专利名称：动态核极化(dnp)的方法及用于所述方法的化合物和组合物的制作方法
动态核极化(DNP)的方法及用于所述方法的化合物和组合物
本发明涉及羧酸的动态核极化(DNP)的改良方法及用于所述方法 的4匕合物和纟且合物。
磁共振(MR)显影(MRI)是一种显影技术，这种技术对医生有特别 的吸引力，因为它允许以无损伤方式得到患者身体或其部分的图像， 而不使患者和医疗人员暴露于潜在有害的辐射，如X-射线。由于高品 质图像，MRI是软组织和器官的有利显影技术，并且允许区分正常组 织和患病组织，如肺瘤和损伤。
进行MRI可利用或不利用MR造影剂。然而，增强造影的MRI 通常使得能够检测非常小的组织变化，使其成为检测早期组织变化的 有力工具，如小肿瘤或转移。
在MRI中已使用数种类型的造影剂。水溶顺磁性金属螯合物，例 如钆螯合物，如OmniscanTM(GE Healthcare),广泛用作MR造影剂。 由于其分子量低，如果将它们提供到维管结构，它们会快速分配到胞 外空间(即血液和间质组织)。它们也相对快速地从身体清除。
另一方面，血池MR造影剂(例如超顺磁性氧化铁颗粒)，在维管 结构内持久保留。已证明它们不仅极有用于增强肝内造影，而且用于 检测毛细管渗透性异常，例如在肿瘤中的"漏"毛细管壁，例如由于血 管生成。
尽管前述造影剂具有无可争辩地极佳性能，但其使用不是没有任 何风险。虽然顺磁性金属螯合物络合物具有通常高稳定性常数，但可 能在给药后在身体内释放毒性金属离子。另外，这些类型的造影剂显 示不良的专一性。
另 一类MR显影剂为超极化MR显影剂。WO-A-99/35508公开一 种用超极化高T,剂溶液作为MRI显影剂MR研究患者的方法。术语
7"超极化，，意味使在高T,剂中存在的NMR活性核(即，具有非零核自旋 的核，优选"C-或"N-核)的核极化作用增强。在增强NMR活性核的 核极化作用时，这些核的核自旋激发态和核自旋基态之间的总体差异 显著增加，从而MR信号强度放大百倍和更多倍。在使用超极化130 和/或"N-增浓的高T,剂时，由于"C和/或15N的天然丰度可以忽略， 基本没有来自背景信号的干扰，因此图像对比有利地高。普通MRI 造影剂和这些超极化高T,剂的主要差异是前者的对比变化是通过影 响身体中水质子的松弛时间所致，而后一类剂可被认作为非放射性示
踪剂，因为得到的信号只从所述剂产生。
用作MR显影剂的各种可能的高剂公开于WO-A-99/35508, 包括非内源和内源化合物，如乙酸盐、丙酮酸盐、草酸盐或葡糖酸盐、 糖(如葡萄糖或果糖)、脲、酰胺、氨基酸(如谷氨酸盐、甘氨酸、半胱 氨酸或天冬氨酸盐)、核苷酸、维生素(如抗坏血酸)、青霉素衍生物和 氨^s黄酰。另外据称，代谢循环(如柠檬酸循环)中的中间体(如富马酸和 丙酮酸)为代谢活性的MR显影的优选显影剂。
在人和非人动物体内代谢过程中起作用的超极化MR显影剂最为 有利，因为可用这些超极化显影剂在体内MR研究中得到组织代谢状 态的信息，即，它们有用于代谢活性的体内显影。例如，可能用组织 的代谢状态信息区别健康组织和患病组织。
丙酮酸盐是在柠檬酸循环中起作用的化合物，超极化的"C-丙酮 酸盐转化成超极化的代谢物可用于体内MR研究人体中的代谢过程。 例如，超极化的"C-丙酮酸盐可作为MR显影剂用于体内肿瘤显影， 如WO-A-2006/011810和WO-A-2006/011809详述，也可用于通过MR 显影评估心肌组织的生存力，如WO-A-2006/054903详述。
丙酮酸盐为人体耐受很好的内源性化合物，甚至在高浓度。作为 柠檬酸循环中的前体，丙酮酸盐在人体中起重要的代谢作用。丙酮酸 盐转化成不同的化合物其转氨基作用通过氧化脱羧产生丙氨酸，丙 酮酸盐转化成乙酰辅酶A和二氧化碳(进一步转化成碳酸氬盐)，丙酮酸盐还原产生乳酸盐，并导致在草酰乙酸盐中羧化。
另外，超极化的"C-丙酮酸盐代谢转化成其代谢物超极化"c-乳 酸盐、超极化"C-碳酸氬盐(只在"C广丙酮酸盐、"d,2-丙酮酸盐或
"Q,2,r丙酮酸盐的情况下)和超极化"C-丙氨酸可用于体内MR研究人 体内的代谢过程。"d-丙酮酸盐在37。C人全血中具有约42s的T!松弛， 然而已发现，超极化的"C-丙酮酸盐转化成超极化"C-乳酸盐、超极 化"C-碳酸氢盐和超极化"C-丙氨酸快得足以允许从"C-丙酮酸盐母 体化合物及其代谢物检测信号。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量取决 于研究下组织的代谢状态。超极化"C-乳酸盐、超极化"C-碳酸氢盐 和超极化"C-丙氨酸的MR信号强度与这些化合物的量和在检测时间 剩余的极化度相关，因此，通过监测超极化130丙酮酸盐转化为超极 化"C-乳酸盐、超极化130碳酸氢盐和超极化"C-丙氨酸，可用无损 伤MR显影或MR谱研究人或非人动物体内的体内代谢过程。
从不同丙酮酸盐代谢物产生的MR信号放大随组织类型变化。由 丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐形成的独特代谢峰图案可在检 查下用作组织代谢状态的指紋。
必须强调，超极化显影剂的信号由于松驰和在对患者体给药稀释 而衰减。因此，显影剂在生物流体(例如，血液)中的T!值必须足够长 (高)，以使所述剂能够在高度超极化状态分布到患者身体中的靶部位。 除具有高T,值的显影剂外，达到高极化度极为有利。如果超极化显影 剂具有高极化度，则由于松驰和稀释以相同速率发生衰减，然而通过
具有更高"起始度"，在给定时间后超极化显影中保留的极化更高。显 影剂中的极化度越高，能够从显影剂检测的MR信号越强。
得到超极化高L剂的数种方法公开于WO-A-99/35508,方法之一 是动态核极化(DNP)技术，其中样品的极化受极化剂或所谓的DNP剂 (包含不成对电子的化合物)影响。在DNP过程中提供通常为微波辐射 形式的能量，这种能量将初始激发DNP剂。在衰减到基态时，有从 DNP剂的不成对电子到样品NMR活性核的极化转移。通常，在DNP
9过程中使用中或高磁场和极低温度，例如通过在液态氦和约IT或高
于1T的磁场中进行DNP过程。或者，可利用中等磁场和达到足够极 化增强的任何温度。DNP技术例如描迷于WO-A-98/58272和 WO-A-01/96895，两者均通过引用包含在本文中。
DNP剂在DNP过程中起决定性作用，因为它的选择对能够在要 极化的样品中达到的极化度有主要影响。已知多种DNP剂，在 WO-A-99/35508中称为"OMRI造影剂"。如WO-A画99/35508 、 WO-A-88/10419、 WO-A-90/00904、 WO-A-91/12024、 WO-A-93/02711 或WO-A-96/39367所述，使用基于氧、基于硫或基于碳的稳定三苯甲 基自由基在多种不同样品中产生高极化度。
我们现在已意外地发现，将某些Gd-螯合物加入到一种组合物显 著增加丙酮酸的极化度，所述组合物包含作为DNP剂的三苯甲基自 由基和要由DNP方法极化的丙酮酸。这在一种临床情况尤其有利， 其中在患者的MR检查步骤中用超极化丙酮酸盐作为MR显影剂，超 极化丙酮酸盐由DNP获得的固体超极化丙酮酸溶于含碱的水性溶解 介质得到。如果丙酮酸的极化度可例如增加x倍，则理论上在MR检 查步骤中需要使用x分之一浓度的丙酮酸盐。因为能够避免由于高 MR显影剂浓度和剂量的可能的不需要的副作用，因此不仅从经济的 观点有利，而且从安全的观点也有利。
因此，本发明第一方面提供一种制备固体超极化羧酸的方法，所 述方法包括制备一种组合物，所述组合物包含所迷羧酸、三苯甲基自 由基和式(l)的Gd-螯合物<formula>formula see original document page 11</formula>
