动物中神经变性疾病或病症的方法，包含在第一 治疗期中给予哺乳动物有效量的hCG或LH,然后在第二治疗期中给予 有效量的EPO。
31. 权利要求30的方法，其中hCG或LH的第一剂量在神经变性疾 病或病症的症状发作或诊断的O到大约14天内给予哺乳动物。
32. 权利要求30的方法，其中hCG或LH的第一剂量在神经变性疾病或病症的症状发作或诊断的0到大约5天内给予哺乳动物。
33. 权利要求30的方法，其中第一治疗期是至少大约三、四、五、 六、七或十四天。
34. 权利要求30的方法，其中第二治疗期是至少大约三、四、五、 六、七或十四天。
35. 权利要求30、 31、 32、 33或34的方法，其中第二治疗期开始于 第一治疗期之后至少一天。
36. 权利要求30的方法，其中hCG或LH在第 一治疗期内间歇递送， 并且EPO在第二治疗期内连续递送。
37. 权利要求36的方法，其中hCG或LH在第一治疗期的第1、 3 和5天递送，并且EPO在第二治疗期的第1、 2和3天递送。
38. 治疗或改善哺乳动物中神经变性疾病或病症的试剂盒，包含EPO 和至少三剂量单元的hCG或LH。
39. 权利要求38的试剂盒，进一步包含hCG或LH的全身给药的使 用说明。
40. 权利要求39的试剂盒，其中使用说明是针对hCG或LH的间歇 给药的。
41. 权利要求38、 39或40的试剂盒，其中EPO是至少三剂量单元。
42. 权利要求38、 39或40的试剂盒，进一步包含连续给予EPO的 使用说明。
43. 权利要求38、 39或40的试剂盒，进一步包含在第一治疗期内给 予神经干细胞增殖试剂和在第二治疗期内给予EPO的使用说明。
44. 权利要求38、 39或40的试剂盒，进一步包含至少一种药物递送装置。
45. 权利要求38、 39或40的试剂盒，进一步包含监视血细胞比容水 平的装置。
46. 权利要求38、 39或40的试剂盒，进一步包含从受试者取血样的装置。
47. 权利要求38、 39或40的试剂盒，其中试剂盒用于健康护理机构。
48. 权利要求38、 39或40的试剂盒，其中试剂盒在离开健康护理机 构之后利用。
49. 权利要求38、 39或40的试剂盒，其中LH或hCG的剂量单元在单个容器中。
50.权利要求38、 39或40的试剂盒，其中LH或hCG的剂量单元在 多个容器中。
51.权利要求38、 39或40的试剂盒，其中分化试剂的剂量单元在单 个容器中。
52.权利要求38、 39或40的试剂盒，其中分化试剂的剂量单元在多 个容器中。
全文摘要
在此提供了神经干细胞增殖和分化试剂的有效给药方案，包含有效给药方案的神经干细胞增殖和分化试剂的试剂盒，以及其用于治疗神经变性疾病或病症的用途。具体而言，神经干细胞增殖剂人绒毛膜促性腺激素(hCG)或促黄体素(LH)以几个剂量给予，用于与神经干细胞分化试剂红细胞生成素(EPO)相结合使用。其它的神经干细胞增殖剂包括催乳素。
文档编号A61K38/24GK101466396SQ200780009432
公开日2009年6月24日 申请日期2007年3月16日 优先权日2006年3月17日
发明者A·大卫朵夫, C·葛瑞格, J·塔克, S·怀斯 申请人:干细胞治疗公司