n为1至10; x为0至3;
R相同或不同，并且表示氟、直链或支化d-C6-烷基或包含5至 IO个碳原子的芳族或非芳族环状基团；并且
Q为H、直链或支化CrC6-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或 非芳族环状基团或
0.1
其中n、 x和R如上限定； 并且对组合物进行动态核极化作用。
术语"超极化"和"极化"在后文可互换使用，表示核极化度超过 ,，更优选超过1。/。，最优选超过10%。 例如，可通过固态NMR测量冷冻的超极化羧酸中的NMR活性 核来测定极化度。例如，如果超极化羧酸中的NMR活性核为13C，则 获取所述超极化羧酸的固态13C-NMR。固态13C-NMR测量优选由利 用低倾倒角的简单脉冲获取NMR序列组成。将NMR谱中超极化羧 酸的信号强度与动态核极化过程之前获取的NMR谱中羧酸的信号强 度比较。然后从DNP之前和之后信号强度的比率计算极化度。
以类似方式，可通过液态NMR测量液体超极化羧酸中的NMR
ii活性核来测定溶解的超极化羧酸的极化度。同样，将溶解的超极化羧 酸的信号强度与动态核极化过程之前的溶解的羧酸的信号强度比较。 然后从DNP之前和之后信号强度的比率计算极化度。
术语"羧酸"表示包含至少 一个羧基(即COOH-基团)的化学实体。 虽然以单数形式书写，但术语"羧酸"表示一种或多种化学实体， 即某一种羧酸或数种不同羧酸，例如数种不同羧酸的混合物。例如， 丙酮酸为确定的羧酸，并且可用本发明的方法制备超极化的丙酮酸。 又比如，丙酮酸和乳酸为数种不同的羧酸，可用本发明的方法制备超 极化的丙酮酸和超极化的乳酸的混合物。
本发明的方法在要被极化的羧酸中产生高极化度。 本发明上下文中的羧酸可以为单羧酸，例如甲酸、乙酸、乳酸、 丙酮酸、烟酸或脂肪酸(如棕榈酸或油酸)。在另一个实施方案中，羧 酸可以为二或多元羧酸，例如苹果酸、富马酸、琥珀酸、亚曱基丁二 酸、丙二酸或柠檬酸或草酸。除包含至少一个羧基外，羧酸可包含其 他官能团和/或杂原子。优选的官能团为氨基，包含氨基的羧酸的实例 为氨基酸，如标准氨基酸，优选甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、 天冬氨酸、谷氨酸盐、色氨酸和丝氨酸，也包括非标准氨基酸，优选 GABA(Y-氨基丁酸)、高半胱氨酸、肌氨酸等。可在羧酸分子中存在的 其他优选的官能团为酮基(此类化合物的优选实例为丙酮酸、草酰乙酸 或a-酮基戊二酸)或羟基(此类化合物的优选实例为乳酸和水杨酸)。在 另一个优选的实施方案中，羧酸包含一个或多个杂原子，例如在烟酸 中的氮原子。
在本发明的方法中使用的优选羧酸为候选药物，更优选为小分子 (例如小于2000Da)，或数种候选药物的混合物，可在NMR生物测定 中用本发明的方法获得的超极化候选药物例如测定对某种受体的结 合亲合力或用于酶测定。这些测定描述于WO-A-2003/089656或 WO-A-2004/051300，它们优选基于使用液态NMR谱，这意味包含固 体超极化候选药物的组合物必须在极化后液化，优选通过溶解或熔
12融。羧酸可经或可不经同位素增浓。
在另 一个优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的羧酸将用
作MR显影剂。术语"MR显影剂"表示可在MR显影中用作MR显影 剂或在MR语中用作MR镨剂的化合物。在另 一个优选的实施方案中， 在本发明的方法中使用的羧酸为MR显影剂的前体。对于这两个实施 方案，优选的羧酸为内源化合物或内源化合物的前体。后者的实例为 诸如丙酮酸的羧酸(前体)，通过例如在DNP过程后使固体超极化丙酮 酸溶于含碱的含水溶解介质并用如此得到的溶解的超极化丙酮酸盐 作为MR显影剂，可使所述丙酮酸转化成内源化合物丙酮酸盐(衍生 物，即羧酸的盐)。优选为内源羧酸或为内源化合物(即在人或非人动 物体内代谢过程中起作用的羧酸的内源衍生物)的前体的羧酸。在用这
MR研究中得到组织代谢状态的信息，即，这些剂用于代谢活性的体 内MR显影和/或MR谱。例如，可能用组织的代谢状态信息区别健康 (正常)组织和患病组织。
因此，要在本发明的方法中使用的优选羧酸为马来酸、乙酸、富 马酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、草酰乙酸、乳酸和a-酮基戊二酸， 这些酸为内源化合物苹果酸盐、乙酸盐、富马酸盐、丙酮酸盐、丙二 酸盐、琥珀酸盐、草酰乙酸盐、乳酸盐和a-酮基戊二酸盐的前体，这
人动物体内代谢过程中起作用的另一种优选的内源羧酸为烟酸。在人
如丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、肌氨酸、GABA或 高半胱氨酸。最优选的羧酸为丙酮酸、草酰乙酸、a-酮基戊二酸、丙 氨酸和甘氨酸。
如
作用的内源羧叛-
的内源衍生物的前体的羧酸，则这些超极化内源羧酸或羧酸的超极化内分子MR显影和/或化学位移显影和/或MR谱。在这些超极化内源 羧酸或羧酸的超极化内源衍生物中，优选为包含显示慢纵向松弛的极 化核，以便保持相当高极化足够时间长度，用于转移到人或非人动物 体内，并且随后显影的那些化合物。优选的内源羧酸或羧酸的内源衍
生物包含具有纵向松弛时间常数(T,)的核，纵向松弛时间常数(T,)在 0.01至5T的磁场强度和20至4(TC范围的温度大于10秒，优选大于 30秒，甚至更优选大于60秒。此类如此称谓的"高T！剂"例如描述于 WO-A-99/35508。或者，可能的内源羧酸或羧酸的内源衍生物的^值 可发现于文献中，或者可通过获取可能的化合物的NMR谱(例如 UC-NMR谱)，以测定"C标记的可能的内源羧酸或羧酸的内源衍生物 的1\来测定。
通常，旨在作为MR显影剂用于体内MR显影和/或化学位移显影 和/或MR谱或为此剂的前体的羧酸优选为同位素增浓的化合物，同位 素增浓更优选为非零自旋核(MR活性核)的同位素增浓，非零自旋核 适合为"N(如果在化合物中存在)和/或13C,更优选为13C。同位素增 浓可包括在化合物内 一个或多个部位选择增浓或所有部位均匀增浓， 并且一个部位的增浓优选在具有高T!值的核。增浓可例如通过化学合 成或生物标记达到，两种方法在本领域已知，可根据要被同位素增浓 的具体化合物选择适合的方法。
旨在作为体内MR显影剂或为此剂的前体的羧酸的优选实施方案 为在分子的仅一个位置同位素增浓的化合物，优选增浓至少10%,更 适合至少25%,更优选至少75%，最优选至少90%。理想增浓为100%。
同位素增浓的最佳位置取决于MR活性核的松弛时间。优选在本 发明的方法中使用的羧酸在具有长T!松弛时间(高T!值)的位置同位素 增浓。在本发明的方法中使用的"C-增浓的羧酸优选在羧基-C-原子、 羰基-C-原子或季C-原子增浓。如果它们在羧酸中存在，当然可只使 后两个位置增浓，即如果除了羧基外(例如柠檬酸和氨基酸(除甘氨酸外))，羧酸还包含羰基(例如丙酮酸或a-酮基戊二酸)或季C-原子。
用作MR显影剂的前体的尤其优选的羧酸为"C-丙酮酸、"C-乙 酸、"C-草酰乙酸和"C-a-酮基戊二酸。这些化合物为130丙酮酸盐、 130乙酸盐、"C-草酰乙酸盐和"C-a-酮基戊二酸盐的前体。用作MR 显影剂的尤其优选的羧酸还可以为"C-丙氨酸和"C-甘氨酸，更优选 "C广丙氨酸和3(^-甘氨酸。"C-丙酮酸为最优选的羧酸，并且可同位 素富集于C1-位("C广丙酮酸)、02-位(13(32-丙酮酸)、C3-位("Cr丙酮 酸)、Cl-和C2-位(^d,2-丙酮酸)、Cl-和C3-位("d,3-丙酮酸)、C2-和 C3-位("C2，3-丙酮酸)或Cl-、 C2-和C3-位("C,2,3-丙酮酸)。Cl-位为丙 酮酸13C同位素富集的优选位置。
在另一个优选的实施方案中，由本发明的方法获得的超极化羧酸 用于固态NMR谱。在此，超极化固体羧酸可通过静态或幻角自旋固 态NMR谱分析。在此实施方案中，可在本发明的方法中使用任何类 型和分子大小的羧酸。
在本发明的方法中使用的三苯曱基自由基作为DNP剂，该剂在 DNP方法中必不可少，因为DNP剂的大电子自旋极化通过接近电子 拉莫尔频率的微波照射在羧酸中转化成核的核自旋极化。微波通过e-e 和e-n跃迁激励电子和核自旋系统之间的传递。为了有效DNP， DNP 剂必须稳定并且可溶于要被极化的化合物或其溶液，以达到所述化合 物和DNP之间紧密接触。此紧密接触为电子和核自旋系统之间前述 传递所必须。就此而论，稳定的三苯曱基自由基证明为非常有用的 DNP齐')。基于氧、基于硫或基于碳的稳定三苯曱基自由基例如描述于 WO-A-99/35508、 WO誦A-88/10419、 WO-A-90/00904、 W0-A國91/12024、 WO-A-93緒U或WO-A-96/39367。
三苯曱基自由基的最佳选择取决于多个方面。如上所述，为了在
化合物中产生最佳极化度，三苯曱基自由基和要被极化的化合物必须 在DNP过程中紧密接触。因此，在本发明的优选实施方案中，三苯 曱基自由基可溶于羧酸或其溶液。如果要被极化的羧酸在室温为液体(例如丙酮酸)，或者使羧酸例如通过在升高的温度熔融转变成液态， 则前者为适合的选择。为了制备羧酸的溶液，可使用溶剂或溶剂混合 物。然而，如果祐:极化的羧酸用于体内应用，如作为MR显影剂用于
体内MR显影或为此剂的前体，则优选保持溶剂量最低，或者如果可 能，避免使用溶剂。为了用作体内MR显影剂，超极化的化合物通常 需要以相对高浓度给药，即，包含羧酸、三苯曱基自由基、式(l)的 Gd-螯合物的高浓组合物优选用于DNP过程，因此，优选保持溶剂量 最低。在此上下文中，优选保持组合物的质量尽可能小也很重要。如 果在DNP过程后用溶解使包含超极化羧酸的固体組合物液化，例如 用作MR显影剂或用作前体并在那个溶解过程中转化成MR显影剂，
则高质量对溶解过程的效率有负面影响。这是由于对在溶解过程中给 定体积的溶解介质，在固体组合物的质量增加时，溶解介质与固体组 合物质量之比减小。另外，使用某些溶剂可能需要在用作MR显影剂 的超极化羧酸或其衍生物给予患者之前将其除去，因为这些溶剂可能 在生理学上不能耐受。
苯甲基自由基也应相当亲油/亲水。三苯甲基自由基的亲油性/亲水性 可能受选择给予三苯甲基自由基分子亲油性/亲水性的适合残基影响。 另外，三苯甲基自由基必须在羧酸存在下稳定。因此，如果在本发明 的方法中使用的羧酸为相当强的酸，例如草酸或丙酮酸，则三苯甲基 自由基应在强酸性条件下稳定。如果羧酸还包含反应基，则应使用对 这些反应基相对惰性的三苯甲基自由基。从前述明显看出，选择三苯 甲基自由基高度依赖在本发明的方法中使用的羧酸的化学性质。
在WO-A-2006/011811中公开的三苯甲基自由基为酸性有机化合 物(即羧酸)DNP极化的尤其有用的DNP剂。优选在本发明的方法中使 用这些三苯曱基自由基。
在本发明方法的优选实施方案中，羧酸为丙酮酸，更优选为13C-丙酮酸，最优选为"d-丙酮酸，并且三苯甲基自由基为式(2)的三苯甲
16基自由基
COOM
其中
M表示氢或1当量的阳离子；并且
Rl相同或不同，表示直链或支化C广C6-烷基或基团-(CH2)n-X-R2， 其中
n为1、 2或3;
X为O或S;并且
R2为直链或支化d-CV烷基。
在一个优选的实施方案中，M表示氢或1当量生理学上可耐受的 阳离子。术语"生理学上可耐受的阳离子"表示活的人或非人动物体耐 受的阳离子。优选M表示氢或碱阳离子、铵离子或有机胺离子(例如 葡甲胺)。最优选M表示氢或钠。
在进一步优选的实施方案中，Rl相同，更优选为直链或支化 d-Gp烷基，最优选为曱基、乙基或异丙基。
在进一步优选的实施方案中，Rl相同或不同，优选相同，并且表 示-CH2-OCH3、 -CH2-OC2H5、 -CH2-CH2-OCH3 、 -CH2-SCH3、 -CH2-SC2H5 或-CH2-CH2-SCH3，最优选为-CH2-CH2-OCH3。
在更优选的实施方案中，M表示氢或钠，Rl相同并且表示 -CH2-CH2-OCH3。
在本发明的方法中使用的三苯甲基自由基可如WO-A-88/10419 、WO-A-90/00904、 WO-A誦91/12024、 WO-A-93/02711 、 WO-A-96/39367 和WO-A-2006/011811详述合成。
如上所述，在本发明的方法中使用的Gd-螯合物为式(l)的Gd-螯
合物:<formula>formula see original document page 18</formula>n为1至10; x为0至10;
R相同或不同，并且表示氟、直链或支化d-CV烷基或包含5至
io个碳原子的芳族或非芳族环状基团；并且
Q为H、直链或支化CrCV烷基或包含5至10个碳原子的芳族或 非芳族环状基团或
Rx
其中n、 x和R如上限定。
在优选的实施方案中，Q为H、直链或支化C广C6-烷基，优选为 甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基，或者Q与以下 基团相同在以上实施方案的优选实施方案中，n为l至5，更优选1至3。 如果R为直链或支化d-Q-烷基，则R优选为甲基、乙基、丙基、
异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。
如果R为包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团，则R
优选为环戊基、环己基、甲基环;1^、甲基环己基、千基、苯基或曱苯基。
在一个实施方案中，x为3，并且相同或不同的三个R基团优选 在邻位和在对位连接。此实施方案的实例为下列部分
<formula>formula see original document page 19</formula>
其中以上部分相当于以下所示式(l)的Gd-螯合物的加框部分:<formula>formula see original document page 19</formula>(1)
在另一个实施方案中，x为2，并且相同或不同(优选相同)的两个 R基团优选在间位连接。此实施方案的优选实例为以下部分，其中所 述部分相当于以上所示式(l)的Gd-螯合物的加框部分
<formula>formula see original document page 19</formula>在一个优选的实施方案中，X为1，并且R基团优选在对位连接。
在此实施方案中，R优选选自氟、甲基、异丙基、异丁基和叔丁基，
最优选选自甲基和叔丁基。
在另一个优选的实施方案中，x为0,并且n为1至5，优选1至
——CH
式(l)的Gd-螯合物适合用具有受保护的羧基的D03A衍生物作原 料作为螯合剂来合成。适合的D03A衍生物为例如1,4,7-三(叔丁氧基 羰基甲基)-l,4,7，10-四氮杂环十二烷或1,4,7-三(千基氧基羰基曱 基)-l,4,7,10-四氮杂环十二烷。这些D03A衍生物可通过已知方法制 备，如美国专利4,885,363或WO-A-96/28433所述，所述专利通过引 用结合到本文中。
D03A书f生物可在溶剂中并且在石J
Q
I
Q v (3)
其中L为离去基团，如卤素，优选为氯，并且Q、 n、 x和R如 上限定。
通过在溶剂中并且在^5成存在下Rx-取代的胺或胺(在x为0的情况 下)与2-卣素乙酰氯(优选2-氯乙酰氯)反应，可得到式(3)的化合物。合 成Rx-取代的胺和胺的方法在本领域已知，多种此类Rx-取代的胺和 胺可以购得。
在已除去存在的保护基后，例如在具有叔丁氧基保护的羧基的 D03A衍生物情况下通过与三氟乙酸反应，使式(la)的螯合剂
20、
N
N、
N
'N
Q N-
0
'M V—、 n v
Rx
0_、
0
(la)
与适合的Gd"-化合物(如Gd203)或Gd"-盐(如GdCb)在适合的溶剂(例 如水)中反应，以得到式(l)的Gd-螯合物，其中Q、 n、 x和R如上限 定。合成式(la)的螯合剂和式(3)的化合物的其他适合方法描述于美国 专利5，737,752,其内容通过引用结合到本文中。
式(l)的Gd-螯合物尤其用于羧酸的DNP极化，因为这些Gd-螯合 物在此类酸存在下稳定。这是一个重要的特性，因为Gd-螯合物的络 合物离解(解螯)产生游离的Gd"离子，并且对极化具有有害后果。在 游离顺磁性金属离子(如Gd^离子)存在下极化衰减快得多，这显著地 缩短旨在用作MR显影剂的超极化化合物的"寿命"。
如果要被极化的羧酸为液体或溶于溶剂，则优选使用可溶于液体 羧酸或其溶液的式(l)的Gd-螯合物。如果要被极化的羧酸相当亲油， 则式(l)的Gd-螯合物也应相当亲油。亲油性可受R基团的适合类型和 数目选择的影响。
任选在本发明的方法中使用的包含所述羧酸、三苯甲基自由基和
式(l)的Gd-螯合物的组合物进一步包含螯合剂和/或Ca-螯合物。
术语"螯合剂"表示结合(络合)金属离子(例如Gd,以形成螯合物 的化学实体。
可将螯合剂加入到组合物，以避免在DKP过程后在已溶解或熔 融包含超极化羧酸或其衍生物的固体组合物后液体组合物中的任何 游离Gd"离子。如前所述，游离的G(^+离子对极化具有有害后果，因 为在游离顺磁性金属离子(如Gd"离子)存在下极化衰减快得多。这又显著地缩短作为MR显影剂的超极化羧酸或其衍生物的"寿命"。组合
物中存在的另外的螯合剂与游离的Gd"+离子反应生成Gd螯合物，因 此游离的Gd"离子一旦液化(即溶解或熔融)，就4皮从组合物"清除"。 适合的螯合剂为容易并且快速与Gd3+离子形成络合物的那些螯合剂， 优选为EDTA、 DOTA-BOM或DTPA-BMA。这些螯合剂及其合成在 本领域已知。在另一个优选的实施方案中，使用式(la)的螯合剂。
可不用螯合剂，而将包含上述螯合剂的Ca-螯合物加到组合物。 效果与加螯合剂类似，因为Ca-螯合物为弱络合物。在游离的Gd"离 子存在下，由于上述螯合剂与Gd^比与Ca^形成更强的络合物，在 Ca"离子和Gd"离子之间发生交换。然而，由于它们不是顺磁性离子， 游离的Ca^离子没有如上所述对极化的有害后果。因此，优选的Ca-螯合物为Ca-EDTA、 Ca-DOTA-BOM和Ca-DTPA-BMA。在另一个优 选的实施方案中使用式(lb)的Ca-螯合物
、M 、 n
Rx
(lb)
其中Q、 n、 x和R如上限定。
或者，在本发明的方法中使用的组合物可包含螯合剂和Ca-螯合 物两者。所述螯合剂可与Ca-螯合物的螯合剂相同或不同，例如，螯 合剂可以为EDTA，且Ca-螯合物可以为Ca-EDTA。在另一个实施方 案中，螯合剂可以为EDTA,而Ca-螯合物可以为Ca-DTPA-BMA。 在一个优选的实施方案中，螯合剂为式(la)的螯合剂，而Ca-螯合物为 式(lb)的Ca-螯合物。
为了实施本发明的方法，制备包含羧酸、三苯甲基自由基、式(l)
22的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的组合物。
如果在本发明的方法中使用的羧酸在室温为液体(例如丙酮酸)， 则使所述液体羧酸与选择的三苯甲基自由基和选择的式(l)的Gd-螯合 物并任选与螯合剂和/或Ca-螯合物混合，以形成其中组合物的所有组 分紧密接触的组合物。优选选择的三苯甲基自由基、式(l)的Gd-螯合 物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物可溶于液体羧酸。供选但较不优选， 可在适合溶剂(例如水)中制备选择的三苯曱基自由基的溶液和/或选择 的式(l)的Gd-螯合物的溶液和/或任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的溶 液，然后将溶液加入到液体羧酸。
还可通过本领域已知的几种方式促进均匀混合，如搅拌、涡旋或 声处理。
如果在本发明的方法中使用的羧酸在室温为固体，则可使羧酸熔 融(其条件为不发生羧酸降解)，并使熔融的羧酸与选择的三苯曱基自 由基、选择的式(1)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物混合， 如前面段落所述。
在另一个实施方案中，可制备固体羧酸的溶液，例如通过使羧酸 溶于适合的溶剂或溶剂混合物，优选溶于为优良玻璃形成剂的溶剂， 以防止在冷却/冷冻时组合物结晶。适合的玻璃形成剂为例如甘油、丙 二醇或乙二醇。随后使溶解的羧酸与选择的三苯曱基自由基、式(l) 的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物(优选全部作为千燥组分) 混合。供选但较不优选，可在适合溶剂(例如水)中制备选择的三苯甲 基自由基的溶液和/或选择的式(l)的Gd-螯合物的溶液和/或任选的螯 合剂和/或Ca-螯合物的溶液，然后将溶液加入到溶解的羧酸。也可将 玻璃形成剂加入到溶于非玻璃形成溶剂的羧酸，以防止在冷却/冷冻时 组合物结晶。然而，如前所述，加入溶剂和/或玻璃形成剂应保持必需 的最低量。因此，优选的方式是选择可溶于或溶混于羧酸的三苯甲基 自由基、式(l)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物，其条件 为羧酸在室温为液体或者可在不降解下熔融。
23三苯曱基自由基的浓度适合在组合物中5至25mM,优选10至 20mM。关于式(l)的Gd-螯合物的浓度，适合在组合物中0.1至8mM， 0.1至6mM和0.5至4mM的浓度分别为优选和更优选浓度。如果螯 合剂和/或Ca-螯合物存在于在本发明的方法中使用的组合物，则所述 螯合剂和/或Ca-螯合物在所述组合物中的浓度适合为0.1至10mM， 优选0.5至8mM，更优选1.5至7mM。
优选以禁止结晶的方式冷却和/或冷冻组合物。冷却和/或冷冻可 通过在本领域已知的方法达到，例如在冷冻机或在液氮中冷冻组合 物，或者通过简单地放入DNP极化器，在此液氦将使其冷冻。
在一个实施方案中，使组合物在冷却/冷冻前脱气。脱气可通过氦 气鼓泡通过组合物(例如2-15分钟时间)实现，但也可通过其他已知的 普通方法实现。
根据本发明的方法，组合物经过动态核极化(DNP)。 DNP技术例 如描述于WO-A-98/58272和WO-A-01/96895,两者均通过引用包含在 本文中。通常，在DNP过程中使用中或高磁场和极低温度，例如通 过在液态氦和约1T或高于1T的磁场中进行DNP过程。或者，可利 用中磁场和达到足够极化增强的任何温度。在一个优选的实施方案 中，DNP过程在液态氦和约1T或高于1T的磁场中进行。适合的极 化装置(=极化器)例如描述于WO-A-02/37132。在一个优选的实施方案 中，极化装置包括低温恒温器和极化装置，例如，通过导波器连接到 由磁场产生装置(如超导磁体)围绕的中孔中的微波源的微波室。孔向 下垂直延伸到接近超导磁体的至少区域"P"的平面，其中磁场强度高得 足以使样品核发生极化，例如在1和25T之间。用于探针(即要被极化 的组合物)的孔优选可密封，并且可抽空到低压，例如lmbar或更小的 压力。探针引入装置，如可移动的输送管，可包含于孔内，并且可将 此管从孔的顶部向下插到区域P中微波室内侧的位置。区域P通过液 氦冷却到低得足以发生极化的温度，优选0.1至100K级的温度，更 优选0.5至IOK，最优选1至5K。探针引入装置优选可在其上端以任何适合方式密封，以保持孔内部分真空。探针保持容器，如探针保持 杯，可移除地装配到探针引入装置的下端内部。探针保持容器优选由
具有低比热容和优良低温性能的轻质材料制成，例如KelF(聚三氟氯 乙烯)或PEEK(聚醚醚酮)，并且可以能够容纳多于一个探针的方式设 计。
可将探针插入探针保持容器，浸入液氦并用微波照射，优选在 200mW以约94GHz的频率。极化度可如本申请第6页上公开监测。
在一个优选的实施方案中，由本发明的方法制备的固体超极化羧 酸在随后步骤中液化。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法为制备包含超极 化羧酸或其衍生物的液体组合物的方法，所述方法包括制备包含所述 羧酸、三苯甲基自由基和式(l)的Gd-螯合物的组合物；对组合物进行 动态核极化；并使所述组合物液化。
任选以上组合物包含螯合剂和/或Ca-螯合物。
在本发明上下文中，术语"超极化羧酸，，表示已用于制备上述组合 物并且在已进行上述方法后超极化的羧酸。术语"超极化羧酸的衍生 物"表示超极化化学实体，该超极化化学实体通过在溶解介质中溶解超 极化羧酸使组合物液化，使其转化成不同的超极化化学实体而从超极 化羧酸衍生。 一个实例为在碱中溶解超极化羧酸，并因此使羧基转化 成羧酸盐基团，例如使超极化丙酮酸转化成超极化丙酮酸盐或使超极 化乙酸转化成超极化乙酸盐。
通过在DNP过程后使固体组合物溶于适合溶剂或溶剂混合物(例 如含水载体，如緩冲剂溶液)，或使其熔融，任选利用在适合溶剂或溶 剂混合物中的随后溶解步骤或稀释步骤，可进行液化。用于溶解超极 化固体组合物的适合方法和装置例如描述于WO-A-02/37132。用于熔 融超极化固体组合物的适合方法和装置例如描述于WO-A-02/36005。 如果超极化羧酸或其衍生物旨在用作MR显影剂，则优选在含水载体 或适合溶剂中溶解包含超极化羧酸的固体组合物，以得到生理学上可耐受的溶液。
如前解释，用于溶解包含超极化羧酸的固体组合物的溶解介质也 可为此性质，以使超极化的羧酸转化成不同的超极化化学实体(衍生 物)。在此情况下，将超极化的羧酸称为前体。如果例如用包含碱的溶 解介质溶解包含超极化羧酸的固体组合物，则将所述超极化的羧酸中 和，并转化成超极化的羧酸盐。因此，液体组合物中的超极化化合物
为羧酸的盐，而不再是羧酸本身。
在随后的任选步骤从液化组合物除去三苯曱基自由基和/或式(1)
的Gd-螯合物和/或任选存在的螯合剂和/或Ca-螯合物和/或Gd-螯合物 (即，为螯合剂或Ca-螯合物与游离Gd3+离子的反应产物的Gd-螯合物)。 如果超极化的羧酸或其衍生物旨在活的人或动物中用作MR显影剂， 则优选从液化組合物除去三苯曱基自由基、.式(l)的Gd-螯合物和任选 存在的螯合剂和/或Ca-螯合物和/或其Gd-螯合物(后文也称为"前述化 合物")。
用于除去三苯甲基自由基、式(l)的Gd-螯合物、螯合剂和/或Ca-螯合物和/或Gd-螯合物的方法在本领域已知。通常，可应用的方法取 决于已用于制备本发明方法所用组合物的前述化合物的确切性质和 化学特性。在溶解或熔融包含超极化羧酸的固体组合物时，三苯甲基 自由基和/或式(l)的Gd-螯合物和/或螯合剂和/或Ca-螯合物和/或Gd-螯合物可能沉淀，因此可很容易地通过过滤从液体组合物分离。是否 发生沉淀当然取决于溶剂和前述化合物的性质。
如果不发生沉淀，则可通过层析分离技术除去三苯甲基自由基、 式(l)的Gd-螯合物、螯合剂、Ca-螯合物和Gd-螯合物，例如液相层析 (如反相层析)、(固相)萃取或在本领域已知的其他层析分离方法。由于 在液体组合物中超极化羧酸或其衍生物中的极化由于T!松弛衰减，因 此一般优选使用能够在一个步骤除去所有前述化合物的方法。前述化 合物从液体組合物除去得越快，极化度保持越高。因此，不仅是从待 极化羧酸、三苯甲基自由基和式(l)的Gd-螯合物之间有紧密接触的观
26点，而且是从快而有效除去的观点，有益选择具有类似化学性质的三 苯甲基自由基和式(l)的Gd-螯合物。这当然也适用于选择螯合物和/
或Ca-螯合物，若是那些化合物用于本发明方法所用的组合物。如果 例如使用相当亲油的三苯曱基自由基和相当亲油的式(i)的Gd-螯合 物，并且任选使用相当亲油的螯合剂和/或Ca-螯合物，则可全部在一 个步骤在单一层析柱上通过反相液体层析除去。
在除去前述化合物后，可检验液体组合物的残余三苯甲基自由基 和/或式(l)的Gd-螯合物以及任选存在的螯合剂、Ca-螯合物和Gd-螯 合物的残余量。
由于三苯甲基自由基具有特征UV/可见吸收光谱，因此，可用UV/ 可见吸收测量作为一种方法检验其在除去后在液体组合物中的存在。 为了得到定量结果，即在液体组合物中存在的三苯曱基自由基的浓 度，可校准光学分光计，使得在特定波长从液体组合物等分试样的吸 收得到在液体组合物中相应的三苯曱基自由基浓度。
由于在式(l)的Gd-螯合物中存在芳族基团，也可用UV/可见吸收 测量作为一种方法检验式(l)的Gd-螯合物的存在。通过如前面段落所 述校准分光计，也可得到定量结果。如果式(lb)的螯合剂和/或式(lb) 的Ca-螯合物已用于在本发明的方法中使用的组合物，则由于它们均 包含芳族基团，也可用相同的UV/可见吸收测量作为一种方法检验这 些化合物的存在。
在优选的实施方案中，本发明的方法用于制备液体MR显影剂， 并且在本发明的方法中使用的组合物通过溶解液化，优选在生理学上 可耐受的含水载体(如緩冲溶液)中溶解。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述组合物包含13C-丙酮酸(优选"C广丙酮酸)、式(2)的三苯甲基自由基和式(l)的Gd-螯合 物。由于"d-丙酮酸为相当亲油的化合物，因此优选选择相当亲油的 式(2)的三苯曱基自由基和相当亲油的式(l)的Gd-螯合物。
在更优选的实施方案中使用式(2)的三苯甲基自由基，其中M表
27示氢或钠，Rl相同并且表示-CHrCH2-OCH3，并使用式(l)的Gd-螯合 物，其中Q为H， n为l至3， x为0或l，并且R基团(如果存在)在 对位连接。在很优选的实施方案中，Q为H, n为l至3， x为l，并 且在对位连接的R为甲基、异丙基、异丁基和叔丁基，最优选甲基和 叔丁基。由于在丙酮酸存在下稳定，式(l)的这些Gd-螯合物不仅尤其 用于丙酮酸的DNP极化，而且可在单一步骤与式(2)的三苯甲基自由 基一起除去。任选将式(la)的螯合剂和/或式(lb)的Ca-螯合物加入到组 合物。
在此优选的实施方案中，通过在"C-丙酮酸中溶解前述三苯甲基 自由基、式(l)的Gd-螯合物和任选的螯合剂(la)和/或Ca-螯合物(lb) 制备所述组合物。使组合物的组分彻底混合，并使组合物冷却和/或冷 冻。在动态核极化后，将包含超极化"C-丙酮酸的固体组合物溶解或 熔融，然后转化成超极化的"C-丙酮酸盐，或者同时溶解和转化。
在一个实施方案中，使包含超极化130丙酮酸的固体组合物与液 体碱反应，以使其同时溶解并转化成"C-丙酮酸盐，随后加入緩沖溶 液(优选生理学上可耐受的緩冲溶液)，以完成溶解，并任选使残余的 "C-丙酮酸转化成"C-丙酮酸盐。在一个优选的实施方案中，碱为 NaOH、 Na2C03或NaHC03的水溶液，更优选NaOH的水溶液。緩沖 溶液适合为包含緩沖剂的生理学上可耐受的緩沖溶液，緩冲剂緩沖于 约pH7至8，例如磷酸盐緩沖剂(KH2PCVNa2HP04)、 ACES、 PIPES、 咪哇/HCl、 BES、 MOPS、 HEPES、 TES、 TRIS、 HEPPS或TRIC既 优选使用TRIS緩冲溶液、柠檬酸盐緩冲溶液或磷酸盐緩冲溶液。緩 冲溶液可进一步包含诸如EDTA、 DTPA-BMA或DOTA-BOM —类的 螯合剂，以络合可能存在的任何游离Gd"离子。在另一个优选的实施 方案中，将緩冲溶液和^成混合成一种^M"生溶液，并将此溶液加入到包 含超极化"C-丙酮酸的固体组合物，并使"C-丙酮酸同时溶解并转化 成130丙酮酸盐。
优选除去上述式(l)的Gd-螯合物、式(2)的三苯甲基自由基和任选
28的式(la)的螯合剂和/或式(lb)的Ca-螯合物，适合通过使用反相液体层 析除去，因为这允许同时除去所有上述化合物。任选检验包含超极化"C-丙酮酸盐的液体组合物的前述残余化合 物，例如使用前面在本申请中所迷的方法。为了用作体内MR显影剂，包含由本发明的方法获得的超极化羧 酸或其衍生物的液体组合物作为一种组合物提供，即，适合给予活的 人或非人动物体的显影介质。显影介质优选包含生理学上可耐受的含 水载体，如上述緩沖溶液、水或盐水。显影介质可进一步包含普通的 药学上可接受的载体、赋形剂和制剂助剂。因此，显影介质可例如包 含稳定剂、重量克分子渗透浓度调节剂、增溶剂等。优选胃肠外给予所述体(优选静脉内)包括用于体内MR显影(即在 活的人或非人动物体中)的液体组合物的显影介质，所述液体组合物包 含由本发明的方法获得的超极化羧酸或其衍生物。一般在检查下的活人或非人动物体位于MR磁体中。专用的 MR-RF-线圈布置成覆盖感兴趣的区域。显影介质的剂量和浓度将依赖 多种因素，如毒性和给药途径。在给药后小于400s，优选小于120s， 更优选在给药后小于60s,尤其优选20至50s,施加MR显影序列来 编码所感兴趣的体积。为了用作用于体外NMR测定或用于离体组织或分离器官的MR 显影或MR谱的剂，由本发明的方法获得的包含超极化羧酸或其衍生 物的液体组合物作为一种组合物提供，即，适用于加入到例如分离蛋 白(如受体、酶)、细胞培养、从人或非人体得到的样品(例如血液、尿 或唾液)、离体组织(如生检组织或分离器官)的显影介质。对本领域的 技术人员显而易见，药学上可接受的载体、赋形剂和制剂助剂可存在 于显影介质，但不需要为此目的存在，因此，显影介质优选包含含水 载体，如上述緩沖溶液或緩冲溶液的混合物，并且可包含一种或多种 非水溶剂，如DMSO或曱醇(尤其用于体外NMR)。可用包括含超极化羧酸或其衍生物的液体组合物的显影介质作29为"普通的"MR显影介质，即为解剖学显影提供对比增强。如果超极合物，则可将所述显影介质用于体内代谢MR显影，因此在检查下提 供组织代谢状态的信息。如上所述，丙酮酸盐是种檬酸循环中的化合物，因此，可用超极 化的13(3-丙酮酸盐作为肿瘤显影的显影剂，如WO-A-2006/011810所 详述。另外，用超极化的"C-丙酮酸盐作为显影剂评价心肌组织的生存 力已详述于WO-A-2006/054903。本发明的另一方面为包含羧酸、三苯甲基自由基、式(l)的Gd-螯 合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的组合物。优选所述组合物用于 动态核极化。所述组合物的优选实施方案，即优选的羧酸、三苯曱基 自由基和式(l)的Gd-螯合物，已在本申请前面描述。本发明的另 一 方面为包含超极化羧酸或其衍生物(优选羧酸的 盐)、三苯甲基自由基、式(l)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/或Ca-螯合物的組合物，其中所述组合物通过动态核极化获得。在更优选的 实施方案中，所述组合物为通过动态核极化，随后溶解或熔融由动态 核极化获得的固体组合物得到的液体组合物。本发明的另一方面为包含三苯甲基自由基和式(l)的Gd-螯合物的 极化剂。优选所述极化剂用于由动态核极化使羧酸极化。本发明的另一个方面为式(l)的新的Gd-螯合物其中
n为1至10; x为0至3;
R相同或不同，并且表示氟、直链或支化Ci-CV烷基或包含5至 IO个碳原子的芳族或非芳族环状基团；并且
Q为H、直链或支化CrC6-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或 非芳族环状基团或
其中n、 x和R如上限定。
式(l)的Gd-螯合物的优选实施方案在本申请前面描述。 本发明的新Gd-螯合物可用于羧酸的动态核极化，如本申请所述。
然而，它们也可用作MR活性化合物，即在MR显影所用造影介质中
的显影剂。
本发明的另 一个方面为式(l a)的新螯合剂
Q
(la)
其中
n为1至10; x为0至3; R相同或不同，
并且表示氟、直链或支化的d-C6-烷基或包含
至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团，其条件为如果Q为H并且
31x为O,则n为2至10，优选2至5，更优选2至3;并且
Q为H、直链或支化的d-CV烷基或包含5至10个碳原子的芳族 或非芳族环状基团或
其中n、 x和R如上限定。
式(la)的螯合剂的优选实施方案与式(l)的Gd-螯合物的优选实施 方案相同，并且在本申请前面描述。
本发明的另一方面为通过在溶剂中并且在碱存在下使具有受保 护的羧基的D03A衍生物(优选1,4,7-三(叔丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)与式(3)的化合物反应制备上述式(la)的螯合剂的方 法
其中L为离去基团，如卤素，优选为氯，并且Q、 n、 x和R如 以前对式(la)所限定，随后除去保护基。
本发明的另一个方面为制备式(l)的Gd-螯合物的方法，所述方法
包括
a)在溶剂中并且在碱存在下使具有受保护的羧基的D03A衍生物 (优选l,4,7-三(叔丁氧基羰基曱基)-l,4,7,10-四氮杂环十二烷)与式(3)的
化合物反应<formula>formula see original document page 32</formula>
其中L为离去基团，如卤素，优选为氯，并且Q、 n、 x和R如 以前对式(l)所限定b)除去保护基；和
e)使步骤b)的反应产物与Gd"-化合物(优选GdCl3)在溶剂(优选水) 中反应。
本发明的另 一方面为一种试剂盒，所述试剂盒包括《吏用i兌明书和 包含用于动态核极化的组合物的一个或多个小瓶，所述组合物包含羧 酸、三苯曱基自由基和式(l)的Gd-螯合物，并且进一步任选包含螯合 剂和/或Ca-螯合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括包含组合物 的单个小瓶，所述组合物包含羧酸、三苯甲基自由基和式(l)的Gd-螯 合物及任选的螯合剂和/或Ca-螯合物。在另一个实施方案中，所述试 剂盒包含第一小瓶和第二小瓶，第一小瓶包含含有羧酸和三苯甲基自 由基的组合物，第二小瓶包含式(l)的Gd-螯合物和任选的螯合剂和/ 或Ca-螯合物。第一小瓶和第二小瓶的内容物在动态核极化之前混合。 小^l中的组合物可以为干燥物质的组合物，即所有化合物均可为固 体。或者，组合物可以为液体组合物，即，可将化合物溶于溶剂，或 者如果化合物之一为液体，可将各化合物溶于所迷液体化合物。
在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒包括使用说明书和包 含用于动态核极化的组合物的小瓶，所述组合物包含"C-丙酮酸(优选 。C-丙酮酸)、式(2)的三苯甲基自由基、式(l)的Gd-螯合物和任选的螯 合剂和/或Ca-螯合物。
实施例
实施例la合成三苯甲基自由基三(8-氯基-2，2,6，6-(四(甲氧基乙基) 苯并-[l，2-4，5'j双-(l，3)二硫杂环戊二烯-4-基)甲基钠盐，式(2)的三苯甲 基自由基
在氩气气氛下，使根据W0-A1-98/39277的实施例7合成的10g (70mmol)三(8-羧基-2,2,6,6-(四(羟基乙基)苯并-[l,2-4，5'〗-双-(l,3)-二硫 杂环戊二烯-4-基)甲基钠盐悬浮于280ml 二甲基乙酰胺。加入氢化钠 (2.75g),随后加入甲基碘(5.2ml)，并使轻微放热的反应在34°〇水浴中
33进行1小时。加入氢化钠和曱基碘重复两次，各化合物量相同，并且
在最后加入后，在室温搅拌混合物68小时，然后倒入500ml水中。 用40ml 1MNaOH(含水)将pH调节到pH>13,并将混合物在环境温度 搅拌15小时，以使生成的甲酯水解。然后用50ml2MHCl(含水)将混 合物酸化至pH约2，并用乙酸乙酯萃取3次(500ml和2x200ml)。合 并的有机相经Na2S04干燥，然后蒸发至干。粗产物(24g)用乙腈/水作 为洗脱液通过制备HPLC纯化。使收集的部分蒸发，以除去乙腈。剩 余的水相用乙酸乙酯萃取，有机相经Na2S04干燥，然后蒸发至干。 将水(200ml)加入到残余物，用0.1MNaOH(含水)将pH小心调节至7， 在此过程中残余物緩慢溶解。中和后，将水溶液冷冻干燥。
实施例2合成1，4，7-三(羰基曱基)-10-((4-叔丁基)-苄基氨基羰基 甲基)-l，4，7，10-四氮杂环十二烷，式(la)的螯合剂
所有化学药品购自Sigma-Aldrich或Fluka。如WO-A-96/28433所 述制备1,4,7-三(叔丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷。 2a制备2-氯-N-(4-叔丁基苯基甲基)-乙酰胺
在室温向市售的二氯曱烷(100ml)中4-叔丁基苄基胺(8.16g， 50mmol)和碳酸钾(7.95g， 57.5mmol)的悬浮体滴加二氯曱烷(25ml)中 2-氯乙酰氯(6.21g， 55mmol)的溶液。在室温搅拌反应混合物30分钟 后，使反应混合物回流4小时。使反应混合物冷却并加入水(100ml)。 使相分离，有机相经MgS04千燥，并在真空中蒸发。标题化合物作为 白色结晶物质得到，所述物质无需进一步纯化即可用于下一步骤。
2b制备1，4，7-三(叔丁氧基羰基甲基)-10-((4-叔丁基)-千基氨基羰 基甲基)-l,4，7，10-四氮杂环十二烷
将乙腈(100ml)中1，4,7-三(叔丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环 十二烷(7.57g， 12.7mmo1)、从实施例2a得到的2-氯-N-(4-叔丁基苯基 甲基)-乙酰胺(3.60g， 15mmol)和碳酸钾(5.53g， 40mmol)的反应混合物加热到75。C,并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却到室温并 且过滤。使滤液在真空中蒸发，残余物经过快速层析(二氧化硅，
MeOH/CHCl3)。将包含产物的部分合并，并在真空中蒸发，得到标题 化合物，为一种在々者存时结晶的黄色油。
2c 1，4，7-三(羰基曱基)-10-((4-叔丁基)苄基#^羰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷
将来自实施例2b的1,4,7-三(叔丁氧基羰基甲基)-10-((4-叔丁基)-苄基氨基羰基甲基)-l,4,7,10-四氮杂环十二烷(3.59g， 5mmol)在氮气气 氛下溶于三氟乙酸(25ml)。在室温搅拌反应过夜，然后在真空中蒸发。 将残余物溶于水(lOml)，并在真空中蒸发。使残余物重新溶于水(lOml)， 加入交联的聚4-乙烯基吡啶(ReillexTM425， 5.2g)，并在过滤前搅拌混 合物20分钟。使滤液经过冷冻干燥，得到标题化合物，为一种白色 吸湿物质。
以类似方式，从以下胺和Rx-取代的胺开始制备式(la)的其他螯合
剂
.4-甲基卡基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为1， x为1,并且 R为甲基；
.4-乙基卡基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为1， x为1，并且 R为乙基；
.4-异丙基千基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为1， x为1,并 且R为异丙基；
.2,4,6-三甲基苄基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为1， x为3， 并且所有的R均为在邻位和对位连接的甲基；
*3,5-二曱基苄基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为l, x为2， 并且所有的R均为在间位的甲基
.4-苯基千基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为1, x为1,并且 R为苯基-4-氟千基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为l, x为l，并且R
为F
苯基丙基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为3，并且x为O 苄基胺，得到式(la)的螯合剂，其中n为l，并且x为O
实施例3制备1，4，7-三0tt甲基)-10-((4-叔丁基)苄基Jl^tt甲 基)-l，4，7，10-四氮杂环十二烷合钆，式(l)的Gd-螯合物
在室温水(1 Oml)中溶解1,4,7-三(羰基曱基)-l 0-((4-叔丁基)-千基氨 基羰基甲基)-l,4,7,10-四氮杂环十二烷(1.10g， 2mmol)和GdCl3六水合 物(0.74g， 2mmo1)。将反应混合物加热到90。C并搅拌2小时，通过加 入1M含水NaOH将pH连续调节至7。然后将反应混合物冷却到室 温，并将pH调节至9(含水NaOH， 1M)。过滤得到的不透明混合物， 并通过加入含水HC1(1M)将pH调节至7。使混合物经过冷冻干燥，得 到标题化合物，为 一种白色结晶物质。
以类似方式，从以下式(la)的螯合物开始制备式(l)的其他Gd-螯
合物
式(la)的螯合剂，其中n为l， x为l，并且R为甲基；
式(la)的螯合剂，其中n为l， x为l,并且R为乙基；
式(la)的螯合剂，其中n为l， x为l,并且R为异丙基；
式(la)的螯合剂，其中n为l， x为3，并且所有的R均为在邻
位和对位连接的甲基；
式(la)的螯合剂，其中n为l， x为2，并且所有的R均为在间
位的甲基
式(la)的螯合剂，其中n为l， x为l，并且R为苯基 式(la)的螯合剂，其中n为1， x为1,并且R为F 式(la)的螯合剂，其中n为3，并且x为O 式(la)的螯合剂，其中n为l，并且x为O实施例4在没有式(l)的Gd-螯合物存在下制备超极化"CV丙酮 酸盐的溶液(比较实施例)
通过在Bd-丙酮酸(164^U)中溶解三苯甲基自由基制备一种组合 物，所述组合物具有15mM实施例的三苯甲基自由基。将组合物混 合至均匀，放入探针保持容器，并插入DNP极化器中。
在用微波(93.950GHz)照射下，使组合物在1.2K在3.35T磁场中 DNP条件下极化。通过13C-NMR监测固态极化，并且继续极化，直 到达到22%最大极化，即在显示NMR信号-时间的曲线图中得到饱和 曲线。
使用WO-A-02/37132的溶解装置，将包含超极化"d-丙酮酸的 固体组合物溶于氢氧化钠、三(羟基曱基)氨基曱烷(TRIS)和 ETDA(0.3mM)的水溶液，以得到超极化"d-丙酮酸钠的中性溶液。将 层析柱与溶解装置串联。柱由包含Varian提供的疏水填充材料 (Bondesil-C18, 40UM Part 12213012)的柱体(D-38mm; h=10mm) 组成。迫使溶液通过选择性吸附三苯甲基自由基的柱。过滤后的溶液 用UV分光光度计在469nm分析，并将残余的三苯甲基自由基浓度测 定到低于O.lnM检出限。
实施例5在式(l)的Gd-螯合物存在下制备超极化"C,-丙酮酸盐 的溶液
具有15mM实施例1的三苯甲基自由基、1.5mM式(l)的Gd-螯合 物和3mM相应的式(la)的螯合剂的组合物通过在"C广丙酮酸(164^d) 中溶解前述化合物制备。将组合物混合至均匀，放入探针保持容器， 并插入DNP极化器中。
用以下化合物作为式(l)的Gd-螯合物
Gd-螯合物A:式(l)的Gd-螯合物，其中n为l， x为l，并且R
为甲基；
Gd-螯合物B:式(l)的Gd-螯合物，其中n为l, x为l，并且R为叔丁基；
Gd-螯合物C:式(l)的Gd-螯合物，其中n为3，并且x为0;和 Gd-螯合物D:式(l)的Gd-螯合物，其中n为l，并且x为0 式(la)的相应螯合剂为
螯合剂A:式(la)的螯合剂，其中n为1， x为1，并且R为甲基； 螯合剂B:式(la)的螯合剂，其中n为l, x为l,并且R为叔丁
基；
螯合剂C:式(la)的螯合剂，其中n为3，并且x为0;和 螯合剂D:式(la)的螯合剂，其中n为l，并且x为0 如实施例4中所述进行DNP极化和固态极化的检测。 经检测，对包含以下组分的组合物得到的最大固态极化如下 Gd-螯合物A: 31%极化 Gd-螯合物B: 29%极化 Gd-螯合物C: 34%极化 Gd-螯合物D: 34%极化
因此，与实施例4中得到的极化比较，通过将式(l)的Gd-螯合物 加入到要被极化的组合物，可提高极化约31-55%。
使用WO-A-02/37132的溶解装置，将包含超极化"d-丙酮酸的 固体组合物溶于氢氧化钠和三(羟基曱基)氨基曱烷(TRIS)及 DTPAB-MA(1.5mM)的水溶液，以得到超极化"C广丙酮酸钠的中性溶 液。将层析柱与溶解装置串联。柱由包含Varian提供的疏水填充材料 (Bondesil隱C18， 40UM Part #: 12213012)的柱体(D-38mm; h-10mm) 组成。迫使溶液通过选择性吸附三苯甲基自由基、式(l)的Gd-螯合物 和相应螯合剂的柱。在过滤后，溶液用UV分光光度计在469nm分析， 并测定残余的三苯甲基自由基、式(l)的Gd-螯合物和相应螯合剂的浓 度。发现三苯甲基自由基的浓度低于O.lpM检出限，式(l)的Gd-螯合 物和相应螯合剂的浓度低于10pM检出限。
38
权利要求
1. 一种式(1)的Gd-螯合物其中n为1至10；x为0至3；R相同或不同，并且表示氟、直链或支化C1-C6-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团；并且Q为H、直链或支化C1-C6-烷基或包含5至10个碳原子的芳族或非芳族环状基团或其中n、x和R如上限定。
2.权利要求1的Gd-螯合物，其中Q为H或<formula>formula see original document page 2</formula>并且R相同或不同，并且为氟、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁 基、异丁基、叔丁基、环戊基、环己基、甲基环戊基、曱基环己基、 千基、苯基或甲苯基。
3. 权利要求l或2的Gd-螯合物，其中x为l,并且R在对位连 接，优选其中R在对位连接，并且为氟、曱基、异丙基、异丁基和叔 丁基。
4. 权利要求1的Gd-螯合物，其中x为0，并且n为1至5,优 选1至3。
5. —种组合物，所述组合物包含羧酸、三苯曱基自由基和权利要 求1至4的式(l)的Gd-螯合物。
6. 权利要求5的组合物，所述组合物进一步包含螯合剂和/或Ca-螯合物。
7. 权利要求5和6的组合物，所述组合物用于动态核极化。
8. 权利要求5至7的组合物，其中所述羧酸为内源化合物或其前前体。
9. 权利要求5至8的组合物，其中所述羧酸为马来酸、乙酸、富 马酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、草酰乙酸、乳酸、a-酮基戊二酸、 烟酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、肌氨酸、GABA 和高半胱氨酸。
10. 权利要求5至9的组合物，其中所述羧酸经同位素增浓，优 选"N和/或^C-增浓，更优选"C-增浓。
11. 权利要求5至10的组合物，其中所述三苯甲基自由基为基于 氧、基于硫或基于碳的稳定三苯甲基自由基。
12. 权利要求5至11的组合物，其中所述三苯甲基自由基为式(2) 的自由基<formula>formula see original document page 4</formula>其中M表示氢或1当量的阳离子；并且Rl相同或不同，表示直链或支化C!-Q-烷基或基团-(CH2)n-X-R2,其中n为1、 2或3;X为O或S;并且R2为直链或支化d-Cr烷基。
13. —种组合物，所述组合物包含超极化羧酸或其衍生物、三苯 曱基自由基和权利要求1至4的式(l)的Gd-螯合物。
14. 权利要求13的组合物，所述组合物进一步包含螯合剂和/或 Ca-螯合物。
15. —种极化剂，所述极化剂包含三苯曱基自由基和权利要求1 至4的式(l)的Gd-螯合物。
16. 权利要求15的极化剂，所述极化剂用于羧酸动态核极化。
17. —种制备固体超极化羧酸的方法，所述方法包括制备包含羧 酸、三苯甲基自由基和权利要求1至4的式(l)的Gd-螯合物的組合物， 并且对所述组合物进行动态核极化。
18. 权利要求17的方法，其中随后使得到的固体超极化羧酸液 化，因此产生包含超极化羧酸或其衍生物的液体组合物。
19. 权利要求17和18的方法，其中所述组合物进一步包含螯合 剂和/或Ca-螯合物。
20. —种用于动态核极化的试剂盒，所述试剂盒包括使用说明书 和包含权利要求5至12的组合物的一个或多个小瓶。
21. —种制备权利要求1至4的式(l)的Gd-螯合物的方法，所述 方法包括a)在溶剂中并且在碱存在下使具有受保护的羧基的D03A衍生物 与式(3)的化合物反应 (3)其中L为离去基团，并且Q、 n、 x和R如权利要求1至4限定；b) 除去保护基；和c) 使步骤b)的反应产物与Gc^-化合物在溶剂中反应。
22. —种式(la)的螯合剂<formula>formula see original document page 5</formula>其中n为1至10 x为0至3;并且R相同或不同，并且表示氟、直链或支化的d-C6-烷基或包含5 至IO个碳原子的芳族或非芳族环状基团，其条件为如果Q为H并且 x为0, n为2至10;并且Q为H、直链或支化的d-C6-烷基或包含5至10个碳原子的芳族 或非芳族环状基团或其中n、 x和R如上限定。
23. —种制备权利要求22的式(la)的螯合剂的方法，所述方法包括在溶剂中并且在碱存在下使具有受保护的羧基的D03A衍生物与 式(3)的化合物反应Q其中L为离去基团，并且Q、 n、 x和R如权利要求21限定;并且随后除去保护基。
全文摘要
本发明涉及羧酸的动态核极化(DNP)的改良方法及用于所述方法的化合物和组合物。
文档编号A61K31/555GK101506179SQ200780031693
公开日2009年8月12日 申请日期2007年8月29日 优先权日2006年8月30日
发明者C·格洛加德, M·萨宁, R·瑟文 申请人:通用电气医疗集团股份有限公司